La biodegradacin de la mezcla de explosivos en el suelo

bajo diferentes condiciones de contenido de agua

S. Sagi-Ben Moshe una ,O. Dahan b ,N. Weisbrod b ,A. Bernstein b ,E. Adar b ,
c ,Z. Ronen b ,

abstract
El potencial redox del suelo juega un papel clave en las tasas y las vas de
degradacin de explosivos, y est muy influenciada por el contenido de agua y
la actividad microbiana. El potencial redox del suelo puede variar
significativamente, tanto temporal como espacialmente en micro-sitios. En este
estudio, cuando el contenido de agua del suelo aumenta, el potencial redox
disminuye, y no haba mejora significativa en la biodegradacin de una mezcla
de tres explosivos. Considerando que la degradacin de TNT se produjo bajo
condiciones aerbicas y anaerbicas, RDX y HMX degradacin se produjeron
slo cuando las condiciones de contenido de agua resultaron en un perodo
prolongado de potencial redox negativo. Por otra parte, en condiciones
insaturados, que son ms representativas de las condiciones ambientales
reales, el bajo potencial redox, incluso cuando se mide por perodos
temporales, era suficiente para facilitar la degradacin anaerobia. Nuestros
resultados indican claramente una influencia negativa de TNT en la
biodegradacin de RDX y HMX, pero este efecto fue menos pronunciado que el
que se encuentra en los anteriores experimentos de suspensin por lotes: esto
puede explicarse por un efecto de enmascaramiento del suelo en los botes.
Total o parcialmente suelos saturados pueden promover la existencia de micronichos que difieren considerablemente en sus condiciones de concentracin de
explosivos, la comunidad microbiana y redox.

introduccion
En muchos sitios de explosivos contaminada, el suelo est contaminado con
mezclas de explosivos, ms comnmente 2,4,6-trinitrotolueno (TNT),
hexahidro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazina (RDX) y octahidro-1,3,5,7-tetranitro1,3,5,7-tetrazocine (HMX) [1] y [2] ( Fig. 1 ). La biodegradacin de estos
compuestos parece ser un medio eficaz para la remediacin de la tierra
contaminada y el agua. Condiciones redox influyen altamente la eficiencia de
explosivos biodegradacin en la sub-superficie, as como dictan la va de
degradacin y los productos de degradacin acumulados.

TNT se puede biodegradar tanto aerbicas y anaerbicas. En ambos casos, los

productos iniciales formados son los derivados amino reducidos 4-amino-2,6dinitrotolueno (4-Am-2,6-DNT) y 2-amino-4,6-dinitrotolueno (2-Am-4, 6-DNT) [1]
. Una mayor degradacin de los productos ms reducida, triaminotoluene (TAT),
requiere de potencial redox muy negativo en valores inferiores a -200 mV-TAT y
por lo tanto slo se encuentra en los ambientes reducidos [3] . Se puede
producir condensacin de los compuestos intermedios de amino parcialmente
reducidos, lo que lleva a la formacin de productos intermedios azoxi [3] y
[4] .
La biodegradacin de RDX se produce tanto en condiciones aerobias y
anaerobias, pero el proceso anaerbico es significativamente ms rpido [5] .
Aerbicamente, se ha encontrado que la escisin microbiana de uno de los N
enlace sencillo NO2 bonos produce intermedios inestables, y es seguido por la
rpida escisin del anillo de triazina [1] . Anaerobio, la reduccin secuencial de
los grupos nitro para producir mono-, di- y trinitroso derivados (MNX, DNX y
TNX, respectivamente) se observa con mayor frecuencia. Los derivados
nitrosos pueden ser transformados adicionalmente para producir los derivados
de hidroxilamina inestables, lo que lleva al anillo de escisin [6] . Esta va se
describe para la incubacin RDX con lodos municipales bajo medidos E h
valores de -250 a -300 mV [7] .
HMX mayora sufre biodegradacin anaerbica a travs de la reduccin de los
grupos nitro para formar los derivados nitroso correspondientes, o,
alternativamente, a travs de la escisin directa anillo [8] .
Potencial redox del suelo juega un papel clave en la va de degradacin de los
explosivos, as como en la tasa de degradacin de [1] , [5] , [8] , [9] y [10] .
Por lo tanto, para predecir el destino de los explosivos en el ambiente, se
requiere el conocimiento de las condiciones redox. Explosivos experimentos de
degradacin en el que se midi el potencial redox experimentos han implicado
en suelos fangosos que no representan las condiciones naturales [9] y [11] .
Potencial redox del suelo se sabe que est altamente influenciada por tanto el
contenido de agua y la respiracin microbiana. Oxgeno actos molecular que el
aceptor de electrones preferido pero una vez que se consume, la actividad
microbiana cambia a la fermentacin y la respiracin anaerobia [12] . El
potencial hdrico del suelo y la estructura de los poros determinan la velocidad

a la que el oxgeno se repone en el suelo ya que el coeficiente de difusin de

oxgeno es menor en el agua que en el gas [13] . Se ha demostrado que el
potencial redox del suelo puede ser muy dinmico, variando tanto temporal
como espacialmente en varios rdenes de magnitud, en micro-sitios [12] .
Dado que bajo condiciones naturales suelos estn normalmente insaturados, la
cuestin es que de las vas que se detectan en el laboratorio tambin puede
ocurrir en el campo, y en qu contenidos de agua. La hiptesis de que las
condiciones anxicas pueden desarrollar en las zonas no saturadas que son
suficientes para las vas de degradacin anaerobias que se produzca en el
campo. Esto se ve reforzado, por ejemplo, por la deteccin de los derivados
nitroso anaerbicas de RDX a lo largo de perfiles de suelo insaturados [14] .
El grado de saturacin puede afectar a la medida a la que un compuesto afecta
a la degradacin de la otra, como se observa en los experimentos de lodos [2] .
Es posible que la saturacin inferior disminuir la disponibilidad de compuestos
inhibidores.
Para llenar algunas de estas lagunas en nuestro conocimiento de explosivos
biodegradacin en condiciones no saturadas se explor si podran existir
condiciones anaerbicas en los suelos no saturados con diferente contenido de
agua y si estas condiciones seran suficientes para la biodegradacin
anaerbica de los explosivos. Nos determin adems si el efecto inhibidor de
TNT y sus productos de degradacin en RDX y HMX degradacin ocurre en
suelos insaturados, similar a la observacin reportado para condiciones de
saturacin [2] .

Experimental
2.1. productos qumicos
TNT, RDX y HMX (> 95% de pureza) proporcionado por la industria militar
israel se utilizaron para el experimento de biodegradacin. estndares
analticos para el anlisis de HPLC de RDX, 2-Am-4,6-DNT y 4-Am-2,6-DNT se
compraron a Supelco (Bellefonte, PA). estndares analticos para 4-nitro-2,4diazabutanal (NDAB), MSX, DNX y TNX eran de SRI International (Menlo Park,
CA). Tambin se prepararon los estndares de TNT y HMX para el anlisis HPLC
de polvo slido (> 95% de pureza). El metanol y acetona fueron de grado HPLC,
y todos los dems productos qumicos eran de grado reactivo.
2.2. Biodegradacin de mezclas explosivas en diferentes condiciones de
contenido de agua
Se llevaron a cabo experimentos por lotes para caracterizar la biodegradacin
de tres explosivos TNT, RDX y HMX en una mezcla, bajo diferentes condiciones
de contenido de agua: seco (1%, w / w), moderada (7%, w / w) y saturado
( 19%, w / w). Desde que ocurri la produccin de la fermentacin y gas
intensiva en el tratamiento saturada del suelo en los primeros 2 das, el agua
se filtr a partir de los botes, y se determin el contenido de agua por encima

de despus de la fuga. El suelo de todos los tratamientos (94% de arena, 1%

de limo y el 5% de arcilla sobre una base de peso seco) fue excavado 10 cm
por debajo de la superficie del suelo de un estanque de infiltracin que se ha
utilizado durante ms de 20 aos para eliminar las aguas servidas no tratadas
de explosivos plantas -manufacturing [14] . Suelo (200 kg) se tamiz para
excluir materiales gruesos y se mezcla con 25 l de solucin estril libre de
nitrgeno mineral [15] melaza que contienen (5 g / L como el carbono), que
sirvi como fuente de carbono externa. Entonces el suelo se sec al aire
durante 4 das, y luego se tamiza de nuevo y se mezcla con explosivos polvo.
El suelo se mezcl despus con agua destilada para obtener el contenido de
agua deseado y se embala para llenar completamente botes de acero
inoxidable de 1 l. Los botes con contenido moderado de agua se hicieron girar
dos veces al da (180 cada vez) para evitar el drenaje del agua y para
mantener condiciones homogneas en el contenido de agua. Se tomaron tres
repeticiones de cada tratamiento, el contenido de agua en cada punto de
muestreo (una vez a la semana), y se monitorizaron las concentraciones del
contenido de explosivos y de agua en las muestras para los tres tratamientos
(por triplicado, 3-5 submuestras de cada bote) cada semana. Los botes de
replicar desde el punto de muestreo final (es decir, las tres rplicas de cada
contenido de agua que se muestrearon al final del experimento) contenan
electrodos Ag / AgCl (Cole-Parmer electrodo de ORP, en lnea, de doble
unin, Vernon Hills , IL) que permiti el control continuo del potencial redox
durante todo el experimento (un perodo de 20 semanas). Tenga en cuenta que
las lecturas de los electrodos de Ag / AgCl representan slo el entorno
inmediato del electrodo y que el potencial redox pueden variar, como se
mencion anteriormente, tanto temporal como espacialmente en micro-sitios
[12] .
En el primer experimento, los diferentes tratamientos se muestrearon una vez
a la semana, durante un perodo total de 20 semanas. Este primer experimento
se centr en la degradacin de los tres explosivos, es decir, en presencia de
TNT. A continuacin, un segundo experimento se llev a cabo, esta vez
centrndose nicamente en RDX y HMX degradacin. El segundo experimento
se realiz bajo contenido de agua moderada y saturado solamente (7% y 16%
(w / w), respectivamente), en ausencia de TNT. Los tratamientos en el segundo
experimento se tomaron muestras cada 1-2 semanas, durante un perodo total
de 20-24 semanas. En el segundo experimento, se examin tambin la
influencia de TNT en la biodegradacin de RDX y HMX. Por lo tanto, aunque el
suelo para este experimento fue contaminado solamente con RDX y HMX, cada
tratamiento tena botes de control adicionales que incluan TNT tambin. Los
botes de TNT que contienen se muestrearon cada 2-4 semanas.
La concentracin inicial se calcul a partir concentraciones determinadas en
cinco extractos de suelo repetidas ( Tabla 1 ), y las incertidumbres ( valores)
representan una desviacin estndar de las mediciones repetidas.

2.3. Efecto de las concentraciones de explosivos y humedad del suelo en la

poblacin microbiana

Con el fin de seguir los cambios en las poblaciones microbianas, se extrajo ADN
de 0,65 g de suelo de varias muestras de los tres tratamientos de la primera
experimento de biodegradacin (Seccin 2.2 ) con el Kit DNA del suelo de
energa (Mo Bio, Carlsbad, CA). Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
seguida de electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE) se
realiza como describir anteriormente [2] y [16] . Las principales bandas del
gel se escindieron cuidadosamente, se extrajo ADN de cortes de gel y se clon
en el plsmido pTZ57R / T usando el PCR Cloning Kit InsTAclone (Fermentas,
Hanover, MD). La secuenciacin de ADN se realiz por Macrogen Inc. (Sel,
Corea).

2.4. Efecto de TNT sobre la toxicidad del suelo

Toxicidad del suelo fue examinado en varias muestras de suelo obtenidas a

partir de diferentes muestras de los tratamientos en el contenido de agua en
hmedo y moderados del segundo experimento (Seccin 2.2 ). Toxicidad de
ensayo se llev a cabo utilizando biosensor (CheckLight Qiryat-Tivo'n, Israel),
un sensor microbiana que est diseado para producir luz en respuesta a los
efectos txicos del medio ambiente [17] .

Suelo (1,5 g) a partir de varias repeticiones del tratamiento en hmedo de la

segunda experimento se suspendi en 3 ml de agua bidestilada y se agit en
un agitador rotatorio (150 rpm) durante 1 h. El sedimento en suspensin se
dej sedimentar y el sobrenadante se centrifug para reducir an ms los
slidos en suspensin. La toxicidad de esta solucin fue probada usando PCBTOX (ToxScreen3) que contiene la bacteria luminiscente Photobacterium

leiognathi segn las instrucciones del fabricante para el ensayo de placa de

microlitro (CheckLight Ltd.). Las placas se incubaron y ledo por Tecan Infinito
M200 lector de micro-placa (Mnnedorf, Suiza). La toxicidad se expresa como
IC 50 (IC 50 que representa la dilucin de la muestra porcentaje causando una
doble disminucin de la luminiscencia, mientras ms bajos IC 50 valores
significan mayor toxicidad), donde IC 50 valores de las diferentes muestras se
calcularon utilizando una hoja de clculo Excel proporcionado por el fabricante
del kit toxicidad.

2.5. mtodos analticos

Para determinar las concentraciones de explosivos, muestras de suelo de los
diferentes experimentos se extrajeron en metanol usando Accelerated
disolvente de extraccin (ASE-200, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) de
acuerdo con el mtodo de Ronen et al. [20] . Las concentraciones de los
compuestos TNT, 2-Ser-4,6-DNT, 4-Ser-2,6-DNT, RDX, la MSX, DNX, TNX y HMX
se analizaron por HPLC (Agilent 1100 series, Agilent Technologies, Inc., Santa
Clara, CA) de acuerdo con el mtodo EPA 8330 [18] . El lmite de deteccin de
los compuestos anteriores en los extractos de suelo fue de 0,05 mg / L.
Contenido de agua en las muestras de suelo se determin gravimtricamente
en tres a cinco muestras repetidas de suelo de cada bote mediante la
comparacin de un peso de la muestra con relacin a su peso despus de
secar durante 24 horas a 105 C.

3. resultados
3.1. La biodegradacin de la mezcla de explosivos en diferentes condiciones de
contenido de agua
En ambos experimentos, el aumento de contenido de agua result en un
aumento de la medida de degradacin. En el primer experimento, bajo
contenido de agua gravimtrico (GWC) de 1%, se observ algo de desaparicin
de TNT pero no desaparicin de RDX o HMX ( Fig. 2 a). Menos del 7% de GWC,
aunque se degrad TNT, sin degradacin de RDX o HMX se observ ( Fig. 2 b).
En el tratamiento saturada de la primera experimento, casi completa
desaparicin (> 98%) de TNT se observ despus de 11 semanas ( Fig. 2 C).
Degradacin RDX se retras y slo comenz despus de 20 semanas, tal como
se indica por la ligera acumulacin de los productos nitroso anaerbicas. Un
promedio de ca. 7% de la cantidad inicial RDX se ha recuperado como
derivados nitrosos en este punto de muestreo (un total de 107 mmol / kg).
Estos productos de degradacin aparecieron cuando TNT haba desaparecido
casi por completo del suelo y la concentracin de los compuestos intermedios
de amino TNT fue ca. 10 7% de la concentracin inicial de TNT. Al final del
perodo de incubacin, la concentracin HMX no difera de su concentracin

inicial que indica que la biodegradacin de HMX no ocurri en ninguno de los

tratamientos.

En el segundo experimento, en ausencia de TNT, no se espera que la

degradacin de RDX y HMX que ser retardado y por lo tanto era posible
estudiar su comportamiento bajo diferentes contenidos de agua. Las tasas de
biodegradacin de RDX y HMX ( Fig. 3 A y B) se han encontrado para ser ms
rpido al aumentar el contenido de agua. Aunque se observ retraso en RDX y
HMX degradacin en los botes de TNT que contienen, no se observ inhibicin
de la degradacin completa, en contraste con el efecto inhibidor ms fuerte
detectada en presencia de TNT en el primer experimento.

Higo. 3.
Biodegradacin de RDX y HMX en presencia y ausencia de TNT en: (a) condiciones moderadascontenido de agua (7%, w / w) y (b) condiciones de alto contenido de agua (16%, w / w). Los
puntos de datos de experimentos representativos son los medios de los triplicados SD.
En la ltima muestra del tratamiento contenido en agua 7%, se observ extremadamente alta
variacin en la extensin de degradacin entre los diferentes recipientes de: mientras que 75% y
43% de degradacin de RDX y HMX, respectivamente, se encuentra en uno de los botes, sin
degradacin de RDX y HMX se observ en los otros dos repeticiones ( Fig. 3 a y b).
3.2. potencial redox durante la biodegradacin de explosivos en diferentes condiciones de
contenido de agua

Todos los tratamientos presentan una tendencia general de disminucin de potencial redox con el
aumento de contenido de agua. Sin embargo, las tendencias temporales de las diferentes rplicas
y los tratamientos eran muy diferentes. Por ejemplo, en el tratamiento GWC 7% del primer
experimento, se observaron tres patrones diferentes de potencial redox para cada una de las
repeticiones ( Fig. 4 B). Este patrn tambin se observ en el tratamiento GWC 7% del segundo
experimento ( Fig. 5 a).

potencial redox (segundo experimento) en: (a) las condiciones moderadas en el contenido
de agua (7% GWC) y (b) condiciones de alto contenido de agua (16% GWC).

En el tratamiento de alto contenido de agua (19% GWC) del primer experimento, se observaron
valores significativamente ms bajos de potencial redox ( Fig 4. C): se observ una disminucin
significativa (~170 mV) en el potencial redox en los primeros 4 das ( Fig. 4 c). Esta rpida
disminucin fue seguido por un incremento del potencial redox a un rango entre -240 y -80 mV.
Finalmente, el potencial redox anaerbica se midi en este tratamiento, con valores finales de -195,
-215 y -277 mV. En el tratamiento de alto contenido en agua de la segunda experimento (16%
GWC), se observaron patrones similares para el primer experimento, con valores finales por debajo
de -360 mV ( Fig. 5 B).

3.3. Efecto de las concentraciones de explosivos y humedad del suelo en la poblacin microbiana
Se realiz un anlisis de PCR-DGGE de las muestras de los primeros experimentos para examinar
el efecto del contenido de agua del suelo y explosivos concentracin en la poblacin microbiana
natural. En el primer experimento, dos bandas se presentaron en todos excepto en el tratamiento
seco, donde se convirtieron en muy dbil despus de la primera semana, probablemente debido a
la falta de actividad en estas condiciones ( Fig. 6 ). Estas bandas exhiben baja similitud de
secuencia con el gen 16S rRNA de uncultured Bacteroidetes y uncultured Sphingobacteria ,
respectivamente (marcados con flechas 1 y 2 en la Fig. 6 ). Otra banda fuerte, que exhibi 96% de
similitud de secuencia con el gen 16S rRNA de Sporolactobacillus kofuensis , apareci despus de
11 semanas en el tratamiento en hmedo (marcado con un crculo en la Fig. 6 ). Esta fue la ltima
muestra antes del inicio de la degradacin RDX (9 semanas despus). En general, ninguna de
estas secuencias se asoci con un conocido degradador explosivos.

La composicin de la poblacin microbiana despus de 20 semanas del tratamiento en hmedo fue

significativamente diferente de la de la poblacin inicial, con varias bandas nuevas. Dado que en
las muestras de suelo tomadas despus de 20 semanas, los productos RDX-degradacin (es decir,

la MSX, DNX y TNX) aparecieron por primera vez, estas bandas podran representar la poblacin
microbiana capaz de degradacin RDX. Anlisis de similitud de las distintas filas utilizando software
de equidad 1 1D (BioRad) proporcion algunos resultados interesantes ( Fig. 7 ). Se agruparon tres
grupos principales: M1, W1, M6 y M11 desde el primer periodo del experimento (donde M
representa el moderado y W los tratamientos en hmedo, y el entero es el tiempo transcurrido en
semanas). La muestra "La semana 0" tambin se incluy en este grupo y, en general, los grupos
de este grupo no fueron muy afectada por el contenido de agua o el tiempo de incubacin. El
segundo grupo de M20, M6 y W11 pareca estar influenciada de hecho tanto por el contenido de
agua y el tiempo. El ltimo grupo estaba formado por las tres rplicas de las muestras W20, con el
D1 muestra la agrupacin de lejos (en seco) con este grupo.

3.4. Efecto de TNT sobre la toxicidad del suelo

La toxicidad fue probada usando la bacteria luminiscente P. leiognathi (CheckLight Ltd.). En
ausencia de TNT y la presencia de RDX y HMX, la toxicidad del suelo aument ligeramente con el
tiempo en el tratamiento en hmedo (IC 50 se redujo sistemticamente 35,4-24,25%), mientras que
no se observ ninguna diferencia significativa en la toxicidad durante el perodo experimental en el
agua moderada tratamiento (IC 50 se mantuvo entre 29,6 y 34,1%) ( Tabla 2 ).

En presencia de TNT, la toxicidad del suelo fue significativamente mayor

despus de 1 semana en comparacin con su toxicidad en ausencia de TNT (IC
50 de 6,64% en comparacin con 35,4% en el tratamiento en hmedo y IC 50
de 8,1% en comparacin con 32,4% en el tratamiento contenido en agua
moderado). En los suelos que contienen TNT, la toxicidad disminuy en las

muestras tomadas despus de 10 semanas y aument de nuevo despus de 10

semanas adicionales.

Se observ el efecto de toxicidad para cada compuesto por separado (datos no

mostrados) y por lo tanto no podan separar el efecto de toxicidad de cada
compuesto en la mezcla de explosivos y por consiguiente no pudo calcular los
IC 50 concentraciones para cada compuesto explosivo.

4. Discusin
Se evalu el efecto del contenido de agua y el potencial redox en la
biodegradacin de una mezcla de explosivos en muestras de suelo de la zona
no saturada. Los resultados revelaron una relacin entre el contenido de agua,
el potencial redox y la velocidad y extensin de explosivos biodegradacin.
Como era de esperar, cuando el contenido de agua del suelo aumenta, el
potencial redox disminuye, y se observ una mejora significativa en la
biodegradacin de los tres explosivos ( Fig. 2 y Fig. 3 ). Esto implica que
aunque TNT y RDX pueden degradarse aerbicamente, esta va de degradacin
no es tan rpida como la degradacin anaerobia. Tambin se observ que el
potencial redox bajo, incluso cuando se mide por perodos temporales, era
suficiente para facilitar la degradacin anaerbica a lo largo de las 20 semanas
de incubacin.

La interaccin entre el contenido de agua, el potencial redox y la velocidad de

biodegradacin se puede demostrar mediante la comparacin de los diferentes
tratamientos: en condiciones secas, slo una ligera degradacin de TNT y no
biodegradacin de se observaron RDX y HMX durante las 20 semanas del
experimento debido a la baja de agua contenido. A pesar de que la
biodegradacin aerbica (potencial redox positivo) de TNT y RDX tanto se
conoce [19] y [20] , se requiere un mayor contenido de agua del suelo [20] .
Adems, un estudio reciente ha demostrado que la reductasa de xenobiticos
enzima, que participan en la biotransformacin de diferentes explosivos por
Pseudomonas fluorescens IC, es sensible a la tensin de oxgeno de alta [21] .

Las tendencias redox en todas las repeticiones de 7% GWC presentan

formacin transitoria de condiciones anaerbicas, alcanzando bajos potenciales
redox negativos, aunque por diferentes duraciones ( Fig. 4 ). En el primer
experimento, en el que se puso a prueba una mezcla de los tres explosivos, se
observ degradacin parcial del TNT y sin degradacin de RDX o HMX, y el
potencial redox se mantuvo positivo durante la mayor parte del perodo
experimental. En el segundo experimento, en el que slo se incluyeron RDX y
HMX, la degradacin parcial de estos compuestos explosivos de hecho produjo

( Fig. 3 ), mientras que las condiciones anaerbicas fueron desarrollados para

diferentes perodos ( Fig. 5 a). La formacin de las condiciones anaerbicas
temporales en suelos no saturados, presumiblemente, se produce en los
microorganismos del suelo sitios [12] . Las condiciones transitorias y alta
variabilidad entre repeticiones son nicos para el contenido de agua moderada
heterognea, y no se observan en condiciones secas o de saturacin, que se
espera que sea ms homogneo. Tales micro-sitios anaerobios son menos
abundantes en condiciones secas, mientras que en la saturacin se espera que
la totalidad de las latas del suelo para ser anaerbica. Es evidente que el
potencial redox aparente del suelo, que se mide por el Ag / AgCl 2 electrodo
(con un dimetro de 0,5 cm), no puede representar a las condiciones locales
dentro de una biopelcula microbiana (con un espesor de slo unos pocos
micrmetros) que se adjunta al sedimento en condiciones insaturados. Se
puede suponer que la biodegradacin de RDX y HMX en contenido de agua
moderada ocurri principalmente en estos micro-sitios anaerobios, en lugar de
en micro-sitios aerobios, ya que la biodegradacin anaerbica se ve que es
ms reforzada. El hecho de que anaerobias micro-sitios son ms activos se ve
apoyada por la acumulacin observada de los derivados nitroso RDX, que slo
aparecen durante la degradacin anaerbica, y la ausencia completa de NDAB,
un derivado RDX aerbico que se considera que es un producto relativamente
persistente [ 22] . Sin embargo, hay que sealar que no se puede excluir la
formacin de algn producto de degradacin aerbica (NDAB) y su posterior
transformacin. La tendencia en la degradacin de los explosivos con el tiempo
no mostr cambios en la correlacin de las fluctuaciones en el potencial redox
a granel, que pueden apoyar an ms la hiptesis de que el potencial redox
mayor no representa las condiciones redox reales en micro-nichos separados.

La conclusin de que la degradacin de explosivos se mejora con la

disminucin de potencial redox se ve reforzada por los resultados de las
ltimas muestras de la tratamiento GWC moderada del segundo experimento,
en el que los Ag / AgCl 2 electrodos proporcionan monitorizacin continua del
potencial redox en los recipientes durante todo el todo el perodo experimental.
Los tres rplicas del ltimo punto de muestreo mostraron tres patrones redox
diferentes en los tres botes de replicados, los cuales se correlacionaron con
extensiones de degradacin: la mayor degradacin de RDX y HMX (75% y 43%,
respectivamente) se encontr en el bote en el que la potencial redox por
debajo de -300 mV se mantuvo por ms de 9 semanas. En los otros dos botes
de replicados, por otro lado, en el que el perodo anaerbico fue mucho ms
corto y el potencial redox fue superior, no se observ degradacin de RDX o
HMX. Por lo tanto, se sugiere que las medidas de potencial redox en suelos no
saturados pueden proporcionar solamente una indicacin aproximada de la
eficiencia de los procesos de biodegradacin reductivas. Cabe sealar que
aunque los tres botes muestran diferentes patrones redox mientras que tienen
contenidos de agua similares, no implica que el contenido de agua y el
potencial redox son en realidad no correlacionados. La correlacin entre el
contenido de agua y el potencial redox se ve reforzada por la comparacin de

la composicin de agua de moderada a secar y las condiciones de saturacin.

Mientras que los suelos secos y saturados establecen una clara tendencia entre
estas dos situaciones extremas, las observaciones del tratamiento contenido
en agua es moderada en correlacin con esta tendencia. As, la alta
variabilidad entre las tres rplicas de contenido de agua moderada puede ser
el resultado de la alta variabilidad entre los tres recipientes.

En alto contenido de agua en ausencia de TNT, casi la degradacin completa

de RDX y HMX (hasta 98,3% y 90,5%, respectivamente) fue detectado por el
final de la segunda experimento. condiciones redox anaerobias se midieron en
dos de las tres repeticiones de este tratamiento durante todo el perodo
experimental, con valores redox final por debajo -360 mV. La tercera rplica
excepcional present un incremento del potencial redox despus de
aproximadamente 15 semanas, alcanzando un valor final de 155 mV. Sin
embargo, la extensin de RDX y HMX degradacin en este recipiente fue
similar a la de los otros dos. Se sugiere que el potencial redox bajo observado
desde el principio en este bote era suficiente para promover la degradacin
anaerbica, y que estas condiciones se mantuvieron dentro de micro-nichos en
el bote, pero no fueron representados por el alto potencial, redox mayor.

La observacin general de degradacin RDX ms mejorado en condiciones

anaerobias est de acuerdo con estudios anteriores. Price et al. [11] observ la
estabilidad relativa de RDX en virtud de oxidacin y reduccin de las
condiciones moderadamente, y la inestabilidad de RDX en condiciones
altamente reductoras (-150 mV), que fue acompaada por la aparicin de
derivados nitrosos. Se detectaron aquellos derivados a slo muy bajas
concentraciones menores de oxidacin o reduccin de las condiciones
moderadamente. Ringelberg et al. [9] mostr que la tasa de prdida de RDX es
significativamente mayor cuando el suelo est saturado, coincidiendo con un
aumento gradual en la anaerobicity del sistema y la formacin de productos
intermedios nitroso, seguido de su desaparicin del sistema. En contraste, no
se detectaron intermedios nitroso en el microcosmos insaturados. La
observacin general de degradacin RDX ms mejorado con el aumento de
contenido de agua est de acuerdo con estudios previos con el suelo desde el
mismo sitio. Ronen et al. [20] calcul la vida media RDX en suelo saturado de
carbono modificado para ser de 6 das, mientras que en suelo no saturado de
carbono-modificado (0,1 bar potencial mtrica) que fue de 21 das.

Cabe sealar que el contenido de agua moderada puede representar el estado

de saturacin real de suelo en el medio ambiente. Saturada, o cerca de las
condiciones de contenido de agua saturado pueden ser menos abundante, pero
todava se puede observar, por ejemplo, en las proximidades de las capas
bajas del suelo conductoras. En ambos casos, la biodegradacin total de

explosivos puede ser facilitada, y se ver reforzada con el aumento de

contenido de agua (donde la biodegradacin anaerbica domina). Esto es
apoyado por observaciones de campo en un perfil de suelo subsuperficial
desde el mismo sitio que mostraron enriquecido 15 N valores de RDX (que
indican mayores grados de degradacin) en las proximidades de las capas
arcillosas, donde se observan mayor contenido de agua [14] . Este
enriquecimiento tambin se correlacion con un aumento de los derivados
nitroso detectados de RDX, que sugiri que la biodegradacin anaerbica RDX
en estos puntos de muestreo era dominante.

Al igual que en los experimentos anteriores en condiciones saturadas, este

estudio muestra que TNT y su metabolito inhiben la biodegradacin de RDX y
HMX. Nuestros resultados indican claramente una influencia negativa de TNT
en la biodegradacin de RDX y HMX por los microorganismos del suelo
indgenas. La presencia de TNT en el suelo disminuy RDX y HMX velocidad de
degradacin durante el perodo experimental ( Fig. 3 ). Sin embargo, el efecto
inhibidor en este estudio no fue tan pronunciada como la observada en
suspensiones uniformes [2] , que presentan inhibicin ms fuerte de RDX y
HMX degradacin en presencia de TNT y su tetranitroazoxytoluene intermedio.
Esta inhibicin se explica por un efecto citotxico sobre la probable RDX- y
poblacin microbiana HMX-degradantes, as como la inhibicin directa de las
enzimas implicadas en la degradacin de RDX y HMX [21]
y
[23] .
Luminiscente bacteria P. leiognathi pruebas de toxicidad realizados en nuestro
trabajo actual indican que la toxicidad del suelo aumenta significativamente en
presencia de TNT y disminuye despus de su degradacin (despus de 10
semanas) ( Tabla 2 ). El segundo aumento de la toxicidad del suelo 10 semanas
ms tarde se puede explicar por la posible formacin de la
tetranitroazoxytoluene intermedio TNT, que se ha encontrado para ser ms
txico que el propio TNT y para causar una mayor tasa de mutaciones [3] .

El hecho de que el efecto de TNT sobre la degradacin de RDX y HMX en este

estudio fue menos pronunciado puede explicarse por un efecto de
enmascaramiento del suelo en los botes. En contraste con los experimentos
suspensin homognea, suelos total o parcialmente saturado pueden promover
la existencia de micro-nichos que difieren considerablemente en sus
condiciones de concentracin explosivos, la comunidad microbiana y redox. Por
lo tanto, la biodegradacin de RDX y HMX puede proceder de micro-nichos en
los que no existen TNT y su producto de degradacin txicos (ya sea porque ya
han sido totalmente degradado en estos nichos, o porque estaban
completamente ausentes en el primer lugar).

Los cambios en las poblaciones microbianas fueron evidentes en el anlisis del

gel DGGE. Las bandas fuertes (marcados 1 y 2 en la Fig. 6 ) fueron ms

similares al gen 16S rRNA de uncultured Bacteroidetes (JN695872) y al gen 16S

rRNA (96%) del uncultured Sphingobacteria (EF520602). Estos son organismos
de sedimentos de agua dulce sin relacin conocida con la degradacin de los
explosivos. La banda nica en el tratamiento en hmedo despus de 11
semanas fue de lo ms similar (96%) a la S. kofuensis gen 16S rRNA
(AJ634661.1), una bacteria del cido lctico presentes en el suelo, pero sin
conocida capacidad para degradar explosivos [24] . Sin embargo, se desprende
de la Fig. 7 que la poblacin cambia con el tiempo. La divergencia completa de
las muestras despus de 20 semanas en el tratamiento en hmedo del resto de
las muestras mostr que el contenido general, el agua fue el factor ms
importante en la evolucin de las poblaciones microbianas durante el
experimento. La incapacidad para detectar secuencias de genes 16S rRNA
pertenecientes a conocidos degradadores de explosivos no nos permiti
evaluar los efectos de la concentracin de explosivos en la poblacin
microbiana. Un marcador funcional de genes implicados en TNT, RDX y HMX
degradacin sera til en el trabajo futuro.

5. Conclusiones
Se encontr que la poblacin microbiana autctona del suelo puede degradar
TNT, RDX y HMX en una mezcla, en condiciones que reflejan las condiciones
naturales de la zona no saturada contaminada. La degradacin ha demostrado
ser fuertemente afectado por la humedad del suelo y las condiciones en
consecuencia, redox. Mientras que la degradacin de TNT se produjo, en estos
experimentos, tanto en condiciones aerbicas y anaerbicas, la degradacin de
RDX y HMX se produjo slo cuando las condiciones de contenido de agua
resultaron en un perodo prolongado de potencial redox negativo. Estas
condiciones generalmente desarrollan bajo la saturacin, pero tambin podran
desarrollar temporalmente en los microorganismos del suelo sitios bajo
contenido de agua moderada y as promover RDX y HMX degradacin.