Introduccin a la Bioenergtica

Cundo tiene lugar una reaccin qumica? (1)

- Las reacciones que tienen lugar espontneamente suelen ser
exotrmicas, esto es, con desprendimiento de calor.

- El calor que se desprende o absorbe en una reaccin a presin

constante recibe el nombre de Entalpa (DH). Las reacciones en
las que se desprende calor son exotrmicas y por convencin, la
entalpa se supone negativa: DH < 0
H = H productos- H sustratos
- Sin embargo, hay reacciones endotrmicas que cursan espontneamente, DH > 0; por ejemplo, la disolucin de sulfato amnico
en agua.

Cundo tiene lugar una reaccin qumica? (2)

- La disolucin de sulfato amnico en agua es un proceso por
el cual se pasa de un sistema altamente ordenado, cual es el
estado cristalino, a otro de mucho mayor desorden molecular.
- La funcin termodinmica que mide el desorden de un sistema
recibe el nombre de Entropa (DS). Puede observarse que muchas
reacciones que cursan espontneamente lo hacen con incremento
positivo de entropa: DS > 0.
- Sin embargo, hay procesos espontneos que cursan con disminucin de entropa, p.e.: la solidificacin del agua a 0C.

Cundo tiene lugar una reaccin qumica? (3)

- Ni la entropa ni la entalpa valen como criterio nico para
definir la espontaneidad de una reaccin.
- Existe otra funcin termodinmica de estado que agrupa a
las dos en procesos a presin constante, la Energa Libre de
Gibbs, que se define as:

DG = DH - TDS
- La energa libre de Gibbs es un criterio vlido para verificar
la espontaneidad de una reaccin. Pueden cursar espontneamente aquellos procesos en los que se desprende energa libre,
exergnicos, (DG < 0). No pueden hacerlo, sin embargo,
aquellos procesos en los que se absorbe energa libre,
endergnicos (DG > 0)

Sea un sistema

La reaccin cursar de izquierda a derecha cuando las concentraciones de A y B sean tales que la energa libre del sistema sea
negativa. La energa libre del sistema viene dada por:
DG =

DG0

+ RT ln

[B]

[A]

Donde DG0 es la Energa Libre Standard de la reaccin: la energa

libre del sistema con los reactivos a concentracin unidad, en condiciones STP. Hay tablas que nos dan la DG0 para toda reaccin. A
partir de las mismas podemos calcular si un proceso puede tener
lugar espontneamente o no en unas determinadas condiciones.

Ejemplo:
Calcular la energa libre del proceso de descomposicin del
ster Glucosa-6-fosfato a Glucosa y fosfato inorgnico en las
condiciones intracelulares, que son:
Temperatura: 37 C, equivalentes a 310 K
[Glucosa-6-fosfato], 1 mM
[Glucosa], 0.01 mM
[fosfato], 10 mM
La Energa Libre Standard de la reaccin es de -3250 cal/mol
La reaccin es:
G6P + H2O

G + Pi

La expresin que nos da la Energa Libre es:

DG =

DG0

+ RT ln

[Glucosa] [Fosfato]
[Glucosa-6-fosfato]

(No se tiene en cuenta el agua porque su concentracin se

considera constante)

Sustituyendo, obtenemos:
DG = -3250 + 1.98*310*2.303* log

10-5*10-3

= -8900 cal/mol

10-2
Por lo tanto, en las condiciones intracelulares el
proceso puede tener lugar espontneamente.

Relacionado con el anterior, tendramos el siguiente problema:

Cul sera la concentracin mnima necesaria de glucosa para que,

siendo el resto de las condiciones iguales a las del ejemplo anterior,
en la clula tuviera lugar la formacin de ster por reversin de la
hidrlisis?
Esta concentracin sera la que diera lugar a un valor de 0 para
DG en el ejemplo anterior. As, llamando X a la conc. de glucosa,
-2
X*10
0 = -3250 + 1.98*310*2.303*log
10-3

Despejando log X obtenemos log X = 1.3

X = antilog (1.3) = 20 M

La expresin que nos da la energa libre de un proceso tiene

otra importante derivacin. Para la reaccin

Esta expresin es:

DG =

DG0

+ RT ln

[B]
[A]

En el equilibrio, DG = 0; por tanto,

0=
[Beq]
Pero
= Keq
[Aeq]

DG0

[Beq]
+ RT ln [A ]
eq

Por tanto, DG0 = -RT ln Keq

Esquema energtico del metabolismo

Estructuras complejas

Catabolismo

DG

Estructuras simples

Anabolismo

En general, podemos decir:

Reacciones catablicas: DG < 0
Reacciones anablicas: DG > 0
Supongamos una reaccin anablica mediante la cual se forma
un enlace qumico entre A y B; esquemticamente,

A+B

A-B

(DG > 0)

La reaccin no puede tener lugar espontneamente. Cmo

puede entonces tener lugar en el metabolismo?

Lo que ocurre en el metabolismo es que las reacciones

endergnicas (DG > 0) se acoplan a reacciones exergnicas
(DG < 0) de manera que :

1. La energa desprendida en una de las reacciones es absorbida

por la otra.
2. La suma total de energas libres de una y otra reaccin da una
DG < 0, por lo que el proceso en conjunto tiene lugar espontneamente.

As, la reaccin

A+B

A-B

(DG1 > 0)

Se acopla a

X-Y + H2O
Siendo

X + Y (DG2 < 0)

|DG2 | > |DG1|

Dando lugar a una reaccin global

A + B + X-Y + H2O

A-B + X + Y

(DG < 0)

El tipo de reaccin

X-Y + H2O

X + Y (DG2 < 0)

Que tiene lugar en los seres vivos para acoplarse a procesos endergnicos es, en la mayora de los casos, la hidrlisis de anhdridos
de cido, y particularmente, la hidrlisis de polifosfatos :

R O P O P O- + H2O
O-

O-

R O P OH + HO P OO-

O-

El polifosfato mayoritario en las reacciones de acoplamiento

energtico es el ATP, 5-Adenosina trifosfato:

NH2
N
O
-

O P O P O P O CH2
-

OH

OH

De esta manera, los procesos catablicos productores de energa

generan ATP, que se emplear en todas aquellas reacciones endergnicas en las que sea requerido.

En general, el ATP se produce de dos maneras:

1. Por fosforilacin a nivel de substrato
(procesos anaerbicos, fermentativos)
Por ejemplo: La Glicolisis
2. Por fosforilacin oxidativa
(procesos aerbicos, oxidativos)
Por ejemplo: Ciclo de Krebs, - b oxidacin, etc.

Los dos enlaces anhdrido del polifosfato del ATP son el ejemplo
de configuraciones de alta energa de hidrlisis:
O

O P O P O P O R
O-

O-

O-

Existen otras configuraciones de alta energa, por ejemplo:

COO- O
C O P OCH2

O-

Fosfoenolpiruvato

CH3

O
C CH2
-

N C NH P ONH

Fosfocreatina

O-

Otras configuraciones de alta energa de hidrlisis

H2N C O P O-

O
R C

S CoA

O-

Carbamilfosfato

Tiosteres de Coenzima A

Consideremos ahora la reaccin de degradacin aerbica de la glucosa:

C6H12O6 + 6O2

6CO2 + 6H2O

DG0 = -684 kcal/mol

Segn lo hasta ahora expuesto, esta reaccin es fuertemente

exergnica, por lo que debera cursar espontneamente.

Sin embargo, la glucosa en presencia de oxgeno es perfectamente

estable y no entra espontneamente en combustin.

Ello es debido a que los reactivos han de superar una barrera

energtica, la Energa de Activacin:

Energa

Ea

G + O2
DG0

CO2 + H2O

Coordenada
de reaccin

La barrera energtica que separa al

papel del CO2 es de 451F o 233C. A
esta temperatura todas las molculas
del
papel
se
transforman
espontneamente a producto.
A temperatura ambiente existe una
amplia distribucin de energa en las
molculas de papel y slo algunas de
ellas alcanzan a romper la barrera
energtica lo que hace que el papel se
vaya destruyendo a muy baja
velocidad pero en forma constante.
(Todos los papeles con el tiempo se
tornan amarillos, luego se convertirn
en polvo).
Un catalizador como el cido
sulfrico har que la reaccin sea
inmediata.

Introduccin a la Enzimologa

Catlisis

Ea
Ea
DG

DG

Reaccin
no catalizada

Reaccin
catalizada

Enzima: Protena dotada de actividad cataltica

- Enzimas proteolticas
- Desnaturalizacin de enzimas
- Purificacin de enzimas
- Sntesis completa de una enzima

A partir de 1982, se sabe que no todas las enzimas son

protenas; existen molculas de RNA con actividad cataltica, las llamadas ribozimas

Las enzimas cumplen su papel cataltico gracias a:

- Fijacin estereoqumicamente complementaria
del substrato

- Transformacin cataltica del mismo

En ambas funciones participan:
- Cadenas laterales de los aminocidos
- Grupos o molculas no proteicas:
- Grupos prostticos
- Iones metlicos
- Cofactores

En la catlisis qumica se distingue entre:

- Catlisis homognea, cuando catalizador y reactivos

estn en la misma fase fsicoqumica: Por ejemplo, la
hidrlisis cida de la sacarosa.
- Catlisis heterognea, cuando catalizador y reactivos
estn en distinta fase fsicoqumica: por ejemplo, la
reaccin en fase gaseosa entre N2 y H2 para formar amonaco
(proceso Haber), que es catalizada por metales (slidos)
La catlisis enzimtica tiene caractersticas de ambas

Los siguientes hechos:

- Especificidad de la reaccin enzimtica
- Carcter heterogneo de la catlisis enzimtica

Nos llevan a postular la existencia de un Centro Activo en

la molcula de enzima, capaz de:
- Fijar especficamente al substrato
- Transformarlo catalticamente.

Lisozima y su
substrato

Substrato: molcula(s) sobre la(s) que acta la enzima

Actividad enzimtica: velocidad a la que cursa la reaccin
enzimtica
Velocidad: variacin de la concentracin en la unidad
de tiempo
Unidades:
katal: moles.s-1
U.I.: mmoles.min-1 (a 25C)

La velocidad es directamente proporcional de la concentracin

de enzima; por tanto, la velocidad es una medida de la concentracin de enzima en una preparacin.

Activador: Agente que aumenta la actividad enzimtica

Inhibidor: Agente que disminuye la actividad enzimtica

Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima:

E+I

EI

Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:

E+I

Cofactor (Coenzima):
tomo, ion o molcula que participa en el proceso
cataltico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A travs de una fijacin muy fuerte a la protena y salen
sin ser modificados del ciclo cataltico
2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclo
cataltico y por lo general requieren otra enzima para volver
al estado original.

Aminocido

LAO

R CH COO- + O2 + H2O

Cetocido
R CO COO- + H2O2 + NH4+

NH3+

LAO: L-aminocido oxidasa: es una flavoprotena

Las flavoprotenas tienen un grupo prosttico flavnico,

que interviene en el proceso cataltico sin salir modificado
del mismo
O
H3C

H3C

NH

NH
N

L-Lactato

Piruvato
COOC O

COO-

LDH

HO C H

CH3

CH3
NADH + H+

NAD+

LDH: Lactato deshidrogenasa

Utiliza como cofactor NADH, el cual sale de la reaccin

oxidado a NAD+. La regeneracin a NADH requerira otra
enzima.

Los cofactores que estn unidos a la enzima en forma covalente

reciben el nombre de grupo prosttico.
Las enzimas unidas al su grupo prosttico se conocen como
HOLOENZIMAS, poseen actividad.

Las enzimas carentes de su grupo prosttico se conocen como

APOENZIMAS, y no presentan actividad.

Isoenzimas: formas moleculares distintas de una enzima dentro

del mismo organismo
Hexokinasa: Presenta, al menos, cuatro formas distintas
- Heptica
- Cerebral
- Muscular
- Eritrocitaria
Las isoenzimas representan formas que tienen que ver con
la diferenciacin celular, presentando distintas caractersticas
funcionales.

Especificidad de las enzimas, 1

Especificidad absoluta:

COOCH
CH
COOFumarato
(trans-)

H 2O

COOHO CH
CH2
COOL-Malato

Enzima:
Fumarato hidratasa
Especfica para el
ismero trans- por
un lado y para el
L- por otro.

Especificidad de las enzimas, 2

Especificidad de grupo:

R CO O R' + H2O

R COOH + HO R'
Esterasa

Las carboxilesterasas hidrolizan todo tipo de steres, independientemente de la naturaleza de R o R

Otras caractersticas de la accin enzimtica

Eficiencia cataltica
En ocasiones llega a ser enorme; con nmeros de recambio
del orden de 108 s-1
Las enzimas que han llegado a este lmite reciben el nombre
de Enzimas plenamente evolucionadas, ya que un incremento
en la actividad no tendra sentido al superar la velocidad de
difusin de los substratos.

Teoras de la accin enzimtica, 1

Modelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecfica,

de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.
Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera
insuficiente al no explicar algunos fenmenos de la inhibicin enzimtica, por ejemplo

Teoras de la accin enzimtica, 2

Modelo de Ajuste Inducido (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteracin
en su estructura por el hecho fsico de la unin.
Est mucho ms de acuerdo con todos los datos experimentales conocidos hasta el momento.

Teoras de la accin enzimtica, 3

La teora del Ajuste Inducido se ampla en la actualidad
definiendo la accin enzimtica como

Estabilizacin del Estado de Transicin

Segn lo cual, el Centro Activo enzimtico es en realidad

complementario no al substrato o al producto, sino al
estado de transicin entre ambos.

O
R C O R'

OR C O R'
O-

Substrato: un ster

Estado de transicin:
intermediario tetradrico,
inestable

O
R C O

HO R'

Productos

R P O R'
O-

Anlogo de Estado de Transicin

Derivado fosforilado, que no es substrato
de la reaccin, pero que por su analoga
estructural ocupa el centro activo de la
enzima e inhibe fuertemente a la reaccin

Clasificacin y nomenclatura de enzimas

Reacciones enzimticas

Nombre sistemtico:

Grupo transferido

ATP: hexosa fosfotransferasa

Donador

Aceptor

Grupo Subgrupo

Nmero sistemtico
Enzyme
Comission

EC 2.7.1.1

Nombre comn: Hexokinasa

Sub-subgrupo

Enzima

1. Oxidorreductasas
2. Transferasas

3. Hidrolasas
4. Liasas
5. Isomerasas

6. Ligasas

Clasificacin de enzimas:
Grupos

Cintica de las reacciones enzimticas

Concepto de velocidad inicial

[ ]

d[ ]
v = dt , t -> 0

Variables que influyen en la velocidad de una

reaccin enzimtica

1. Concentracin de enzima
2. Concentracin de substrato
3. pH
4. Temperatura
5. Efectores (Activadores e Inhibidores)

Efecto de la concentracin de enzima: relacin lineal

v

.
..

.
.
.

.
.

.
.
.

[E]

S
Una cintica lineal implica
un proceso regenerativo,
cclico

ES
E

EP

Ciclo cataltico
de una enzima

Efecto de la concentracin de substrato

.
.
.
.
.

.
.
[s]

Una cintica hiperblica implica un proceso saturante:

Hay un nmero limitado de sitios en la enzima

para fijar substrato; una vez que estn ocupados
todos, por mucho que aumente la concentracin
de substrato, la velocidad permanecer constante
tendiendo a un valor asinttico

E+S

k+1
k-1

ES

k+2

E+P

Descripcin dinmica de la catlisis enzimtica

E+S

k+1

ES

k+2

E+P

k-1
s = [S]
x = [ES]
e = [E]
e0 = [ES] + [E] = x + e

ds/dt = - k+1es + k-1x

de/dt = - k+1es + (k-1 + k+2) x
dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x
dp/dt = k+2 x
e0 = e + x

El sistema de ecuaciones diferenciales que describe la dinmica

del sistema

E+S

k+1

ES

k+2

E+P

k-1
No admite solucin analtica. Para describirlo recurrimos a:
- Simulaciones numricas
- Hiptesis que lo simplifiquen

Simulacin numrica del sistema

E+S

k+1
k-1

ES

k+2

E+P

Hiptesis de Michaelis - Menten

E+S

k+1

ES

k+2

E+P

k-1
- La primera parte del mecanismo,

k+1

E+S

ES

k-1
Tiene lugar mucho ms rpidamente que la segunda:

ES

k+2

E+P

Hiptesis de
Michaelis-Menten

E S es e0 xs
Km

ES x
x

Equilibrio rpido

e0 s
x
Km s

v k2 x

k 2 e0 s
v
Km s

Vmax s
v
Km s

k2e0 Vmax

Hiptesis de estado estacionario

Segn veamos en la simulacin numrica, hay un tiempo

relativamente prolongado en el curso de la reaccin en el
que la variacin de complejo [ES] es prcticamente igual
a cero:

dx/dt = k+1es - (k-1 + k+2) x = 0

A partir de esta expresin podemos llegar a obtener una
expresin que nos da la velocidad para la concentracin
de substrato

dx
0 k 1es k 1 k 2 x
dt

k1es k1 e0 xs k1 k2 x
e0 s
e0 s
x

k 1 k 2
Km s
s
k 1

Vmax s
v
Km s

v k2 x

k2e0 Vmax

Hiptesis de
estado estacionario

Tanto con las suposiciones de Michaelis-Menten como con

Las de estado estacionario, llegamos a la ecuacin

v=

Vmaxs

Km + s

La nica diferencia radica en el significado de Km:

Km = k-1/k+1 en mecanismo de M.M.
Km = (k-1 + k+2)/k+1 en mecanismo de E.E.

Significado de la constante Km
1. Constante de equilibrio de disociacin del complejo ES
(en condiciones de equilibrio rpido)
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el substrato
(en condiciones de equilibrio rpido)

3. Mide la funcin de fijacin (en cond.de equilibrio rpido)

4. Concentracin de substrato para la que la velocidad se hace
igual a la mitad de la mxima (s0.5)

5. Se define para una pareja enzima-substrato

6. Se mide en unidades de concentracin

Significado de la constante Vmax = k+2 e0

1. Velocidad asinttica para s

2. Directamente proporcional a la concentracin de enzima

(hoy se prefiere caracterizar a la enzima por k+2)
3. Mide funcin de transformacin cataltica
4. Se expresa en unidades de velocidad

Representacin directa

Vmax

100

80

60

Vmx s
v
Km s

40

20

s
0
0

20

Km

40

60

80

100

Representacin recproca doble

(Lineweaver - Burk)
0.04

1/v
0.03

1/Vmax
-1/Km

0.02

1 Km 1 1

v Vmx s Vmx

0.01

0.00
-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

1/s

Efecto del pH
v

pH

Efecto del pH

1. Sobre la fijacin del substrato al centro activo:

- Grupos disociables de la enzima
- Grupos disociables del substrato

2. Sobre la transformacin cataltica del substrato

3. Sobre la estructura de la protena enzimtica

NH
-

H3N

COO

Arg

NH

CH2

CH

CH2
COO+

H3N

Lys
CH

Succinato y
centro activo de SDH
pH 7

NH
+

H 3N

COOH

NH

CH2

CH

CH2
COOH
+

H 3N
CH

Succinato y
centro activo de SDH,
pH 2

NH
C
COO-

H2N

NH

CH2

CH

CH2
COOH2N
CH
Succinato y
centro activo de SDH,
pH 13

Efecto de la temperatura
v

En el efecto de la temperatura hay dos componentes:

1. Aceleracin de la reaccin segn la ecuacin

de Arrhenius

k = A exp (-Ea/RT)
2. Desnaturalizacin trmica de la protena

Inhibicin enzimtica

Inhibidor:
Efector que hace disminuir la actividad enzimtica, a travs de
interacciones con el centro activo u otros centros especficos
(alostricos).
Esta definicin excluye todos aquellos agentes que inactivan a
la enzima a travs de desnaturalizacin de la molcula enzimtica
De esta forma, habr dos tipos de inhibidores:
I. Isostricos: ejercen su accin sobre el centro activo
II. Alostricos: ejercen su accin sobre otra parte de la
molcula, causando un cambio conformacional con
repercusin negativa en la actividad enzimtica.

Los inhibidores isostricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre,

con el complejo enzima-substrato o con ambos:
E+I

EI

ES + I

ESI

2. Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima:

E+I

Inhibicin reversible
(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre,
impidiendo la fijacin del substrato: Inhibicin Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo

haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la
fijacin del substrato a la enzima, pero s impide la accin
cataltica: Inhibicin No Competitiva
(c) El inhibidor se fija nicamente al complejo enzima-substrato
una vez formado, impidiendo la accin cataltica; este tipo
se conoce como Inhibicin Anticompetitiva

S
E

ES

E+P

I
Inhibicin
Competitiva

EI
Las fijaciones de substrato e inhibidor son
mutuamente exclusivas; el complejo EI no es productivo

S
E

ES

Inhibicin
No Competitiva

S
EI

E+P

ESI

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre E

y al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EI
ni el complejo ESI son productivos

S
E

ES

E+P

I
Inhibicin
Acompetitiva

ESI
El inhibidor slo puede fijarse al complejo ES;
el complejo ESI no es productivo

Inhibicin Competitiva
S
E

ES

E+P

I
EI

Se define una constante de

equilibrio de disociacin del
inhibidor:

[E] [I]
Ki =
[EI]

Caractersticas:
- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas
- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibicin
- Por lo general, el inhibidor competitivo es un anlogo qumico del
substrato.
- El inhibidor es tan especfico como el substrato

En condiciones de equilibrio rpido, llamando y a la concentracin

del complejo EI, para la inhibicin competitiva obtenemos el sistema de ecuaciones

(e0 x y ) s
Km
x
(e0 x y )i
Ki
y
Que resuelto para x nos da

e0 s
x

i
Km 1 s
Ki

De donde

Vmx s
v

i
Km 1 s
Ki

Por tanto, en la inhibicin competitiva,

1. El efecto cintico del inhibidor es el aumento aparente de la

Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)
2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy
altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor
3. Cuanto ms pequeo sea el valor de Ki mayor ser la potencia
del inhibidor competitivo.

Representacin directa
Inhibicin competitiva

120

100

80

60

40

20

s
0
0

20

40

60

80

100

120

Inhibicin competitiva - Representacin recproca doble

0.07

1/v

0.06

0.05

0.04

1/Vmax
0.03

0.02

-1/Km
0.01

1/s
0.00
-0.3

-0.2

-0.1

0.0

0.1

0.2

-1/(Km(1 + i/Ki))

0.3

0.4

0.5

0.6

Inhibidores
competitivos

Succinato deshidrogenasa
COO-

FAD

FADH2

COO-

CH2

CH

CH2

CH

COOSuccinato

SDH

COOCH2
COOMalonato

COO-

COO-

Fumarato

C O
CH2
COOOxalacetato

COOInhibidores competitivos
como nalogos estructurales
del substrato

CH2
CH2
COOSuccinato
COOC O
CH2
COO-

Oxalacetato

O
H2N

C
O-

H2N

S NH2
O

4-aminobenzoato

4-aminobenceno
sulfonamida

H 2N

N
H

CO OH

OH

CH2

c. Flico

CH2
C NH C H
O

COOn

H 2N

N
CH3

CO OH
CH2

Methotrexate

CH2
C NH C H
O

COOn

O
CH3

HN
O

Anlogos de base

NH

Timina

O
Br

HN
O

NH

5-Bromouracilo

NH2

Anlogos de
nuclesido

O
HOCH2

Citidina
OH

OH

NH2
O
HOCH2

N
OH

OH

Citosina
arabinsido

Un paso ms all en el desarrollo de inhibidores potentes

es el concepto de Anlogo de Estado de Transicin (AET)

- El inhibidor no es estrictamente anlogo del substrato,

sino del Estado de Transicin de la reaccin.
- La afinidad de las enzimas por los AET es enorme, del
orden nM o pM, con lo que la fijacin es tan fuerte que
puede considerarse irreversible

O
O2N

N+ CH3

H3C
N+ CH3

OH

O2N

HO

O-

O
P

Estado de transicin

CH3

O
O2N

Susbtrato

CH3

O-

O2N

H3C

H3C
O

N+ CH3

Productos

CH3

H3C
N+ CH3
CH3

Anlogo de
estado de transicin

Estado de
transicin

Substrato

Anlogo de
estado de transicin

Aspartato
transcarbamilasa

COOH 2C
-

NH2
NH

OOC

OO

O P O-

Estado de
transicin

O-

COOO

H 2C
-

NH
OOC

CH2
O P OO-

Anlogo de
estado de transicin:
N-fosfonoacetil L-aspartato
(PALA)

Angiotensingeno
Hipotensin,
hipovolemia,
ortostatismo

Renina
Angiotensina I
DRVYIHPFHL

Enzima convertidora
de Angiotensina, ECA

HL

Angiotensina II
DRVYIHPF

Aumento de la presin arterial

Anlogos de Estado de Transicin: Captopril

R
HN

CH COO-

C O
R'

C H
NH

HO C
C
O

Zn2+
Estado de transicin
de la ECA

CH COO-

C O
H 3C C H
H C
H
S

Zn2+

Captopril
Enalapril
Ramipril

Inhibicin Irreversible
- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo
qumico de la enzima, modificndola covalentemente
- Su accin no se describe por una constante de equilibrio Ki,
sino por una constante de velocidad ki:

E+I

- A diferencia de la inhibicin reversible, el efecto de los

inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuacin
del inhibidor.
- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
txicos.

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfricos
3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Reactivos de grupos -SH, 1

(a) Agentes alquilantes

Yodoacetato

ICH2 COO-

E SH

IH

E S CH2 COOO

(b) Compuestos insaturados

E

E SH

N CH2 CH3

O
N CH2 CH3

N-Etil maleimida (NEM)

O

Reactivos de grupos -SH, 2

(c) Formadores de mercptidos
HOHg

E SH

COO-

p-Hidroximercuribenzoato

E S Hg

COO-

(d) Oxidantes
Promueven la oxidacin de dos tioles a un disulfuro

Organofosfricos

Ser CH CH2

H3C

OH

Ser CH CH2
H3 C

CH3
CH

P O

CH
H3 C
CH3

DFP:
diisopropil
fluorofosfato

CH3
CH

O P O
CH
H3C
CH3

- Actan sobre enzimas sernicas

- nicamente sobre la Ser activa
- Insecticidas: Parathion, Malathion
- Inhibidores de la Acetilcolinesterasa
- Neurogases

Ligandos de coordinacin de metales

Es el caso del ion cianuro, CNSe fija con gran afinidad a la sexta posicin de coordinacin
del Fe hemnico, impidiendo toda modificacin posterior.

Por ello acta sobre sistemas de Fe hemnico con la sexta

posicin de coordinacin libre, como la citocromo oxidasa,
de lo que deriva su elevadsima toxicidad

Substratos suicidas
(Inhibidores activados enzimticamente)
- Se trata de molculas que se unen al centro activo de manera
especfica, igual que el substrato o los inhibidores competitivos

- Una vez unidos al centro activo, la enzima transforma la

molcula en una especie qumica muy reactiva que modifica
covalentemente a la enzima, inactivndola
- Tienen por tanto (a) la especificidad del inhibidor competitivo
y (b) la potencia de los inhibidores irreversibles

Modo de accin de los inhibidores suicidas

E+I

EI

EI*

E + I*

1. El inhibidor se fija a la enzima igual que el substrato o un

inhibidor competitivo convencional

2. La accin cataltica de la enzima convierte al inhibidor I

en una especie altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivndola
de forma definitiva al igual que un inhibidor irreversible.

Ejemplos de inhibidores suicidas, 1

- Sistema de la b-lactamasa bacteriana
La utilizacin masiva de antibiticos b-lactmicos (penicilinas,
sus derivados semisintticos y cefalosporinas) ha conducido a
la aparicin de resistencias a los mismos.

Los microorganismos resistentes a estos antibiticos lo son por

producir una enzima, la b-lactamasa, que inactiva a los antibiticos b-lactmicos.

Penicilina (activa)
S

R CO NH

CH3
CH3

N
O

COO-

b-Lactamasa

R CO NH
O C HN
O-

CH3
CH3

COO-

c.peniciloico (inactivo)

Muy a menudo los preparados de penicilinas o penicilinas

semisintticas se formulan aadiendo un inhibidor suicida
de la b-lactamasa, el cido clavulnico
O

CH2OH
C

b-Lactamasa

C
O-

HN

CH2OH
C
H

COO

COO-

c.clavulnico

C
CH CH2
Ser

HN

CH2OH
C
H

COO-

Esta molcula
reacciona con la
serina activa de la
b-lactamasa,
produciendo su
inactivacin

Ejemplos de inhibidores suicidas, 2

- Sistema de la monoamino oxidasa (MAO) cerebral
Los estados depresivos, en general, estn relacionados con un
descenso en la concentracin de neurotransmisores adrenrgicos
(dopamina, noradrenalina, etc.) en determinadas regiones del
cerebro.
Una de las enzimas encargadas de la degradacin de estos
neurotransmisores es la monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4).
Por tanto, la inhibicin de la monoamino oxidasa se emplea como
teraputica de los estados depresivos. Se han desarrollado muchos
inhibidores suicidas de la MAO

Noradrenalina
HO
HO

CHOH CH2 NH2

O2 + H2O

Monoamino
oxidasa
NH3 + H2O2
HO
HO

CHOH CHO

Dihidroxifenilglicol

La MAO es una flavoprotena:

tiene un grupo prosttico
flavnico (FAD) fundamental
para la catlisis. Los inhibidores
suicidas de la MAO inactivan
al cofactor FAD.

O
H3C

E S H2C

NH
N

Flavina

Inhibicin suicida de la
MAO mediante Pargilina
Selegilina
(antiparkinsoniano
y antidepresivo)

N,N dimetil
propargilamina
(pargilina)

CH3

HC C CH N

CH3

H3C

N+

CH CH

H3C

CH

H3C

E S H2C

N
R

Flavina modificada

O
NH
NH

Cofactores enzimticos (Coenzimas)

Cofactor (Coenzima):
tomo, ion o molcula que participa en el proceso
cataltico sin ser enzima ni substrato.

Los cofactores participan de dos maneras distintas:

1. A travs de una fijacin muy fuerte a la protena y salen
sin ser modificados del ciclo cataltico
2. Como un segundo substrato; salen modificados del ciclo
cataltico y por lo general requieren otra enzima para volver
al estado original.

Los cofactores enzimticos suelen ser molculas complejas,

que nuestro organismo no puede sintetizar, por lo general.

Por esa razn muchos cofactores enzimticos deben ser, en

todo en parte, ingresados con la dieta; muchos de ellos son, por
lo tanto, vitaminas.
Ni todos los cofactores son vitamnicos ni todas las vitaminas
son cofactores enzimticos

Cofactores de naturaleza vitamnica; ejemplos

1. Hidrosolubles
Tiamina
Riboflavina
Piridoxal
Cobalamina
c.Ascrbico
Nicotinamida
c.Lipoico
c.Flico
c.Pantotnico

Tiamina pirofosfato
Flavinas: FAD, FMN
Piridoxal fosfato
Coenzimas cobamdicos
Ac. Ascrbico
NAD+, NADP+
Lipoamida
Coenzimas folnicos
Pantetenas (CoA, p.e.)

B1
B2
B6
B12
C
PP

2. Liposolubles
Naftoquinonas

g-Carboxilacin

Cofactores de naturaleza no vitamnica: ejemplos

Hemo
Complejos Fe-S
Quinonas
Glutatin
ATP
UTP
PAPS
S-AM
Carnitina

Hemoenzimas, citocromos
Ferredoxinas
Tr.electrnico mitocondrial y fotosinttico
Redox; transporte de aminocidos
Transf.de fosfato y/o de energa
Transf.de grupos glicosdicos
Transf.de grupos sulfato
Transf.de grupos metilo
Transportador de grupos acil-

Vitaminas que no forman parte de cofactores enzimticos

Liposolubles
Retinoides
Calciferoles
Tocoferoles

vit. A
vit. D
vit. E

Cofactores redox
Operan en procesos de transferencia electrnica, a veces
como aceptores, a veces como donadores.
- Cofactores piridnicos (NAD+, NADP+)
- Cofactores flavnicos
- Cofactores hemnicos
- Ferredoxinas
- Quinonas
- c. Ascrbico
- c. Lipoico
- Glutatin

CONH2
+
N

O
CH2
OH

OH

O
O-

NAD+

O P O P O CH2
O-

NH2
N

H
OH

OH

Nicotinamida - Ribosa - P - P - Ribosa - Adenina

CONH2
+
N

O
CH2
OH

OH
O

NADP+

O P O P O CH2
O-

NH2

O-

H
OH

O
-

O P O
O-

NAD+, NADP+
(Formas oxidadas)
CONH2
N

NADH, NADPH
(Formas reducidas)
H

CONH2

AH2

AH2 + NAD(P)+

A + H+

A + NAD(P)H + H+

Flavina (Isoaloxazina)
O

Riboflavina
(vit. B2)

H 3C

H 3C

NH
N

CH2
H C OH

Ribitol

H C OH
H C OH
CH2

O P OO-

FMN: Flavin mononucletido

(Riboflavin fosfato)

Fosfato

O
H 3C

H 3C

NH
N

CH2
H C OH
H C OH
H C OH
CH2

O P O P O CH2
-

NH2

H
H

FAD: Flavin Adenin Dinucletido

H
H

OH

OH

O
H 3C
H 3C

N
N

NH
N

Forma oxidada

O
H 3C

H 3C

Semiquinona
(Radical libre)

NH
NH

O
H 3C
H 3C

NH
N

NH
NH

Forma reducida

CH2
H3C

H3C
N
-

OOC CH2

CH

CH2

CH3

Fe++ N
CH CH2

H2C
CH2
COO-

CH3

Citocromos
Son protenas de tamao pequeo, que operan como
transportadores monoelectrnicos debido a una transicin

Fe2+

Fe3+

Se distinguen tres tipos:

1. Citocromos A: Alto potencial redox (transportadores terminales)
2. Citocromos B: Bajo potencial redox
3. Citocromos C: Potencial redox intermedio
(Se distinguen por su espectro caracterstico de absorcin)

Citocromo c

Cofactores quinnicos

Quinona

OH

OH

Hidroquinona
AH2

O
CH3

CH3

CH3

CH3

Ubiquinona (Coenzima Q)

OH H
H2 C C

OH H
H2 C C

O
O

O
O

HO

HO
HO

OH

cido Ascrbico
(vit. C)

AH2

COOH
S

c. Lipoico

Lipoamida
CO

AH2

NH

CO
SH

NH

SH

Dihidrolipoamida

CH

Lys

CH

Lys

Glutatin: g-Glu-Cys-Gly
(forma reducida, GSH)

g-Glu-Cys-Gly
S

COO-

COO-

H3N C H

H3N C H

g-Glu-Cys-Gly

CH2

CH2

CH2

CH2

CO NH CH CO NH CH2 COOH

CO NH CH CO NH CH2 COO-

CH2

CH2

SH

S
S
CH2
CO NH CH CO NH CH2 COO-

2GSH + A

GSSG + AH2

CH2
CH2
H3N C H
-

COO

Glutatin:
forma oxidada, GSSG

CH2 CH2OH
H3C
CH2 N

N
H3C

Tiamina (vit. B1)

CH2 CH2 O P O P OO-

H 3C
CH2 N

O-

Tiamina pirofosfato, TPP

H 3C

CHO
HOH2C

OH
N

Piridoxal (vit. B6)

CH3

CHO

O
O P O-

HOH2C

ON

CH3

Piridoxal fosfato

CHO

O P O-

HOH2C

CH2NH2 O

O P O-

HOH2C

O-

ON

CH3

Piridoxal fosfato

CH3

Piridoxamina fosfato

Pteridina
H 2N

N
H

CO OH

OH

CH2
CH2

4-amino
benzoico

C NH C H
O

COOn

c. Flico

Poliglutamato

H 2N

N
H

CO OH

OH

CH2

c. Flico

CH2
C NH C H
O

COOn

Folato
reductasa

c.Tetrahidroflico, THF

Methotrexate
H 2N

H 2N

NH
H

H
N

NH

NH

CO OH

OH

CO OH

OH

CH2

CH2

CH2

CH2

C NH C H
O

C NH C H

COO

c.Dihidroflico, DHF

DHF Reductasa

COOn

H 2N

N
N

NH
N

OH

H 2C N

CO

OH

CH2

N5,N10 Metilen THF

CH2
C NH C H
O

COOn

H 2N

NH
H

N
OH

CO OH

C
H

CH2
O

CH2
C NH C H

N5 Formil THF

COOn

CH2CONH2
H

H 3C

CH3
NH2COCH2

NC
Co+

N
H 3C
NH2COCH2CH2 CH3 H
NH2COCH2

CH2CH2CONH2

CH3
N

N
H 3C

CH2CH2CONH2

CH3

H
CH2

CH3

N
CH3

CH2
N
CH3

CO

O
OH

NH
H

OH

CH2

P
H 3C

CH

O
H

CH2OH

Cobalamina
(vit. B12)

HN

Biotina

NH

COOH

CO2

O
HO

C N

NH

Carboxibiotina
S

COOH

OC
HN

CH R

NH
HN
S

Biotinil- protena

CO

NH

CO
CH
Lys
NH
OC
CH R'
HN

c. Pantoico

b-Alanina

CH3
CH2OH C CHOH CO NH CH2 CH2 COOH

c. Pantotnico

CH3

CH3

c. Pantotnico

Cisteamina

CH2OH C CHOH CO NH CH2 CH2 CO NH CH2 CH2 SH

CH3

Pantetena

Pantetena
H
HS

C
O

ADP

H HO H
O
O
N
C
O P O P O CH2
OOO H3C CH3
H
H

NH2

N
O

OH

Coenzima A

N
N

H
H
OH

O
-

O S O P O CH2
O

NH2

O-

H
H

N
N

H
H

OH

O P O
O-

3- Fosfoadenil 5- Fosfosulfato
(PAPS)

CH3
CH3 N CH2 CHOH CH2 COOH
CH3

Carnitina

O P O P O P O CH2
O-

O-

NH2

O-

H
H

H
H

OH

OH

5- Adenosina trifosfato (ATP)

El Centro Activo Enzimtico

- La evidencia cintica lleva a concluir que las enzimas

funcionan a travs de la formacin de un complejo ES

- El complejo ES es estequiomtrico: existe una relacin

entera entre nmero de molculas de enzima y nmero de
molculas de substrato (1:1, 1:2, etc)
-La fijacin de S a E es estereoqumicamente especfica, y S
puede ser desplazado de su fijacin por anlogos estructurales
(inhibidores competitivos)
-De todo lo cual se deduce que el substrato se fija a una regin
especfica de la molcula enzimtica, llamada Centro Activo

Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 1

1. Formacin de complejo ES evidenciable cinticamente

2. Presencia de grupos prostticos que participan en la catlisis
3. Fenmeno de la inhibicin competitiva y efecto de los anlogos
de estado de transicin

4. Efecto de inhibidores irreversibles:

- Organofosfricos slo reaccionan con Serina activa
- Clorometilcetonas slo reaccionan con Histidina activa

Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 2

5. Estudios filogenticos en secuencias de aminocidos en enzimas

Tripsina
Quimotripsina
Elastasa
Trombina
Plasmina
Pr. Sorangium
Pr. St.griseus

CQGDSGGPV
CMGDSGGPL
CQGDSGGPL
CEGDSGGPF
CQGDSGGSW
GRGDSGGST
CQGDSGGPV

Pruebas experimentales de la existencia del Centro Activo, 3

6. Estudios de fijacin de anlogos de substrato marcados

7. Estudios estructurales por cristalografa de rayos X de

enzimas cocristalizadas con su substrato (p.e., lisozima)

8. Otras tcnicas fsicas (RMN, RSE, polarizacin de fluorescencia)

Lisozima y su
substrato

Nmero de centros activos

1. Estudios de fijacin de ligandos
2. Nmero de grupos prostticos
3. Reactivos especficos de centro activo (Organofosfricos)
4. Titulacin directa del centros activos

Estudio de fijacin de ligandos

Consisten en incubar la enzima con un anlogo del substrato
debidamente marcado (radioactivo, fluorescente, etc.), a difeRentes concentraciones de ligando.

Ligando libre y ligando unido pueden separarse por:

- Dilisis de equilibrio
- Ultrafiltracin
- Cromatografa de exclusin en gel.

Aminocidos presentes en el centro activo de enzimas

- Serina: enzimas inhibidas por organofosfricos

- Histidina: enzimas inhibidas por clorometilcetonas
- Cistena: enzimas inhibidas por reactivos SH
- Lisina: enzimas que forman bases de Schiff
- Aspartato y Glutamato: dependencia de pH

Mecanismos de accin enzimtica, 1

1. Efectos de proximidad y orientacin
Las enzimas logran en su centro activo una concentracin
local de reactivos mucho mayor que cuando stos estn
en solucin (efecto de proximidad)
Adems, la fijacin al centro activo se hace en la orientacin correcta (efecto de orientacin)

Colisiones
no productivas

Colisin
productiva
En la superficie de la enzima,
los reactivos se encuentran
en la orientacin correcta y a
una concentracin local mucho
mayor que en solucin

Mecanismos de accin enzimtica, 2

2. Catlisis general cido-base

3. Formacin de intermediarios covalentes
4. Otros efectos (efectos cunticos, por ejemplo)

Mecanismo de la ribonucleasa pancretica, 1

OH

P O
O
O CH2

His 119
HN

OH
-

Py

His 12

Lys 41
NH3+

OH

P O
O
O CH2

:N

NH

P O
O
O CH2

His 119
HN

OH
-

P O
O
O CH2

O
O

HN + NH

O
P
O

NH+

His 12

Lys 41
NH3+

Py

H
N:

CH2

OH
-

P O
O
O CH2

Mecanismo de la ribonucleasa pancretica, 2

OH

P O
O
O CH2

His 119

OH
-

Py

His 12

Lys 41
NH3+

O
O
P
H
O
O
O
H

HN + NH

P O
O
O CH2

N:

HO

NH3+

HOCH2

His 12

Lys 41

:N

O
O-

HN

NH+
HOCH2

NH

O P O

His 119
HN

Py

OH
-

P O
O
O CH2

OH
-

P O
O
O CH2

Mecanismo de las serinproteinasas

CH
His
CH2

Ser
CH

CH

CH2
OH

CH2

NH

:N

R C NH R'

O
-

O
C

CH
His
CH2

Ser

Asp

HN + NH

R C NH R'

O
C

Asp

CH

CH

Mecanismo de las serinproteinasas

CH
His
CH2

Ser
CH

Ser
CH

CH2
HN

CH2

+ NH

R C NH R' O
O

CH His
CH2

NH
-

NH2 R'

R C

:N

O
C
Asp

Asp

CH

CH

Mecanismo de las serinproteinasas

CH His
CH2

Ser
CH
CH2
O

CH His
CH2

Ser
CH

:N

R C H O
O

CH2

NH
-

O
C

R C
Asp

HN
O
H

+ NH

O
C
Asp

CH

CH

Mecanismo de las serinproteinasas

CH His
CH2

Ser

CH His
CH2

Ser

CH

CH
CH2
O

CH2

+ NH
HN
-

OH

:N

R C

NH
O

O
C

Asp

OH

Asp

CH

CH

His 57

Asp 102

Ser 195
Configuracin en el centro
activo de la Quimotripsina,
con un inhibidor

Regulacin de la actividad enzimtica, 1

Regulacin de la actividad enzimtica

v=

k+2e0 s

Km + s

Vmax s

Km + s

I. Sobre e0: Regulacin de la concentracin enzimtica

II. Sobre Km y k+2: Regulacin de la actividad intrnseca
de la enzima
1. Regulacin alostrica
2. Regulacin por modificacin covalente

Regulacin alostrica
Procesos a nivel celular; regulacin de ajuste fino
de la actividad enzimtica, a travs de efectos de
retroalimentacin (negativa o positiva)

Regulacin por modificacin covalente

Procesos a nivel supracelular (orgnico); regulacin
a gran escala de actividades enzimticas, a travs de
modificacin covalente de enzimas, provocadas por
seales (transduccin de seales)

Retroalimentacin negativa en vas metablicas, 1

Sntesis de Isoleucina
Thr

Treonina
desaminasa

a-cetobutirato

Ile

El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primera

enzima de la misma, Treonina desaminasa

Retroalimentacin negativa en vas metablicas

Sntesis de pirimidinas
ATP
+
Asp + CP

ATCasa

Carbamil aspartato

CTP

El producto final de la va, CTP (citidin trifosfato) inhibe a la

primera enzima de la ruta metablica, Aspartato transcarbamilasa
Al mismo tiempo, dicha enzima puede ser activada por ATP

Rutas metablicas controladas por retroalimentacin

Ruta
Glicolisis
Neoglucognesis
Bios. cs. Grasos
Bios. Colesterol
Bios. Purinas

Enzima

Inhibidor

Fosfofructokinasa
ATP
FBP fosfatasa
AMP
AcetilCoA carboxilasa
AcilCoA
HMGCoA reductasa
Colesterol
PRPP sintetasa
AMP,GMP,IMP

En el estudio de las enzimas controladas por realimentacin

negativa, se comprobaron una serie de regularidades en las mismas:

1. Primer paso de una ruta metablica o punto de ramificacin

2. Enzimas de naturaleza compleja: subunidades; la enzima puede
desensibilizarse a sus inhibidores por diversos mtodos.
3. Los inhibidores se comportan como competitivos (elevan el valor
de la Km aparente, pero sin embargo no son anlogos estructurales
del substrato
Estas ltimas caractersticas lleva al concepto de alosterismo:
Una accin sobre la actividad enzimtica que se desarrolla
fuera del Centro Activo (Jacob y Monod, 1960)

Centro
alostrico

Centro
activo

En ausencia de inhibidor,
el substrato se fija normalmente al centro activo

Inhibicin alostrica

Centro
alostrico

Centro
activo

Cuando el inhibidor ocupa

el centro alostrico, tiene
lugar un cambio conformacional
en el centro activo que impide la
fijacin del substrato

Otra caracterstica importante de las enzimas alostricas

es que presentan cinticas anmalas, normalmente
cinticas sigmoides:

La presencia de una
sigmoide implica
la existencia de
cooperatividad en la
fijacin del substrato
s

La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijacin de una

molcula de substrato favorece la fijacin del siguiente, y as
hasta ocuparse toda la molcula

+
1

s s

+
2

s s
s

+
3

s s
s s

En trminos de Km veramos que Km1 > Km2 > Km3

Existe tambin cooperatividad negativa, cuando la fijacin de
una molcula de substrato dificulta la fijacin del siguiente.

El comportamiento cooperativo implica:

1. Que hay ms de un sitio de fijacin de substrato

por molcula de enzima (estr.cuaternaria)

2. Que hay interacciones entre los sitios de fijacin

Un sistema alostrico clsico es la Hemoglobina:

1. La fijacin de su substrato, O2, es de tipo sigmoide

2. La fijacin del substrato puede inhibirse por efectores
(H+, CO2, 2,3-BPG) que no actan sobre el Centro Activo (grupo hemo)
3. Las subunidades, por separado, presentan cintica
michaeliana en la fijacin de O2

Cinticas michaeliana y sigmoide:

Mioglobina y Hemoglobina
1.0

Y
Mioglobina

0.8

0.6

0.4

Hemoglobina
0.2

0.0
0

10

12

Efecto del pH sobre la saturacin de la hemoglobina

(Efecto Bohr)
100

pH 7.0

Saturacin de O2, %

80

pH 7.4
60

pH 6.6
40

20

0
0

20

40

60

PO2, mmHg

80

100

Efecto del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG)

sobre la saturacin de la hemoglobina
100

Saturacin de O2, %

80

60

0.1 mM
1 mM

40

20

0
0

20

40

60

PO2, mmHg

80

100

Inhibidores y activadores
alostricos
1.0

(+ Activador)

0.8

V+
0.6

(sin efectores)

V0
0.4

(+ Inhibidor)
0.2

V-

0.0
0

10

12

Los efectores alostricos operan sobre el grado de

cooperatividad del sistema:

- Los inhibidores alostricos aumentan el grado de

cooperatividad

- Los activadores alostricos disminuyen el grado de

cooperatividad; a concentraciones elevadas de activador,
la cintica pasa a ser michaeliana, y deja de ser sigmoide.

Ecuacin de Hill
h

Ks
y
h
1 Ks
_

h > 1, cooperatividad positiva

h = 1, no hay cooperatividad
h < 1, cooperatividad negativa

Obsrvese que para h=1, esta ecuacin se reduce a una forma

normalizada de la ecuacin de Michaelis-Menten:

v
k 2 x
s
Ka s
Km s
y

Vmx k 2 e0 Km s 1 1 s 1 Ka s
Km
_

Modelo MWC

Forma R
s

s s

s s
s

s s
s s

i
Forma T

a 1 a
y
n
L 1 a
_

n 1

a: Concentracin normalizada de substrato, s/Km

L: Constante alostrica: a mayor valor de L, mayor
grado de cooperatividad (positiva)
n: Nmero de sitios de fijacin de substrato

Regulacin de la actividad enzimtica, 2

Suele haber fenmenos de modificacin covalente de

enzimas en la respuesta celular a seales qumicas:

1. Neurotransmisores
2. Hormonas
3. Factores de crecimiento
4. Estmulos morfogenticos y de diferenciacin
5. Muerte celular programada (apoptosis)
6. Estmulos antignicos
7. Luz y otros agentes fsico-qumicos

Formas de modificacin covalente, 1

Fosforilacin: Protein kinasas
R CH
N
O C
Ser H C
H N
C
R' CH
N

ATP

ADP

CH2OH
O
H

Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr

R CH
N
O C
Ser HC
H N
C
R' C H
N

H
O
CH2O P OOO
H

Formas de modificacin covalente, 2

Defosforilacin: Protein fosfatasas

R CH
N
O C
Ser HC
H N
C
R' C H
N

H 2O

H
O
CH2O P OOO
H

Pi

R CH
N
O C
Ser H C
H N
C
R' CH
N

H
CH2OH
O
H

Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-P, Thr-P, Tyr-P

Formas de modificacin covalente, 3

Adenilacin: Sistema de la Glutamina sintetasa

R CH
N
O C
HC
Tyr
H N
C
R' C H
N

H2 N
H

N
O

CH2

O P O CH2
O-

O
H

OH

OH

Formas de modificacin covalente, 4

ADP-ribosilacin: acta NAD+ como donador del
grupo ADP-ribosa

R CH
N H
O C
HC
H N
C O
R' CH
N H

H2N
O
OH
NH

N
C H
NH2
+

N
O
O
OH
CH2 O P O P O CH2
O-

OOH

OH

Formas de modificacin covalente, 5

Rotura proteoltica:

Zimgeno

C
Proteinasa
especfica

C
Enzima activada

Concepto de Segundo Mensajero

La mayora de las seales qumicas operan sobre un
receptor situado en la parte externa de la membrana.
Al operar sobre este receptor determinan la aparicin en el
interior celular de un segundo mensajero, que desencadena
la respuesta celular a la seal.
Algunos segundos mensajeros:

- Nucletidos cclicos: cAMP, cGMP

- Ca++
- Diacilglicerol
- Inositolfosfatos
- xido ntrico, etc.

I
X

Efector

R
P

Glucgeno (n)
CH2OH

CH2OH
O

H
HO

H
OH

OH

H
O

CH2OH

H
OH

OH

H
O

H
OH

OH

H
O

....

Pi

Glucgeno fosforilasa

CH2OH
O

H
HO

H
OH

CH2OH
H

O
O P O-

O
H

OH

Glucosa-1-fosfato

H
OH

OH

OH

CH2OH
H

H
O

H
OH

OH

Glucgeno (n-1)

H
O

....

Subunidad de la glucgeno fosforilasa

Activacin de la
fosforilasa, 1
2 ATP

2ADP

Fosforilasa b

Fosforilasa a
Fosforilasa
kinasa, activa

Protein kinasa
inactiva (R2C2)
4 cAMP

Protein kinasa
activa (2C)
(cAMP)4R2

Glucgeno

Fosforilasa
kinasa, inactiva

El cAMP (AMP cclico) desencadena

la activacin de la fosforilasa

Glucosa-1-fosfato

NH2
N
O
-

O P O P O P O CH2
O-

O-

O-

ATP
OH

Protenas G

OH

Adenilato
ciclasa

NH2
N
N
O

Formacin de cAMP
a partir de ATP

O O
-

OH

cAMP

AC

R
a

GTP
b
g

a
GDP

g
b

a
GTP

ATP

cAMP

GDP
g
Activacin de la
Adenilato ciclasa

L R

Ga

AC

cAMP

PKA

FK

NH2
N
N
O

O O
-

cAMP
fosfodiesterasa

OH

NH2

Metilxantinas
(p.e. cafena)

N
O

O P O CH2
-

OH

OH

cAMP
+

Protein kinasa A

Glucgeno
sintetasa

+
Glucgeno
Fosforilasa

Protein
fosfatasas

cAMP
fosfodiesterasa

Protein kinasas
1. Protein kinasas A (Activadas por cAMP)
2. Protein kinasas G (Activadas por cGMP)
3. Protein kinasas A (Activadas por DAG)

4. Protein kinasas dependientes de Ca++-Calmodulina

5. Protein tirosin kinasas (Factores de crecimiento, etc.)

Activaciones proteolticas

N
Pepsingeno
C
N
pH < 5

Activacin del
pepsingeno
C

Pepsina

Protrombina (II)

Precursores,
va intrnseca

Fase 2
Fase 1

Protrombinasa

Precursores,
va extrnseca
Trombina (IIa)
Fibringeno (I)

Monmero
de fibrina (Ia)

Fase 3

Polmero
de fibrina

Va extrnseca

VII

VIIa
X

Xa
Ca++

Va

Complejo
protrombinasa

XII

XIIa
XI

Va intrnseca
XIa

IX

Ca++
IXa

VIII

Trombina

VIIIa
X

Xa
V

Ca++ Va

Complejo
protrombinasa

Protrombina
Va

Ca++

Xa

PLP

Complejo
protrombinasa

S
S

H
Trombina

Aa
Bb
g
Aa2Bb2g2

Fibringeno

Trombina

+
Monmero de fibrina a2b2g2

Fibrinopptidos

Aa
Bb
g

Fragmento C-terminal
del fibringeno

+
+

+
+

- +
- +
- +
- -

- +
- +
- +
+

Monmero de fibrina

+
+
- +
- -

+
- +
- +
- +

Fibrina (Unin no covalente)

Lys CH

HOOC
NH2

CH
Glu

Factor XIII
(estabilizador
de la fibrina)

Lys CH

OC
NH

CH
Glu

Formacin de
enlaces covalentes
en la fibrina

Enzimas en Medicina
Biotecnologa enzimtica

Enzimas en el diagnstico clnico

Existe en el suero sanguneo una gran cantidad de

actividades enzimticas. De la relacin
Vmax = k+2 e0
Se deduce que la medida en suero de la actividad
enzimtica es una medida directa de la concentracin
de enzima en dicho medio.

Alteraciones de la concentracin enzimtica en suero, 1

1. Aumentos de la actividad enzimtica

(a). Incremento patolgico de la permeabilidad de membrana
(b). Muerte y destruccin celular
(c). Induccin enzimtica
(d). Proliferacin celular

Alteraciones de la concentracin enzimtica en suero, 2

2. Disminuciones de la actividad enzimtica
(a). Intoxicaciones
(b). Enfermedades crnicas
(c). Alteraciones del estado nutritivo

Algunas enzimas con inters diagnstico

1. Aminotransferasas
2. Creatin kinasa
3. Fosfatasa alcalina
4. a-Amilasa
5. Fosfatasa cida
6. Lactato deshidrogenasa
7. g-Glutamil transferasa
8. Seudocolinesterasa

Aminotransferasas (Transaminasas)
Catalizan la interconversin reversible de aminocidos
y cetocidos. Utilizan piridoxal fosfato como cofactor
COOH
H2N CH
R1

COOH
+ C O
R2

COOH

COOH

C O + H2N CH
R1

R2

Su papel es importantsimo en el metabolismo de

aminocidos. En clnica se determinan las siguientes:
EC 2.6.1.1, Aspartato aminotransferasa (AST, GOT)
EC 2.6.1.2, Alanina aminotransferasa (ALT, GPT)

Aspartato aminotransferasa, EC 2.6.1.1 (AST, GOT)

COO-

COO-

C O

H3N CH

CH2
-

COO

Aspartato

CH2

COOC O
CH2

CH2

COO

COO

a-Cetoglutarato

Oxalacetato

COO+

H3N CH

CH2
CH2
COOGlutamato

Aparece en citosol y mitocondrias de tejidos metablicamente

muy activos. Su nivel se eleva en el suero ante afecciones
hepticas y miocrdicas.

Alanina aminotransferasa, EC 2.6.1.2 (ALT, GPT)

COO-

COO-

C O

H3N CH
CH3
Alanina

CH2
CH2
COO-

a-Cetoglutarato

COOC O
CH3
Piruvato

COO+

H3N CH

CH2
CH2
COOGlutamato

Enzima citoslica, de elevada concentracin en el parnquima

heptico. Se considera casi especfica de lesin heptica.

Creatin kinasa, EC 2.7.3.2 (CK, CPK)

CH3

ATP

CH3

ADP

N CH2 COOH
HN C
NH2
Creatina

N CH2 CO O P OHN C
NH2

O-

Creatin fosfato

Creatin fosfato es una forma de almacenamiento de enlaces

ricos en energa en el tejido muscular. Es el prototipo de los
compuestos conocidos como fosfgenos.

MM

La CK se presenta en forma de tres isoenzimas

especficas de tejido:

- Forma MM (msculo esqueltico)

- Forma MB (msculo miocrdico)
- Forma BB (cerebro)

MB

La isoenzima MB es un marcador precoz de

infarto de miocardio. Un nivel muy elevado es
mal pronstico

BB

Las isoenzimas se distinguen electroforticamente

o por mtodos inmunolgicos

Fosfatasa alcalina, EC 3.1.3.1

O
R O P O- + H 2 O
O-

O
R OH + HO P OO-

Hidroliza con baja especificidad fosfomonosteres, a un pH

alto (de ah el nombre). No se conoce con certeza cul es
su funcin metablica. Aparece en gran cantidad de tejidos.

La fosfatasa alcalina presenta varias isoenzimas:

- sea
- Heptica
- Intestinal
- Placentaria
Las ms importantes son las dos primeras. Se pueden distinguir
por su termoestabilidad, siendo la sea ms termolbil.

sea: Propia del tejido seo en crecimiento y de enfermedades

que cursan con neoformacin sea
Heptica: Propia de las clulas del rbol biliar: se eleva en las
colestasis (obstrucciones biliares) asociada a partculas
de elevado peso molecular

g-Glutamil transferasa, EC 2.3.2.2 (GGT)

GSH + aa

g-Glu-aa + Cys-Gly

Tiene un importante papel en el transporte de aminocidos

a travs de membranas. Aparece, como la fosfatasa alcalina,
en obstrucciones biliares asociada a fracciones de alto peso
molecular.
Es una enzima inducible, y su concentracin en suero aumenta
con xenobiticos (alcohol, drogas, etc.)

a-Amilasa, EC 3.2.1.1
Es una enzima producida por las glndulas salivales y el
pncreas.
Es un marcador muy importante de afecciones pancreticas
agudas (pancreatitis). Puede incluso aparecer en la orina, debido
a su bajo peso molecular (amilasuria)

Fosfatasa cida, EC 3.1.3.2

O
R O P O- + H 2 O
O-

O
R OH + HO P OO-

Hidroliza fosfomonosteres con baja especificidad. Presenta

varias isoenzimas, una de las cuales (Fosfatasa cida prosttica)
es un marcador muy fiable del cncer de prstata y que se emplea
en el diagnstico precoz del mismo.

Enzimas en Teraputica: producidas por recombinacin

Adagen (adenosine deaminase) Enzon, Inc.

Autorizado su uso peditrico en inmunodeficiencias
congnitas.

Ceredase (alglucerase) Genzyme Corp.

Autorizado su empleo en enfermedad de Gaucher tipo 1
Cerezyme (imiglucerase) Genzyme Corp.
Autorizado su empleo en enfermedad de Gaucher tipo 1
Pulmozyme (Dnase) Genentech, Inc.
Autorizado su empleo en fibrosis qustica
Activase (recombinant alteplase) Genentech, Inc.
Autorizado en infarto de miocardio y embolia pulmonar

Biotecnologa enzimtica
- Procesos industriales enzimticos:
* Industrias del almidn
* Detergentes
* Industrias lcteas
* Industrias de la fruta
* Antibiticos
- Biosensores y biochips

Biosensores

Anodo
Ctodo
Membrana de Teflon

Producto

Substrato

Membrana semipermeable

Enzima inmovilizada

Esquema de un
biosensor de glucosa