TP 7

CLOROPLASTOS

Grupo 7
Aranguren Paloma, Malamud Florencia, Cavallotti Gomez Alina

Tp: 6
Fecha: 02/07/15

Resumen:

En este TP aislamos cloroplastos de hojas de espinaca para verificar que eran

fotosintticamente activos mediante una reaccin de Hill. A esos mismos
cloroplastos los expusimos a distintos tratamientos (detergentes, iluminacin
con diferentes longitudes de onda) para evaluar cmo era su actividad
fotosinttica. Adems los visualizamos en un microscopio.

Introduccin:
Los cloroplastos son los orgnulos celulares delimitados por una bicapa
lipdica que en organismos eucariontes fotosintetizadores se ocupan de
la fotosntesis.
La fotosntesis es utilizada para transformar el CO (dixido de carbono) de la
atmosfera en hidratos de carbono. Adems, tambin es usada para reducir el
sulfato y el nitrato. La fotosntesis ms abundante es la oxignica en la cual se
consumen HO, CO y luz para generar hidratos de carbono y O. Este tipo de
fotosntesis es llevada a cabo por plantas, algas y cianobacterias.
Durante la fase lumnica de la fotosntesis, la energa lumnica que absorbe la
clorofila excita a los electrones externos de la molcula, los cuales pueden
pasar a otra molcula adyacente (separacin de cargas), y producen una
especie de corriente elctrica (transporte de electrones) en el interior del
cloroplasto a travs de la cadena de transporte de electrones. La energa
(procedente de la luz) de los electrones que se transportan es empleada
indirectamente en la sntesis de ATP mediante la fotofosforilacin, y
directamente en la sntesis de NADPH (el NADP recibe los electrones
procedentes del agua, al final de la cadena de transporte y se reduce a
NADPH).
Una manera sencilla de evaluar la actividad fotosinttica de los cloroplastos en
el laboratorio consiste en agregar un aceptor de electrones sinttico, cuya
reduccin sea simple de revelarse por un cambio de color. En este TP
utilizamos DCPIP el cual cambia de color azul (oxidado) a incoloro (reducido).A
esta transferencia de electrones mediada por la luz desde la molcula de agua
hacia el DCPIP se la llama Reaccin de Hill.

Objetivos:
Observa la actividad fotosinttica de los cloroplastos extrados de hojas de
espinaca y visualizarlos completamente bajo el microscopio. Y poner a prueba
su capacidad fotosinttica, cambindole la longitu de onda y/o bajo l efecto de
detergentes

Procedimiento Experimental
1) Aislar cloroplastos por mtodo subcelular

Lavar y cortar hojas de espinaca

Licuar
Filtrar
Centrifugar
Resuspender pellet en 2 ml de BH10
Buffer de hidrogenacin (el nmero corresponde a la
Armar un gradiente discontinuo de BH
concentracin de sacarosa).

El gradiente se forma debido a

la diferencia de densidad entre
los distintos buffers.
BH20
BH4
0
BH60

Sembrar la suspensin de cloroplastos al tope del gradiente (esta

suspensin contiene otros componentes de la clula adems de
cloroplastos)

Centrifugar: en este paso, los distintos componentes se ubicarn en el

lugar correspondiente a su densidad

cloroplastos

ncleos

Retirar los cloroplastos del gradiente con pipeta Pasteur y pasarlos a un tubo,
dejndolo en hielo.

2) Verificacin de actividad fotosinttica

Preparar 6 tubos con los siguientes reactivos: (hacer cada tubo por duplicado)

Tubo 1:
-

BH10 4ml
Suspensin de cloroplastos 5 gotas

Tubo 2:
-

BH10 3 ml
DCPIP 1 ml: aceptor de electrones artificial de color azul cuando est oxidado, el cual
se torna incoloro cuando se reduce (efecto acromtico)

Tubo 3:
-

BH10 3 ml
DCPIP 1ml
Suspensin de clorplastos 5 gotas
Mezclar agitando suavemente y colocar una serie de duplicados en la
oscuridad y otra bajo luz blanca
Medir el tiempo necesario para llegar al efecto acromtico de cada tubo
Tratamientos:
1) Iluminacin a distintas longitudes de onda
Preparar 4 tubos conteniendo:
3

- 3 ml de BH10
- 1 ml de DCPIP
- 5 gotas de cloroplastos
Inmediatamente, iluminar a cada tubo con distintas longitudes
de onda:
- Luz blanca
- Luz azul
- Luz verde
- Luz roja
Medir el tiempo que tarda cada tubo en llegar al efecto
acromtico

2) Efecto de los detergentes

Preparar 7 tubos conteniendo:
Tubo
BH10

1
3 ml

2
3 ml

3
3 ml

4
3 ml

5
3 ml

6
3 ml

7
3 ml

DCPIP

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

SDS

5 l

50 l

200 l

Triton X100

5 l

50 l

200 l

Mezclar suavemente, agregar 5 gotas de cloroplastos a cada

tubo y volver a mezclar
Incubar bajo luz blanca
Medir el tiempo que necesita cada tubo para llegar al efecto
acromtico

Resultados
Procedimiento estndar:
4

Luego de este procedimiento, en los tubos expuestos a luz blanca pudimos

observar que en los tubos 1 y 2 no mostraron ningn cambio (esto es debido a
que eran tubos control). Por otro lado, el tubo 3 pas de color verde oscuro a
verde claro en un tiempo de aproximadamente 3 minutos. En los tubos
colocados en la oscuridad no se observ ningn cambio.

Fig 1: Comparacin de los tubos expuestos a luz con aquellos que fueron
tratados en oscuridad
L= expuesto a luz
O= tubos tratados en oscuridad

Tratamiento de iluminacin a distintas longitudes de onda:

Logramos observar que, mientras que los tubos expuestos a luz blanca
obtuvieron el mismo resultado que en el procedimiento estndar, los expuestos
a luz roja y azul tardaron ms tiempo en lograr el efecto acromtico. El tubo
expuesto a luz verde no observamos ningn cambio de color.
Tratamiento con detergentes:
Observamos que el tubo sin detergente (tubo 1) se obtiene el mismo resultado
que en el procedimiento estndar. El tubo 2 logr un cambio de color un poco
menor que el 1, mientras que el del 3 y el 4 fue un cambio mucho menor (casi
no hay). Por ltimo, observamos que los tubos 5 y 6 tienen un cambio de color
levemente menor que el 1, mientras que el cambio de color del tubo 7 es
mucho menor (casi no hay).
En comparacin, los tubos con SDS presentan un cambio de color mucho
menor que los tubos con igual concentracin de Tritn X-100.

Grfico 1: Porcentaje de cambio de color correspondiente a

cada tubo

Observacin de cloroplastos en el microscopio:

Cuando colocamos los cloroplastos extrados y diluidos en el microscopio,
pudimos verificar que estos eran viables para el procedimiento realizado, ya
que se observaban en su conformacin total y no daados.

Conclusin y discusin:
Lo primero que podemos concluir de nuestro experimento es que, para realizar
la fotosntesis las plantas necesitan de luz. Como vimos en los resultados DCPIP
cambia de color (de azul, oxidado a incoloro, reducido) solo cuando es
expuesto a luz. Adems analizando las clases tericas la fase oscura de la
fotosntesis es dependiente de la fase lumnica. Por ende, aunque en nuestro
experimento solo medimos el poder de oxidacin y no la formacin de ATP,
sabemos que la fase oscura ser intil sin pasar previamente por la lumnica.
Los controles negativos nos garantizaron:

Los cloroplastos son los responsables de la oxidacin (tubo sin

cloroplastos). Ya que el DCPIP quedo de color azul
El tubo final al cual el DCPIP estaba completamente reducido. Ya que los
cloroplastos son de color verde, una vez incoloro el DCPIP el tubo se
vera del verde exacto al de los cloroplastos.

Lo segundo que podemos deducir es que para realizar la fotosntesis se

necesita una longitud de onda de entre 400-450 o 600-700. Ya que cuando
expusimos a los tubos a luces rojas y azul (respectivamente) la reduccin del
aceptor de electrones DCPIP fue exitosa. En cambio cuando fue expuesta a luz
verde no hubo actividad alguna, lo cual refleja que los cloroplastos no pueden
trabajar con esa longitud de onda. Eso es debido a que no absorben esa luz

sino que la reflejan. A su vez la luz blanca (la cual absorbe todos los colores)
tambin es viable para la fotosntesis.
En los experimentos en base a detergentes de los grupos 9 y 10. Razonamos
que el cloroplastos tiene gran cantidad de protenas (como las porinas) y
lpidos en su membrana. Con respecto a los resultados observamos que el SDS,
el cual es un detergente muy agresivo, afecta ms a la actividad fotosinttica
que el Tritn que solo desnaturalizara protenas. Lo que puede inferir que los
cloroplastos o los tilacoides estn compuestos por una gran cantidad de lpidos.
Al desestabilizar a los cloroplastos la actividad fotosinttica se ve afectada y a
mayor concentracin de los detergentes, menor su actividad. Adems,
tambin sabemos que la membrana es fundamental para la formacin de ATP
debido al bombeo de protones. Al romperse la membrana, este mecanismo no
puede suceder.

Respuestas:
3) A) La actividad fotosinttica se realizara de todas formas ya que
para crear glucosa el cloroplasto solo necesita de CO2 + H20 y no de
02.
B) Al ser un desacoplante quedara dividido entre fotosistema 1 y 2,
trabajando individualmente. Entonces no se formara un gradiente
electroqumico, ya que el B6F no bombeara protones, ni tampoco se
formara ATP. Aunque si ser posible forma NADH.
C) Al inhibir el fotosistema 1 por completo. No obtendramos producto
alguno. Se veran los citocromos del fotosistema 2 en un estado de
excitacin constante. Lo nico que nos puede llegar a dar un
producto es la fotolisis del agua, la cual nos otorga H2 y O, sin
contar los protones que quedaran en el estroma.