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UNIVERSIDAD NACIONAL JOS MARA ARGUEDAS


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

PROYECTO DE TESIS
AISLAMIENTO Y SELECCIN DE LACTOBACILLUS SP PRODUCTOR
DE BACTERIOCINAS A PARTIR DE QUESO ELABORADO
ARTESANALMENTE PARA USO PROBITICO.

AUTOR:

Crdova Ramrez Alex


Talaverano Rojas Abel
Guzman Poma Yori Yoon
Uchupe Ramrez Dennis

ASESOR: Blga. Luz Azucena Torres Garca.


ANDAHUAYLAS PER
2013

Microbiologa
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1. PROYECTO DE INVESTIGACIN
I. GENERALIDADES:
1.

TTULO:
Aislamiento y seleccin de Lactobacillus sp Productor de Bacteriocinas
a partir de queso elaborado artesanalmente para uso probitico.

2.

AUTOR :
2.1 Nombre:
Crdova Ramrez Alex
Talaverano Rojas Abel
Guzman Poma Yori Yoon
Uchupe Ramirez Dennis
2.2 Carrera Profesional:Ingeniera agroindustrial.

3.

ASESORA:
3.1 Nombre: Blga. Luz Azucena Torres Garca.

4.

TIPO DE INVESTIGACIN
4.2. De acuerdo al fin que persigue:
Bsica
4.1 De acuerdo a la tcnica de contrastacin:
Descriptiva.

5.

RGIMEN DE INVESTIGACIN:
Libre.

6.

LOCALIDAD

INSTITUCIN

DONDE

SE

DESARROLLA

PROYECTO:
6.1 Localidad:
Santa Rosa Talavera Andahuaylas Apurmac Per.
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EL

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6.2 Institucin:
Universidad Nacional Jos Mara Arguedas

7.

CRONOGRAMA DE TRABAJO:
ETAPAS

Fecha

Dedicacin

Trmino

Horas semanales

08/08/2014

3hrs

Fecha Inicio

Recoleccin de datos

01/04/2014

Anlisis de resultados

05/04/2014

08/08/2014

2hrs

Elaboracin de informe

05/04/2014

08/08/2014

2hrs

8.

RECURSOS
8.1 Recursos disponibles:
8.1.1 Personal:
3.2 Profesional: Blga. Luz Azucena Torres Garca.

8.1.2 Bienes:
Materiales para el aislamiento de Lactobacillus sp
(materiales

de

vidrio,

plstico,

equipos,

materia

prima,

reactivos)

Materia prima
Queso
Materiales de vidrio
Placa petri

cantidad
2 unidades
cantidad
5 unidades

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descripcin
Queso artesanal
descripcin
De marca SCHOT

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Mechero
Vaso de licuadora.
Vasos precipitados
Materiales de metal
Cuchillo
Azas bacteriolgicas.

2 unidades
1 unidades
2 unidades
cantidad
2
2

DURAN
De ron de quemar
De 1 litro
De 100 ml
descripcin
Marca facusa
Con terminal de aro y en

cantidad
2
cantidad
1
1

escuadra
descripcin
De tamao mediano
descripcin
Separacin de la muestra
Para Incubacin de la

Materiales de plstico
Lavatorios.
Equipos
Centrifugadora.
Incubadora.
Reactivos y otros.
Caldo MRS.

muestra
descripcin
Medio de cultivo

cantidad
125g del envase

Alcohol
Algodn.

especifico.
Alcohol de 96
Industrial

25ml
100g

8.1.3 Local:
Laboratorio

de

la

escuela

profesional

de

ingeniera

agroindustrial.

8.2 Recursos no disponibles:


Caldo MRS.
Quesos artesanales.
Otros (tipeo, internet, etc.)
II.

PLAN DE INVESTIGACION:
1. REALIDAD PROBLEMTICA:
Las bacterias cido lcticas se utilizan desde hace aproximadamente 4 mil
aos en la elaboracin de alimentos. Comprenden un grupo de bacterias
benignas que como producto final de su fermentacin tienen al cido
lctico. Se

han

identificado

diversas

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tipos

de

bacterias

en

las

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fermentaciones

acido

lcticas, en

las

que

destaca el gnero

Lactobacillus. Se caracterizan por ser bacilos Gram positivos, no


esporulados, sin motilidad (no

tienen

movimiento), de metabolismo

fermentativo, anaerobio facultativo. (Fuente: Zamorano - 2002)


Existen diversos pptidos antimicrobianos denominados bacteriocinas
los cuales en su mayora son producidos por bacterias cido
lcticas.
Las bacteriocinas son sustancias de origen proteico, que se
como un grupo de sustancias antimicrobianas de
caracterizadas

por la

adsorcin

origen

receptores

de

define

bacteriano,
membrana

especficos, la actividad intraespecfica y, la biosntesis letal.


Las propiedades que principalmente que tienen las bacteriocinas en
cuenta

son

las

siguientes:

naturaleza,

tamao

molecular,

composicin aminoacdica y estructura qumica, termo resistencia y


estabilidad frente a pH, se han descrito algunas que presentan en su
molcula componentes glucocdicos y/o lipdicos, adems de una
fraccin proteica.
Las bacteriocinas se pueden utilizar como pro-biticos en diferentes
alimentos procesados. Al ingerir productos con contenido de pro-biticos
logra alcanzar un buen estado de salud del individuo, es a travs de la
resistencia otorgada contra la invasin de microorganismos patgenos,
que se logra mediante la generacin de sustancias antimicrobianas como
cido lctico. (Fuente: biblioteca.universia.net - bacteriocinas)
El uso de bacteriocinas producidas por bacterias cido lcticas junto con
otras tecnologas, mejora la seguridad en alimentos, ha sido comprobado
mediante la combinacin con calor, agentes antimicrobianos, sistema
lactoperoxidasa, presin hidrosttica y campo elctrico pulsado, las cuales
van a gen erar que se alargue la vida til y comercial de los productos.
Los beneficios que brindan las

bacteriocinas, estn relacionados con la

salud humana y animal, por tal motivo estas bacterias pueden ser usadas
en la conservacin de ciertos alimentos usando las bacteriocinas como
antimicrobianos, los cuales

ayudan a una mejor digestin. Presentan

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varias

caractersticas

ventajas

que

las hacen

particularmente

atractivas: un espectro de inhibicin especfico, un sistema de


autorregulacin de PH, estabilidad y procesos de produccin, costo
efectivo y el consumo en forma segura para los humanos por un
periodo prolongado. (Fuente: Sedano 2006)
Actualmente, la bio-conservacin en la industria alimentaria se basa en
las bacteriocinas producidas especialmente por el gnero Lactobacillus.
1.1. Antecedentes:
En el ao 2002, en Francia y Colombia, realizaron un trabajo acerca
de bacterias cido lcticas

productoras

aisladas

frescos

de

quesos

de

bacteriocinas

artesanales.

Las

cepas

productoras de bacteriocinas se reconocieron mediante la inhibicin


del crecimiento de

Listeria

(Gonzales,1994).
El Sedano e n el a o 2006,

sp

utilizada como

cepa indicadora

aisl 81 cepas de Lactobacillus de 11

muestras de masato procedentes de Pucallpa Ucayali, de estas 81


cepas, 8 cepas presentaron actividad inhibitoria, y solamente una
demostr que la sustancia inhibitoria no era un cido orgnico ni
perxido de hidrgeno, pudiendo corresponder a una bacteriocina.
En el Per ya se han realizado diversos estudios sobre las bacteriocinas
presentes en el queso, como es el caso de la Universidad Mayor de San
Marcos, donde aislaron bacteriocinas a partir de bacterias del gnero
Lactobacillus sp. Presentes en fermentaciones cido lctico como es el
caso de yogurt. Fue un trabajo de investigacin realizado por Ruth
Liliana Cristbal Delgado de la facultada de farmacia y bioqumica en el
ao 2008, en sus estudios de postgrado

1.2. Justificacin:
Las bacteriocinas, por ser sustancias antagnicas (antimicrobianos que
inhiben el daos de las bacterias) ayudan en las dietas no digeribles y
brindan un buen estado de salud. Se pueden utilizar tambin como
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conservadores biolgicos puros que en un momento dado podran


reemplazar a los conservadores qumicos ya que tienen la ventaja de ser
protenas que al biodegradarse no forman compuestos secundarios,
debido a esto se debera dar un valor agregado en producciones
industriales de derivados lcteos como el queso para ser usados como
pro biticos.
2. PROBLEMA:
Cmo

aslar y se

seleccionar

Lactobacillus

sp. Productor de

bacteriocinas a partir de queso elaborado artesanalmente para uso


probitico?

3.

HIPTESIS:
Implcita.

4. OBJETIVOS:
4.1. Generales:
Aislar y seleccionar Lactobacillus sp. Productor de bacteriosinas a
partir de queso elaborado artesanalmente para uso probitico.

5. DISEO DE CONTRASTACIN
5.1

Material de estudio:
Queso:
Se recolectaron quince muestras de quesos artesanales elaborados
en Sanmiguel de Llimpe perteneciente a la provincia de Chincheros ,
los cuales lo compramos en la feria dominical de Chincheros.
Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de qumica de la
EPIA. De cada queso se tomar una porcin de aproximadamente

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300g, la cual se colocar en una bolsa estril o de primer uso y se


transportar a temperatura ambiente.
5.2

Tcnicas:
5.2.1. Tcnica para el aislamiento de Lactobacillus sp. productores de
bacteriocinas para uso probitico.

A. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
De cada porcin de queso, realizar dos cortes radiales desde
el centro del queso usando un cuchillo estril.
Tomar de cada muestra,
25 g de

queso

se

homogenizarla con 225 ml de caldo MRS (Merck, pH 6.5)


por 1 minuto usando como homogeneizador una licuadora.
Realizar diluciones decimales hasta 10-4 en frascos con 90 ml
de caldo MRS, de la dilucin 10-4, tomar 0.1 ml y se sembrar
en superficie por diseminacin con esptula por duplicado en
placas Petri con agar MRS (Merck, pH 6.5).
Incubar las placas a 37 C por 72 horas.

B. OBTENCIN DE BACTERIOCINAS:
Despus del tiempo de incubacin, se seleccionara 5
colonias al azar de cada placa.
Anotar las caractersticas morfolgicas de las colonias
como: color, tamao (mm), aspecto y forma.

C. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LAS BACTERIOCINAS:

Cultivar cada aislado identificado en caldo MRS pH 6.5 a


37C por 18 horas en ausencia de oxgeno.
Centrifugar a 3500 rpm por 15 minutos
centrfuga
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usando

una

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Filtrar el sobrenadante obtenido con discos de filtro.


colectar en un tubo de ensayo estril para determinar la
actividad

bacteriocinas

las

pruebas

de caracterizacin

fisicoqumica.
Neutralizar el sobrenadante con NaOH 2.5N hasta llegar a un
pH de 6.5 para descartar que la accin inhibitoria se deba a
cidos orgnicos.
En placas petri estriles colocar 1 ml de inculo de la cepa
indicadora y agregar 20 ml de agar Meller Hinton, licuado a
menos de 50C y luego homogeniz el inculo con el agar.
D. EFECTO DE TEMPERATURA DE CONSERVACIN:
Los sobrenadantes con actividad antibacteriana se deben incubar a 4
C, 15 C y 32 C por 30 das.
Despus del periodo de incubacin, se determinar la actividad
antibacteriana de los sobrenadantes tratados
Para la temperatura de 4 C usar una refrigeradora y para las
temperaturas de 15 C y 32 C usar estufas graduadas a las
temperaturas indicadas.

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6.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
Ratto M.

Control

microbiolgico

lcteos:

Mtodos recomendados.

de

leches

productos

Lima, Cleiba Universidad

Nacional Mayor de San Marcos; 1983


Gonzlez B, Arca P, Mayo B, Surez J.

Detection,

purification and partial characterization of Plantaricin C,


a

bacteriocin

strain

of

dairy

produced
origin.

by

Lactobacillus plantarum

Applied

and

Environmental

Microbiology 1994.
Sedano J. Seleccin de cepas nativas de Lactobacillus
con actividad inhibitoria y tolerantes al etanol aisladas de
masato (Tesis Licenciatura). Lima, Universidad Nacional
Mayor de San Marcos; 2006.
http://www.ugr.es/~anpenet/metodologia.html.
"Queso." Microsoft Encarta 2009.
Zamorano 2002, extrdo de :
zamo-oti-02.zamorano.edu/.../getFicha.asp?...
biblioteca.universia, extrado de:
net/ficha.do?id=44756650

7.

ANEXOS:
Colonias de bacillus sp.

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10

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11

Colonias obtenidas del aislamiento de bacteriocinas a partir del queso


artesanal.