UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CAMPUS DE FREDERICO WESTPHALEN RS

DEPARTAMENTO DE CINCIAS
AGRONMICAS E AMBIENTAIS
CURSO DE AGRONOMIA

ESPECTROFOTOMETRIA

Acadmicos:

Anderson Pessotto
Leonardo Roppa

Frederico Westphalen, dezembro de 2015.

Introduo
Atualmente muito importante o conhecimento de Espectrofotometria em
anlises qumicas, devido o fato expem-se os contedos bsicos para compreenso de
tal assunto.
Primeiro o conceito, Espectro que o registro das caractersticas espectrais de
uma substncia, mostrando a quantidade de energia absorvida ou emitida a cada
comprimento de onda ou de freqncia do espectro eletromagntico.
Espectro eletromagntico um arranjo da radiao conhecida de acordo com o
comprimento de onda ou energia de fton; j o instrumento espectrofotmetro que
permite o desmembramento da radiao policromtica, por meios dispersivos (rede ou
prisma) ou no dispersivos (interfermetros), permitindo determinar a intensidade da
radiao nos diferentes comprimentos de onda, atravs da obteno do espectro, isto ,
fornecendo a razo, ou uma funo da razo, do poder da radiao de dois feixes em
funo do comprimento de onda espectral.
A radiao infravermelha corresponde aproximadamente a parte do espectro
eletromagntico situada entre regies do visvel e das microondas, sua maior utilizao
so para compostos orgnicos, que est situada entre 4.000 e 400 cm -1. Banda de
absoro o registro, num espectro, da absoro da radiao incidente numa amostra,
num intervalo de frequncias.
A espectrofotometria uma tcnica analtica que utiliza a luz para medir a
concentrao de espcies qumicas. Este mtodo analtico baseia-se na interao
(absoro e/ou emisso) da matria com a energia radiante, ou seja, radiao
eletromagntica quando os eltrons se movimentam entre nveis energticos (a partir da
absoro luminosa, a energia da espcie aumentada e h promoo deste para um
estado excitado que possui maior energia que o seu estado fundamental). Uma vez que
diferentes substncias tm diferentes padres de absoro, a espectrofotometria permitenos, por exemplo, identificar substncias com base no seu espectro. Permite tambm
quantific-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida est relacionada com a
concentrao da substncia.
O presente trabalho tem por objetivos realizar o estudo terico pratico,
apresentando conceitos da espectrofotometria, seus equipamentos, e mtodos de analise,
e suas aplicaes na rea da agronomia.

2 DESENVOLVIMENTO

2.1REVISO BIBLIOGRFICA

Princpios bsicos
A espectrofotometria visvel e ultravioleta um dos mtodos analticos mais
usados nas determinaes analticas em diversas reas. aplicada para determinaes
de compostos orgnicos e inorgnicos, como, por exemplo, na identificao do princpio
ativo de frmacos.
A espectroscopia de absoro molecular valiosa para a identificao dos
grupos funcionais na molcula. Mais importante, entretanto, so as aplicaes da
espectroscopia de absoro visvel/ ultravioleta para a determinao quantitativa de
compostos contendo grupos absorventes.
A regio ultravioleta do espectro geralmente considerada na faixa de 200 a
400 nm, e a regio do visvel entre 400 a 800 nm. As energias correspondentes a essas
regies so ao redor de 150 a 72 k.cal.mol -1 na regio ultravioleta, e 72 a 36 k.cal.mol -1
para a regio visvel. Energias dessa magnitude correspondem, muitas vezes, diferena
entre estados eletrnicos de muitas molculas.
A absoro da regio visvel e ultravioleta depende, em primeiro lugar, do
nmero e do arranjo dos eltrons nas molculas ou ons absorventes. Como
conseqncia, o pico de absoro pode ser correlacionado com o tipo de ligao que
existe na espcie que est sendo estudada.
De um ponto de vista prtico, o aspecto mais importante do clculo quntico
a determinao de quanta luz absorvida pela amostra. Isto descrito pela lei de BeerLambert, que d a relao entre a intensidade da luz incidindo na soluo (I0), e a
intensidade da luz saindo da soluo (I).

Log (I0/ I) =A=cl

A= absorbncia
= absorvidade molecular ou coeficiente de extino

c= concentrao do material absorvedor

l= espessura da amostra da amostra atravs da qual a luz passa.

A absoro pelos compostos orgnicos e inorgnicos relacionada com uma

deficincia de eltrons na molcula. Nos inorgnicos, o comprimento de onda de
absoro das transies d-d depende do metal envolvido, do nmero de grupos
coordenados, da basicidade, dos tomos doadores e da geometria dos grupos
coordenados.
Nos compostos orgnicos, os que possuem dupla ligao absorvem fortemente
no ultravioleta remoto. Os compostos que possuem ligaes simples e duplas
alternadamente,

chamadas

de

ligaes

conjugadas,

produzem

absoro

em

comprimentos de ondas maiores. Quanto mais extenso for o sistema conjugado, mais
longos sero os comprimentos de onda absorvidos, podendo chegar regio do visvel.
Cores
A interao da matria com radiaes de comprimento de onda entre 450 e 750
nm, denominada luz visvel, se manifesta atravs das cores das substncias. Por que
motivo ento, uma soluo de sulfato de cobre tem cor azul esverdeada, enquanto que
uma soluo de permanganato de potssio vermelho prpura?
Quando a luz solar, ou a de uma lmpada, incide sobre a soluo de sulfato de
cobre, radiaes de todas as cores penetram no seu interior, mas, praticamente, apenas
as radiaes de comprimento de onda acima de 600 nm so absorvidas. As radiaes
que no so absorvidas, correspondentes basicamente s cores: violeta, azul, verde e
amarelo, constitui somada, a colorao azul esverdeada da soluo que percebida
pelos nossos olhos. A cor que uma substncia exibe corresponde, portanto, frao da
luz visvel que ela no absorve. A absoro de radiaes ultravioletas abaixo de 400 nm
no detectada pelo olho humano, e percebemos as radiaes infravermelhas como
calor.
Lei de Lambert-Beer
Lambert estudou a transmisso da luz por slidos homogmeos. Beer estendeu o
trabalho de Lambert ao estudo de solues. Pode-se apresentar concluses dos dois
pesquisadores na forma de uma lei conhecida como Lei de Lambert-Beer.

As leis de Lambert-Beer so o fundamento da espectrofotometria. Elas so

tratadas simultaneamente, processo no qual a quantidade de luz absorvida ou
transmitida por uma determinada soluo depende da concentrao do soluto e da
espessura da soluo (1).

A lei de Lambert-Beer pode ser expressa matematicamente pela relao: T= e a.1.C

Onde:
T= Transmitncia
e = Logaritmo Natural de Euler
a= Constante
1= Espessura da soluo
c = Concentrao da soluo (cor)
Convertendo a equao para forma logartmica:
-lnT=a . l . c
Utilizando-se logaritmo na base 10, o coeficiente de absoro convertido no
coeficiente de extino K .
assim: -log T=k. l . c

em que: k = a/2.303.
As determinaes das concentraes de compostos, o "1" (caminho ptico), so
mantidas constantes e tm grande importncia para os bioqumicos, portanto:
-log T =k' . c
em que: k'=k. l
O -log (I/Io) foi denominado densidade ptica (DO) ou absorbncia (A) ou
extino (E). Portanto, A = k' . c. A relao entre A e a concentrao da soluo linear
crescente, conforme mostrado na Figura 1.5.

Figura 1.5 Curva de absorbncia versus concentrao de glicose (umol/mL).

Comparando com a equao da reta tem-se: y = a . (x) + b; A =k' . c + 0,02.

Desvios da Lei de Lambert-Beer

Desvios qumicos
Deslocamento do equilbrio: quando um analito dissocia, associa ou reage com
um solvente para formar um produto que tem um espectro de absoro diferente do
analito. Ex: indicador cido-base.

Dissociao de complexos: excesso ou insuficincia de agente complexante.

Desvios instrumentais
Em solues muito concentradas, as molculas de soluto influenciam umas s
outras devido a suas proximidades, pois quando ficam muito perto umas das outras, a
absorvidade pode mudar um pouco.

Espectrofotmetros
O instrumento usado na espectrofotometria chamado de espectrofotmetro.
Para se obter informao sobre a absoro de uma amostra, ela inserida no caminho
ptico do aparelho. Ento, a luz UV visvel em certo comprimento de onda (ou uma
faixa de comprimentos de ondas) passada pela amostra. O espectrofotmetro mede o
quanto de luz foi absorvida pela amostra. A intensidade da luz antes de passar pela
amostra simbolizada por I0, e a intensidade da luz depois de passar pela amostra
simbolizada por I. A transmitncia da amostra definida pela razo (I / I0), a qual
normalmente expressa em porcentagem de transmitncia (%T). A partir dessa
informao, a absorbncia de ambos determinada para esse certo comprimento de
onda ou como uma funo de uma faixa de comprimentos de onda. Os
espectrofotmetros mais sofisticados normalmente fazem isso automaticamente.
Existem dois tipos de espectrofotmetros: de feixe simples e de feixe duplo.
Os espectrofotmetros so instrumentos de anlise que permitem:
1.

Selecionar o comprimento de onda (lmbda) da radiao adequado anlise de

um determinado componente;

2.

Medir a intensidade I do feixe emergente que corresponde a um determinado

feixe incidente I0, convertendo o sinal recebido no detector em medida de Absorbncia
para o comprimento de onda da anlise.

Determinar a concentrao de uma espcie em soluo a partir do grfico da

variao de absorbncia (ou transmitncia) em funo da concentrao de vrias
solues-padro.
Abaixo o esquema ptico dos principais componentes do espectrofotmetro. As
letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difrao, (d)
fenda seletora de X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo soluo, (f)
clula foteltrica, (g) amplificador.

A preciso dos comprimentos de onda para anlise chamada de bandas de

passagem, mais comum na ordem de 10nm. O espectro da anlise mais comum de
360nm a 1000nm para a faixa visvel. Apesar de, as amostras poderem ser slidas (ou
mesmo gasosas), elas usualmente so lquidas. Uma cela transparente (ou seja, que no
absorve radiao na faixa de comprimentos de onda usada), comumente chamada de
cubeta, preenchida com a amostra lquida e inserida no espectrofotmetro. O caminho
ptico L pela a amostra ento a largura da cubeta. Espectrofotmetros mais simples
(econmicos) usam cubetas com a forma cilndrica (tubos de ensaio), porm os mais
sofisticados usam cubetas retangulares, geralmente com uma largura de 1 cm. Para
espectroscopia apenas no visvel, simples cubetas de vidro podem ser usadas, porm a
espectroscopia no ultravioleta requer cubetas especiais feitas de um material que no
absorva luz UV, como o quartzo. Um espectro ultravioleta-visvel essencialmente
um grfico (ou plotagem) da absorbncia versus o comprimento de onda na faixa do
ultravioleta e/ou visvel. Tal espectro pode facilmente ser produzido pelos

espectrofotmetros mais sofisticados. O comprimento de onda frequentemente

representado pelo smbolo . Da mesma forma, para uma dada substncia, um grfico
psilon; vs. pode ser feito ou usado se um j est disponvel. Para uma dada
substncia, o comprimento de onda no qual ocorre o mximo de absoro chamado de
max (lmbda mximo).

Procedimentos analticos em espectrofotometria visvel e ultravioleta

Anlise qualitativa: pela analise da absorvncia possvel determinar qual

espcie qumica esta presente na amostra. Tambm possvel detectar contaminaes
ou processos de decomposio de matrias-primas pela comparao dos espectros de
absoro da matria e do padro da mesma.

Anlise quantitativa: a condio essencial para qualquer determinao por

espectrofotometria no visvel e ultravioleta a observao da lei de Beer.
Outras condies como pH, tcnicas de extrao por solventes, ajuste do estado
de oxidao, remoo prvia dos interferentes, controle da fora inica do meio, e as
variaes das temperaturas tambm so observadas.

Espectro de protenas
- possuem espectro bem caracterstico;
-so influenciadas pelo meio local: dependem de fenmenos eltricos;
-mostra a quantidade de hlice e folha ;
-caso a protena seja desnaturada, a espectroscopia ser diferente.

Espectro de cidos nuclicos

-tem a absorbncia menor que a soma das absorbncias dos nucleotdeos
individuais (hipocromicidade) e ocorre devido ao empilhamento ou alinhamento dos
planos paralelos das bases;
-se ocorrer um acrscimo na absoro hipercromicidade
-serve para determinar se esto estruturados.

Fluorescncia e fosforescncia
Fluorescncia a emisso de luz associada com eltrons que se movem de
um estado excitado para o estado fundamental.
Fosforescncia a capacidade que uma espcie qumica tem de emitir luz.
As duas so freqentemente usadas para se estudar processos biolgicos e
so muito mais teis que a absorbncia, por serem consideravelmente mais
sensveis, podendo, ento, detectar concentraes bastante baixas.

Automao nos mtodos espectrofotomtricos

Os principais motivos para o desenvolvimento de um sistema que viabilizasse

vrias determinaes simultneas com o mnimo de trabalho humano foram:
- preencher as necessidades dos laboratrios de analises clnicas, devido
crescente nmero de analises;
- o aumento do nmero de espcies qumicas a serem determinadas no sangue e
na urina como anlise de rotina.
O uso desses instrumentos em laboratrios de anlises clnicas foi logo estendido
a laboratrios de controle de qualidade de processos industriais num variado tipo de
amostras como ar, gua solo, produtos agrcolas e farmacuticos.

As vantagens dos mtodos automatizados so:

- maior velocidade no processamento das anlises;
- maior confiabilidade nos resultados;
- minimizao de contaminaes;
- diminuio na gerao de resduos;
- menor consumo de amostras e reagentes.

Aplicaes da espectrofotometria

Determinao em solos do fsforo solvel pelo mtodo do azul de

molibdnio em soluo de H 2SO4 0,025 M ou determinao de fsforo em
materiais que possuem baixa concentrao no elemento.
Uma vez que o fsforo pode ocorrer no solo sob vrias formas a
obteno do extrato ser feita mediante o uso de uma soluo 0,025 mol L

-1

de

H2SO4. Dessa forma se obter uma soluo da amostra que contm apenas as formas
de fsforo solveis naquele extrator.
A seguir uma alquota do extrato ser tratada com um reativo cido que
contm os ons molibdato e bismuto. O complexo formado entre o fosfato presente no
extrato com os ons presentes no reativo, sendo reduzido pelo cido ascrbico dar
origem a um complexo colorido azul. A intensidade dessa colorao azul
proporcional quantidade de fsforo presente no extrato de solo e, por conseguinte na
amostra analisada.

Determinao em fertilizantes do fsforo solvel em gua, pelo mtodo

colorimtrico simplificado do cido molibdovanadofosfrico ou determinao de
fsforo em materiais que possuem alta concentrao no elemento.
Dentre os nutrientes vegetais contidos nos fertilizantes o fsforo o que se
apresenta em maior nmero de formas qumicas diferentes. Enquanto para outros
nutrientes tal fato no seja motivo para maiores problemas, pelo menos at o
momento, o mesmo no acontece em relao ao fsforo: isso porque as diferentes
formas qumicas desse nutriente apresentam diferentes comportamentos agronmicos.
Essa caracterstica faz com que o contedo total de fsforo dos fertilizantes
tenha um valor agronmico apenas relativo: indica a capacidade potencial do adubo
em fornecer esse nutriente. Importante o contedo de fsforo que proporcione o
mximo aproveitamento pelos vegetais: precisamente a determinao desse valor
que tem tornado problemtico avaliar, em condies de laboratrio, o contedo de
fsforo dos fertilizantes, uma vez que uma mesma fonte de fsforo tem
comportamento agronmico varivel em funo do solo, clima, cultura, forma de
aplicao e outros fatores.
Essa situao justifica o fato de j terem sido sugeridos e usados vrios
extratores qumicos para avaliar e interpretar o contedo de fsforo dos fertilizantes;
os principais so: gua, soluo neutra de citrato de amnio (pH = 7,0) e soluo de
cido ctrico a 2%.
A presente determinao do fsforo em fertilizantes usa a gua como extrator
e a determinao colorimtrica do fsforo no extrato feita pelo mtodo
colorimtrico ou espectrofotomtrico do cido molibdovanadofosfrico (amarelo de
molibdnio).
Esse mtodo colorimtrico fundamenta-se na reao entre os ons ortofosfato
(H2PO4 ), molibdato e vanadato, em meio cido com formao do cido
molibodvanadofosfrico, presumivelmente, H3PO4.NH4.VO3.16MoO3.

Concluso