Tincin de GRAM

INTRODUCCIN
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan
difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar
el contraste es la utilizacin de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las clulas para la
microscopa, son suficientes los procedimientos que usan un solo colorante
llamado de tincin simple. Sin embargo, a menudo se utilizan mtodos que no
tien de igual modo todas las clulas, es el proceso denominado tincin
diferencial. Uno muy usado en microbiologa es la tincin Gram. Basndose en su
reaccin a la tincin Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: granpositivas y gran-negativas. Esta tincin tiene gran importancia en taxonoma
bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las
distintas bacterias.

Tincin de Gram:
Es la tcnica de coloracin diferencial ms importante aplicada a bacterias.
Las clulas se tien con cristal violeta y despus se tratan con una solucin de
ioduro como mordiente. Luego se tratan con decolorante; las bacterias granpositivas retienen el color violeta, mientras que las gran-negativas no. Para teir
estas ltimas, se utiliza safranina (rojo) como contracolorante.
La teora de la permeabilidad ha sido propuesta como una posible
explicacin del mecanismo de la coloracin de Gram. La teora

propone que las

bacterias se tien diferencialmente por diferencias fsicas y qumicas de sus

paredes celulares. Estas paredes en las gran-positivas son gruesas y
qumicamente simples, compuestas principalmente de protenas y mucopptidos
(peptidoglicano y murena). El alcohol causa la deshidratacin de la pared celular
gran-positiva, reduciendo la perdida de sustancias tales como cristal violeta. La
pared en las gran-negativas es fina y compleja, conteniendo protenas,
mucopeptidos y lpidos. Cuando es tratada con alcohol se disuelven los lpidos y la
coloracin primaria es eliminada.
Si la integridad de la pared celular est daada o si se decolora en exceso,
pueden aparecer como gran-negativas, las gran-positivas. Por otra parte, las
bacterias gran-negativas pueden aparecer como positivas si la capa de bacterias
es muy gruesa y la decoloracin no es completa. Para obtener resultados ms
confiables es mejor trabajar con cultivos jvenes en crecimiento activo y adems
utilizar organismos conocidos gran-positivos y gran-negativos como controles.
Procediemiento:
1) Extensin: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se
coloca una gota de agua destilada a la que con el ansa de siembra, previamente
esterilizada a la llama, se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias
o, en su caso, de una colonia. Con el ansa se extiende la gota y las bacterias

sobre el porta y se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la llama

del mechero hasta que se seque.

2) Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se decolora con alcohol de 95 o decolorante (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto en safranina (colorante de contraste)
g) se lava con agua corriente
h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy
pequea de aceite de inmersin y observar al microscopio con el objetivo
de inmersin.