Aula Terica N.3 REPRODUO E CRESCIMENTO MICROBIANO INTRODUO O crescimento microbiano (CM) um fenmeno que est relacionado ao nmero de clulas formadas em determinado tempo em um substrato. Assim, os microrganismos em crescimento esto na realidade aumentando em nmero e se acumulando em colnias (grupos) que contm milhares de clulas. O crescimento microbiano (CM), necessariamente, um processo que refere-se aos mecanismos envolvidos com a reproduo das clulas, que so os responsveis pelo aumento em seu nmero e conseqente formao das colnias. Por meio do entendimento do crescimento microbiano, podemos controlar o crescimento de organismos patognicos ou estimular o crescimento de organismos benficos. Antes de abordarmos os conceitos sobre CM das bactrias, vamos compreender como ocorre sua reproduo. A REPRODUO BACTERIANA A reproduo nas bactrias feita, na grande maioria dos casos, pelo processo de diviso binria simples (tambm conhecida como fisso binria transversa ou bipartio), na qual uma clula, atingindo um determinado tamanho, divide-se ao meio, dando origem duas clulas-filhas iguais. Este um processo que no envolve clulas sexuais. Inicialmente, antes de ocorrer a diviso celular, os contedos celulares se duplicam e o nucleide replicado (A e B). Na medida em que a clula parental aumenta (C), a membrana citoplasmtica se estende, invagina-se para o centro e o material nuclear se separa (C e D). Esta etapa da diviso celular ocorre na zona entre os dois nucleides. Ao mesmo tempo, um novo material para a parede celular cresce na direo interna para formar uma parede cruzada (septo) entre as duas clulasfilhas (D). Finalmente, as clulas filhas podem se separar completamente (E), mas em algumas espcies elas permanecem acopladas para formar pares, arranjos ou cadeias (Ex. Bactrias do grupo dos estreptococos e estreptobacilos).
Outros modos de reproduo bacteriana podem ocorrer na natureza, mas estes
ocorrem em algumas espcies. Por exemplo, bactrias do grupo Rhodopseudomonas
sp. reproduzem-se por brotamento. Neste processo a clula apresenta a formao de
uma pequena protuberncia que cresce na extremidade da clula. Este brotamento aumenta e eventualmente torna-se uma nova clula com todos os constituintes celulares separando-se da parental ao final. Outras espcies, como Nocardia spp. reproduzem-se pela fragmentao dos filamentos, com formao de pequenas clulas em forma de basto que daro origem espcie. Por fragmentao, tambm, as espcies de Streptomyces podem se reproduzir, formando estruturas erroneamente chamadas de condios, pois este termo associado a fungos filamentosos. So exemplos de reproduo por fragmentao, algumas espcies de cianobactrias. FATORES NECESSRIOS AO CRESCIMENTO MICROBIANO Podem ser divididos em fatores fsicos e qumicos e afetam todos os grupos de microrganismos, no apenas as bactrias. Fatores Fsicos 1. Temperatura: o fator mais importante, pois afeta o crescimento e a reproduo das clulas, ou seja, todas as suas reaes bioqumicas. Em geral, os microrganismos crescem em uma ampla faixa de temperatura, mas h um ponto timo que denominado temperatura tima de crescimento. Esta definida como a temperatura ideal, em que o crescimento acelerado. Abaixo ou acima deste limite definem-se a temperatura mnima de crescimento e temperatura mxima de crescimento. Em funo de sua preferncia quanto faixa de temperatura, os microrganismos so denominados: - Psicrfilos: crescem em baixas temperaturas (15 a 20C); - Mesfilos: crescem em temperaturas medianas (25 a 40C) - Termfilos: crescem em temperaturas altas (50 a 60C). 2. Atmosfera Gasosa: refere-se quantidade de gases essenciais ao crescimento microbiano, como O2, CO2, N e metano. Estes gases e outros so utilizados no metabolismo celular, mas h diferenas quanto s espcies. Assim, em geral, o CO2 sempre utilizado enquanto que o O2 utilizado com restries. Quanto utilizao de O2, os microrganismos so definidos em: - aerbios: so os que requerem o oxignio para o seu desenvolvimento e somente crescem na presena deste elemento. - anaerbios: so os que crescem somente na ausncia de oxignio, sendo este um composto txico s clulas. - facultativos: podem crescer tanto na presena quanto na ausncia de oxignio. 3. pH do meio: em geral, o pH timo ao crescimento microbiano definido para cada espcie. Porm, independentemente do pH externo, um microrganismo deve ser capaz de manter seu pH interno em torno de 7,5 para se manter vivel. Portanto, o pH externo pode chegar a um ponto de desequilibrar o pH interno e causar a morte celular. Fatores Qumicos Esto relacionados com as caractersticas nutricionais, essenciais ao crescimento. Assim, alguns nutrientes como C, N, P, K, H, S e microelementos (Cu, Fe, Mo, Mg, Mn, etc). so exigidos pelas clulas para sua nutrio. Estes so
fornecidos em maior ou menor quantidade pelo meio onde o microrganismo se
desenvolve, o qual pode ser um meio natural ou artificial (meios sintticos). Assim, os microrganismos que no so capazes de sintetizar seu alimento so denominados heterotrficos, enquanto que os que realizam fotossntese para obteno de energia so os autotrficos. Os tipos e constituio dos meios de cultura sero esclarecidos na aula prtica. CRESCIMENTO BACTERIANO O crescimento bacteriano est associado ao aumento na quantidade de clulas e no ao aumento de tamanho da clula. Assim, quando uma colnia de bactrias cresce no meio de cultura isto significa que milhes e milhes de novas clulas esto surgindo, fruto da intensa atividade metablica e reproduo celular. A maioria das espcies de bactrias conhecidas pelo homem reproduz-se de maneira assexuada, em que no existe troca de material gentico e no ocorre meiose e produo de gametas (clulas sexuais). A velocidade com que este processo ocorre depende da disponibilidade dos fatores de crescimento j mencionados. Se as condies forem ideais, o crescimento microbiano rpido at o momento em que todos os nutrientes se esgotam, quando a colnia entra em fase de declnio. Recordando, o principal processo de diviso das bactrias conhecido como fisso binria transversa, em que a clula- me se divide dando origem a duas clulas-filhas em tamanho aproximadamente igual. Conforme j estudado, outros processos de diviso de procariotos podem ocorrer, dependendo da espcie, como brotamento ou fragmentao. Portanto, temos o crescimento microbiano, em que clulas vo se dividindo e dando origem a novas clulas, aumentando em escala logartmica a populao. Se partirmos de um exemplo hipottico em que 1 clula sofre fisso binria e d origem a duas novas clulas temos que: 1
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32... e assim, sucessivamente.
Neste modelo, podemos observar que o aumento expresso em progresso
geomtrica, podendo ser representando da seguinte maneira: 2 21 22 nmero de geraes.
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2n, onde n o expoente que se refere ao
Assim, temos que 2n definido como o nmero total de clulas em uma
colnia, o que varia de acordo com o nmero de geraes. Quanto maior o nmero de geraes, maior o nmero total de clulas. Sabemos que este nmero aumenta em funo do tempo, que podemos denominar de Tempo de Gerao (g) . Este tempo definido como o tempo necessrio para a clula se dividir e, portanto, a populao da colnia dobrar de tamanho . O tempo de gerao depende do nmero total de clulas e do nmero de geraes, podendo ser varivel entre as espcies de bactrias e das condies ambientais a que estes organismos vivem (Ex: E. coli demora 12 minutos para a populao dobrar de tamanho, enquanto que M. tuberculosum demora at 13 horas). Atualmente h expresses matemticas que definem o crescimento microbiano e que ajudam os tcnicos e pesquisadores estudarem caractersticas de determinado microrganismo, seja para fins de pesquisa ou aplicao em indstria de alimentos, petrolfera, estudos de impacto ambiental, etc... Se partirmos de um exemplo hipottico em que temos 1 clula, conclumos que:
Populao Final (N) = 1 x 2n
Porm, nunca uma cultura bacteriana ou colnia inicia-se de apenas uma nica clula e sim de milhares de clulas que se multiplicam. Portanto, esta equao pode ser melhorada considerando-se o nmero de clulas iniciais no tempo zero (No), ou seja, no momento em que foram inseridas no meio de cultura para iniciar o crescimento. Desta forma temos: Populao Final N = No x 2n , onde No o nmero de clulas no tempo zero (incio da formao da colnia). Conforme foi constatado, o crescimento microbiano exponencial e no linear. Assim, esta equao deve ser expressa em termos logartimos: Log10 N = Log10No + nLog102 Realizando-se as devidas transformaes matemticas nesta frmula o valor n (nmero de geraes) pode ser calculado como: n=3,3(Log10N Log10No), onde N o nmero final de clulas e No o nmero inicial de clulas no tempo zero. Sabendo-se o nmero de geraes (n), podemos determinar o tempo de gerao (g) e assim temos que: g = t/n onde, t o tempo desejado e n o nmero de geraes. Veja o exemplo: Em uma populao inicial (N) de 1.000 clulas e final de 100.000.000 clulas, qual o nmero de geraes (n) e o tempo de gerao (g) desta espcie? a) o nmero de geraes ser: n=3,3(8-3) = 16,5 geraes b) o tempo de gerao aps 5h (tempo final) ser: g=5/16,5 = 0,3 horas (ou seja, a populao dobra a cada meia hora) CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO
A curva de crescimento bacteriano demonstra o crescimento das clulas durante
um perodo de tempo. Esta curva obtida quando se realiza a contagem da populao em intervalos de tempo aps a introduo de um inculo contendo um pequeno nmero de bactrias em meio de cultura sinttico (normalmente lquido). Existem basicamente quatro fases de crescimento: A) A FASE LAG Durante certo perodo de tempo o nmero de clulas sofre pequenas variaes, praticamente no h crescimento, pois as bactrias no reproduzem-se imediatamente aps inoculadas em um meio. Antes, precisam passar por uma fase de adaptao, em que h uma preparao da clula para o incio do crescimento. Assim, a fase lag caracterizada pela ausncia de reproduo e adaptao celular ao meio de cultura. B) A FASE LOG (EXPONENCIAL) Aps a adaptao, as clulas iniciam seu processo de diviso intensamente,
entrando em um perodo de extremo crescimento, onde a multiplicao celular
abundante e logo a populao dobra de tamanho. A fase log tambm denominada de fase exponencial. Nesta fase as clulas so uniformes e apresentam intensa atividade fisiolgica. C) FASE ESTACIONRIA O crescimento exagerado que verificado na fase log chega em um momento em que fica estacionado. Isto porque o nmero de clulas aumenta num ponto em que falta espao e os nutrientes comeam a se extinguir. Nesta etapa, no ocorre mais crescimento, a cultura atinge um ponto de equilbrio, caracterstico da fase estacionria. Algumas clulas comeam a morrer devido ao acmulo de metablitos txicos e falta de espao. Porm, a grande maioria das clulas esto em atividade. D) FASE DECLNIO (MORTE) Nesta etapa o crescimento negativo, pois o nmero de mortes supera o nmero de novas clulas. Isto ocorre devido ao esgotamento nutricional do meio de cultura e excesso de substncias txicas, prejudiciais s clulas. Com o passar do tempo, o nmero de mortos continua a aumentar em funo do tamanho da populao e o momento de uma parte das clulas vivas serem transferidas para um novo substrato. Todas estas etapas podem ser mais bem compreendidas observando-se o crescimento da populao em termos grficos.
Figura 1. Curva de Crescimento microbiano
Bibliografia TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia 8 ed. Traduo de Roberta Marchiori Martins. So Paulo: Atmed Editora, 2005. 894p. PELCZAR JR., J.M.; CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e aplicaes 2nd ed. Traduo de Sueli Fumie Yamada, Tnia Ueda Nakamura, Tereza Cristina R.M. Oliveira, Benedito Prado Dias Filho, Lourdes Botelho Garcia. So Paulo: Makron Books, 1996. 517p. volume 1.