3 - Extraccin de cidos nucleicos

30/3/2016

Anlisis de parentesco
Anlisis filogenticos
Anlisis poblacionales
Diagnstico de sndromes y prevencin
enfermedades
Deteccin de agentes infecciosos
Identificacin de mutantes
Etc.

de

Digestin con enzimas

Deteccin con sondas

Secuenciacin

Amplificacin por PCR

Gentica Molecular

Tejidos enteros
Clulas (sobrenadante de monocapas celulares o
cultivos en suspensin)
Hisopados bucofarngeos o genitales
Sangre entera o suero
Materia fecal
Semen
Tacos de parafina
Etc.
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Tacos de parafina: a T ambiente

Sangre, hisopados: a 4 C
Suero: a 20 C
Anticuerpos sin conjugar: a 4 C
Anticuerpos conjugados: a 20 C
Tejidos, clulas, virus: a 80 C
Pajuelas de semen: a - 200 C (N2 lquido)

Se toma una pequea porcin de la muestra EN ESTERILIDAD

mantenindola dentro de lo posible- a su temperatura ideal
de almacenamiento

Cuanto ms baja es la temperatura, menos dainos son los

efectos de los cristales formados por la congelacin
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Si se trabaja con virus y se va a usar para

infectar, la muestra se debe alicuotar ni
bien se recibe, ya que en cada proceso
de descongelacin su titulo disminuye
considerablemente

Por el mismo motivo, el sobrante de la

alcuota utilizada se inactiva con
lavandina al 20% y se descarta (NO
vuelve al freezer)
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Gentica Molecular

En mesada limpia primero con EtOH- 70% y luego con NaOH

0,1 N

En reas protegidas de las corrientes de aire, ya que las

mismas propician la contaminacin con cidos nucleicos
(evitar los flujos laminares)

Con guantes limpios y barbijo

En tubos eppendorf estriles y libres de ADNasas y ARNasas

Con tips estriles y libres de ADNasas y ARNasas

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1. Lisis celular
2. Eliminacin de protenas
3. Precipitacin y limpieza del ADN

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Tradicional (fenolcloroformo)
2) Kit comercial (QIAGEN, Nucleospin, etc.)
1)

Se deben desparafinizar para dejar el

tejido al descubierto
2 lavados con xileno
2 lavados con OH de graduacin
decreciente

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Hervor
Detergentes con o sin calor
Hidrxido sdico con calor
Ciclos de congelacin-descongelacin
Proteinasa K
cido perclrico
Homogenato (mortero con arena)
Sonicacin
Etc.

Tiene actividad proteasa (degrada protenas). Acta

rompiendo los enlaces dbiles del polipptido hasta que
adquiera su estructura 1ria. y pierda su funcionalidad.

La temperatura ideal para esta enzima es 56 C.

Durante la incubacin se recomienda vortexear a intervalos

regulares para que toda la muestra entre en contacto con la
enzima.

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Agregar a la muestra fenol:cloroformo:alcohol isoamlico 25:24:1

Vortexear y centrifugar
Tomar la fase superior cuidadosamente con una micropipeta y
pasarla a otro tubo

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Solvente

Fraccin subcelular

Fenol

Protenas + metabolitos de
pequeo peso molecular

Fenol:cloroformo

Protenas + lpidos

Cloroformo

Lpidos

Fase acuosa final

ADN + ARN

Los restos celulares son precipitados por la centrifugacin en forma

de pellet visible
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Agregar acetato de sodio. Los iones Na+

neutralizan las cargas de los grupos P del ADN
y as impiden que stos interacten con las
molculas de H2O, volvindose ms insoluble, y
favoreciendo su precipitacin.

Vortexear y agregar isopropanol (o etanol fro).

Incubar:
A 20 C ON
A 80 C durante una hora
En N2 lquido por unos segundos

En presencia de las mismas sales que hacen insoluble

al ADN genmico, el plasmdico se renaturaliza y
queda en el sobrenadante, de modo que se puede
separar fcilmente en caso de ser el producto de
inters.
La tcnica de extraccin de ADN plasmdico se
conoce como Mini-Prep

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Centrifugar la muestra a 4 C

Descartar el sobrenadante

Lavar con etanol 75%

Dejar secar con la tapa abierta en bloque trmico

Resuspender en agua MilliQ

Conservar en freezer a 20 C

LISTO!
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Medicin por espectrofotometra a 260 nm. Tambin se

puede saber la pureza del ADN respecto de las protenas
(absorcin UV a 260/280 nm)

PCR que amplifique algn fragmento de un gen conservado

para descartar falsos negativos.

Siembra de 1 del ADN extrado en un gel de agarosa. El

patrn de bandas da adems una nocin de la integridad
del ADN

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Si se desea extraer ARN de la muestra el procedimiento es

distinto, ya que el mismo es sumamente lbil y por lo tanto
requiere un tratamiento diferente.

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Tradicional (TRIzol)
2) Kit comercial (QIAGEN, Nucleospin, etc.)
1)

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Gentica Molecular

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Se deben desparafinizar para dejar el

tejido al descubierto
2 lavados con xileno
2 lavados con OH de graduacin
decreciente

Se hace con un producto comercial de Invitrogen

llamado TRIzol (Tiocianato de guanidina-fenol).

El TRIzol mantiene la integridad del ARN durante la

homogeneizacin del tejido, y a la vez lisa las
clulas y sus componentes.

Reacciona fuertemente ante el cloroformo!

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Incubar la muestra en TRIzol a T ambiente

Agregar cloroformo

Invertir el tubo con la mano

Incubar a T ambiente

Centrifugar y pasar la fase acuosa a otro tubo

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Agregar isopropanol y glicgeno (agente

coprecipitante)

Incubar a T ambiente

Centrifugar y descartar el sobrenadante

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Agregar etanol 75% y vortexear

Centrifugar y descartar el sobrenadante

Dejar secar con la tapa abierta en bloque trmico

Resuspender en agua DEPC con RNAsin (inhibidor

de ribonucleasas)

Conservar en freezer a 80 C
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Se realiza una RT-PCR y se controla el

producto (cADN) como a cualquier
otro ADN

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