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ENSAYO DE MTT: VIABILIDAD CELULAR

- Aadir solucin de MTT (5mg/mL) en una cantidad igual al 10% de volumen


del cultivo celular.
- Incubar por un tiempo de 1 a 4 horas a temperatura apropiada para el tipo
de lnea celular.
a) En caso de que las clulas se adhieran firmemente a la superficie
del recipiente de cultivo, se retira el medio de cultivo y se aade
la misma cantidad pero de isopropanol actico
b) En caso de que las clulas estn libres en el recipiente del cultivo
celular, se aade directamente isopropanol actico en una
cantidad igual al del volumen de cultivo original
- Dentro de una hora (todos los cristales deben de disolverse, si no, se debe
de reducir el tiempo de incubacin con MTT) despus de la adicin de
isopropanol actico se leer la absorbancia a 570 nm y se resta la
absorbancia del background tomada a 690 nm.

MOSMAN 1983: ENSAYO DE MTT


- El MTT se disuelve en PBS 5 mg/mL y se filtra para esterilizar y remover las
pequeas cantidades de residuos insolubles.
- La solucin stock de MTT (10 l por 100 l de medio) se aade a todos los
pocillos de la placa, y las placas se incuban a 37C por 4 horas.
- Se aade cido isopropanol (100 l de 0.04 N HCl en isopropanol) en cada
pocillo y se mezclan bien hasta disolver los cristales azul oscuro
- Pasados unos minutos, en una habitacin a temperatura ambiente, se
verifica que los cristales se hayan disuelto, posteriormente las placas se
leyeron en un lector de Micro Elisa, utilizando una longitud de onda de 570
nm, y una longitud de onda de referencia de 630 nm y con una calibracin
de 1.99 ( o 1.00 si las muestras fueron fuertemente coloreadas)

CONTEO CELULAR CON CAMARA DE NEUBAUER


Created by E. Ramsay, 1998. Last printed 22.10.03 FilenameHEMOCYT
El hemocitometro es una manera accesible y econmica para el conteo de clulas.
El hemocitometro es prcticamente un portaobjetos de microscopio que consiste
en una cmara plana. El cubreobjetos que se coloca en la superficie de la cmara
determina su profundidad. Un volumen conocido de la suspensin homognea de
las clulas se introduce en la cmara mediante la accin de la capilaridad.

Posterior el microscopio se centra en un rea de la cuadricula definida de


dimensin de 1 mm2 y se procede a contar el nmero de clulas en el rea de
conteo.
Para lograr un conteo celular preciso es necesario que las clulas suspendidas
estn homogneas y no se encuentren en agregados celulares. Tambin es
importante que al momento de transportar las clulas de la punta Gilson a la
cmara se haga de manera rpida, debido a que en la punta las clulas se pueden
adherir.
El nmero ideal de clulas debe de estar entre 100 a 300/mm 2 con el fin de
proporcionar un grado razonable de precisin. Cuanto mayor es el nmero de
clulas, mejor.
El conteo de ambas cmaras debe tomarse y se realiza un promedio de lo
calculado. El nmero de clulas se calcula utilizando la formula siguiente.
c=n/v
Dnde:
c: concentracin celular ( clulas/ mL)
n: nmero de clulas contadas
v: volumen contado (mL)
Empleando la cmara de Neubauer, que tiene una profundiad de 0.1 mm. Por lo
tanto la zona de recuento de 1 mm 2 nos da un volumen de 0.1 mm 3 (o 10-4cm3).
Reorganizando la formula anterior con esta nueva informacin, la ecuacin nos
queda asi:
c= n x 104
Por lo tanto si se tiene un nmero de clulas medio (n) de 200, la concentracin
celular ser de 200 x 104 que equivale a 2.000.000 de clulas/mL. Para calcular el
nmero total de clulas presentes, simplemente basta con multiplicar c por el
volumen original de clulas en suspensin.
Materiales
-

Cmara de Neubauer y cubre objetos


Tripsina- EDTA 1x
PBS libre de Ca y Mg
Medio de cultivo ( DMEM/10% FBS)
Tubos de centrifuga de 15 ml
20 l de gilsen
Puntillas amarillas esteriles
Contador

Mtodo

1.
2.
3.
4.

Limpiar la cama de Neubauer con alcohol al 70%


Limpiar el cubreobjetos (cubre hematimetro )
Humedecer los bordes del cubreobjetos
Suave, pero firme colocar el cubreobjetos sobre el rea de conteo de la
cmara
5. Cuando se visualice la apariencia de anillos de arcoris (como cuando el
aceite se intenta mezclar con el aceite) indica que el cubreobjetos se ha
sellado hermticamente y asegurado la profundidad de 0.1 mm
6. Tipsinisar una monocapa de clulas de inters como se describe
previamente
7. Desde la suspensin homognea de clulas se extrae una alcuota de 10l
8. Inmediatamente transferir la alcuota a la cmara de Nuebauer
9. Coloque la punta de la pipeta a la orilla en un lado de la cmara de
Neubauer
10. Por la accin de la capilaridad, el lquido ir entrando debajo del
cubreobjetos
11. El lquido debe correr solamente a los bordes de las ranuras
12. Repetir los pasos del 7-11 en el otro lado de la cmara
13. Ahora tenemos el volumen total de 20 l de suspensin celular, 10 l por
cada una de las rejillas
14. Retirar cualquier exceso de lquido de la superficie, sin retirar liquido de
debajo del cubreobjetos
15. Observar en el microscopio con el objetivo de 10X
16. Esto debera permitir que el rea de conteo ocupe la totalidad del campo
de visin
17. La zona de 1 mm2 es el rea ms grande y se puede identificar debido a
que esta bordeada por tres lneas paralelas
18. Se debe de asegurar que exista una distribucin igual de clulas entre las
dos cmaras
19. Se debe comprobar que no existan grandes grupos de clulas, esto causa
errores en el conteo
20. Contar las clulas que estn dentro del rea, tambin deben incluirse las
clulas que estn en la parte superior izquierda y las que tocan la lnea
media del cuadro, pero no se deben considerar las que estn en la parte
inferior derecha
21. Repita el procedimiento para la segunda cmara
22. Se realiza el promedio de las dos cmaras
23. Calcular las clulas/ml y el nmero total de clulas con las ecuaciones
correspondientes