IDENTIFICAO MOLECULAR E ANLISE DE PSIDIUM GUAJAVA L.

DE TRIBOS INDGENAS DE TAIWAN

ABSTRATO
Psidium guajava L. uma rvore frutfera perene em reas tropicais e subtropicais. Em Taiwan, P. guajava foi
usado como plantas anthro-farmacolgica por pessoas indgenas para tratar a diarreia aguda, tosse e doenas
espasmdicas intestinais. A classificao e identificao funcional do P. guajava permanece sem soluo estes
dias. Neste estudo, os marcadores moleculares rRNA 18S, transcreva interno (ITS) regio do DNA ribossomal, trnL
intro e trnL-trnF espaador intergnica (IGS) de DNA do cloroplasto (cpDNA), e ADN polimrfico amplificado
aleatoriamente (RAPD) foram utilizados para a identificao molecular de 18 amostras de P. guajava de diferentes
tribos indgenas, 2 de tribo no-indgena, e 12 cultivares comerciais de mercados em Taiwan. Mtodos
moleculares comprimento do fragmento de polimorfismo restrito (RFLP) e electroforese em gel com gradiente
desnaturado (DGGE) so encontrados demorada e menos eficiente em comparao com RAPD, portanto, no so
adequados para amostras de elevada homologia. Neste estudo, 18S rDNA, ITS e cpDNA trnL intron e trnL-trnK
intergnico espaador tambm foram testados marcador molecular; no entanto, os resultados analisados por
UPGMA algoritmo molecular, Neighbor-Joining, Parcimnia ou a probabilidade mxima no mostrou
discriminaes (dados no mostrados). Por outro lado, dez iniciadores oligonucleotdicos 10 mer foram usadas na
tcnica de RAPD para amplificar os genes especficos de 32 amostras de goiaba. Quatro primers, OPB 17, OPG 6,
OPY 15 e OPY 18, foram capazes de dirigir a amplificao e rendeu um total de 82 padres de RAPD polimrficas.
Trinta e dois gentipos no dendrograma foram identificados e foram divididos em dois grupos principais, as
cultivares no cultivadas e comerciais. Com base na anlise de cluster, as amostras vermelhas carne Psidium que
se acreditava ter alta funo mdica foram agrupados de forma independente. Os resultados sugerem que RAPD
til para a discriminao de baldios, cultivares e potencial Psidium de alta economia.
Palavras-chave: goiaba, Psidium guajava, RAPD, tribo indgena
INTRODUO
Psidium guajava L. , vulgarmente chamado de goiaba
, uma rvore frutfera perene em reas tropicais e
subtropicais . nativo para os pases da Amrica do
Sul e foi introduzido na ndia pelo Portugus durante
o sculo 17 (1). P. guajava tem alto teor nutritivo e
especialmente rica em vitamina C. Existem muitas
variedades de goiaba no cultivadas e goiabas
importados de Taiwan. cultivares cultivadas de P.
guajava foram introduzidos a partir de ndia e
Amrica para melhoria da qualidade . Existem
muitas variedades de goiaba cultos e incultos ,
incluindo goiaba prola , goiaba cristal , goiaba Thai ,
goiaba pra, e branco, vermelho e amarelo carne
goiaba. A maioria das espcies no cultivadas so
encontrados em tribos indgenas de Taiwan. Eles
foram utilizados como um remdio eficaz para tratar
e prevenir doenas , tais como dor de cabea , tosse
( 2-3 ) , espasmo , inflamatria , pirexia , diarreia
aguda ( 4 ) , clicas , flatulncia , dores de estmago
e(5).
Caractersticas morfolgicas so marcadores
fenotpicos tradicionais para a identificao de
plantas. Eles podem mudar com o ambiente de
cultivo e crescimento de modo que a identificao
confuso. A fim de identificar de carne vermelha e de
polpa branca goiabeiras em tribos indgenas de uma

forma mais sistemtica, marcadores genticos

especficos para goiabas so desenvolvidos. regies
Recentemente, muitos marcadores moleculares, tais
como polimorfismo de fragmentos de restrio
(RFLP), amplificado polimorfismo fragmento de
lengh (AFLP), sequencecharacterized amplificados
(SCAR), entre repeat sequncia simples (ISSR),
simples repetio de sequncia (SSR) e polimorfismo
amplificado ao acaso DNA (RAPD), so utilizados em
investigao culturas hortcolas. O DNA do
cloroplasto de tabaco normalmente serve como
referncia para o genoma de plastos (6) e a sua
sequncia de nucletidos completa e mapa do gene
foram publicados em 1986 (7). Zhang (8)
estabeleceu as relaes filogenticas em CARPHA
por cladstica anlises baseadas em cloroplasto trnL
intron e dados de sequncia espaador intergenetic
trnL-trnF. Os marcadores RAPD foram utilizados para
identificao de cultivares e anlise de diversidade
gentica entre 25 Feijoa sellowiana (9) cultivares e
adeses em Itlia e 41 gentipos de goiaba na ndia
(10). Isso faz com que a discriminao de cultivar
fcil, rpida e barata. No presente estudo, 18S rDNA,
ITS e cpDNA trnL intron e trnL-trnK marcadores
espaador e RAPD intergnicas so usados para
identificar 32 gentipos indgenas da goiaba em
Taiwan. O estudo tem como objetivo compreender a
distribuio de vermelho e branco-carne de goiaba
em tribos indgenas de Taiwan por marcadores

moleculares analisa. Os resultados preliminares so

teis para a discriminao de espcies de goiabeira.
crucial identificar goiabas, que podem ter
potencial para ser desenvolvido em uma planta
medicinal.
MATERIAIS E MTODOS
I. MATERIAIS VEGETAIS
As folhas de goiabeira coletados de diferentes tribos
indgenas de Taiwan esto listadas na Tabela 1.
folhas de goiabeira foram coletados durante de abril
a julho de 2005. Quinze a 20 folhas foram coletadas
de uma goiabeira em cada tribo indgena. Somente a
folha ao sol brilhou posio foi recolhido
II . TOTAL DE GENOMIC DNA EXTRACTION
As folhas das plantas foram enxaguadas com gua
destilada , seco e armazenado a -80 C . O ADN
genmico foi extrado a partir das folhas atravs do
mtodo de brometo de cetiltrimetilamnio ( CTAB ) (
11 ) com algumas modificaes . Amostras de folhas
foram modas em p com almofariz e pilo em azoto
lquido . Aproximadamente 0,1 g de p de folha seca
foi misturada com 1 mL de tampo de extraco ( 2
%
de
CTAB
,
20
mM
de
cido
etilenodiaminotetractico ( EDTA ) , 100 mM de Tris
/ HCl , pH 8,0 , 1,4 M de NaCl ) . A mistura foi
centrifugada a 13200 g . O precipitado de ADN
goiaba foi lavada com 500 mL de lcool 70 % e duas
vezes um precipitado limpo foi obtido . O DNA foi
dissolvido em 20 uL de gua estril , aps secagem
sob vcuo durante 20 min e armazenadas a -20 C
para posterior utilizao .

de 0,5 mM, 1x tampo, a polimerase de ADN de 0,5

unidade (TM Dynazyme II, Finnzymes Inc.,
Riihitontuntie, Finlndia), dNTP 200 mM, e 200 ng de
ADN genmico. O Nmero de ciclos de reaco
depende das regies amplificadas de ADN genmico.
Os iniciadores especficos de ADNr 18S, STI e cpDNA
trnL intro e regies espaadoras intergnica trnLTRNF esto listados na Tabela 2 (12 13). Para a
amplificao de 18S ADNr, o PCR foi programado
para 35 ciclos de: 94 C durante 30 seg, 55 C
durante 30 seg, e 72 C durante 3 min com um
passo de desnaturao inicial a 94 C durante 3
minutos e um adicional etapa de extens de 7 min a
72 C. Por seu amplificao do gene, a PCR foi
programado para 35 ciclos de: 95 C durante 30 seg,
58 C durante 30 seg, e 72 C durante 1,5 min com
uma desnaturao inicial a 95 C durante 3 minutos
e um passo final de extenso a 72 C para 7 min. A
PCR do intro e TRN L trnLtrnF amplificao do gene
espaador intergnica foi efectuada em 30 ciclos de:
96 C durante 1 seg, 54 C durante 5 seg, e 72 C
durante 1 min, com uma inicial de desnaturao
passo 3 min a 96 C e uma extenso final a 72 C
durante 10 min. Para o mtodo de RAPD, quatro
primers (Tabela 3) (10) dirigida a amplificao de
altamente reprodutiva e os nmeros mais elevados
de diversos fragmentos. A PCR consistia de 35 ciclos
com desnaturao inicial a temperatura de 95 C
durante 3 min e extenso final a temperatura de 72
C durante 7 min. Cada ciclo incluiu desnaturao a
95 C durante 30 seg, emparelhamento a 30 C
durante 1 min e extenso a 72 C durante 2 min.
Amplices foram resolvidas num gel de agarose a 2%
por electroforese a 100 V durante 60 min.
X. A SEQUENCIAO DE ADN

III . QUANTIFICAO DE DNA

A quantificao do ADN foi realizada utilizando um
espectros otmetro ( Beckman , CoulterTM DU640 ,
EUA ) . Um microlitro de cada um dos extractos de
ADN de goiaba foi diluda com 99 mL de gua
desionizada e as absorvncias a 260 e 280 nm foram
medidos . Os oncentrations absorvncias foram
calculadas e expressas em ng / mL . As
concentraes finais de solues stock de ADN de
goiaba foram ajustada para 100 ng / mL

REAO EM CADEIA DE POLIMERASE

Os fragmentos de ADN especficos foram
amplificados foi realizada por reaco em cadeia da
polimerase (PCR). O volume total da mistura
reaccional foi de 25 mL que continham iniciadores

Os produtos de PCR de amostras de g uava foram

sequenciados por misso Biotech Co., Taiwan em um
ABI Prism 377-96 ADN Sequencer, Perkin-Elmer, CA,
EUA.

XI. ANLISE CLADSTICA

Cada amplificao de ADN foi repetido trs vezes e o resultado das bandas no gel de agarose foram marcadas
quanto presente (1) ou ausente (0). O polimorfismo RAPD foi analisado e expresso como uma matriz de
dissimilaridade gentica utilizando NTSYS-pc (Taxonomia Numrica System, verso 2.0, Exeter Software, NY,
software EUA). Dice ndice de similaridade SD = 2Nab / (Na + Nb) (14) foi usada para calcular a matriz de
similaridade entre pares, onde Nab indica o nmero de bandas partilhadas entre um par de gentipos de a e b,
Na significa o nmero marcado bandas no gentipo um, e Nb significa o nmero de bandas marcados ao gentipo
b . A similaridade dos gentipos foi analisado por anlise mtodo pairgroup no ponderada (UPGMA), e o
resultado de agregados anlise foi demonstrada como um dendrograma. Depois de sequenciar o produto,
mtodo de PCR-Neighbor juntar (NJ), o mtodo de Parcimnia (PA) e um algoritmo de mxima verossimilhana
(ML) foram aplicados anlise de cluster. Os resultados foram expressos como tambm dendrograma.
RESULTADOS E DISCUSSO
As sequncias de rDNA 18S, ITS, e cpDNA trnL e trnL-trnF intergnica espaador foram determinadas e, em
seguida, processada por algoritmos PA, NJ, e ML para a construo de dendrogramas. O dendrograma de 18S
ADNr produzido pelo mtodo de PA indicada alta similaridade destes goiabeira (Figura 1). Nove goiabas no
cultivadas e 3 cultivares comerciais foram escolhidos para anlise de cluster. Trs cultivares foram agrupados em
um cluster e eles tambm foram agrupados por outras pequenas cultivadas em outro cluster com respectivas
taxas de recorrncia de 100% e 61%. As sequncias de rDNA ITS e cpDNA trnL e trnL-trnF intergnico espaador
tambm foram determinados e analisados usando o PA, NJ, e ML. Os dendrogramas de estas duas regies foram
construdos e exibida baixo grau de discriminao (dados no mostrados). Ele sugeriu que 18S rDNA e suas suas
regies, de goiaba no eram adequados para intra-espcies de anlise filogentica, devido s suas sequncias de
DNA altamente conservadas. Alm disso, cpDNA trnL e trnL-trnF intergnico espaador, que pertence regio de
no-codificantes e so herdadas atravs da ligao materna, produzindo, assim, baixo grau de discriminao.

Para melhorar o polimorfismo de gentipos de goiaba , dez iniciadores de 10 - meros foram utilizados para
amplificao de ADN . Foram selecionados apenas quatro iniciadores ( OPB17 , OPG6 , OPY15 e OPY18 ) (10) para

o fingerprinting . Uma vez que a amplificao dirigida por estes quatro iniciadores produziu polimorfismo
significativa e produziu um total de 82 padres RAPD polimrficas como mostrado na Figura 2. matriz de
similaridade gentica (Tabela 4) foi gerada usando NTSYS -pc com base nas pontuaes marcadas dos padres
RAPD polimrficas onde 1 ou 0 foi designado para a banda presente ou ausente. Mostra-se na matriz de
similaridade gentica que a maior similaridade gentica de 87 % entre Chungshin goiaba e Jiafeng goiaba, eo
mnimo que de 33 % entre Sam Tom goiaba , goiaba vermelha e goiaba coletadas de Gangkau , Hualien. A
similaridade gentica entre goiabas no cultivadas ou cultivares comerciais maior do que entre as cultivares no
cultivadas e comerciais.
Trinta e dois gentipos no dendrograma foram distinguidos e divididos em dois grupos principais, como mostrado
na Figura 3, em que as suas origens com base na localizao geogrfica dos diferentes gentipos so indicados.
Inculto goiabas coletadas de tribos indgenas foram agrupados em conjunto G1, exceto para a goiaba coletados a
partir da tribo de Qinhe, Kaohsiung. mais comercial cultivares foram agrupadas em conjunto G2. Pobre
reprodutibilidade de marcadores RAPD pode explicar excluso de Qinhe goiaba do G1 cluster. De acordo com Dai
et al. (15), a discriminao de Lilium formosanum e L. longiflorum poderia ser conseguida utilizando quatro
iniciadores de 10-mer, ou seja OPB17, OPG6, OPY15 e OPY18, com elevada reprodutibilidade. Seu resultado
demonstrou que quatro oligonucleotdeos arbitrria 10-meros poderia dirigir a produo de 86 bandas
reprodutveis e observou-se mais de 80% polimorfismo. Neste estudo, duas cultivares comerciais cultivadas em
alta altitude de Sam Tom e Prncipe, frica Austral e foram usados como grupos de referncia. O seu estatuto de
agrupamento, mesmo que as goiabas da tribo Qinhe amostrados de alta altitude superior a 700 m na regio
montanhosa de Kaohsiung, foi excludo do G1 e G2. Isso pode indicar que RAPD til para diferenciar as amostras
de diferentes reas geogrficas ou vrios climas.

Tradicionalmente , vermelho - carne, de polpa branca e cultivares comerciais foram diferenciados em tamanho de
folhas, cor de ramos e flores, a forma de frutas , ea altura das rvores. Ao se comparar os fentipos de todas as
goiabeiras , cultivares comerciais tendem a ter folhas com mais e mais espessas e frutos maiores . superfcie
spera de folhas , baixa altura de planta, pele cor marrom escuro do caule e ramos , e carne de espessura de
frutas so as principais caractersticas de cultivares comerciais . Ambos goiabeiras red- e branco de carne so

altos , e eles podem ser distinguidos pelos frutos , forma redonda para a carne vermelha de goiaba e frutas em
forma de pra de branco - carne goiaba.
Agrupamento primitiva de 32 cultivares de goiabeira pelo seu fentipo semelhante ao dendrograma baseado
em polimorfismo RAPD . No grupo G1 , o subgrupo G1- I e G1 -II foram identificadas, grosso modo por de brancoou vermelho - carne. No subgrupo G1- II, goiabas de carne vermelha foram agrupados em qualquer G1- II-a ou G1
II -b . Obviamente , vermelho -f lesh goiaba no G1- II-a foram recolhidas das tribos indgenas no norte de Taiwan ,
e que em G1 -II- b pertenciam s tribos no sul de Taiwan . Portanto , a latitude de crescimento e do clima pode
causar a diferenciao de G1 - II - A e II - G1 - b .

As goiabas de Laiyi , Pingtung tribo e Renmei , Kaohsiung estavam estreitamente agrupados como a sua forma de
frutas , o tamanho das folhas e cores de ramos so muito semelhantes . Alm disso, as goiabas de Gangkau ,
Pingtung e Manchou , Pingtung foram no mesmo cluster , devido estreita proximidade dessas duas tribos. A
maioria das goiabas no G1- II-a crescer a uma altitude mais elevada em comparao com goiabas em G1 -II- b .
Quanto ao subgrupo G1 -I goiaba foram coletadas de tribos de altitude superior a 250 m, tal como Hongye &
Jiafeng , Taitung , Chunghsing & Shilin , Miaoli e Tawan , Taoyuan ou de outra rea , como Gangkao , Hualien e
Saijia , Pingtung . Todos eles pertencem ao branco - carne goiaba e compartilhar gentipos similares.
Os marcadores moleculares tm sido utilizadas como uma ferramenta para investigar a diversidade do
germoplasma de plantas recentemente . padres de bandas pode ser convertida em dados informativos para
anlises pedigree . A desvantagem do mtodo de RAPD a reprodutibilidade na amplificao . Neste estudo , as
reaces de PCR foram realizadas em condies ptimas e fragmentos de amplificao informativos foram
obtidos com elevada reprodutibilidade . anlise de RAPD eficiente e preciso para a
investigao da distribuio de comercial , vermelho - carne, de polpa branca goiaba ou goiabas no cultivadas . A
anlise de RAPD til na impresso digital de cada amostra de goiaba. As localizaes geogrficas , altitude de
crescimento , e climas podem contribuir a RAPD polimrficas da goiabeira em Taiwan. Acredita-se este resultado
benfico para a investigao sobre a funcionalidade de goiaba como remdios tradicionais.