Tecnol.Ciencia
Ciencia
Tecnol.Ed.
Ed.
Ciencia
(IMIQ)
(IMIQ)
Ed.
vol.
vol.
(IMIQ)
14
22nms.1-2,1999
nm.
22(1):
1, 35-42,
2007 2007
35
Facultad de Ingeniera Qumica, Universidad Autnoma de Yucatn, Tel. (01) 999460981 Ext. 232, Fax (01) 999460994.
Correo-e (e-mail): doming@uady.mx
RESUMEN
INTRODUCCIN
Las bacterias cido-lcticas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se han aislado de tierra, plantas verdes, del tracto intestinal o de vagina de seres
humanos y animales. Naturalmente, la presencia de bacterias cido-lcticas (BAL) se utiliza tambin como un
cultivo iniciador para el bioprocesamiento de varios
productos alimenticios. Las actividades ms importantes de las bacterias cido-lcticas, tanto en alimentos
como en preparaciones farmacuticas son: proporcionar sabor a la comida, promover la preservacin de alimentos y promover la salud (Shah, 2001).
En los alimentos conocidos como biotransformados,1 la generacin de cido lctico resulta en general
incompatible con la actividad y, en ocasiones, con la
sobrevivencia de los microorganismos patgenos que
les acompaan. Sin embargo, los mecanismos de la inhibicin microbiana por las BAL no se limitan a este
factor. Hay que sumar (segn las BAL involucradas) la
composicin del sustrato, condiciones ambientales y
el efecto de otros productos de su metabolismo. Estos
pueden ser de composicin relativamente sencilla o de
naturaleza peptdica. Entre los primeros se encuentran
los cidos orgnicos como el lctico ya mencionado,
en menor proporcin el cido actico, perxido de hidrgeno, cidos grasos voltiles y diacetilo. El otro
Palabras Claves:
Keywords:
1
Nota de los editores: Louis Pasteur defini a la biorreaccin
anaerobia obligada de glucosa para producir etanol por Saccharomyces
cerevisiae como fermentacin por lo que ese trmino no debe ser usado
para otras biorreacciones distintas a sa, ni los biorreactores en los que
se realizan denominarse fermentadores.
36
Materias primas
El jugo y pulpa utilizados en el estudio provenan de
hojas de Aloe vera variedad barbariensis y fueron donados en sus formas industrializadas por una compaa agrcola ubicada en el municipio de Oxcutzcab,
Yucatn, Mxico. Esta misma compaa proporcion
tambin la miel orgnica tipo tajonal que se utiliz en
los experimentos como suplemento de carbono y edulcorante en la formulacin del producto final.
Experimentos biolgicos
Se realizaron estudios de biotransformacin a nivel de
laboratorio en matraces de 250 mL con 100 mL de jugo
de sbila donde se utilizaron dos diferentes
microorganismos lcticos obtenidos de colecciones
(Lactobacillus plantarum, NCIMB 11718 y Lactobacillus johnsonii, donadas por el Dr. Humberto Hernndez, de la Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas del
Instituto Politcnico Nacional). Ambas cepas fueron
mantenidas en medio de Man, Rogosa y Sharpe, MRS
(De Man y col., 1960) (Tabla 1).
Se utiliz el jugo de Aloe vera como sustrato
carbonoso a cuatro diferentes niveles de concentracin
(25, 50, 75, 100%). As mismo, se evalu la biotransformacin del jugo en presencia o ausencia de un complemento en la fuente de carbono (glucosa y miel a
concentraciones de 1% - 5% m/v). La biorreaccin fue
llevada a cabo a las condiciones de incubacin recomendadas para cada uno de los microorganismos empleados por 48 horas. A cada experimento se le
realizaron tres rplicas y las referencias para cada tipo
de cultivo fueron medios sin biodegradar.
Al jugo biodegradado se le realizaron anlisis
fisicoqumicos que permitieran caracterizar el producto: Acidez total (AOAC, 2000), contenido de cido lctico (AOAC, 2000) y azcares por el mtodo de DNS
37
Tabla 1
Medio de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) para el
cultivo de Lactobacillus*
Ingredientes
Peptona
Extracto de carne
Extracto de levadura
Glucosa
K2HPO4
Acetato de sodio
Citrato de amonio
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
Tween 80
pH final
g/L
10
10
5
20
2
5
2
0.2
0.2
1
6.2 6.6
38
log(UFC/mL)
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
25%
75%
50%
100%
UFC/mL de pulpa
Figura 2. Desarrollo de L. plantarum en los productos de pulpa y jugo de Aloe vera al final
de la biotransformacin.
Al hacer la comparacin estadstica de las medias
de las cuentas viables y sus desviaciones estndar se
encontr que los contenidos bacterianos de ambos
medios no presentaron una diferencia significativa
(P>0.05) haciendo pensar que existe una concentracin
lmite de Aloe vera alrededor del 50% (v/v), donde el
desarrollo del cultivo sea independiente de la concentracin de sustrato o que algn nutriente (carbono, ni-
39
Tabla 2
Cuentas viables de L. plantarum en diferentes medios de cultivo cuya fuente de carbono era jugo de Aloe Vera
% (p/v) de fuente de
carbono
Aloe vera sin complemento.
1% glucosa
5% glucosa
1% miel
5% miel
25%
50%
3.8 x 108
(4.73x107)
1.8 x 1010
(2.24x109)
3.6 x 1011
(4.48x1010)
5.9 x 108
(7.34x107)
3.1 x 109
(3.86x108)
6.9 x 108
(8.59x107)
3.6 x 1011
(4.48x1010)
1.0 x 1012
(1.24x1011)
6.8 x 1011
(8.46x1010)
2.8 x 1012
(3.48x1011)
75%
1.0 x 1010
(1.24x109)
9.0 x 1010
(1.12x1010)
1.8 x 1012
(2.24x1011)
4.3 x 1010
(5.35x109)
7.8 x 1012
(9.71x1011)
100%
5.8 x 109
(7.22x108)
2.4 x 1011
(2.99x1010)
2.6 x 1011
(3.24x1010)
8.4 x 108
(1.05x108)
4.8 x 1010
(5.97x109)
(p/v), sin haber diferencia significativa entre las concentraciones de Aloe de 50 y 75%(v/v). Como era tambin de esperarse, el menor desarrollo se obtuvo en los
medios de jugo sin fuentes de carbono adicionales (7.6
x 107 UFC/mL).
Los resultados de las cuentas viables finales fueron
comparados con los de tres productos lcteos que existen en el mercado (Yakult, Chamito y Actimel).
Los productos biodegradados a base de Aloe vera presentaron caractersticas similares (pHfinal: 3.23; 2.8x1012
UFCL.plantarum /mL y 4.45x1010 UFCL. johnsonii/mL), a las
del producto comercial Actimel (pHfinal: 3.82; 2.5
x1010 UFC/mL).
Con estos resultados, se puede decir que no existen diferencias significativas (P>0.05) entre los medios biodegradados con jugo de Aloe vera en las
concentraciones de 50 y 75% (v/v) y cualquiera de
estas concentraciones con un 5% (p/v) de fuente de
carbono (glucosa o miel). Se obtuvieron unidades
formadoras de colonias superiores a las obtenidas en
algunos de los productos comerciales. Esto indica que
es factible la elaboracin de productos biodegradados
mediante el uso de ambas cepas (L. plantarum y L.
johnsonii).
Prueba sensorial
De las 130 personas que se encuestaron, 91 de ellas
aceptaron consumir el producto. El 30% de la poblacin a la cual no le agrad el producto afirm
que esto fue principalmente por el color del producto ya que adquiri el color de la miel y no del Aloe
40
Figura 3. Inhibicin de E. coli 0157:H7 en (a) 50 y 75% (v/v) de jugo de Aloe vera con 5% (m/v) de glucosa
sin biotransformacin, (b) 50 y 75% (v/v) de jugo de Aloe vera con 5% (m/v) de glucosa
biotransformada con L. plantarum
Viabilidad de las bacterias lcticas en el jugo
biotransformado en almacenamiento
En la prueba de viabilidad del microorganismo, despus
de los 90 das se obtuvieron valores de 106 UFC/mL y al
trmino de 180 das, se obtuvieron 3.58 x 104 UFC/mL en
el jugo biotransformado de Aloe vera. Con estos resultados, se determin el tiempo mximo de anaquel, el cual
debe ser menor a tres meses, ya que despus de este tiempo el nmero de UFC/mL es menor a 106 UFC/mL,
obtenindose as un producto con un porcentaje de aceptacin bueno y un tiempo de vida estimado y con caractersticas especficas para proceder a realizar el escalamiento
del proceso de biotransformacin de Aloe vera.
Escalamiento 1: 10 de la biorreaccin en jarras y
clculo de la cintica
Para la obtencin de la cintica de la reaccin para el
jugo de Aloe vera biotransformado se tomaron 12 muestras en un perodo de 48 h. Con los datos obtenidos se
determin la tasa mxima de proliferacin (maximum
growth, en ingls) de las bacterias, la cual estuvo alrededor de 12 h, as como las fases de desarrollo durante
la biorreaccin (Figura 4). Para el clculo de la (velocidad o rapidez de proliferacin) se utilizaron los puntos centrales de la fase de desarrollo exponencial, ya
que esta seccin de la curva garantiza la tasa mxima
de proliferacin de los microorganismos. Se obtuvo la
constante de 1.59 h-1. El valor de Ks (constante de
Monod) se calcul de acuerdo con la ecuacin
Cs
= max
Ks + Cs
donde
: velocidad de proliferacin
max:tasa maxima de proliferacin
Cs: concentracin de sustrato limitante
Obteniendo como resultado Ks = 0.1 g/L. Los resultados de la proliferacin de L. plantarum en el medio
MRS, se muestran en la Figura 5. De estos datos se
calcul la constante de velocidad o rapidez en el
inculo obteniendo un valor de 1.8921h-1.
Simulacin y diseo conceptual de la planta para
una escala de 1:300
La simulacin y diseo del proceso se realiz con el
jugo de Aloe vera al 50% y 5% de glucosa, las razones por la que se emple el 5% de glucosa y no de
miel como en el escalamiento, es debido a que los
clculos de azcares reductores se realiz con base
nicamente en glucosa as como el balance de materia, lo que significa que los parmetros calculados y
simulados son adecuados y como se ha presentado en
el transcurso del trabajo no se presenta diferencia
en el crecimiento microbiano entre ambas fuentes de
carbono.
Bajo estas condiciones, se realiz el diagrama de
bloques del diseo conceptual del proceso (Figura 6),
donde se muestran las principales operaciones realizadas para la elaboracin del jugo biotransformado de
Aloe vera, que son las mismas que se realizaron a nivel
de laboratorio. La primera parte del diseo fue el
biorreactor, donde se utilizaron las propiedades que se
obtuvieron en el escalamiento. Los parmetros cinticos
que se simularon fueron los que se obtuvieron en el
III
IV
1.00E+10
1.00E+14
V
VI
III
log (UFC/mL)
1.00E+12
log (UFC/mL)
IV
1.00E+12
II
1.00E+16
41
1.00E+10
1.00E+08
I
II
III
IV
1.00E+06
1.00E+04
Desarrollo exponencial
Desaceleracin
Estacionaria
Declinacin o muerte
1.00E+07
II
1.00E+06
I
II
III
IV
V
VI
1.00E+04
1.00E+02
1.00E+02
1.00E+00
Retardada Lag
Aceleracin del crecimiento
Desarrollo exponencial
Desaceleracin
Estacionaria
Declinacin o muerte
1.00E+00
0
10
20
30
40
50
60
Tiempo (h)
10
20
30
40
50
60
permiten un mezclado efectivo en todo el tanque evitando problemas de lquido estancado. Para evitar vrtices o torbellinos dentro del tanque se recomienda el
uso de placas deflectoras.
Los tanques de mezclado consisten en un recipiente
cilndrico, cerrado o abierto dependiendo del flujo que
se maneje y un agitador mecnico, montado en un eje y
accionado por un motor elctrico. En el proceso se requieren cuatro tanques: tres cerrados y uno abierto. Los
tanques cerrados son necesarios, ya que el flujo que se
maneja debe estar en condiciones estriles y el abierto
es solamente para realizar la mezcla del jugo con el
complemento carbonoso a la concentracin estipulada
en el proceso.
Las dimensiones del tanque se obtuvieron mediante
el clculo en lnea que permite determinar el diseo de
una geometra bsica o estndar para tanques agitados
de mezcla con flujo axial o radial (Dond, 2004).
Para los esterilizadores se utiliza como servicio de
calentamiento vapor saturado de agua de baja presin
a 152C y para los intercambiadores de calor se utiliza
como servicio de enfriamiento agua de 5 a 10C. Los
intercambiadores de calor recomendados son de tipo
de doble tubo ya que el rea de transferencia requerida
es muy pequea y, por lo tanto, estos intercambiadores
son pequeos y fciles de limpiar y esterilizar si es necesario.
Precultivo de bacterias L.
Plantarum
Aloe vera: 500 L
Agua
Tanque
de mezclado
Tanque
semilla
Pasteurizador
Edulcorante
Miel
(materia orgnica)
Biorreactor
Tanque
agitado
Jugo de Aloe Vera
biotransformado
CONCLUSIONES
42
rrollo de bacterias lcticas y la consecuente produccin de cido lctico. La proliferacin mxima (max)
se obtuvo a las concentraciones de 50 y 75% (v/v) de
jugo de Aloe vera y con una fuente de carbono de 5%
(m/v) de miel o glucosa con un aumento de hasta 1012
UFC/mL.
El jugo biodegradado tuvo un tiempo de vida de
anaquel de 3 meses, con halos de inhibicin de las bacterias patgenas de Salmonella sp. y E. coli de 2.5 y
1.0 mm, respectivamente.
De las pruebas sensoriales se obtuvo una aceptacin
del producto del 70%, siendo la principal objecin el
color del jugo (ligeramente pardo debido a la adicin
de miel como edulcorante).
Con la concentracin de 50% (v/v) de jugo y 5%
(m/v) de miel se realiz el escalamiento obteniendo los
parmetros cinticos de la biorreaccin como la velocidad especfica de proliferacin () de 1.59 h-1, la constante de Monod (Ks) fue de 0.1g/L y la constante de
produccin de cido lctico (qp) de 0.186 h-1. Para la
produccin de inculo se obtuvo una velocidad especfica de proliferacin () de1.89 h-1.
El diseo del proceso hecho por computadora plante cuatro mezcladores, tres intercambiadores de calor, tres esterilizadores, un biorreactor de tipo
intermitente de 69 litros de capacidad (tanque semilla)
y un biorreactor tambin intermitente con una capacidad de 1691 litros (reactor principal). Todos los tanques y los dos biorreactores sern de acero inoxidable,
ya que el jugo biodegradado es cido (con valores de
pH menores de 4).
NOMENCLATURA Y ABREVIATURAS
BAL
C
Bacterias cido-lcticas
Fuente de carbono adicional al medio base
de jugo de Aloe vera
Cs
Concentracin de sustrato limitante
DNS
Mtodo de determinacin de azcares reductores basado en el uso del cido dinitrosaliclico (D.N.S)
Growth Palabra en ingls que significa proliferacin o
desarrollo ya que las clulas de las bacterias
no crecen sino que proliferan (se subdividen)
Ks
Constante de Monod
MRS
Medio de Man, Rogosa y Sharpe para el cultivo de Lactobacillus
qp
Produccin de cido lctico
Tajonal Miel producida por las abejas obreras a partir
del nctar de las flores o de las secreciones
procedentes de la floracin tajonal (Viguiera
dentata)
UFC
% m/v
% v/v
max