Pewarnaan Gram atau Metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling

penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antarapneumokokus dan
bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua
kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri Gram positif akan
mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di
bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet
setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat
pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat
dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan
dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja (Gupte, 1990).
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor
yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat
warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat
juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri
tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna.
Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini
berfungsi untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakteri akan
memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri
(Sutedjo , 1991).
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan yang digunakan untuk
mengidentifikasi bakteri (mikroorganisme). Zat warna yang digunakan pada pengecatan Gram
meliputi crystal violet , yodium , alkohol dan safranin. Fungsi dari masing-masing zat warna
tersebut adalah :
1. Crystal Violet
Berwarna ungu. Merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna
mikroorganisme target. Crystal Violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel
mikroorganisme yang bersifat asam , dengan begitu sel mikroorganisme yang transparan akan
terlihat berwarna (Ungu).
2. Yodium
Merupakan pewarna Mordan , yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer
yang diserap mikroorganisme target. Pemberian yodium pada pengecatan Gram dimaksudkan
untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri.
3. Alkohol
 Solven organik yang berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna
pada sel bakteri (mikroorganisme). Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan :
1. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu
2. Bakteri menjadi tidak berwarna
4. Safranin
Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk
mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan
alkohol. Dengan kata lain , memberikan warna pada mikroorganisme non target

Macam-macam pewarnaan (Yulneriwanti, 2008) :

1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang
- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta
2. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
3. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pw. Gram, Pw. Bakteri Tahan Asam
4. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri→ kapsul, spora, flagel dll
Teknik pewarnaan:
A. Pengecatan Sederhana
Pengecatan sederhana digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan
latar belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri, dengan
cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal violet. Pada
pengecatan sederhana digunakan bakteri Bacillus cereus dan Salmonella typii. Setelah
pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yang berarti bakteri tersebut menyerap zat
warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat warna yang umunya digunakan yakni
yang bersifat alkalin (kromatofornya bermuatan +).

B. Pengecatan Negatif
Pada pengecatan ini digunakan cat asam nirosin (tinta cina). Pengecatan ini dilakukan untuk
mewarnai latar belakang preparat sedangkan bakteri sendiri tidak terwarnai serta untuk
mengamati ukuran, bentuk, dan tata letak sel. Setelah pengamatan dibawah mikroskop diperoleh
preparat mikroba berwarna hitam sedangkan bakteri sendiri tidak berwarna (berwarna putih) dan
berbentuk basil (batang).

C. Pengecatan Gram
Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri
gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatn ini digunakan 3 jenis bakteri yaitu
Bacillus cereus, Salmonella typii dan Eshericia coli.. Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan
yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensifan cat utama, alcohol
asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh
Bacillus cereus dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat
dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan
dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding
sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian
alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel
disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli bersifat gram
negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni
merah dari pewarna safranin.
Prosedur Praktikum

1. Pewarnaan Sederhana

Siapkan kaca objek, bersihkan dengan alcohol dan panaskan di atas lampu spiritus. Jika
sampel dalam bentuk padat, encerkan dengan NaCl, terbentuklah suspensi bakteri. Kawat Ose di
panaskan hingga memijar dan dinginkan, lalu celupkan kedalam suspensi bakteri. Kawat Ose
yang telah di celupkan ke dalam suspensi digoreskan pada kaja objek, dan teteskan NaCl
fisiologis. Keringkan preparat dengan cara diangin-angin dan dekat panas api Bunsen. Preparat
lalu didinginkan, setelah dingin teteskan zat pewarna air Fuchsin diatas suspensi yang
mengering. Diamkan selama 1-2 menit. Lalu zat pewarna yang berlebih dituang dan dibersihkan
dengan kapas. Lalu preparat dikeringkan dekat dengan panas api hingga mengering. Preparat
diteteskan dengan minyak imersi lalu amati dan catat hasilnya.

2. Pewarnaan Diferensial

Preparat yang sudah diberi bakteri diatas kaca objek dikeringkan di atas panas api
sebanyak 3 kali. Teteskan dengan karbol gentian violet dan diamkan selama 30 detik, buang zat
pewarna yang berlebih. Bilas dengan alkohol 96% selama 2 detik hingga zat pewarna larut, dan
dibilas lagi dengan aquades. Keringkan dan diberi minyak imersi. Catat dan amati hasilnya.

3. Pewarnaan Negatif

Siapkan 2 buah kaca objek dan bersihkan dengan alkohol. Kaca objek yang pertama
diteteskan tinta cina di ujung kaca objek, dan letakan suspensi bakteri dekat dengan tinta cina
menggunakan kawat ose dan campurkan. Sedangkan kaca objek yang kedua menekan kaca objek
yang pertama sehingga membentuk lapisan film yang tipis. Catat dan amati hasilnya.
 DAFTAR PUSTAKA
-http://mei-smart.blogspot.com/2009/10/fungsi-zat-pewarna-pada-pengecatan-gram.html

-http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram

-http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/