UNIVERSIDAD NACIONAL

FEDERICO VILLARREAL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y
MATEMTICA
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGA

Tcnicas de Aislamiento de cidos Nucleicos:

Preparacin de muestras
PRESENTADO POR:
Vanessa
CURSO:
GRUPO:
PROFESORA:

ROMERO

CARHUAVILCA,

Biologa Molecular
B
Milagros Quintana

2016

Daisy

Prctica N1:
Tcnicas de Aislamiento de cidos Nucleicos: Preparacin de
muestras
Cuestionario:
1. Explique en qu consiste la sonicacin. En qu tipo de
muestras es empleada?
La sonicacin es el proceso de convertir una seal elctrica en una vibracin
fsica que puede ser dirigida hacia una sustancia. Los sonicadores son
equipos vitales de laboratorio y se utilizan para muchos propsitos.
La sonicacin se realiza generalmente para separar compuestos o clulas
para su examen ms detallado. La vibracin tiene un efecto muy poderoso
en las soluciones, haciendo que sus molculas se separen y las clulas se
rompan. Un primer ejemplo est en las pruebas de ADN, donde las clulas
que pueden contener informacin del ADN son sometidas a la sonicacin
para poderlas romper para que as liberen las protenas del ADN para poder
ser probadas.
2. Qu consideraciones deben tenerse para extraer ADN de
bacterias Gram positivas? En qu difiere de un protocolo de
extraccin de ADN de Gram negativas?
Una bacteria gram positiva posee una pared gruesa de peptidoglicano,
mientras que la gram negativa posee una pared fina de peptidoglicano
seguida hacia

el exterior por una membrana externa. Esta pared y

membrana protegen el interior de la clula, que es donde se encuentra el

ADN genmico.
Para poder extraer el mismo, debemos utilizar agentes qumicos y/o fsicos
que debiliten la pared y membrana de la clula. Por ende, es importante
conocer el tipo de gram a la hora de realizar una extraccin de ADN
genmico, ya que debemos determinar qu agentes utilizar para el
rompimiento efectivo de la clula.

De todas las muestras biolgicas que podemos someter a un proceso de

extraccin de ADN, las suspensiones bacterianas, son quizs las que ofrecen
menos problemas por la homogeneidad y riqueza del material. En particular,
las suspensiones densas de bacterias gramnegativas pueden liberar
cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves como pueden
ser una simple ebullicin, congelacin o una combinacin de ambas .
3. Para qu se realiza la incubacin a 55C de una muestra
biolgica?
Para permitir la ruptura de las membranas, en el caso de bacterias y
levaduras

se rompen solo con calor. En el caso de clulas eucariotas a

pesar de haber macerado un tejido y adicionado reactivos se pone a incubar

la muestra para que el calor dilate el resto del tejido y funcione con ms
eficiencia los reactivos para lisar.
Por ejemplo para la obtencin de ADN a partir de sangre se incuba a 55C,
para poder purificar el ADN.
Para microorganismo la incubacin tiene por objeto:
Conseguir el crecimiento de microorganismo mesofilos utilizando tiempos de
incubacin prolongados a temperatura adecuada.
Conseguir el crecimiento de microorganismos termfilos, utilizando tiempos
de incubacin limitados a temperatura adecuada ( 55 C durante 10 dias ,
como mximo), para evitar el fenmeno de autoesterilizacion de la
conserva.
4. Consulte otra tcnica de ruptura de tejido vegetal y explique
el fundamento?
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de mtodos y tcnicas que
tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un
determinado componente celular, ya sea ste un orgnulo (mitocondrias,
ncleos, peroxisomas, etc.) una fraccin de membrana (membrana total,
plasmtica,

dominio

basolateral,

dominio

apical,

etc.),

complejos

multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtbulos, poros nucleares, etc.).

Tcnicas de rotura de clulas y tejidos:

1. HOMOGENIZACION
Se trata de romper las clulas con la ayuda de un mbolo rotatorio que
se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal
especial, el homogenizador. Clulas anexas: primero se deben romper
conexiones con otras clulas. Clulas no anexas: pueden separarse teniendo
en cuenta forma, densidad o caractersticas que puedan marcarse. Existen
dispositivos de homogenizacin en los que est calibrada la separacin
entre el mbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un
tamao de partcula determinado. Consiste en el procesamiento del tejido y
posteriormente de las clulas con el fin de obtener una mezcla fluida en la
cual estn todos los componentes celulares, para lo cual podemos recurrir a
diversos mtodos fsicos.
1.1. SHOCK OSMOTICO
La clulas se hacen estallar al someterlas a un medio hipotnico, lo cual
hace que la membrana no resista la presin osmtica. Puede ocasionar el
dao a las membranas de algunas organelas.No se recomienda porque en
algunas Organelas se lesiona la membrana. Es utilizado para el aislamiento:
Mitocondria y Cromosomas Mitticos
1.2. MORTERO Y MANO
Es un mtodo convencional de rompimiento por friccin. Pueden
emplearse materiales abrasivos como cuarzo, vidrio molido, arena, o
materiales silceos. La masa celular contenida en un volumen de buffer se
mezcla con un volumen de medio moledor (0.5 1). La friccin sobre las
clulas genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar.
Actualmente se dispone de homogenizadores ms sofisticados que emplean
el mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de friccin y la
temperatura del proceso, son conocidos como potters. Los principales
problemas de esta tcnica son: la eficiencia baja cuando se usan pequeas
cantidades de medio moledor cuando es baja la concentracin celular; la
friccin genera calor y pueden presentarse alteracin en las protenas
1.3. SONICACION
Consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una suspensin celular. La
intensa

agitacin

producida

destruye

las

membranas

celulares.

Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energa aplicada se pueden

destruir

asimismo

complejos

las

proteicos.

sobrecalentamiento

estructuras
Se

de

suele
las

subcelulares
aplicar

muestras

en

incluso

frio

para

que

podra

solubilizar
evitar

el

provocar

la

desnaturalizacin de las protenas. Se transmite una corriente elctrica a un

sistema mecnico que la convertir en vibraciones de alta intensidad
generndose ondas de ultrasonido que generan millones de

burbujas

microscpicas, las cuales se expanden y colapsan contra las clulas

causando la ruptura de su membrana. Este fenmeno llamado cavitacin
puede incrementarse adicionando al medio finsimas esferas de vidrio.
1.4. COMPRESION - DESCOMPRESION. Picador / prensa de slidos
Se emplea la prensa francesa, consiste en el paso de las clulas a
gran presion por un pequeo orificio a una cmara con presin baja, lo cual
ocasiona la ruptura de las clulas por descompresin.
La filtracin al pasar las clulas a travs de orificios a presin de
dimetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares.
Preparacin de extractos de tejidos animales. El tejido es prensado por una
placa metlica de tamiz mientras rotan cuchillas que barren lentamente
sobre la superficie de la placa. Fragmentos resultantes de 0.3 0.5 mm. Es
paso preliminar para someter a otros tipos de homogenizador.
Compresin / Expansin
Prensa Francesa. (Asociarse a Tec. Congelamiento). Material celular difcil
de fragmentar. No se usa con frecuencia. Mecanismo: paso de las clulas de
una cmara con gran presin a otra con presin baja a travs de un orificio.
Repetidas a Alta Velocidad. Ruptura por descompresin. (Virus, Bacterias).
Unidades con capacidad de 1-40 ml. Presin 20.000

- 40.000 libras por

pulgada2.
1.5. CONGELAMIENTO - DESCONGELAMIENTO
Requiere de periodos prolongados de tiempo (hasta 36 horas) para el
congelamiento y descongelamiento. El lquido al congelarse a -56 C forma
cristales muy finos que rompen la clula cuando esta se descongela
rpidamente a 37C. El lquido al congelarse (-56C) provoca la formacin

de cristales muy finos que rompen la clula cuando se descongela

rpidamente (37C).
Tejidos animales y vegetales y masas microbianas pueden congelarse con
nitrgeno lquido y molerlos en mortero comn. Aparato fracturador:
pulverizador de tejidos Bessman. Fragmenta 10 mg 10 g de tejido.
Procedimiento largo (36 h).
1.6. Uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.

Preparacin de reactivos y buffers

Reactivos:

Tris-HCl 1M pH 8
EDTA 0.5M
SDS 10%
NaCl 5M
Proteinasa K 20 mg/ml
Etanol absoluto

Procedimiento:
Realizar los clculos adecuados para preparar los siguientes buffers y
soluciones a partir de las soluciones stocks anteriormente citados en
materiales y reactivos:
1. 10 ml Buffer TE (Tris-HCl 10mM, pH 8; EDTA 1 mM)

C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=10 mM . 10 ml

Tris-HCl 10mM

C o . V o=C f . V f
V o=0.1ml
500 mM .V o=1 m M .10 ml
EDTA 1 mM

V o=0.02ml

2. 10 ml Buffer High TE (Tris-HCl 25mM, pH 8; EDTA 20 mM)

C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=25 mM . 10 ml

Tris-HCl 25mM

V o=0.25 ml
C o . V o=C f . V f
EDTA 20mM

500 mM .V o=20 mM . 10 ml

3. 2 ml Buffer Low TE (Tris-HCl 50mM, pH 8; EDTA 1 mM)

V o=0.4 ml
C o . V o=C f . V f
Tris-HCl 25mM

1000 mM .V o=50 mM . 2 ml
V o=0.1ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=1 mM . 2ml

EDTA 1mM

V o=4 x 103 ml=4 uL

4. 10 ml Solucin de precipitacin de protenas (Acetato de amonio 10M)
Formula qumica: CH3COONH4
PM= 77.08

5.

M=

m
PM .V

M=

m
77,08 x 0.01

5 ml Buffer de lisis para aislar ADN E. coli (High TE; NaCl 0.15 M;
SDS 0.2%)

M =7,708 g

C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=25 mM . 5 ml

Tris-HCl 25mM

V o=0.125ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=20 mM . 5 ml

EDTA 20mM

C o . V o=C f . V f
V o=0.2ml
5000 mM .V o=0.15 M . 5 ml

NaCl 0.15M

V o=0.15 ml=150 uL
10 . V =0.2 . 5 ml
V =0.1 ml

SDS 0.2 %

6. 30 ml Buffer de lisis para aislar ADN genmico animal (Tris-HCl 100

mM, pH 8; EDTA 5mM; SDS 0.2% NaCl 200 mM; Proteinasa K 0.1
mg/ml)

C o . V o=C f . V f
1000 mM .V o=100 mM . 30 ml

Tris-HCl 100mM

V o=3 ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=5 mM . 30 ml

EDTA 5mM

V o=0.3 ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=2000 mM . 30 ml
V o=1,2 ml

NaCl 200mM

10 . V =0.2 . 30 ml
SDS 0.2 %

V =0.6 ml

20

mg
mg
x V =0.1
X 30 ml
ml
ml

Proteina

7. 5 ml Buffer maceracin (Tris-HCl

200mM
V =0,15
ml pH 8; EDTA 25mM; SDS
0.5%; NaCl 0.25 M)

C o . V o=C f . V f

Tris-HCl 25mM

1000 mM .V o=200 mM . 5 ml
V o=1 ml
C o . V o=C f . V f
500 mM .V o=25 mM . 5 ml

EDTA 25mM

V o=0.25 ml
C o . V o=C f . V f
5 M . V o=0.25mM .5 ml

NaCl 0.25M

V o=0,25 ml
10 . V =0.5 .5 ml
SDS 0.5 %

8. 10ml Etanol 70%

96 . V =70 .10 ml
V =7.2916 ml

V =0.25 ml