Practica 6.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Objetivo
Conocer y utilizar la tcnica de PCR para amplificar fragmentos de ADN e identificar con
qu primeros se est trabajando.

Resumen
La PCR es una tcnica para la sntesis "in vitro" de secuencias especficas de ADN. Es una
forma simple y muy rpida de multiplicar el ADN presente en diferentes muestras
biolgica, obtenindose millones de copias de una determinada secuencia de ADN. Las
siglas PCR significan "Polimerase ChainReaction", Reaccin en Cadena de la Polimerasa.
El inventor de esta interesante tcnica fue Kary Mullis por la cual se le adjudic el Premio
Nobel de Qumica en 1993. Utiliz la PCR para la amplificacin del gen de la b-globina
humana (Mullis y cols., 1986; Mullis y Faloona., 1987) y el diagnstico prenatal de la
anemia falciforme (Saiki y cols., 1985; Saiki y cols., 1986; Embury y cols., 1987), desde
entonces la PCR ha revolucionado todos los campos que estudian y manipula los cidos
nucleicos.
Mullis se bas en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la
DNA polimerasa. Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de
DNA en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una
regin de doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados
cebadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de DNA que se
desea amplificar.
Partiendo de este principio, la reaccin en Cadena de la Polimerasa se basa en la
repeticin de un ciclo formado por tres etapas:

Desnaturalizacin del ADN doble cadena

Hibridacin de los cebadores a la zona 3especfica de cada una de las hebras
Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa

HONGO METARHIZIUM
Es un entomopatgeno que tiene extrema importancia en el control de ectoparsitos,
virtualmente todos los ectoparsitos son susceptibles a las enfermedades fungosas.
Caracteristicas de los hongos estomopatogenos.

Son organismos hetertrofos (falta de fotosntesis), que poseen clulas quitinizadas,

normalmente no mviles;el inicio de la infeccin se realiza por germinacin de las
esporas del hongo sobre el tegumento del individuo plaga. La dispersin de las esporas
se realiza por contaminacin ambiental a travs del viento, la lluvia e incluso individuos
enfermos al entrar en contacto con otros sanos.
Normalmente son especies especficas o de amplio espectro de hospedantes (insectos y
caros). El hongo sale del insecto enfermo a travs de las aperturas (boca, ano, orificios
de unin de los tegumentos y artejos) y en el exterior forma sus estructuras fructferas y
las esporas.

Cuestionario
1. Seale brevemente los fundamentos de la tcnica de PCR.
La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN
utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que
proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79C a 85C),
de ah su nombre comercial ms conocido: taq polimerasa. Cuando hacemos una
reaccin de PCR simulamos lo que sucede en una clula cuando se sintetiza el ADN y en
el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN
del organismo que queremos estudiar (donde se encuentra el fragmento que queremos
sintetizar), los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores,
oligos, etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las
condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas
cantidades de magnesio en forma de MgCl2 , KCl, y pueden necesitarse otras sales o
reactivos, dependiendo de cada polimerasa).

2. Esquematice y describa lo que sucede en cada uno de los tres pasos bsicos de la
tcnica de PCR.

Desnaturalizacin: En este paso la doble cadena de ADN se abre, quedando solo

una cadena de ADN, esto sucede debido al aumento de temperatura y se
denomina desnaturalizacin. Para poder lograr la desnaturalizacin la temperatura
se aumenta 93-96 oC, para romper los puentes de hidrogeno y que quede solo
una cadena de ADN.

Poner primers: En esta fase, se baja la temperatura esto para que el ADN se
vuelva a hacer una cadena doble y que los cebadores se puedan pegar a ella. Una
vez enlazado el cebador en la doble cadena de ADN, si el cebador es el correcto, el
enlace dura ms. Cuando se han introducido unas cuantas bases, el enlace inico
entre el ADN molde y el cebador es tan fuerte que ya no se rompe. Es ah donde
puede fijarse la polimerasa y comenzar la transcripcin.

Extensin de la cadena de ADN: es este paso los cebadores se extienden a lo

largo de la secuencia diana con ayuda de la DNA polimerasa
(ADN Taq
polimerasa). Este proceso da lugar a la extensin de fragmentos de DNA

3. Mencione la funcin de cada uno de los componentes de la mezcla de reaccin de

PCR:

Buffer de reaccin.

El buffer de es el encargado de regular el pH de la reaccin, el cual afecta la actividad

y fidelidad de la enzima.

MgCl2.

Se utiliza para forman un complejo soluble con los dNTP, lo cual es fundamental para
la incorporacin de estos; estimulan la actividad polimersica yaumentan la Tf de la
interaccin cebador / ADN molde (con lo que estabilizan la interaccin entre las dos
cadenas).
Y el MG, para evitar que se inhiba el proceso de amplificacin

mezcla de dNTP's.

Complementan la sntesis de ADN

oligonucletidos.

Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que

son diferentes entre s y complementarias de los sitios de reconocimiento que
flanquean el segmento de ADN diana que debe amplificarse.

DNA polimerasa

Estas enzimas realizan la sntesis de una cadena complementaria de DNA en el

sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de
doble cadena. Para crear esta regin doble cadena se usan los denominados
cebadores (primers)f) ADN molde.
4. Explique por qu razn la temperatura de alineamiento es variable y sta depende de
la secuencia de los cebadores.
Un cebador mal diseado puede hacer que fracase una PCR. La secuencia del cebador
determina varios aspectos, como la posicin y la longitud del producto, su temperatura
de fusin y finalmente el rendimiento (Innis y Gelfand, 1994). Un cebador mal diseado
puede hacer que se consiga poco producto o incluso ninguno, debido a una amplificacin
inespecfica o a la formacin de dmeros de cebador, lo que puede llegar a competir con
la formacin de producto hasta suprimirla.
5. Cules son las caractersticas ptimas que deben tener los cebadores
(oligonucletidos) para que la tcnica de PCR amplifique solamente el producto deseado?
Es necesario que uno de los oligonucletidos tenga la misma secuencia que se encuentra
en una de las cadenas del ADN, y el otro deber llevar la secuencia complementaria que
estar al final del fragmento que se quiere amplificar (por lo cual se les llama forward y
reverse) para que uno sea complementario a la cadena que forma el otro; si no es as no
podra amplificarse el sitio que se necesita.
6. Qu modificaciones a la tcnica realizara si:
a) no se obtiene ningn producto de PCR; realizar nuevamente un PCR pero ahora con un
distinto cebador, porque tal vez el anterior no tena el cebador correcto y por tal motivo
no se obtuvo ningn producto de PCR.
b) si, adems del producto de PCR esperado, se obtienen productos inespecficos

Material

 1 Termociclador (MJResearch, Eppendorf, Corvette Research, etc.)

1 Cmaras para electroforesis de cidos nucleicos (horizontales)
1 Fuente de poder
1 Transiluminador
Hielo frap
Muestras de ADN (molde)
1 tubo tipo Eppendorf de 0.2 mL (de pared delgada para PCR)
1 Micropipetas de volumen variable 1 a 10 L
1 Micropipetas de volumen variable 10 a 100 L
Puntas para micropipetas
SOLUCIONES Y REACTIVOS
Buffer de reaccin
Mezcla de nucletidos trifosfatados o dNTPs (10 mM de cada uno: dATP, dCTP,
dGTP, dTTP)
Oligonucletidos 5 (sentido, superior, forward, upper)
Oligonucletidos 3 (antisentido, inferior, reverse, lower)
Ampli Taq DNA polimerasa
Agarosa
Buffer de corrida
Buffer de carga
Resultados

Ilustracin 1 Marcado PM LADDER 100pb

800 pb

600 pb

Ilustracin 2 Gel de agarosa

Anlisis de los resultados

Solo se pudo visualizar bandas en los pocillos nmero 2 y 5. En los pocillos restantes no
se pudo observar nada, esto se debe a varios factores que interviene en el PCR, el
principal es que los primers que se colocaron no fueron los correctos. Cuando se ponen
cebadores incorrectos, estos en el momento que se alinea la cadena se desprenden por
el calor y no nos arrojan resultados. Otro motivo por el cual no revelo resultados, pudo
haber sido por que se desnaturalizo completamente el ADN. O por contaminantes en la
muestra, estos factores pudieron haber hecho que no se amplificaran los fragmentos de
nuestra muestra de ADN.
Conclusiones
La tcnica de PCR tiene muchas aplicaciones distintas y es una herramienta muy
importante en la biologa molecular.
En alguna de nuestras muestras no tuvimos resultados favorables esto se vio implicado a
distintos factores, pero en dos pocillos se observ que se hiso bien la amplificacin de
fragmentos de ADN con el primer correcto.