Mestrado EPA

Vivian Almeida Paschoal
Efeito comparativo dos cidos

eicosapentaenico (EPA) e docosahexaenico (DHA) sobre a funo de
neutrfilos
Dissertao apresentada ao Programa de

Ps-Graduao em Fisiologia Humana do
Instituto de Cincias Biomdicas da
Universidade de So Paulo, para obteno
do Ttulo de Mestre em Cincias.
So Paulo
2011
Vivian Almeida Paschoal
Efeito comparativo dos cidos

eicosapentaenico (EPA) e docosahexaenico (DHA) sobre a funo de
neutrfilos
Dissertao apresentada ao Programa de

Ps-Graduao em Fisiologia Humana do
Instituto de Cincias Biomdicas da
Universidade de So Paulo, para obteno
do Ttulo de Mestre em Cincias.
rea de concentrao: Fisiologia Humana
Orientador: Prof. Dr. Rui Curi
Verso original
So Paulo
2011
RESUMO
Paschoal A. V Efeito comparativo dos cidos eicosapentaenico (EPA) e docosahexaenico (DHA) sobre a funo de neutrfilos. [dissertao (Mestrado em
Fisiologia Humana)]. So Paulo: Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade
de So Paulo; 2011.
leos de peixe ricos em cidos graxos (AGs) -3 so utilizados como agentes

teraputicos em doenas inflamatrias crnicas. Os cidos graxos -3 encontrados
nesses leos so o eicosapentaenico (EPA) e o docosa-hexaenico (DHA). O
efeito anti-inflamatrio atribudo aos dois cidos graxos -3 indistintamente.
Contudo, h evidncias de que EPA e DHA no apresentam os mesmos efeitos e
algumas vezes atuam de modo oposto. No presente estudo, os efeitos de EPA e
DHA sobre a funo de neutrfilos foram comparados. Para isso, foram realizados
experimentos em neutrfilos isolados de ratos. Inicialmente, foram analisadas
clulas com a membrana plasmtica ntegra e fragmentao de DNA (citometria de
fluxo) com o intuito de determinar as concentraes no txicas de EPA e DHA.
Posteriormente, foram realizados ensaios para determinar produo espcies
reativas de oxignio (EROs) (quimiluminescncia amplificada por lucigenina e
fluorescncia utilizando Amplex Ultrared); nitrito (reagente de Griess) e citocinas
(ELISA) no sobrenadante de culturas, alm de capacidade fagoctica e atividade
fungicida de Candida albicans (microscopia). Aumento da produo de perxido de
hidrognio ocorreu a partir de concentraes menores de DHA (50 M comparado
com 100 M de EPA). J para a produo de nion superxido, EPA estimulou em
doses menores (12,5 M e o DHA em 100 M). Ambos AGs aumentaram a sntese e
liberao das citocinas CINC-2 e TNF- e no modificaram a produo de IL1- e
xido ntrico aps incubao das clulas por 18 horas. Somente DHA elevou a
capacidade fagocitria e a atividade fungicida dos neutrfilos. EPA e DHA
apresentaram efeitos distintos na produo de citocinas, fagocitose e atividade
fungicida dos neutrfilos. J na produo das EROS, EPA e DHA apresentaram
efeitos similares, embora em concentraes diferentes.
Palavras-chave: cidos graxos -3. Espcies reativas de oxignio. CINC-2. TNF-.

IL-1. Fagocitose. Atividade fungicida.
ABSTRACT
Paschoal A. V Comparative effect of eicosapentaenoic (EPA) and docosa-hexaenoic

(DHA) acids on neutrophil function. [Masters thesis (Human Physiology)]. So Paulo:
Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo; 2011.
Fish oils rich in -3 fatty acids (FAs) are used as therapeutic agents in chronic
inflammatory diseases. The -3 fatty acids found in these oils are eicosapentaenoic
(EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids. The anti-inflammatory properties are
attributed to both -3 fatty acids indistinctly. However, there is evidence that EPA
and DHA do not have the same effects and sometimes act in the opposite way. In
this study, the effects of EPA and DHA on neutrophil function were compared. For
this purpose, experiments were performed in isolated rat neutrophils. Initially, cells
with intact plasma membrane and DNA fragmentation (flow cytometry) were analyzed
in order to determine the non-toxic concentrations of EPA and DHA. Subsequently,
tests were conducted to determine the production of reactive oxygen species (ROS)
(lucigenin-amplified chemiluminescence and Amplex Ultrared fluorescence assays),
nitrite (Griess reagent) and cytokines (ELISA) in the culture supernatants. In addition,
phagocytosis capacity and fungicidal activity of Candida albicans (microscopy) were
also measured. Increased production of H2O2 in lower concentrations of DHA (50 M
compared to 100 M of EPA). For production of O2 -, EPA stimulated at lower doses
(12.5 M compared to 100 M of DHA). Both FAs increased synthesis and release of
cytokines, CINC-2 and TNF-, and did not change the production of IL-1 and nitric
oxide after incubation of the cells for 18 hours. Only DHA increased the phagocytic
capacity and fungicidal activity of neutrophils. These FAs showed distinct effects on
cytokine production, phagocytosis capacity and fungicidal activity by neutrophils. For
production of ROS, both EPA and DHA had similar actions, although at different
concentrations.
Keywords: Neutrophils. Fatty acids -3. Reactive oxygen species. CINC-2. TNF-.
IL-1. Phagocytosis. Fungicidal activity.
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 - Representao esquemtica do processo de fagocitose e da produo de
EROs pelo sistema NADPH oxidase ......................................................................... 27
Figura 2 - Representao esquemtica da produo de EROs pelo sistema NADPH
oxidase (NOX2) e cido peroxinitrito pela iNOS........................................................ 28
Figura 3 - Integridade de membrana em neutrfilos tratados com DHA e EPA por 4
horas. ........................................................................................................................ 42
Figura 4 - Fragmentao de DNA em neutrfilos tratados com EPA e DHA por 4
horas ........................................................................................................................ 43
horas ......................................................................................................................... 44
horas ......................................................................................................................... 44
horas na presena de LPS.. ...................................................................................... 46
horas na presena de LPS.. ...................................................................................... 46
Figura 9 - Produo de CINC-2 durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA e
EPA. .......................................................................................................................... 48
Figura 10 - Produo de CINC-2 durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA e
EPA na presena de LPS. ......................................................................................... 48
Figura 11 - Produo de TNF- durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA e
EPA. .......................................................................................................................... 49
Figura 12 - Produo de TNF- durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA e
EPA na presena de LPS. ......................................................................................... 49
Figura 13 - Produo de IL1- durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA e
EPA. .......................................................................................................................... 50
Figura 14 - Produo de IL1- durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA e EPA
na presena de LPS. ................................................................................................. 50
Figura 15 - Produo de xido ntrico durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA
e EPA. ....................................................................................................................... 51
Figura 16 - Produo de xido ntrico durante 18 h por neutrfilos tratados com DHA
e EPA na presena de LPS. ...................................................................................... 51
Figura 17 - Produo de perxido de hidrognio durante 1 h por neutrfilos tratados
com DHA e EPA. ....................................................................................................... 53
Figura 18 - Produo de perxido de hidrognio durante 1 h por neutrfilos tratados
com DHA e EPA na presena de PMA. .................................................................... 53
Figura 19 - Produo de nion superxido durante 1 h por neutrfilos tratados com
DHA e EPA................................................................................................................ 55
DHA e EPA na presena de PMA.. ........................................................................... 55
DHA e EPA na presena de zimosan.. ...................................................................... 56
DHA na presena do inibidor DPI.............................................................................. 57
EPA na presena do inibidor DPI.. ............................................................................ 57
DHA na presena do inibidor etomoxir.. .................................................................... 58
EPA na presena do inibidor etomoxir,. .................................................................... 58
Figura 26 - Porcentagem de neutrfilos que fagocitaram Candida albicans tratados
com DHA e EPA. ....................................................................................................... 60
Figura 27 - Escore da atividade fungicida dos neutrfilos tratados com DHA e EPA.
.................................................................................................................................. 60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de escore para a atividade fungicida de neutrfilos. ................... 40

Tabela 2 - Concentraes mximas no txicas dos cidos EPA e DHA em
neutrfilos. ................................................................................................................. 45
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Efeitos do EPA e DHA em diferentes tipos celulares. Foram selecionados
alguns artigos considerados relevantes. ................................................................... 22
Quadro 2 - Contagem de clulas peritoneais no perodo de 3 horas aps
administrao de glicognio de ostra (1%). .............................................................. 34
Quadro 3 - Resumo dos efeitos de EPA e DHA em neutrfilos observados nesse
estudo. ...................................................................................................................... 61
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA: anlise de varincia

BPI: protena de aumento de permeabilidade bacteriana
CEEA: tica em Experimentao Animal
CINC-2: citocina indutora da quimiotaxia de neutrfilos 2
Cl-: cloreto
COX: ciclo-oxigenase
CPT-I:carnitina palmitoiltransferaseI
CR-1: receptor para componentes do complemento
CTE: cadeia de transporte de eltrons
DHA: cido docosa-hexaenoico
EPA: cido eicosapentaenoico
EPM: erro padro da mdia
ERN: espcies reativas de nitrognio
EROs: espcies reativas de oxignio
fMLP: N-formyl-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina
GDP:guanosina difosfato
GEF: fator de troca de guanosina
GTP: guanosina trifosfato
H2O2: perxido de hidrognio
HOCl: cido hipocloroso
HRP: peroxidase de raiz forte
IFN- : interferon-
IB: subunidade inibitria do NF-B
IL: interleucina
IL-1ra: antagonista do receptor de IL-1
iNOS: xido ntrico sintase induzvel
IP: iodeto de propdio
IP3: fosfatidil inositol trifosfato
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry
LPL: lipase de lipoprotena
LPS: lipopolissacardeo
MDP: bactrias gram positivas e negativas
MIP2-: protena inflamatria de macrfagos
MPO: mieloperoxidase
mtDNA: DNA mitocondrial
NF-B: fator nuclear kappa B
NLRP3: receptor pryin domain containing 3
NO: xido ntrico
NO2: radical dixido de nitrognio
NRL: receptor do tipo NOD
-
O2 : nion superxido
-
ONOO : peroxinitrito
ONOOH: cido peroxinitrito:
PKC: protena quinase C
PMA: acetato miristato de forbol
PMN: clula polimorfonuclear
PPAR: receptor nuclear ativador da proliferao de peroxissomos
PUFA: cido graxo poli-insaturado
RNS: espcies reativas de nitrognio

SFB: soro fetal bovino
SHN: soro homlogo normal
TGF-: fator de crescimento tumoral-
TLRs: receptores do tipo Toll-like
TNF-: fator de necrose tumoral
SUMR
RIO
INTRODUO ....................... ................................................ ............................ 18

8
1.1
CIDO
OS GRAXO
OS POLIIN
NSATURAD
DOS (PUF
FAS) MEG
GA-3 ................... 18
8
1.2
PUFAS MEGA
A 3 E FUN
O DOS LEUCCIITOS........ ............................ 19
9
1.3
PUFAS MEGA
DUO DE
A 3 E PROD
D MEDIAD
DORES IN FLAMAT
RIOS .. 20
0
1.4
DIFER
RENAS ENTRE
E
OS
S CIDOS EICOSAPENTAEN
ICO (EPA
A) E
DOC
COSA-HEX
XAENICO
O (DHA) ... ................................................ ............................ 21
1.5
NEUT
TRFILOS ................ ................................................ ............................ 24
4
1.6
PROD
DUO DE
E EROS ... ................................................ ............................ 26
6
1.7
XIDO
O NTRICO
O (NO) ..... ................................................ ............................ 29
9
J
JUSTIFICA
ATIVA PA
ARA A REA
ALIZAO
O DO ESTUDO ........ ............................ 31
OBJETIVO
OS ........................... ................................................ ............................ 32
2
3.1
OBJET
TIVO GER
RAL .......... ................................................ ............................ 32
2
3.2
OBJET
TIVOS ESPECFICO
OS ............................................ ............................ 32
2
MATERIA
AL E MTO
ODOS ....... ................................................ ............................ 33
3
4.1
PREPARO DAS SOLU

ES DE EP
PA E DHA ................ ............................ 33
3
4.2
ANIMA
AIS .......................... ................................................ ............................ 33
3
4.3
OBTENO DE
E NEUTR
FILOS ..................................... ............................ 33
3
4.4
AVALIIAO DA
A CITOXIC
CIDADE DE
E EPA E DHA........... ............................ 34
4
4.4.1
1
Avvaliao da
a integrida
ade da mem
mbrana cellular ......... ............................ 35
5
4.4.2
2
Avvaliao da
a fragmenttao de DNA
D .......................... ............................ 35
5
4.5
DETERMINA
O DAS CI TOCINAS................................ ............................ 35
5
4.6
AVALIIAO DA
A PRODU
O DE NO
O ............................. ............................ 36
6
4.7
AVALIIAO DA
A PRODU
O DE ES
SPCIES REATIVAS
S DE OXIG
GNIO . 36
6
4.7.1
1
Avvaliao de
e perxido
o de hidrog
gnio (H2O2) pelo mttodo de Am
mplex
Ultra
ared
................................... ................................................ ............................ 36

6
4.7.2
2
Avvaliao do
o nion sup
perxido (O
( 2-) pela tcnica
t
de
quim
mioluminesscncia am
mplificada p
pela lucigen
nina ......................... ............................ 37
7
4.7.3
3
Inibidores da
a NADPH oxidase e da oxida
o dos AG
G ........................... 38
8
4.8
OBTENO DE
E SORO HO
OMLOGO
O NORMA
AL (SHN) .. ............................ 38
8
4.9
OPSO
ONIZAO
O DO ZIMO
OSAN ....................................... ............................ 38
8
4.10
0
AVA
ALIAO DA
D CAPAC
CIDADE FA
AGOCITR
RIA E DA A
ATIVIDADE
FUN
NGICIDA, EX
E VIVO, DE
D CLUL
LAS PERIT
TONEAIS ................. ............................ 39
9
4.10
0.1
4.11
5
Ensaios de fagocitosse e de atiividade fun

ngicida de nneutrfilos
s ........... 39
9
AN
LISE EST
TATSTICA
A ............................................... ............................ 40
0
RESULTA
ADOS ....................... ................................................ ............................ 41
5.1
TOXIC
CIDADE DO
OS CIDO
OS GRAXO
OS EM NEUTRFILO
OS ....................... 41
5.2
TOXIC
CIDADE DE DHA E E
EPA EM NEUTRFILOS TRAT
TADOS CO
OM LPS ...
......................................... ................................................ ............................ 45
5
5.3
PROD
DUO DE
E CITOCIN
NAS .......................................... ............................ 47
7
5.4
EFEIT
TOS DOS AGS
A
SOBR
RE A PRO
ODUO DE
D XIDO NTRICO (NO) ... 51
5.5
EFEIT
TOS DE EP
PA E DHA SOBRE A PRODU
O DE ES
SPCIES
REA
ATIVAS DE
E OXIGNIO (EROS ) .............................................. ............................ 52
2
5.5.1
1
Prroduo de
e H2O2 ..... ................................................ ............................ 52
2
PROD
DUO DE
E O2- ........ ................................................ ............................ 54
4
5.6
5.6.1
1
Effeitos dos inibidores

i
da NADPH
H oxidase e da oxidaao dos AG sobre a
prod
duo de superxido ................ ................................................ ............................ 56
6
5.7
EFEIT
TOS DE EP
PA E DHA NA FAGO
OCITOSE E ATIVIDA
ADE FUNG
GICIDA .. 59
9
DISCUSS
O .......................... ................................................ ............................ 62
2
CONCLUS
SO......................... ................................................ ............................ 67
7
REF
FERNCIA
AS............................. ................................................ ............................ 68
8
18
1 INTRODUO
1.1 CIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS (PUFAS) MEGA-3
Os cidos graxos so compostos formados por cadeias hidrocarbonadas

ligadas a um grupamento carboxila terminal. So classificados de acordo com o
tamanho (curta, mdia, longa) ou tipo de ligao (saturados, monoinsaturados ou
poliinsaturados) na cadeia hidrocarbonada. cidos graxos saturados no possuem
dupla ligao na cadeia; cidos graxos monoinsaturados contm uma dupla ligao,
enquanto que cidos graxos poli-insaturados (PUFA polyunsaturated fatty acids)
contm duas ou mais duplas ligaes. A numerao dos tomos de carbono nos
AGs comea a partir do carbono da carboxila, designado como 1 na nomenclatura
da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). O prximo tomo de
carbono designado como 2, tambm chamado de na nomenclatura tradicional. O
carbono metlico terminal designado como "n" de acordo com a nomenclatura
IUPAC, e como "", segundo a nomenclatura tradicional. A posio de uma dupla
ligao pode ser indicada pela contagem decrescente a partir do final da cadeia. Se,
por exemplo, uma dupla ligao est presente entre o terceiro e o quarto tomos de
carbono contados a partir do final do terminal metil descrita como n-3 ou -3
(omega-3).
A estrutura dos AGs indicada de acordo com o nmero de tomos de
carbono, seguida do nmero de duplas ligaes e a posio da insaturao mais
distal. Por exemplo, o cido eicosapentaenico (EPA) abreviado como C20:5 n-3
(ou C20:5 -3). Esta nomenclatura indica um AG com 20 tomos de carbono e 5
duplas ligaes. A ltima das duplas ligaes est localizada no terceiro carbono a
partir da extremidade distal da cadeia aliftica. As propriedades biolgicas e fsicoqumicas dos AGs dependem do comprimento da cadeia aliftica, do nmero de
duplas ligaes (grau de insaturao) e de suas posies.
Os leos vegetais, como os de oliva, milho e soja, so fontes de cidos
graxos monoinsaturados mega 9 (PUFAs mega 9) e poliinsaturados mega 6
(PUFAs mega 6) e os de linhaa e de peixe constituem fontes de cidos graxos
poliinsaturados mega-3 (PUFAs mega-3).
Dentre os cidos graxos da famlia mega 3, os principais so o -linolnico
(18:3), EPA (20:5) e DHA (docosa-hexaenico). A converso do cido -linolnico
19
em EPA e DHA, em humanos, muito baixa (1), o que significa que o EPA e DHA
em especial devem ser consumidos (2). Os fitoplnctons marinhos de locais frios
sintetizam cidos -linolnico, EPA e DHA, com isto, os peixes que se alimentam
desses tambm so ricos nesses AG, como sardinha, cavala, salmo, truta e atum
(peixes de guas frias e profundas). Tambm podemos encontr-los nos leos
vegetais de linhaa e canola (3).
1.2 PUFAS MEGA 3 E FUNO DOS LEUCCITOS
Em 1971, Bang e Dyerberg sugeriram que a baixa incidncia de doenas

cardiovasculares em esquims da Groelndia estaria relacionada com a ingesto de
cidos graxos -3. Em estudos posteriores, tambm foi observada baixa incidncia
de doenas auto-imunes e inflamatrias como psorase, asma e diabetes do tipo I,
alm de ausncia de esclerose mltipla nessa populao (4). Na populao
japonesa foi encontrada menor incidncia de doena inflamatria em relao aos
americanos e este fato foi associado ao maior consumo de peixes de gua fria (5, 6).
O leo de peixe, uma fonte rica de PUFAs -3, modula as respostas imune e
inflamatria, a proliferao de linfcitos, a sntese de citocinas, produo de
anticorpos e expresso de molculas de superfcie de membrana (7-11). Esse leo
atenua a inflamao em vrias condies patolgicas tais como: diabetes mellitus
tipo II, hipertrigliceridemia (12) e doenas cardiovasculares (13, 14).
A incorporao de cidos graxos -3 em membranas celulares influencia a
fluidez, estrutura e funo de vrios receptores, transportadores e enzimas (15). A
incluso dos PUFAs -3 na membrana plasmtica e em membranas intracelulares
tambm modifica a composio de lipid rafts desta e a produo de segundos
mensageiros (16, 17) tais como: fosfatidil inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol (18).
Por outro lado, a substituio do cido linolico (mega-6) pelo cido -linolnico
(mega-3) leva produo de prostanides trienicos, leucotrienos pentaenoicos e
tromboxano-3, havendo reduo da sntese de prostaglandina E2, que prinflamatria (19). EPA e DHA geram resolvinas e protectinas que atenuam a
inflamao (20). Esses mecanismos esto envolvidos nos efeitos dos cidos graxos
em leuccitos.
20
1.3 PUFAS MEGA 3 E PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS
EPA e DHA inibem a produo de IL-1 e do fator de necrose tumoral (TNF-)

por moncitos (21) e a produo de IL-6 e IL-8 por clulas endoteliais (22, 23).
Caughey et al. (1996) relataram correlao inversa entre os contedos de EPA em
clulas mononucleares e a capacidade dessas clulas de produzirem TNF- e IL1-
em resposta a endotoxina (24). Kelley et al. (1999) mostraram que a administrao
de 6 g de DHA por dia, durante 12 semanas, resulta em diminuio da produo de
TNF- (20%) e IL1- (35%) por clulas mononucleares estimuladas por endotoxina
(25). O EPA e o DHA inibem a produo de citocinas inflamatrias como TNF-, IL1, IL-6 e IL-8 por moncitos, macrfagos e clulas endoteliais em cultura (23, 26).
A administrao de leo de peixe diminui a produo de TNF-, IL-1 e IL-6
por macrfagos em roedores (27, 28). A suplementao da dieta de voluntrios
saudveis com leo de peixe (2 g de EPA e DHA por dia) diminui a produo de
TNF-, IL-1 e IL-6 por clulas mononucleares (24, 29-32). Outros autores no
conseguiram demonstrar efeitos dos PUFAs da dieta sobre a produo de citocinas
inflamatrias em seres humanos recebendo menos (33-37) ou mais (35, 38-42) de 2
g de EPA e DHA por dia. Contudo, a suplementao com leo de peixe a 0,3, 1 e 2
gramas por dia resulta em redues significativas na produo de TNF- e IL-6 por
moncitos (32). Calder (2006) props que a relao de EPA e DHA no leo de peixe
determinante para os resultados divergentes reportados (6).
Os PUFAs -3 modificam a atividade dos fatores de transcrio, tais como o
fator nuclear kappa B (NF-B) e o receptor ativador da proliferao de peroxissomas
(PPAR) (43). Estmulos inflamatrios levam fosforilao de serina (IB ser-32 e
ser-36) na poro N-terminal da subunidade inibitria (subunidade inibitria do NFB (IB)), provocando a degradao da subunidade inibitria pelo proteassoma 26S
(44, 45). Este processo ativa o NF-B e a translocao do dmero deste do
citoplasma para o ncleo, onde se liga a regies especficos do DNA, induzindo a
expresso de genes (46, 47). EPA (48) e leo de peixe (49) diminuem a ativao de
NF-B estimulada por LPS (lipopolissacardeo) em culturas de moncitos humanos e
este fato est associado com a diminuio da fosforilao de IB (49, 50). Estas
observaes so sugestivas de que os efeitos diretos de PUFAs -3 sobre a
expresso de molculas inflamatrias ocorre por inibio da ativao do NF-B. Os
PPARs regulam a glicemia, o metabolismo de lipdeos e lipoprotenas, proliferao,
21
diferenciao e apoptose celulares, resposta inflamatria (51) e tumorgnese (52).

PPARs so classificados em trs isotipos (alfa), (beta) ou delta () e (gama),
que diferem na afinidade do ligante, distribuio nos tecidos e expresso (53-55).
PPAR expressa no fgado, corao, msculo e da parede vascular (52), O PPAR
expresso principalmente no crebro e tecido adiposo (56, 57). O PPAR
encontrado no tecido adiposo marrom, tecido adiposo branco (diferenciao dos
adipcitos (58)), clulas -pancreticas, o endotlio vascular e intestino grosso (52),
em menor expresso pelo fgado, rim, corao e msculo esqueltico (59). O PPAR
tambm expresso em clulas T em que seus ligantes podem inibir a proliferao
e produo de IL-2 (60, 61). Em neutrfilos, a sua ausncia leva ao aumento da
quimiotaxia e modulao de citocinas pr-inflamatrias (59). O PPAR aumenta a
diferenciao dos moncitos em macrfagos, preferencialmente para M2 (62) e inibe
a expresso de citocinas inflamatrias tais como TNF-, IL-1 e IL-6 (63, 64).
1.4 DIFERENAS
ENTRE
OS
CIDOS
EICOSAPENTAENICO
(EPA)
DOCOSA-HEXAENICO (DHA)
Embora os efeitos imunomoduladores do leo de peixe sejam bem

conhecidos, ainda no est claro se estes esto associados ao EPA, DHA ou se
decorrem da ao combinada desses dois PUFAs -3 (65).
Nos trabalhos apresentados no Quadro 1, os efeitos de DHA e EPA foram
comparados. Esto indicadas as alteraes induzidas por DHA, EPA ou pelos dois
cidos graxos.
22
2
Qua
adro 1 - Efe
eitos do EP
PA e DHA em diferen
ntes tipos celulares. Foram selecionadoss
algu
uns artigos
s considera
ados releva
antes.
Modelo Experimental
Ex
x vivo Mulheres
E
Ex vivo Hom
mens
Clu
ulas endotelliais de
rato
Efei tos
AG
G
Tratam
mentos
EPA e DHA
inibem a a
agregao
1 M 12 minutos
m
(66)
plaque
etria
EPA
A
coleste
erol na
DHA
A
5 g - 72 horas
h
(67)
EPA
A
12,5 M - 24
4 horas (68)
leo de peixe
1550 g/Kg 6 semanas

s
(27
7)
membran
na celular
C
Clulas Jurkat
(linfcitos T)
IL-2, IIL-10
C
lulas de Ku
upffer
IL--1
e IFN
N-
60 M
Mac
crfagos (c
lulas
Raw 264))
DHA
A
NO e iNOS
NO: 24 h + 24 h LPS
1 h LPS (69
9)
iN OS: 24 h + 12
22 ho
oras:
Mo
oncitos de cabra
Fagoccitose
EPA e DHA
E
EPA: 25,50,100 e 200 M
M
DHA: 100 M
+ 2 horas de fa
agocitose (70
0)
25, 50 e 100 M - 180
Neu
utrfilos de cabra
Fagoccitose
DHA
A*
m
miinutos + 120 minutos com
E. Colli (71)
Lin
nfcitos hum
manos
Inibem a prroliferao
EPA e DHA
10 g/mL 6 dias (72)

25m
mM
Mac
crfagos hum
manos
(LPS - THP--1)
IL-1, IL-6
DHA
A
e NF
F-B
NF-B: 2 horas
h
(73)
Mac
crfagos hum
manos
(LPS - THP--1)
TNF- e e IL-6
EPA
A
Mac
crfagos hum
manos
(LPS - THP--1)
TNF- , IL-1
DHA
A
Neu
utrfilos hum
manos
Citocina: 6 horas
L-6
e IL
LTB
B4
EPA e DHA
25 mM 6 horas (LPS) (73

3)
1000 M 48 ho
oras + 24 LP
PS
(74
4)
3 ou 10 semanas
s
EPA: 9,4
4 g/ dia
23
3
DHA: 5 g/dia (75)
Lin
nfcitos hum
manos
Lin
nfcitos hum
manos
Mon
ncitos hum
manos
leo de
e**
peixe
Prolife rao
leo de peixe
rico em
e
DHA***
Ativa
ao
leo de peixe
rico em EPA
HA
ou DH
No tem e
efeito na
fagoccitose
eo
Suuplementao: 4 g de le
dee peixe/ dia - 12 semanass
(76
6)
Supplementao
o: 4,9 g/dia - 4
semana
as (35)
S
Suplementa
o: 4 g/dia
E PA: [95%] ou DHA:[90%]
7)
(77
S
Suplementa
o: 4 g 6
Mon
ncitos hum
manos
ssemanas e 9 meses (78)
Quimio
otaxia
leo de peixe
S
Suplementa
o: 4 g 9
Neu
utrfilos hum
manos
Neutrfilos
se
moncitos hum
manos
meses
s (78)
No tem e
efeito na
fa
agocitose e e
expresso de
e
molculas d
de adeso
leo de peixe
rico em EPA
ou DH
HA
Suuplementao
o: 4 semana
as
DHA: 4,,9 g/dia
EPA: 4,7 g/dia
g
(35)
As re
efernciass esto indiicadas pelo
os nmero
os entre pa
arnteses.
Abre
eviaturas: ccido graxo (A
AG), eicosap entaenico (EPA)
(
docos
sa-hexaenicco (DHA), leu
ucotrieno B4
4
(LTB4
4), xido ntrico
n
(NO)), interleucin
na-1 (IL1-
), interleuc
cina-2 (IL-2)), interleucina-6 (IL-6),,
interle
eucina-10(IL
L-10), fator de necrose tu
umoral- (TN
NF-), interfe
eron- (IFN-), fator nuclear kappa B
(NF-B), linhagem
m de macrfa
agos human
nos (THP 1), lipopolissa
acardeo (LP
PS).
diminuio,
au
umento.
* Houve
e aumento
o da fagociitose no trratamento com EPA e DHA, porm com
m
DHA
A o aumentto foi mais pronuncia
ado.
** O le
eo de peix
xe contend
do EPA (1
18,8 g/100
0 g totais dde AG) e DHA (7,4
4
g/10
00 g totais de AG) foi comparad
do com ou
utro rico em
m DHA (199,1 g/100 g totais de
e
AG)..
*** A su
uplementa
ao foi co
omposta por:
p
placeb
bo (azeite)), EPA (4,7 g/dia) e
DHA
A (4,9 g/dia
a).
Os achados apre
esentados so indica
ativos de que EPA e DHA ap
presentam
m
efeittos distinto
os sobre a funo de leuccitos
s. No entan
nto, no h estudo sistemtico
s
o
sobrre os efeito
os de DHA e EPA na
a funo de
e neutrfilo
os.
24
1.5 NEUTRFILOS
Os neutrfilos so clulas polimorfonucleadas (PMNs) produzidas na medula

ssea de humanos adultos a partir de clulas precursoras denominadas
mieloblastos (com grnulos promielcitos neutroflicos). Morfologicamente, os
neutrfilos so caracterizados como clulas esfricas que apresentam de 12 a 15
m de dimetro, com ncleo segmentado em 3 a 5 lbulos. Neutrfilos possuem
receptores para a deteco de padres moleculares presentes em micro-organismos
e para a induo de respostas pr-inflamatrias (79) tais como os receptores do tipo
Toll (toll-like receptors ou TLRs) e do tipo NOD (nucleotide-binding protein
oligomerization domain ou NLRs), que esto localizados na membrana celular e no
citoplasma, respectivamente (79, 80). Neutrfilos humanos expressam a maioria dos
TLRs at agora descritos e identificam os seguintes micro-organismos e/ou padres
moleculares: TLRs 1 (bactria), 2 (bactria e fungo [zimosan]), 4 (bactria gram
negativa
[LPS],
fibrinognio),
(flagelina),
(micoplasma),
(pequenos
componentes sintticos), 8 (pequenos componentes sintticos), 9 (bactria) e 10

(desconhecido) (81). Os receptores do tipo NOD 2 e NLRP3 (NOD-like famlia de
receptores, pryin domain containing 3) reconhecem fragmento de peptidioglicano
MDP (bactrias gram positivas e negativas) e DNA bacteriano e ATP,
respectivamente (82).
Os neutrfilos apresentam em seu citoplasma quatro tipos de grnulos:
(1) grnulos azurfilos (ou primrios) so liberados na vescula fagoctica. So
ricos em - defensinas, catepsina G, elastases, proteinase 3, lisozimas, protena de
aumento de permeabilidade bacteriana (BPI), azurocidina (possui atividade
antibacteriana e atividade antifngica contra candida albicans) e mieloperoxidase
(MPO), que desempenham funo importante na patognese da infeco aguda e
inflamao, destinadas destruio e digesto de micro-organismos ou partculas
fagocitadas;
(2) grnulos especficos (ou secundrios) contm lisozima, fosfatase alcalina,
proteinas ligantes a B12, ativador de plasminognio, colagenase, alm de possurem
enzimas que destroem as partculas fagocitadas, como, por exemplo, a lisozima.
Possuem tambm quelantes de ferro e cobre (lactoferrina e transcobalamina);
(3) grnulo gelatinase (tambm conhecido como tercirio) contm gelatinase
acetiltransferase
lisozima.
Grnulo
gelatinase
juntamente
com
grnulos
25
especficos so exocitados quando estimulados. Gelatinase usada para facilitar a

circulao de neutrfilos atravs dos tecidos;
(4) grnulos secretores que contm albumina, receptor para componentes do
complemento (CR-1), tirosinas quinases e fosfolipases. So liberados rapidamente
ao estmulo.
Aps ativao dos neutrfilos por estmulos inflamatrios ou fagocitose de
micro-organismos, os grnulos situados nas proximidades fundem suas membranas
com a dos fagossomos, sendo liberadas enzimas como a MPO para o interior do
fagossomo. A MPO catalisa a converso de perxido de hidrognio formando o
cido hipocloroso (83).
A fagocitose um processo ativo, no qual o patgeno primeiramente
envolvido pela membrana fagoctica e internalizado em uma vescula membranosa
chamada fagossoma, que se acidifica. O fagossoma funde-se com um ou mais
lisossomas para gerar o fagolisossoma. O contedo lisossomal liberado para a
destruio do patgeno (84), com a gerao de peptdeos a serem apresentados s
clulas T, de modo a induzir a resposta imune adquirida (85). Aps a passagem dos
neutrfilos pelo endotlio, essas clulas migram de acordo com o gradiente de
agentes quimioatraentes em direo ao local inflamado, onde so ativados, seja por
contato direto com patgenos ou por meio das aes de citocinas secretadas por
clulas residentes do tecido. Os neutrfilos, na tentativa de eliminar os agentes
invasores, liberam o contedo de seus grnulos, que incluem enzimas proteolticas
como proteinase 3, catepsina G e elastase, EROs (espcies reativas de oxignio) e
espcies reativas de nitrognio (ERN) (86). Os produtos txicos mais importantes
-
so o perxido de hidrognio (H2O2), nion superxido (O2 ), cido hipocloroso

-
(HOCl) e o produto da reao entre o xido ntrico (NO) e o O2 , o peroxinitrito

-
(ONOO ).
Os neutrfilos produzem citocinas cuja funo recrutar outros leuccitos
para o foco inflamatrio (quimiocinas) como IL-8 (interleucina-8), MIP2- (protena
inflamatria de macrfagos) e CINC (citocina indutora de quimiotaxia de neutrfilos)
(87). Essas clulas constituem fonte importante de citocinas pr-inflamatrias como
TNF- e IL-1 e anti-inflamatrias como IL-1ra, fator de crescimento tumoral-
(TGF-) e interleucina 10 (IL-10) (88).
26
1.6 PRODUO DE EROS
A produo de EROs em neutrfilos ativados se d, predominantemente, via

sistema NADPH oxidase (89, 90).
A NADPH oxidase um complexo enzimtico composto por seis protenas:
p22phox (phox: oxidase fagoctica), gp91phox, p47phox, p67phox, p40phox e duas protenas
G de baixo peso molecular chamadas Rac1A e Rac2 (91). A Rac1A est localizada
na membrana plasmtica, enquanto que a Rac2, molcula ativadora na cascata de
sinalizao, encontra-se no citossol na sua forma inativa ligada ao GDP (guanosina
difosfato) (92).
Uma vez no interior do neutrfilo, os micro-organismos so seqestrados para
o fagolisossomo e h ativao do sistema de NADPH oxidase. Este complexo, por
sua vez, gera grandes quantidades de EROs que so liberadas no interior do
fagolisossomo e contribuem para a ao microbicida de neutrfilos
(83)
(esquematizado na Figura 1).

A NADPH oxidase permanece inativa enquanto os seus componentes
citoplasmticos (p47phox, p67phox, p40phox e Rac 2) e de membrana (p22phox e
gp91phox) no esto agregados. A separao dos componentes em compartimentos
celulares distintos garante que a oxidase permanea inativa. Quando a clula
exposta a um estmulo, Rac2 se liga ao GTP (guanosina trifosfato), ao essa
catalisada pela protena P-Rex-1, que atua como GEF (fator de troca de guanosina)
(92), e se desloca para a membrana associando-se s outras protenas oxidases. A
protena p47phox fosforilada pela protena quinase C (PKC) e ento se associa aos
outros componentes citosslicos (p40phox e p67phox). O complexo formado pela
interao dessas protenas, por sua vez, migra para a membrana citoplasmtica,
onde se associa ao flavocitocromo b558 para formar a oxidase ativa (93, 94). A
oxidase organizada capaz agora de transferir eltrons do substrato (NADPH) para
o oxignio (94) (esquematizado na Figura 1).
27
7
Figu
ura 1 - Reprresentao esquemti ca do proce
esso de fag
gocitose e dda produo de EROss
pelo sistema
s
NA
ADPH oxida
ase em neu
utrfilos (95
5). A enzim
ma ativada est
e
apta a
transfferir eltron
ns do sub
bstrato (NA
ADPH) para
a o oxig nio e redu
uzi-lo para
a
forma
ao de nio
on superxiido (O2-) via
a NOX2.
ase em fag
gcitos pod
de ser induuzida por um
u grande
e
A ativao da NADPH oxida
nm
mero de parrtculas e agentes
a
so
olveis, tais
s como: ba
actrias, zyymosan op
psonizado,,
pepttdeos form
milados com
mo o N-forrmyl-L-mettionil-L-leu
ucil-L-fenilaalanina (fM
MLP), e porr
agen
ntes farma
acolgicos, como ion
nforos de clcio e ativadores
a
da PKC, e como oss
steres de forb
bol (PMA). Outros a gentes, co
omo as cito
ocinas pr-inflamatrias (TNF-, G
GM-CSF e IL-8) no ativam a N
NADPH ox
xidase em neutrfiloos, mas ind
duzem um
m
estado de hiper-respons
sividade estimula
o subseq
qente e pproduo de EROs,,
proccesso conh
hecido com
mo efeito ''p
priming'' (9
96).
-
Os agen
ntes oxidantes gerad
dos pela NADPH
N
oxiidase incluuem o O2 , perxido
o
de h
hidrognio (H2O2), radical hidrroxila (OH
H-) e, na presena
p
dda mieloperoxidase,
-
cido
o hipocloro
oso (HOCl) (97). O H2O2 formado a partir
p
do O 2 que convertido
o
pela mielopero
oxidase do
os neutrffilos ou pe
eroxidase de eosinfilos para oxidantess
maiss reativos tais
t
como cidos hip
pocloroso e hipobrom
moso. O ccido hipoc
cloroso o
28
8
princcipal agentte oxidante

e produzid
do pelos ne
eutrfilos (98) (esqueematizado na Figura
a
2).
Figu
ura 2 - Prod
duo de EROs
E
pelo sistema NA
ADPH oxidase (NOX22) e cido peroxinitrito
p
o
pela
a iNOS. Gerao de a
agentes oxid
dantes ap
s a fagocittose de bac
ctria peloss
neuttrfilos. A NADPH oxxidase ativada na membrana do fagoss
soma e oss
eltrrons so transferidoss da NAD
DPH para o oxignioo gerando o radicall
supe
erxido, qu
ue se dismu
uta a perx
xido de hid
drognio. O
Os grnulos
s azurfiloss
conttm a enzima MPO, q
que, na pre
esena de um haleto como o cloreto (Cl-),,
convverte o perrxido de h
hidrognio em cido hipoclorosoo, um potente agente
e
antim
microbiano.. As espcie
es reativas de nitrogn
nio (ERN) aggem em co
onjunto com
m
as EROs
E
causa
ando estressse nitrosativo, sendo que
q essas dduas espcies reativass
so produzidas
s no comba
ate aos ag
gentes invas
sores. O O -reage ra
apidamente
e
2
com
m o NO, e esta reao produz ON
NOO- (perox
xinitrito), quue altamente reativo,,
pode
endo reagirr com outra
as molculas para form
mar outros tiipos de ERN incluindo
o
o ON
NOOH (cid
do peroxinittrito). Figura
a adaptada de Winterbbourn (99).
29
Acreditava-se que os neutrfilos no possuam ou tinham apenas algumas

mitocndrias, e que essas no exerciam funo importante na funo celular. Alm
disso, estudos utilizando microscopia eletrnica quase no identificavam mitocndria
em neutrfilos (100). No entanto, a mitocndria recentemente descrita no neutrfilo
como uma organela peculiar, em comparao com mitocndrias de outros tipos
celulares. Com a tcnica de PCR quantitativo, identificaram que os neutrfilos
possuiam mtDNA (DNA mitocondrial). Alm disso, verificou-se que o nmero de
mitocndrias seria maior do que 5 ou 6 por neutrfilo, o que j havia sido estimado
pela tcnica de microscopia eletrnica (101).
Os neutrfilos tambm podem produzir EROs pela cadeia de transporte de
eltrons (CTE) que est localizada na membrana interna da mitocndria, e que
produz ATP em organismos aerbios. Esta formada por cinco complexos
proticos: NADH desidrogenase (complexo I), succinato desidrogenase (complexo
II), complexo citocromo bc1 (complexo III), ciclo-oxigenase (COX) (complexo IV) e
-
ATP sintase (complexo V) (102). As mitocndrias geram O2 principalmente pela

reduo univalente do oxignio nos complexos I e III da cadeia de transporte de
eltrons (103), sendo que o complexo I contribui com o escape de eltrons na matriz
-
mitocondrial e o complexo III na matriz e no citoplasma. O O2 , tambm pode ser

gerado atravs, do sistema xantina-xantina oxidase e do citocromo P450. O radical
-
O 2
ento formado, caso no seja eficientemente eliminado pelo sistema
antioxidante, pode ainda ser convertido em H2O2 e radical hidroxil (104, 105).
1.7 XIDO NTRICO (NO)
O xido ntrico (NO) sintetizado a partir da L-arginina pela enzima NO

sintase induzvel (iNOS). Existem duas formas de NO sintase: I) a constitutiva, com
baixa atividade, est presente no endotlio vascular e sistema nervoso central e
produz baixas quantidades de xido ntrico; II) a indutiva, que possui alta atividade e
produzida por fagcitos quando estes so estimulados (94). Alm das clulas
endoteliais, o xido ntrico sintetizado pelos macrfagos (106), neutrfilos (107) e
cerebelo (108).
Em macrfagos e neutrfilos, o NO participa das respostas
imunolgica e inflamatria (109, 110).

O NO citotxico e causa danos por sua capacidade de difuso e tambm
30
por se combinar com o O2 , formando o peroxinitrito (ONOO ), um radical muito mais

-
potente que o NO e o O2 . O perxinitrito, produto formado pela reao do O2 com

o NO, um potente oxidante, com propriedades similares ao radical hidroxil, e reage
com on H+ formando ONOOH (cido peroxinitrito) que se decompe em HO e
radical dixido de nitrognio (NO2) (111) (Figura 2).
O NO pode tambm exercer efeito txico, combinando-se a grupos heme, de
vrias enzimas, inativando-as, bloqueando a respirao e levando morte da clula
(112).
31
2 JUSTIFICATIVA PARA A REALIZAO DO ESTUDO
O leo de peixe apresenta propriedades anti-inflamatrias, contudo, ainda no

se sabe se este efeito devido ao EPA, DHA ou a uma ao conjunta dos dois
cidos graxos mega-3. Neste estudo, comparamos os efeitos de EPA e DHA na
funo de neutrfilos de ratos ex vivo.
32
OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a influncia de EPA e DHA sobre a funo de neutrfilos de ratos

ex vivo.
3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Comparar os efeitos do EPA e DHA sobre:

1) a morte de neutrfilos;
2) produo de citocinas (TNF-, IL-1, CINC-2, IL-10 e IL-6);
3) produo de NO e EROs;
4) atividade fagocitria;
5) atividade fungicida.
33
4 MATERIAL E MTODOS
4.1 PREPARO DAS SOLUES DE EPA E DHA
Os cidos graxos (EPA e DHA), adquiridos da Sigma Chemical Company (St.

Louis, MO, USA), foram diludos em etanol conforme descrito em trabalho anterior
do grupo em macrfagos (113).
4.2 ANIMAIS
Ratos Wistar machos (Rattus novergicus) pesando 200 20 g foram obtidos

do biotrio do Instituto de Cincias Biomdicas da Universidade de So Paulo. Os
animais foram mantidos no biotrio de experimentao do Departamento de
Fisiologia e Biofsica, temperatura de 23 C, sob ciclo claro: escuro de 12 horas e
tiveram livre acesso rao e gua.
Os procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pela Comisso
de tica em Experimentao Animal (CEEA) do Instituto de Cincias Biomdicas da
Universidade de So Paulo (protocolo n 103 nas fls 74 do livro 02).
4.3 OBTENO DE NEUTRFILOS
As clulas foram obtidas 3 horas aps a administrao intraperitoneal de

soluo estril de glicognio de ostra (SIGMA, Tipo II) a 1% em PBS (cloreto de
sdio 136,8 mM, cloreto de potssio 2,7 mM, fosfato de potssio 0,9 mM, fosfato de
sdio dibsico 6,4 mM; pH: 7,4). A coleta das clulas foi realizada por lavagem da
cavidade peritoneal com cerca de 50 mL de PBS estril). Em seguida, as clulas
foram centrifugadas a 1200 rpm por 10 minutos a 4 C. Descartou-se o
sobrenadante e as clulas foram ressuspendidas em soluo hipotnica de cloreto
de amnia (cloreto de amnia 150 mM, bicarbonato de sdio 10 mM, EDTA 0,1 mM;
pH: 7,4) para a lise das hemcias. Aps essa etapa, as clulas foram centrifugadas
a 1200 rpm por 10 minutos a 4 C e lavadas com PBS. Posteriormente, foram
ressuspendidas em meio RPMI-1640 tamponado com bicarbonato de sdio 24 mM,
HEPES 20 mM, enriquecido com 10% de soro fetal bovino (SFB) e glutamina 2 mM,
34
e adicionado de antibiticos (10 U/mL de penicilina e 10 g/mL de estreptomicina) ou

PBS suplementado [cloreto de clcio (1 mM), cloreto de magnsio (1,5 mM), glicose
(10 mM) e SFB (10%)]. A contagem celular foi realizada em cmara de Neubauer
utilizando lquido de Turk como diluente. A populao celular utilizada neste estudo
continha principalmente neutrfilos como pode ser observado no quadro abaixo:
Quadro 2 - Contagem de clulas peritoneais no perodo de 3 horas aps administrao de

glicognio de ostra (1%). Resultados esto expressos como mdia E.P.M de dois
animais.
Clulas peritoneais
Porcentagem (3 horas)
Neutrfilos
94 2
Macrfagos
06 2
4.4 AVALIAO DA CITOXICIDADE DE EPA E DHA
Para avaliar a toxicidade dos cidos graxos foram feitos os ensaios de

integridade de membrana e fragmentao de DNA em clulas incubadas com vrias
concentraes de EPA e DHA (12,5 M 150 M). Clulas obtidas do lavado
peritoneal foram colocadas (2,5 x 106 clulas/mL) em placas de 24 poos e tratadas
com vrias concentraes de EPA e DHA por 4 ou 18 horas em meio RPMI como
mostrado por Vinolo et al.(2010) (114). Aps o tratamento, avaliou-se a integridade
da membrana plasmtica e a fragmentao de DNA em citmetro de fluxo
(FACSCalibur, Becton Dickinson, EUA) utilizando o fluorforo iodeto de propdio (IP),
conforme descrito em trabalho anterior do grupo em macrfagos (113).
Esses ensaios foram realizados com o objetivo de estabelecer as
concentraes no txicas desses cidos graxos a serem utilizadas nos
experimentos seguintes. Em todos os experimentos utilizou-se controle contendo
clulas incubadas com a concentrao mxima de etanol ( 0,5%) usada na diluio
dos cidos graxos.
35
5
4.4.1
1 Avalia
o da integ
gridade da membrana celular
Para a anlise
a
de integridad
de de mem
mbrana, as clulas fooram centrifugadas e
o pre
ecipitado foi
f ressusp
pendido em
m 500 L de PBS, ao
a qual se adicionou
u 50 L de
e
soluo de IP (20 g/mL
L). As clu
ulas foram imediatam
mente ana lisadas no
o citmetro
o
de fluxo (Becto
on Dickinson) a 488 nm do las
ser de arg
nio para eexcitao e canal de
e
fluorrescncia laranja-verrmelho (58
85/42 nm)) para leitu
ura. Foram
m adquiridos 10.000
0
even
ntos por am
mostra e a anlise fo
oi, posterio
ormente, re
ealizada uttilizando o programa
a
Cell Quest (Be
ecton Dickinson, EUA
A).
A avalia
ao da inttegridade d
de membra
ana foi rea
alizada util izando IP, que um
m
composto fluorrescente altamente
a
ssolvel em
m gua e que
q no atrravessa membranas
m
s
intacctas. O IP entra apenas nas cclulas com
m perda da
a integridaade de membrana, e
se in
ntercala en
ntre as bas
ses do DNA
A.
4.4.2
2 Avalia
o da fragm
mentao de DNA
As clulas foram centrifuga

adas e o precipitado foi ressusspendido em
e 300 L
L
de ssoluo hip
potnica co
ontendo 50
0 g/mL de
e IP, 0,1% de citratoo de sdio e 0,1% de
e
Trito
on X-100, que
q permeabiliza as clulas, e permite a incorporao do PI no
n DNA.
Os tubo
os foram in
ncubados p
por 30 min
nutos a tem
mperatura aambiente no
n escuro..
Apss esse perodo, as amostras
a
fforam ana
alisadas no
o citmetroo de fluxo em que a
pressena de fragmentos
s com baixxa fluoresc
cncia in
ndicativa dde clivagem
m do DNA
A
(115
5). As anliises foram realizadass como descrito acim
ma.
4.5 D
DETERMINAO DAS CITOC
CINAS
Neutrfiilos de ra
ato foram
m plaquea
ados na concentra
c
o de 2,5
2
x 106
clulas/mL, a 37 C, em
m atmosferra com 5%
% de CO2, em placaas de cultura de 24
4
poo
os. As cllulas foram
m mantida
as em me
eio RPMI 1640
1
conteendo SFB (10%). A
conccentrao de LPS (E
Escherichia
a coli 0111
1:B4 SIGM
MA) utilizadda nos exp
perimentoss
foi de 5 g/mL
L e a coleta
a do sobre nadante fo
oi realizada
a aps 18 horas de incubao..
O so
obrenadan
nte das culturas foi o
obtido por centrifugao (12000 rpm, 10 minutos)
m
e
36
6
cong
gelado (-80
0 C) para posterior d
determina
o das cittocinas.
A quanttificao da
as citocina
as TNF- , IL-1 e CINC-2 prodduzidas ex vivo peloss
neuttrfilos (so
obrenadan
nte das cculturas) foi
f
realizada pelo mtodo de
d ensaio
o
imun
noenzimtiico (ELISA
A) utilizand
do kits Duo
oSet da R&
&D System
m (Minneapolis, MN,,
USA
A) de acord
do com pro
ocedimento
o fornecido
o pelo fabriicante.
4.6 A
AVALIA
O DA PRODUO DE NO
A determ
minao de
d nitrito prresente no
o sobrenad
dante um
ma forma indireta de
e
avaliar a produ
uo de NO
O pelas c
lulas. O mtodo
m
utilizado foi o de Ding et al. (116)..
ente no so
obrenadantte das culturas reag
ge com a ssulfanilamida e o -O niitrito prese
naftil etilenodia
amina form
mando um azo compo
osto, o qua
al absorve luz no com
mprimento
o
de 5
550 nm. Esse procedimento te
em sido uttilizado em
m diversoss trabalhos
s do grupo
o
(117
7-119).
As clulas (2,5 x 106 por po
oo) foram mantidas em estufaa de CO2 a 37C porr
18 h
horas com concentra
es no ttxicas de EPA e DH
HA na preseena ou n
o de LPS
S
(5 ug/mL). Aps o pero
odo de inccubao, 100
1
L dos sobrenaadantes da
as culturass
foram
m transferridos para placa de
e 96 poos
s e, poste
eriormente , adicionou-se iguall
volume do rea
agente de
e Griess (ssoluo de sulfanila
amida a 1 % e solu
o de -naftiletilenodia
amino a 0,1
1%). A con
ncentrao
o do nitrito foi determ inada por densidade
e
a em espe
ectrofotmetro a 550
0 nm (Spe
ectra MAX
X plus, Moolecular Devices). A
tica
quan
ntificao foi
f realizad
da utilizand
do curva pa
adro de nitrito
n
de sdio (5 80 M).
4.7 A
AVALIA
O DA PRODUO DE ESPCIES REA
ATIVAS DE
E OXIGNIO
A anlisse do efeito dos c idos EPA e DHA so

obre a prooduo de
e espcies
reatiivas de oxxignio porr neutrfilo
os foi realiz
zada pelas
s tcnicas: AMPLEX
X ultrared
que permite determinar

d
principalm
mente per
xido de hidrognio
h
nos meio
os intra- e
extra
acelular e a tcnica
a de quimiioluminesc
cncia amp
plificada ppela lucige
enina (N,N
N
Dime
ethyl 9,9
9
biac
cridinium d
dinitrate) utilizada na
n quantifficao ex
xtracelularr
-
princcipalmente
e de O2 .
4.7.1
1 Avalia
o de per
xido de hid
drognio (H
( 2O2) pelo
o mtodo dde Amplex
Ultrared
d
37
7
ensaio
de fluorescn
f
ncia
utiliza
ando
o reagente
Amplex Ultrared
d
(Invitrogen, Ca
arlsbad, CA
A, USA) outra forrma de quantificar R
ROS, porm permite
e
ectar princcipalmente
e perxido
o de hidrrognio. Placas
P
dee 96 po
os foram
m
dete
prep
paradas co
ontendo 5 x 105 clula
as em 250
0 L (2 x 10
06 cl/mL) PBS supllementado
o
(1 m
mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 10 m
mM glicose
e e 10% SF
FB), Ampleex Ultrare
ed (50 M))
e HR
RP tipo II (0
0,1 U/mL),, na ausn
ncia ou presena de EPA
E
ou DH
HA (12,5 M,
25 M,,
50
M, 100 M, 150 M
M) e PMA (10 nM), totalizando
o volume final de 20
00 L. Oss
ensa
aios foram realizados
s em dupliicata. A placa foi inc
cubada no escuro a 37 C, em
m
atmo
osfera mida, por 1 h,
h seguido
o da leitura em fluorm
metro (Synnergy HT Multi-Mode
M
e
Micrroplate Rea
ader) (exciitao 530
0 nM/ emis
sso 590 nM) (120). O
Os resulta
ados foram
m
exprressos com
mo fluores
scncia ao
o longo de 1 h, subttraindo-se a leitura do branco
o
(messmos
re
eagentes,
porm
sem
clulas).
c
Ampplex
(N--acetil-3,7--
diidrroxifenoxazzina) atua como doa dor de eltrons para a reao de redu

o do H2O2
catalisada pela
a HRP, na
a proporo
o de 1:1. O produto da oxidao do Amplex pela
a
HRP
P denom
minado reso
orufina, um
m compostto vermelh
ho, estvel e fluoresc
cente, que
e
pode
e ser quan
ntificado po
or fluorime
etria, sendo uma evidncia inddireta da quantidade
q
e
de p
perxido de
e hidrognio na amosstra (121). Amplex ultrared tem
m sido relattada como
o
uma
a tcnica alltamente sensvel pa
ara avaliar a produo de H2O2 (122).
4.7.2
2 Avalia
o do niion super
xido (O2--) pela tc
cnica de qquimiolumiinescncia
a
amplificcada pela lu
ucigenina
A sonda
a lucigenin
na permite avaliar prrincipalmen
nte a produuo extra
acelular de
e
-
O2 (123, 124
4). Essa tcnica
t
se
e baseia na redu
o da sonnda, que ocorre na
a
-
pressena de O2 , e formao de
e um com
mposto excitado (accridona), o qual, ao
o
retorrnar ao esttado funda
amental, em
mite lumine
escncia.
Resumidamente, placas op
pacas (bra
ancas) de 96 pooss foram preparadas
p
s
conttendo 5 x 105 clula
as em 250
0 L de PBS
P
suplementado ccom CaCl2 (1 mM),,
-
MgC
Cl2 (1,5 mM
M), glicose (10 mM) e SFB (10
0%) . A pro
oduo dee O2 foi monitorada,
m
,
apss a adio
o de lucige
enina (1 m
mM), em lu
uminmetrro (EG&G Berthold Microplate
e
Lum
minometer, Berthold Technolog
gies, Germ
many) por 60 minutoos. Foram utilizadoss
conttroles nega
ativos conttendo todo
os os comp
ponentes exceto
e
as clulas, pa
ara avaliarr
38
8
se h
havia algum
ma interferrncia nass determinaes. Ne
estes expeerimentos, utilizou-se
e
como controle
es positivos PMA e zimosa
an (Zymos
san A froom Sacch
haromycess
cere
evisiae, SIG
GMA). A anlise
a
doss resultado
os foi realiizada utilizzando a integral dass
curvvas obtidass ao longo do perodo
o de anlis
se para cad
da uma daas amostras.
4.7.3
3 Inibidore
es da NAD
DPH oxidasse e da oxiidao dos
s AG
Etomoxir (inibidor da oxid

dao de AG, pois
s inibe a carnitina
a palmitoill
transsferase-I, CPT-I) 10
0 M
(32
2) e difenil-eneiodn
nio (DPI) ((inibidor da NADPH
H
oxida
M (125) fo
oram utiliz ados em alguns ex
xperimentoos com o intuito de
e
ase) 2 M
invesstigar os mecanism
mos involvid
dos na prroduo de EROs i nduzida por
p EPA e
DHA
A. Os inibid
dores foram incubad
dos por 30
0 minutos antes da aadio dos
s AGs em
m
temp
peratura ambiente no
n escuro (125) com
m os neutr
filos em placa bran
nca de 96
6
poo
os. Aps este perodo
o, foi feita a anlise como
c
desc
crito acimaa.
As conccentraes
s dos inibid
dores utiliz
zadas nestte ensaio foram dete
erminadass
atravvs da anlise
a
inttegridade de membrana e fragmentaao de DNA doss
neuttrfilos. O etomoxir fo
oi avaliado
o nas conc
centraes de 10 e 225 M e o DPI em 2,,
5 e 10 M. Estas
E
conc
centraess no fora
am txicas
s para as clulas (d
dados no
o
mostrados).
OBTEN
O DE SORO HOM
LOGO NO
ORMAL (S
SHN)
4.8 O
A coleta
a de sangu
ue de rato
os, machos
s, adultos foi realizaada por decapitao,,
sem uso de anticoagula
a
ante. Apss retrao do cogu
ulo, o sanggue foi ce
entrifugado
o
00 rpm, durante
d
20
0 minutos,, a 4 C)) para ob
bteno doo soro. O soro foii
(200
postteriormente
e fracionad
do em volu
umes de 1 mL e arma
azenado a -20 C at
o uso.
O soro foi utiliza
ado para opsoniza
o do zim
mosan, quue foi usa
ado como
o
-
conttrole positivo na prroduo d e O2 e opsoniza

o de Ca
Candida alb
bicans na
a
avaliao da fa
agocitose e atividade
e fungicida
a.
4.9 O
OPSONIZA
AO DO ZIMOSAN
N
O zimossan foi dilu

udo em PB
BS e, aps
s determina
ao do nmero de partculas,
39
9
alqu
uotas foram
m preparad
das e cong
geladas. No
N momento do expeerimento, o zimosan
n
foi in
ncubado com o mes
smo volum e de soro de rato, como
c
desccrito no item
m 4.8, porr
30 m
minutos a 37 C sob
s
agitao lenta.. O zimos
san j oppsonizado foi ento
o
centtrifugado e ressuspe
endido em PBS. O zimosan
z
opsonizado
o
o foi adicio
onado nass
clulas do lava
ado peritoneal imed iatamente antes da leitura cinntica de 60
6 minutoss
-
produo de
d O2 , de
e modo qu
ue, ao final, foram ad
dicionadass cinco parrtculas de
e
da p
zimo
osan por c
lula.
4.10
0 AVALIA
O
DA
A
CAPAC
CIDADE
FAGOCIT
TRIA
DA
ATIVIDADE
E
FUNGICIIDA, EX VIVO, DE C
CLULAS PERITONE
P
EAIS
As leve
eduras forram obtid as aps cultura de
e 24 hora
ras em meio
m
gar-Sabo
ouraud (Difco BD, Le
L Pont de
e Claix, Fra
ana, Euro
opa). Foi fe
feita uma suspenso
s
o
de C
Candida alb
bicans em
m PBS est
ril (pH 7,4
4) e SHN, perfazendoo um total de 3,75 x
106/1
1,5 mL. Esta suspenso foi in
ncubada a 37 C, so
ob agitao lenta, durante
d
30
0
minu
utos. Esse procedimento foi re
ealizado em
m condies assptiicas empre
egando-se
e
mate
eriais estrreis.
4.10
0.1
Ensa
aios de fago
ocitose e d
de atividad
de fungicida
a de neutr
rfilos
Candida
as albicans opsoniza
adas foram
m adiciona
adas em m
microtubos
s estreis,,
como relatado
o no item 4.10, nass clulas peritoneais
s na propporo de 1:5 (126))
conttendo PBS
S suplemen
ntado com CaCl2 (1 mM),
m
MgCl2 (1,5 mM
M), glicose (10 mM) e
SFB
B (10%). Os
O tubos foram
f
incu
ubados a 37 C em
m agitaoo lenta, durante 40
0
minu
utos, com EPA e DHA.
D
Apss o perod
do acima mencionaado, alquo
otas desta
a
soluo foram retiradas e utilizadass para a ciitocentrifug
gao, coraados poste
eriormente
e
pela tcnica de May-Grunwald--Giemsa modificada
m
a (127). Para ava
aliao da
a
fago
ocitose, forram contad
das, no m nimo, 100 clulas po
or lmina, sendo con
nsideradass
como tendo re
ealizado fa
agocitose as clulas
s que apresentaram
m, pelo me
enos, uma
a
Candida albicans intern
nalizada (1
128-130). A atividad
de fungicidda foi avaliada pela
a
tcnica de colo
orao pro
oposta por Herscowittz (1981) (131). Nestta tcnica, levedurass
vivass coram-se
e de azul com
c
May-G
Grunwald-G
Giemsa, enquanto leeveduras mortas
m
no
o
se ccoram. A atividade
a
fungicida
f
ffoi avaliada contando-se, no m
mnimo, 10
00 clulass
40
que fagocitaram Candida albicans. Como o nmero de leveduras fagocitadas e

mortas varia, a atividade fungicida foi expressa por meio de escore conforme critrio
estabelecido por Corazzini (1993) (132) e descrito abaixo (Tabela 1):
Tabela 1 - Valores de escore para a atividade fungicida de neutrfilos.
Resultado
Escore
n de neutrfilos com zero Candida albicans morta
X0
n de neutrfilos com 1 a 2 Candida albicans mortas
X1
n de neutrfilos com 3 a 4 Candida albicans mortas
X2
n de neutrfilos com + 4 Candida albicans mortas
X3
4.11 ANLISE ESTATSTICA
Os resultados esto expressos como mdia erro padro da mdia. O

programa Prisma 5.02 (Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA) foi utilizado
para
realizao
das
anlises
estatsticas.
Comparaes
entre
os
grupos
experimentais foram realizadas por anlise de varincia one-way ANOVA e psteste de Dunnet. Para comparaes com dois fatores (os dois AGs e vrias
concentraes dos mesmos) foi usado two-way ANOVA com ps-teste de
Bonferroni. As diferenas foram consideradas significativas para p < 0,05.
41
RESULTADOS
5.1
TOXICIDADE DOS CIDOS GRAXOS EM NEUTRFILOS
Os neutrfilos foram incubados com vrias concentraes dos AGs (DHA e

EPA) e, aps 4 e 18 horas, avaliou-se por citometria de fluxo, utilizando o fluorforo
iodeto de propdio, a integridade de membrana e o estado de fragmentao do DNA.
No perodo de 4 horas, o DHA (Figura 3 A) induziu perda de integridade de
membrana na concentrao de 250 M, j o EPA alterou esse parmetro a partir da
concentrao de 300M (Figura 3 B). Com relao fragmentao de DNA, o EPA
teve efeito a partir de 200 M (Figura 4 B) enquanto que o DHA a partir de 150M
(Figura 4 A). No perodo de 18 horas, o EPA na concentrao de 150M e o DHA a
75M induziram perda de integridade da membrana. Aumento da fragmentao de
DNA aps 18 horas de incubao ocorreu na concentrao de 100M para o EPA e
75M para o DHA (Figura 6).
O controle tratado com etanol, o veculo utilizado para a preparao dos AGs,
no causou perda da integridade de membrana ou fragmentao do DNA. Assim, a
concentrao de etanol utilizado (0,5%) no citotxica. Resultado semelhante foi
obtido por Lima et al. em macrfagos (117).
Com base nestes resultados, estabeleceu-se as concentraes mximas no
txicas dos AGs para os neutrfilos em cultura por 4 e 18 horas (Tabela 2).
42
2
Figurra 3 - Avaliao por citometria

c
de
e fluxo do efeito
e
de DH
HA e EPA sobre a inte
egridade de
e
mem
mbrana em neutrfilos
n
ob
btidos de rattos e incubados por quaatro horas. O controle foii
trata
ado com o mesmo
m
volum
me de etano
ol. Resultados esto exxpressos com
mo mdia
E.P.M de pelo menos
m
quatrro animais em
e triplicata.. * p < 0,055 quando comparado ao
o
controle.
43
3
Figurra 4 - Avalia
ao por cito
ometria de fl uxo do efeito
o de DHA e EPA sobre a fragmentao de DNA
A
de neu
utrfilos obtid
dos de ratoss e incubados por quatro horas. O coontrole foi tra
atado com o
mesm
mo volume de etanol. R
Resultados esto expressos como m
mdia E.P
P.M de pelo
o
menoss cinco animais em tripliccata. * p < 0,05 quando comparado
c
aao controle.
44
4
Figurra 5 - Avaliao por citometria

c
de
e fluxo do efeito
e
de DH
HA e EPA sobre a inte
egridade de
e
mem
mbrana em neutrfilos ob
btidos de rato
os e incubad
dos por dezooito horas. O controle foii
trata
ado com o mesmo
m
volum
me de etano
ol. Resultados esto exxpressos com
mo mdia
E.P.M de pelo menos
m
quatrro animais em
e triplicata.. * p < 0,055 quando comparado ao
o
controle e # p < 0,05
0
na com parao entrre DHA e EP
PA.
Figurra 6 - Avalia
ao por citometria de flu
uxo do efeito
o de DHA e EPA sobre a fragmentao de DNA
A
de neu
utrfilos obtid
dos de ratoss e incubados por dezoito
o horas. O coontrole foi tra
atado com o
mesm
mo volume de etanol. R
Resultados esto expressos como m
mdia E.P
P.M de pelo
o
menoss quatro anim
mais em trip licata. * p < 0,05 quando
o comparadoo ao controle
e. # p < 0,05
5
na com
mparao en
ntre DHA e E
EPA.
45
Tabela 2 - Concentraes mximas no txicas dos cidos EPA e DHA em neutrfilos.
cidos graxos
5.2
Perodo de tratamento
4 horas
18 horas
EPA
150M
75M
DHA
100M
50M
TOXICIDADE DE DHA E EPA EM NEUTRFILOS TRATADOS COM LPS
Os neutrfilos foram incubados com as mesmas concentraes de AGs (DHA

e EPA) anteriormente citadas e LPS (5 g/mL) por 18 horas. Aps esse perodo,
avaliou-se a integridade de membrana e a fragmentao de DNA.
Em relao fragmentao de DNA, na presena de LPS, houve maior
toxicidade do DHA em relao ao EPA somente na concentrao de 100 M (Figura
8). EPA e o DHA causaram perda de integridade de membrana com 100 M na
presena do LPS (Figura 7).
46
6
Figurra 7 - Avalia
ao por cito
ometria de flu
uxo do efeito
o de DHA e EPA, na preesena do LPS,
L
sobre a
integriidade de membrana em n
neutrfilos obtidos de rattos e incubaddos por dezo
oito horas. O
contro
ole foi tratado com o me
esmo volume
e de etanol. Resultadoss esto exprressos como
o
mdia
a E.P.M de pelo menoss quatro anim
mais em triplicata. * p < 00,05 quando
o comparado
o
ao con
ntrole.
Figurra 8 - Avalia
ao por cito
ometria de flu
uxo do efeito
o de DHA e EPA, na preesena do LPS,
L
sobre a
fragme
entao de DNA de neu
utrfilos obtidos de ratos
s e incubadoos por dezo
oito horas. O
contro
ole foi tratado com o me
esmo volume
e de etanol. Resultadoss esto exprressos como
o
mdia
a E.P.M de pelo menoss quatro anim
mais em triplicata. * p < 00,05 quando
o comparado
o
ao con
ntrole. # p < 0,05 na com
mparao enttre DHA e EP
PA.
47
5.3
PRODUO DE CITOCINAS
Os neutrfilos foram avaliados quanto capacidade de produzir CINC-2, TNF e IL-1 na presena de concentraes no txicas dos cidos graxos e LPS. A
quantificao das citocinas no sobrenadante foi realizada aps 18 horas de cultura.
O EPA aumentou a produo de CINC-2 no perodo de 18 horas de
incubao dos neutrfilos a partir da concentrao de 25 M (25 M aumentou 2,2 e
50 M 2,9 vezes). Com DHA no foi observada qualquer alterao (Figura 9). O LPS
aumentou em 9,8 vezes a produo de CINC-2. EPA a partir de 25M apresentou
efeito aditivo ao LPS na produo de CINC-2 pelos neutrfilos (25 M de 2,19 e 50
M 2,16 vezes). O DHA no provocou qualquer alterao (Figura 10).
A produo de TNF- foi aumentada nas clulas incubadas com 25 M de
EPA e DHA. Com 50 M, o DHA causou diminuio na produo de TNF-, porm,
na presena de EPA, a produo nos neutrfilos manteve-se elevada (Figura 11). O
tratamento com LPS elevou a produo de TNF- em 17,7 vezes. Contudo, na
presena do LPS, os AGs no alteraram a produo de TNF- (Figura 12).
A produo de IL-1 no foi alterada quando os neutrfilos foram tratados
com EPA ou DHA (Figura 13). Porm, na presena de LPS, o DHA (50 M)
aumentou a produo desta citocina (1,5 vezes) (Figura 14). No controle, o LPS
aumentou a produo de IL-1 em 1,4 vezes.
48
8
Figurra 9 - Produ
uo de CINC-2 por neu
utrfilos obtid
dos de ratos
s (2x106 cluulas/mL). A produo
p
de
e
CINC--2 foi avaliad
da no sobren
nadante das clulas incubadas por ddezoito horas
s com vriass
concentraes de AGs. O con
ntrole foi trata
ado com o mesmo
m
volum
me de etanol. Resultadoss
esto expressos como
c
mdia
a E.P.M. de
d pelo menos dez anim
mais. * p < 0,05
0
quando
o
compa
arado ao con
ntrole.
NC-2 por neu

utrfilos obtidos de ratos
p
de
e
Figurra 10 - Produo de CIN
CINC
C-2 foi avaliada no sob
brenadante das clulas incubadas por dezoito horas com
m
vria
as concentra
aes de AG
Gs com LPS. O controle foi
f tratado coom o mesmo
o volume de
e
etanol. Resultado
os esto exp
pressos com
mo mdia E.P.M.
E
de peelo menos de
ez animais. *
p < 0,05
0
quando comparado ao controle.
49
9
Figurra 11 - Prod
duo de TN
NF- por neu
utrfilos obtid
dos de ratos
p
de
e
TNF- foi avaliad
da no sobren
nadante das clulas incu
ubadas por ddezoito horas
s com vriass
conccentraes de
d AGs. O controle fo
oi tratado com
c
o messmo volume de etanol..
Resu
ultados esto expressoss como mdiia E.P.M. de pelo mennos nove an
nimais. * p <
0,05 quando com
mparado ao ccontrole.
Figurra 12 - Prod
duo de TN
NF- por neu
utrfilos obtid
dos de ratos
p
de
e
TNF- foi avaliad
da em sobre nadante das
s clulas incu
ubadas por ddezoito horas
s com vriass
conccentraes de
d AGs com
m estmulo do
d LPS. O controle foi tratado com
m o mesmo
o
volum
me de etano
ol. Resultad os esto ex
xpressos com
mo mdia E.P.M. de pelo menoss
nove
e animais.
50
0
uo de IL1-- por neutr

filos obtidos
s de ratos (2x
x106 clulas//mL). A produo de IL1-Figurra 13 - Produ
foi avaliada no
n sobrenada
ante das c
lulas incuba
adas por deezoito horas com vriass
conccentraes de
d AGs. O controle fo
oi tratado com
c
o messmo volume de etanol..
Resu
ultados esto
o expressos como mdia
a E.P.M de pelo menoss quatorze an
nimais.
uo de IL1-- por neutr

filos obtidos
s de ratos (2x
x106 clulas//mL). A produo de IL1-Figurra 14 - Produ
foi avaliada no
n sobrenada
ante das c
lulas incuba
adas por deezoito horas com vriass
conccentraes de
d AGs com
m estmulo do
d LPS. O controle foi tratado com
m o mesmo
o
volum
me de etano
ol. Resultad os esto ex
xpressos com
mo mdia E.P.M. de pelo menoss
doze
e animais. * p < 0,05 qua ndo compara
ado ao contrrole. # p < 0, 05 na compa
arao entre
e
DHA
A e EPA.
51
1
5.4 E
EFEITOS DOS AGS SOBRE A PRODU
O DE XIDO
NT RICO (NO
O)
A produ
uo de NO
O por neuttrfilos no
o foi modifficada por EPA e DH
HA (Figura
a
15). Clulas estimuladas
e
s com LPS
S tiveram a produ
o de NO aumentad
da em 2,2
2
veze
es. Esse effeito no fo
oi modifica
ado pelos AGs
A
(Figurra 16).
Figurra 15 - Pro
oduo de xido
ntrico por neutrffilos obtidos de ratos (22x106 clula

as/mL) apss
trata
amento com vrias conccentraes de
d AGs. O controle foi tratado com
m o mesmo
o
volum
me de etan
nol. Os valo
ores represe
entam a mdia E.P.M
M de pelo menos
m
nove
e
anim
mais.
Figurra 16 - Detterminao da
d produo
o de xido ntrico por neutrfilos oobtidos de ratos
r
(2x106
NO foi avalia
clullas/mL). A prroduo de N
ada em sobrrenadante daas clulas incubadas porr
dezo
oito horas co
om vrias co
oncentraes
s de AGs com
m LPS. O coontrole foi tra
atado com o
mesmo volume de etanol. R
Resultados esto
e
expres
ssos como mdia E.P
P.M de pelo
o
menos nove anim
mais.
52
2
5.5 E
EFEITOS DE EPA E DHA SO
OBRE A PRODU
P
O DE ES PCIES REATIVAS
R
S
DE OXIG
GNIO (ER
ROS)
5.5.1
1 Produ
o de H2O2
A produ
uo de H2O2 por ne
eutrfilos fo
oi avaliada
a durante 660 minutos
s a 37 C..
Na p
presena de
d 50 M de DHA, houve aumento da produo de H2O2, enquanto
o
que, para o EP
PA, isto ocorreu som ente a parrtir de 100 M (Figuraa 17). EPA
A e DHA, a
partiir de 50 M
M, aumenttaram a prroduo de H2O2 po
or neutrfiloos estimullados com
m
PMA
A. Porm, com 100
0 e 150 M, o EPA causo
ou maior produo de H2O2
comparado ao
o DHA (1,34 vezes em 100 e 150 M) (Figura 18). No controle,
c
o
amento com
m PMA aumentou em
m 22,9 vez
zes a produ
uo de H2 O2.
trata
53
3
Figurra 17 -Efeito
o dos AGs (EPA e DHA
A) na produ
uo de perrxido de hiddrognio po
or neutrfiloss
obtido
os de ratos. A produo de H2O2 foi avaliada em
m clulas inccubadas porr 60 minutoss
com vrias
v
concen
ntraes de AGs. O conttrole foi trata
ado com o m
mesmo volum
me de etanol..
Resulttados esto expressos ccomo mdia
a E.P.M de
e pelo menoos quatro an
nimais. * p <
0,05 quando
q
comp
parado ao co
ontrole.
Figurra 18 - Determinao da
a produo d
de perxido de
d hidrognio por neutrfilos obtidos
s de ratos. A
produo de H2O2 foi ava
aliada em clulas incub
badas por 660 minutos com vriass
conccentraes de EPA e DH
HA com PMA
A. O controle foi tratado ccom o mesmo volume de
e
etanol. Resultado
os esto exp
pressos como mdia E.P.M. de peloo menos qua
atro animais..
* p < 0,05 quand
do comparad
do ao contro
ole e # p < 0,05 na compparao entrre grupos na
a
mesma concentrrao de AG .
54
4
5.6 P
PRODU
O DE O2-
uo de n
nion super
xido (O2 ) foi avalia
ada no pe rodo de 60
6 minutoss
A produ
a 37
7 C. PMA e zimosan
n opsoniza
ado foram usados como controoles positiv
vos nessess
ensa
aios. O PM
MA elevou a produ
o de O2- em
e 2,5 vez
zes e o zim
mosan em 5,4 vezess
em rrelao aos controles
s.
ento na produo d
de O2- foi dependen
nte da conncentrao
o de DHA,
O aume
ocorrrendo estimulao somente
s
a partir de 100 M, enquanto q ue com EP
PA, houve
e
aum
mento a pa
artir da co
oncentra
o de 12,5
5 M. Na concentraao de 150 M, a
prod
duo de O2- pelos neutrfiloss foi meno
or com DH
HA do que no tratam
mento com
m
EPA
A (Figura 19 B). Na
N presena do PM
MA, DHA e EPA eem 150 e 100 M
M
aum
mentaram significativa
s
amente a p
produo de
d O2- pelo
os neutrfillos, respec
ctivamente
e
(Figu
ura 20 B). Nas clulas tratad
das com EPA, na presena do zimosa
an, houve
e
aum
mento signifficativo na
as concenttraes de 50 e 150 M. Conttudo, com DHA, no
o
houvve altera
o em toda
as as conce
entraes avaliadas (Figura 211 B).
55
5
Figurra 19 - Produo de nio

on superxid
do por neutr
filos obtidos
s de ratos noo perodo de 60 minutos..
A pro
oduo de O2- foi avalia
ada em vrias
s concentra
es de DHA
A e EPA. No controle, foii
Figura repre
adiciionado o volume mximo
o de etanol usado
u
para diluir
d
o AG. F
esentativa da
a
produo de su
uperxido ao
o longo do tempo (A). Resultados esto expre
essos como
o
mdia E.P.M. de pelo me
enos treze animais
a
(B). * p < 0,05 quando comparado ao
o
0
na com parao entrre grupos na
a mesma conncentrao de
d AG.

on superxid
do por neutr
filos obtidos
A prroduo de O2- foi avalia
ada em vria
as concentra
aes de DH
HA e EPA com estmulo
o
(PMA
A). No contrrole, foi adiciionado o volume mximo de etanol usado para diluir o AG..
Figura representtativa da pro
oduo de superxido
s
ao
a longo doo tempo (A). Resultadoss
56
6
esto
o expressos
s como md
dia E.P.M. de pelo me
enos treze aanimais (B).. * p < 0,05
5
quan
ndo compara
ado ao contro
ole.

on superxid
do por neutr
filos obtidos
A prroduo de O2- foi avalia
ada em vria
as concentra
aes de DH
HA e EPA com estmulo
o
(zimo
osan). No controle, foi a
adicionado o volume m
ximo de etaanol usado para diluir o
AG. Figura repre
esentativa da
a produo de
d superxido
o ao longo ddo tempo (A). Resultadoss
esto
o expressos
s como md
dia E.P.M. de pelo menos nove aanimais (B).. * p < 0,05
5
quan
ndo compara
ado ao contro
ole.
5.6.1
1 Efeitos dos inibid
dores da N
NADPH ox
xidase e da
d oxidao dos AG
G sobre a
prod
duo de superxido
A produ
uo de O2 avaliada
a na presena do DP
PI, inibidor da NADPH
H oxidase,,
no foi aumentada pelos

s AGs e zim
mosan (Fig
guras 22 e 23). Os nneutrfilos incubadoss
-
com etomoxir no apres

sentaram diminuio
o na produ
uo de O 2 quando tratadoss
com DHA (Figura 24). O EPA, na p
presena do
d etomoxiir, causou reduo de 49,2% e
57
7
55,9
9%, em 50 e 100 M
M, respectivvamente, quando
q
comparado aao EPA na
a ausncia
a
do in
nibidor (Fig
gura 25).

on superxid
do por neutr
filos obtidos
A prroduo de O2- foi avaliiada em vrrias concentrraes de D
DHA com e sem inibidorr
(DPI), tendo com
mo controle p
positivo o zim
mosan opsonizado. No ccontrole foi adicionado
a
o
volum
me mximo de etanol u
usado para diluir o AG. Resultadoss esto expressos como
o
os quatro an
mdia E.P.M. de
d pelo meno
nimais. * p < 0,05 quandoo comparado
o ao controle
e
e # p < 0,05 na comparao
c
entre grupos
s na mesma concentrao de AG.

on superxid
do por neutr
filos obtidos
A prroduo de O2- foi avaliiada em vrrias concentraes de E
EPA com e sem
s
inibidorr
(DPI), tendo com
mo controle p
positivo o zim
mosan opsonizado. No ccontrole foi adicionado
a
o
volum
me mximo de etanol u
usado para diluir o AG. Resultadoss esto expressos como
o
58
8
mdia E.P.M. EPA de pel o menos qu

uatro animais
s. * p < 0,055 quando co
omparado ao
o
0
na com parao entrre grupos na
a mesma conncentrao de
d AG.

on superxid
do por neutr
filos obtidos
A prroduo de O2- foi avaliiada em vrrias concentrraes de D
DHA com e sem inibidorr
(etom
moxir), tendo
o como contrrole positivo o zimosan. No controle foi adicionado o volume
e
mximo de etanol usado pa
ara diluir o AG.
A Resultad
dos esto exxpressos como mdia
E.P.M. de pelo menos
m
onze animais. * p < 0,05 qua
ando comparrado ao conttrole e # p <
0,05 na compara
ao entre grrupos na mesma concentrao de AG
G.

on superxid
do por neutr
filos obtidos
A prroduo de O2- foi avaliiada em vrrias concentraes de E
EPA com e sem
s
inibidorr
(etom
moxir), tendo
o como contrrole positivo o zimosan. No controle foi adicionado o volume
e
ara diluir o AG.
A Resultad
E.P.M. de pelo menos
m
onze animais. * p < 0,05 qua
ando comparrado ao conttrole e # p <
0,05 na compara
ao entre grrupos na mesma concentrao de AG
G.
59
5.7 EFEITOS DE EPA E DHA NA FAGOCITOSE E ATIVIDADE FUNGICIDA
A fagocitose e a atividade fungicida dos neutrfilos foram avaliadas no

perodo de 40 minutos, em que as clulas foram expostas Candida albicans e
etanol ou AG. O tratamento com o DHA aumentou a capacidade fagoctica em 35%
para a concentrao de 100 M. O EPA no alterou a fagocitose dos neutrfilos
(Figura 26).
Com relao atividade fungicida dos neutrfilos em 40 minutos, o DHA
aumentou esta atividade na concentrao de 100 M, enquanto que o EPA no a
alterou (Figura 27).
60
0
Figurra 26 - Porrcentagem de
d neutrfilo
os obtidos de
d ratos que
e fagocitaram
m Candida albicans no
o
pero
odo de 40 minutos incub
bados com DHA
D
e EPA. No
N controle, foi adicionado o volume
e
ara diluir o AG.
A Resultad
E.P.M. de trs an
nimais. * p < 0,05 quando
o comparado
o ao controlee.
ore da atividade fungicid

da dos neutrfilos obtidos de ratos e incubados com DHA e
Figurra 27 - Esco
EPA
A no perodo de 40 minuttos. No conttrole, foi adic
cionado o voolume mxim
mo de etanoll
usad
do para diluir o AG. Re
esultados es
sto express
sos como m
mdia E.P
P.M. de trss
anim
mais. * p < 0,05
0
quando comparado ao controle e # p < 0,005 na compa
arao entre
e
grup
pos na mesm
ma concentrao de AG.
61
Quadro 3 - Resumo dos efeitos de EPA e DHA em neutrfilos observados nesse estudo.
Efeitos
DHA (M)
EPA (M)
Viabilidade celular sem

estmulo
75
150
Fragmentao de DNA
sem estmulo
50
100
Viabilidade celular com

LPS
100
100
Fragmentao de DNA
com LPS
100
Sem estmulo
No alterou
25
Com LPS
No alterou
25
Toxicidade (18h)
CINC-2
Sem estmulo
25 e
100
50
25
TNF-
Com LPS
No alterou
No alterou
Sem estmulo
No alterou
No alterou
Com LPS
No alterou
50
Sem estmulo
No alterou
No alterou
Com LPS
No alterou
No alterou
Sem estmulo
50
100
Com PMA
50
50
Sem estmulo
100
12,5
Com PMA
150
100
Com Zimosan
No alterou
50
Fagocitose
40 minutos
100
No alterou
Atividade fungicida
40 minutos
100
No alterou
IL-1
Nitrito (18h)
Perxido de
hidrognio (AMPLEX)
nion superxido
(lucigenina)
62
6 DISCUSSO
Neste trabalho comparamos os efeitos de EPA e DHA sobre a produo de

espcies reativas de oxignio (EROS), xido ntrico (NO), TNF-, IL-1 e CINC-2,
fagocitose e atividade fungicida por neutrfilos de rato.
Inicialmente foram determinadas as concentraes no txicas de AGs para
essas clulas. DHA mostrou-se mais txico (18 horas) que o EPA tanto na anlise
de integridade de membrana quanto fragmentao do DNA (75 M e 150 M; 50 M
e 100 M, respectivamente). Na presena de LPS, o DHA foi tambm mais txico
que o EPA (clulas com a membrana ntegra e o DNA fragmentado). O LPS no foi
txico para as clulas (Figuras 7 e 8).
Neutrfilos estimulados com LPS e citocinas pr-inflamatrias, tais como
interferon- (IFN- ) e fator de necrose tumoral (TNF-) (133, 134), produzem
grandes quantidades de NO atravs da isoforma induzvel da xido ntrico sintase
(iNOS) (135, 136). Atuando nas integrinas, o NO modifica a adeso de leuccitos e a
diapedese dos neutrfilos (137). O xido ntrico, assim como as espcies reativas de
oxignio, desempenha funo importante na modulao da inflamao e na
regulao da resposta imune (138).
Em clulas J774 incubadas com EPA e DHA por 48 horas nas concentraes
de 10 e 25 M, foi descrito aumento na produo de NO, mas com 50 e 100 M
ocorreu inibio (117). Komatsu et al. (2003) demonstraram que o DHA inibe a
produo de NO e a expresso de iNOS em clulas RAW264 e macrfagos
peritoneais tratados com 15, 30 e 60 M por 24 horas (69). No presente estudo, no
houve alterao na produo de xido ntrico em neutrfilos incubados com EPA e
DHA por 18 horas, estimulados ou no com LPS (Figuras 15 e 16). Possivelmente,
os resultados conflitantes so devido s clulas estudadas ou aos diferentes
perodos de tratamento com os cidos graxos.
Com relao produo de citocinas, EPA e DHA inibem a produo de IL-1
e TNF- por moncitos ex vivo (26, 48-50) e a produo de IL-6 e IL-8 por clulas
endoteliais vasculares (22, 23). A ingesto de leo de peixe diminui a produo in
vivo de TNF-, IL-1 e IL-6 por macrfagos de roedores (27, 28, 139). Neste estudo,
no houve diferena quanto produo de IL-1 nas concentraes de EPA e DHA
estudadas (Figura 13). Contudo, na presena do LPS, o DHA elevou a produo de
IL-1 pelos neutrfilos diferentemente do EPA que no causou alterao (Figura 14).
63
Com relao ao TNF-, observou-se aumento na concentrao de 25 M de ambos

os AGs, porm, com 50 M, o DHA reduziu sua produo enquanto o EPA a
manteve elevada (Figura 11). Nos neutrfilos tratados com EPA, com e sem LPS,
houve aumento de CINC-2 (quimiocina importante em ratos), j com DHA, no
houve alterao (Figura 9 e 10). Esses resultados so indicativos de efeito ativador
dessas clulas por ambos EPA e DHA. O EPA elevou a produo de CINC-2 (na
presena ou ausncia de LPS) e ambos AGs aumentaram a produo de TNF-
pelos neutrfilos.
No presente trabalho, EPA e o DHA aumentaram a produo de EROs por
neutrfilos. O que diferiu entre eles foi concentrao necessria para elevar esta
produo. Verificamos que, na presena de 50 M de DHA, houve aumento na
produo de H2O2 pelos neutrfilos, enquanto que no caso do EPA isto ocorreu
somente a partir de 100 M (Figura 17). Sob estmulo do PMA, o aumento na
produo de H2O2 foi observado para EPA e DHA a partir de 50 M. Entretanto, na
presena do PMA, o EPA a 100 e 150 M estimulou ainda mais a produo de H2O2
quando comparado ao DHA (Figura 18).
Com relao produo de O2- pelos neutrfilos, o DHA apresentou efeito
estimulatrio a partir de 100 M, enquanto que com EPA houve aumento a partir da
concentrao de 12,5 M. A produo de O2- foi menor (40%) com DHA na
concentrao de 150 M do que no tratamento com EPA (Figura 19). Na presena
do PMA, DHA e EPA aumentaram a produo de O2- pelos neutrfilos, DHA em 150
M e EPA a partir de 100 M (Figura 20). Nas clulas tratadas com EPA, na
presena de partculas de zimosan, houve aumento significativo da produo de
EROs. Contudo, na presena de DHA, no houve alterao na produo de EROs
estimulada por zimosan nas concentraes estudadas. Outros autores quantificaram
a produo de EROs pelo mtodo de citocromo c e quimiluminescncia dependente
de lucigenina e verificaram aumento dose dependente
aps tratamento dos
neutrfilos humanos com EPA e DHA (140).

Em discordncia com esses resultados, Pisani et al. (2009) avaliaram, em
neutrfilos de cabra, a produo de EROs pelo mtodo de citocromo c. As clulas
foram tratadas com EPA e DHA nas concentraes de 25, 50, 100 e 200 M e
analisadas durante 30, 60, 90 e 120 minutos. O EPA no alterou a produo de
EROs nas condies estudadas. Por outro lado, o DHA, em 30 minutos, diminuiu a
64
produo de EROs em todas as concentraes. Na presena de PMA, os neutrfilos

tratados com EPA apresentaram, em 90 minutos de incubao, diminuio da
produo de EROs apenas na concentrao de 200 M. J com DHA, esta
diminuio ocorreu nas concentraes de 25, 50 100 e 200 M (71). A discrepncia
entre os resultados por ns relatados e os descritos por Pisani et al. (2009) pode ser
decorrente da utilizao de mtodos diferentes de quantificao de EROs ou ao
estado de ativao das clulas. Vale ressaltar que no trabalho de Pisani et al.
(2009), utilizou-se a tcnica do citocromo c para anlise de EROs. Essa tcnica,
conforme previamente descrito pelo nosso grupo, no adequada para analisar o
efeito de AGs sobre a produo de EROs por neutrfilos. Os AGs agem diretamente
no citocromo c e sem a presena de neutrfilos, foi encontrado aumento na
absorbncia. Alm disso, o H2O2 produzido pode resultar em uma reduo do Fe2+
citocromo c que volta para a forma Fe3+ gerando resultados subestimados (123).
Quando os neutrfilos so ativados por estmulos como partculas de zimosan
opsonizadas, peptdeos formilados (fMLP, por exemplo) ou PMA, h translocao
dos componentes citosslicos (p47phox, p67phox, p40phox) da NADPH oxidase para a
-
membrana celular. Este complexo enzimtico agora ativado leva produo de O2

-
(141). Um inibidor da produo de O2 o DPI (diphenyliodonium) que, apesar de

ser amplamente utilizado como inibidor da NAPH oxidase, no seletivo para esta
enzima, atuando como um oxidante flavina inespecfico (142). O tratamento com DPI
-
inibiu completamente a produo de O2 induzida por AGs e zimosan opsonizado

(Figuras 22 e 23). Esses dados so indicativos de que os AGs ora estudados
aumentam a produo de EROs por esta via.
O etomoxir inibe irreversivelmente a CPT-1 (carnitina palmitoil transferase - 1)
impedindo assim a entrada de AGs na matriz mitocondrial (32). A produo de O2por clulas musculares esquelticas de ratos reduzida na presena de etomoxir
aps estimulo do cido palmtico (125). Em neutrfilos incubados com etomoxir,
houve inibio na produo de O2- nas concentraes estudadas de EPA (Figura
26). Diferentemente, o etomoxir no inibiu a produo de EROs induzida pelo DHA
(Figura 25). De acordo com os resultados obtidos, a produo de EROs induzida
pelos AGs nos neutrfilos ocorre via NADPH oxidase e pode, ao menos para o EPA,
envolver a oxidao do AG.
Em experimentos realizados in vivo e ex vivo foi evidenciado que EPA e DHA
65
influenciam as funes de neutrfilos humanos, incluindo a fagocitose (143). A

fagocitose um processo rpido que envolve a fixao e internalizao da partcula
fagoctica. promovida atravs de receptores do complemento e imunoglobulinas.
(144, 145).
Verificamos que o tratamento com o DHA por 40 minutos aumenta a
fagocitose de Candida albicans em 35% (100 M) e, apesar do tratamento com EPA
ter aumentado 29% (12,5 M), no foi significativo (Figura 26). Resultado
semelhante foi encontrado por Calder et al. (1990) em que DHA (33 M) e EPA (33
M) aumentaram a fagocitose em macrfagos por 35% e 26%, respectivamente, no
perodo de tratamento por 2 horas com zimosan opsonizado (12 partculas por
clula) (146). Quando moncitos e neutrfilos caprinos foram expostos ao DHA, a
atividade de fagocitose foi maior em 25% apenas na concentrao de 100 M (70,
71).
A fluidez da membrana celular importante para a atividade fagoctica (70).
Por sua vez, a fluidez da membrana fortemente influenciada pela composio de
cidos graxos dos fosfolipdeos de membrana (81). A alterao da composio de
cidos graxos em macrfagos murinos por diferentes cidos graxos altera a
atividade fagoctica. As clulas com maior contedo de cidos graxos insaturados
em sua membrana possuem maior atividade fagoctica do que aqueles com maior
contedo de cidos graxos saturados (82, 146-148). Dessa forma, o DHA
apresentou
efeito
mais
pronunciado
na
atividade
fagoctica
que
EPA
possivelmente por ser mais insaturado. Com relao atividade fungicida dos
neutrfilos, o DHA aumentou esta atividade, enquanto que o EPA no a alterou
significativamente (Figura 28).
Os PUFAs -3 modificam a atividade de PPAR (43). Os neutrfilos
expressam receptores PPAR do isotipo (149-151), um fator de transcrio nuclear
envolvido na regulao das respostas imune e inflamatria (152).
PPAR (153), interage fisicamente com as subunidades p65 e p50 do NF-B
inibindo sua ativao (154). O PPAR inibe a atividade transcricional do NF-B,
reduzindo sua ligao ao DNA (155). Os PUFAs mega-3 e seus metablitos so
ligantes naturais de PPAR (156).
EPA e DHA modifira a produo de citocinas diferentemente, EPA aumentou
as citocinas estudadas (CINC-2, TNF-, IL-1), contudo, DHA aumentou somente
TNF-. Estes AGs podem ter atuado sobre o PPAR por mecanismos diferentes e,
66
dependendo da concentrao administrada, EPA pode diretamente, ou aps ser

metabolizado, inativar a sinalizao de PPAR (156, 157). Com a inativao de
PPAR pelo EPA, ocorre a ativao do NF-B que induz ao pr-inflamatria. DHA
ativa PPAR (54) que, por sua vez, inativa NF-B desempenhando ao antiinflamatria. Esse tema deve ser agora estudado sistematicamente para esclarecer
os mecanismos moleculares envolvidos nos efeitos diferentes de EPA e DHA.
67
7 CONCLUSO
EPA e DHA modularam diversos aspectos da funo de neutrfilos de rato.

Estes AGs apresentaram aes distintas na produo de citocinas, fagocitose e
atividade fungicida pelos neutrfilos. J na produo das EROS, o EPA e o DHA
apresentaram aes semelhantes, embora em concentraes diferentes. Essas
diferenas observadas podem ser explicadas pelo fato de que o EPA e o DHA
alteram a composio de cidos graxos de fosfolipdios da clula diferentemente e
podem mudar a afinidade de receptores ao ligante que geram as molculas de
sinalizao. Esses resultados contribuem para a elucidao de como EPA e DHA
agem na funo de neutrfilos e resposta inflamatria.
68
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Vivian Almeida Paschoal

Efeito comparativo dos cidos

Dissertao apresentada ao Programa de

Vivian Almeida Paschoal

Efeito comparativo dos cidos

Dissertao apresentada ao Programa de

leos de peixe ricos em cidos graxos (AGs) -3 so utilizados como agentes

Palavras-chave: cidos graxos -3. Espcies reativas de oxignio. CINC-2. TNF-.

Paschoal A. V Comparative effect of eicosapentaenoic (EPA) and docosa-hexaenoic

Tabela 1 - Valores de escore para a atividade fungicida de neutrfilos. ................... 40

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANOVA: anlise de varincia

RNS: espcies reativas de nitrognio

INTRODUO ....................... ................................................ ............................ 18

PREPARO DAS SOLU

................................... ................................................ ............................ 36

Ensaios de fagocitosse e de atiividade fun

Effeitos dos inibidores

1.1 CIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS (PUFAS) MEGA-3

Os cidos graxos so compostos formados por cadeias hidrocarbonadas

Em 1971, Bang e Dyerberg sugeriram que a baixa incidncia de doenas

1.3 PUFAS MEGA 3 E PRODUO DE MEDIADORES INFLAMATRIOS

EPA e DHA inibem a produo de IL-1 e do fator de necrose tumoral (TNF-)

diferenciao e apoptose celulares, resposta inflamatria (51) e tumorgnese (52).

Embora os efeitos imunomoduladores do leo de peixe sejam bem

1550 g/Kg 6 semanas

10 g/mL 6 dias (72)

25 mM 6 horas (LPS) (73

DHA: 5 g/dia (75)

ssemanas e 9 meses (78)

Os neutrfilos so clulas polimorfonucleadas (PMNs) produzidas na medula

componentes sintticos), 8 (pequenos componentes sintticos), 9 (bactria) e 10

especficos so exocitados quando estimulados. Gelatinase usada para facilitar a

so o perxido de hidrognio (H2O2), nion superxido (O2 ), cido hipocloroso

(HOCl) e o produto da reao entre o xido ntrico (NO) e o O2 , o peroxinitrito

1.6 PRODUO DE EROS

A produo de EROs em neutrfilos ativados se d, predominantemente, via

(esquematizado na Figura 1).

princcipal agentte oxidante

Acreditava-se que os neutrfilos no possuam ou tinham apenas algumas

ATP sintase (complexo V) (102). As mitocndrias geram O2 principalmente pela

mitocondrial e o complexo III na matriz e no citoplasma. O O2 , tambm pode ser

ento formado, caso no seja eficientemente eliminado pelo sistema

O xido ntrico (NO) sintetizado a partir da L-arginina pela enzima NO

Em macrfagos e neutrfilos, o NO participa das respostas

imunolgica e inflamatria (109, 110).

por se combinar com o O2 , formando o peroxinitrito (ONOO ), um radical muito mais

potente que o NO e o O2 . O perxinitrito, produto formado pela reao do O2 com

2 JUSTIFICATIVA PARA A REALIZAO DO ESTUDO

O leo de peixe apresenta propriedades anti-inflamatrias, contudo, ainda no

3.1 OBJETIVO GERAL

Investigar a influncia de EPA e DHA sobre a funo de neutrfilos de ratos

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Comparar os efeitos do EPA e DHA sobre:

4.1 PREPARO DAS SOLUES DE EPA E DHA

Os cidos graxos (EPA e DHA), adquiridos da Sigma Chemical Company (St.

Ratos Wistar machos (Rattus novergicus) pesando 200 20 g foram obtidos

4.3 OBTENO DE NEUTRFILOS

As clulas foram obtidas 3 horas aps a administrao intraperitoneal de

e adicionado de antibiticos (10 U/mL de penicilina e 10 g/mL de estreptomicina) ou

Quadro 2 - Contagem de clulas peritoneais no perodo de 3 horas aps administrao de

4.4 AVALIAO DA CITOXICIDADE DE EPA E DHA

Para avaliar a toxicidade dos cidos graxos foram feitos os ensaios de

As clulas foram centrifuga