Metabolisme Dna
Metabolisme Dna
Dulu sebelum struktur DNA diketahui, para ilumuan tertarik pada kemampuan
organisme membuat salinan yang layak dari dirinya sendiri, dan kemudian kemampuan
sel memproduksi banyak salinan sama prcis makromolekul komplek. Spekulasi
tentang permasalahan ini terfokus pada konsep template. Template sel seharusnya
menjadi permukaan dimana molekul berada dalam susunan yang khusus dan bergabung
untuk membentuk makromolekul yang struktur dan fungsinya unik.
Proses replikasi DNA menunjukan contoh biologi pertama dari penggunaan template
untuk memandu sintesa makromolekul. Tahun 1940an mengantarkan pada pengetahuan
bahwa DNA merupakan molekul genetic, tetapi semuanya berubah ketika James
Watson dan Francis Crick menyimpulkan struktur DNA yang menjelaskan bagaimana
DNA bekerja sebagai template untuk replikasi dan penyaluran informasi genetic. Satu
strand merupakan pelengkap strand yang lain. Aturan keras pasangan basa berarti
bahwa penggunaan salah satu strand sebagai template akan menghasilkan strand lain
yang dapat diprediksi susunan complementarinya.
Ciri pokok proses replikasi DNA dan mekanisme yang digunakan enzim yang
mengkatalisasi DNA telah menunjukan kesamaan yang identik pada semua organisme.
Kesatuan mekanisasi akan menjadi tema utama seperti yang kita proses dari cirri umum
proses replikasi pada enzim replikasi E. coli dan akhirnya untuk replikasi eukaryotic.
hanya perbedaan kecil , campuran [15N]DNA berat dengan [14N]DNA ringan dapat
dipisahkan dengan sentrifugasi untuk keseimbangan pada garadien densitas klorida
sesium.
Sel E.coli yang berkembang pada medium 15N ditransfer ke medium baru yang hanya
mengandung isotop 14N, dimana sel-sel tersebut dibiarkan berkembang sampai
populasi sel menjadi berlipat ganda. DNA yang terisolasi dari generasi pertama sel
membentuk pita tunggal pada gradient CsCl pada posisi yang mengindikasikan bahwa
DNA helik ganda dari sel turunan merupakan hibrida yang mengandung satu strand
14N baru dan satu stran 15N inang (Gb. 24-2)
Hasil ini menumbangkan replikasi konservatif, hipotesis lain dimana satu turunan
molekul DNA akan terdiri dari dua strand DNa hasil sintesa baru dan yang lainnya akan
mengandung dua strand inang, sementara tidak akan dihasilakan molekul DNA hybrid
pada percobaan Meselson-Stahl. Hipotesis replikasi semikonservatif kemudian
mendukung langkah selanjutnya pada percobaan. Pada medium 14N,sel dibiarkan
mengganda, dan produk hasil DNA dari lingkaran kedua replikasi ini menunjukan dua
pita, satu memiliki densitas yang sama denganDNA ringan dan yang lainnya memiliki
densitas DNA hybrid yang diamati sel pertama menggandakan diri.
Replikasi mulai pada dari yang asli dan biasanya berlangsung dua arah
Pertanyaan tentang inang sekarang muncul. Apakah strand inang dilepaskan seluruhnya
sebelum masing-masing tereplikasi? Apakah replikasi dimulai padatempat yang acak
atau selalu pada point unik tertentu? Setelah inisiasi pada titik tertentu dalam DNA,
apakah replikasi berlangsung searah atau dua arah? Indikasi awal menunjukan proses
koordinasi di mana strand inang dilepaskan dan direplikasi diajukan oleh John Cairns
menggunakan teknik autoradiograpi. Cairns membuat DNA sel E. coli radiaktif dengan
mengembangkannya dalam medium yang mengandung timidin berlabel tritium (3H).
Saat DNA diisolasi dengan hati-hati, menyebar dan terlapisi dengan emulsi potografik,
dan dibiarkan selama beberapa minggu, residu timidin radioaktif yang menghasilkan
lintasan grain perak pada emulsi, memproduksi gamabaran molekul DNA. Lintasan
ini menunjukan kromosom E. coli secara utuh merupakan lingkaran tunggal, sepanjang
1.7 mm (lihat Gb. 23-2). DNA radioactive yang teisolasi dari sel selama proses replikasi
menunjukan loop ekstra radioaktif (Gb. 24-3). Jumlah besar radioactivity dalam loop
terkait dengan DNA yang diajukan Chairns untuk menyimpulkan bahwa loop dalam
satunya lagi terputus (Gb. 24-4). Strand yang berkelanjutan atau leading strand adalah
strand yang mana sintesis 5 3 berlangsung dengan arah yang sama seperti
perpindahan cabang replikasi. Strand teputus atau lagging strand merupakan strand
dimana sintesis 5 3 berlangsung dengan arah yang berlawanan dengan perpindahan
cabang. Panjang fragmen Okazaki berkisar dari ratusan samapi ribuan nukleotida,
tergantung jenis selnya.
perpanjangan DNA
paradokx ini kini menjadi jelas: interaksi nonkovalen yang tidak diketahui pada kalkulai
di atas memberikan kontribusi termodinamika yang penting untuk reaksi polimerisasi.
Setiap nukleotida baru yang ditambahkan pada cincin yang berkembanng dilakukan di
sana tidak hanya dengan ikatan pospodiester baru tetapi juga dengan ikatan hydrogen
pada pasangannya di dalam template dan interaksi penumpukan basa (base-stacking)
dengan nukleotida yang berdekatan pada cincin yang sama (p. 330). Tambahan energy
yang dihasilkan interaksi lemah ganda ini mampu menggerakkan reaksi dalam
arah ;polimerisasi.
yang berasal dari ATP. Pemisahan strand membentuk penekatan topoligi pada struktur
DNA helix, yang dibebaskan olek aksi topoisomerase. Strand yang terpisah distabilkan
dengan ikatan protein-DNA. Primer harus ada atau disintesa sebelum DNA polymerase
mensintesis DNA. Primer umumnya menunjukan segment RNA yang dihentikan oleh
enzim Primases. Akhirnya, Primer RNA harus dihilangkan dan digantikan oleh DNA.
Pada E.coli, hal tersebut merupakan salah satu fungsi DNA polymerase I. setelah
penghilangan segmen RNA dan pengisian salah satu gap dengan DNA, titik pada bagian
belakang DNA dimana terdapat ikatan pospodiester rusak. Kerusakan tersebut,
disebut torehan, harus ditutup dengan ezim DNA ligase. Semua proses tersebut harus
dikoordinasikan dan diregulasi. Pengaruh dari proses dan enzim tersebut telah
dikarakterisasikan pada sistem E. coli.
pasangan A=T. Protein DnaA kemudian berikatan denga wilayah tersebut yang
membutuhkan protein DnaC. Protein DnaB merupakan helicase yang melepaskan DNa
secara dua arah, membentuk dua cabang replikasi potensial. Jika strand tunggal
E.coli-ikatan protein (SSB) dan DNA giras (DNA topoisomerase II) ditambahkan pada
reaksi in vitro, ribuan pasangan basa dilepaskan secara berkelanjutan oleh DnaB
helicase, berlanjut samapi keluar dari origin. Molekul ganda SSB berikatan dengan
DNA strand tunggal secara kooperatif, menstabilakan strand DNA yang dipisahkan dan
mencegah pengaslian kembali (renaturation). Girase membebaskan penekanan topologi
yang dibentuk oleh reaksi DnaB helicase. Saat replikasi protein tambahan ditambahkan
seperti yang dijelaskan di bawah ini, DNA yang dilepaskan dan dimediasi oleh protein
DnaB dipasangkan pada replikasi.
Replikasi DNA harus dengan celas diregulasi sehingga replikasi hanya terjadi sekali,
sekali pada masing-masing lingkaran sel. Inisiasi adalah tahapan satu-satunya pada
fase replikasi yang diregulasi, namun mekanismenya belum begitu dipahami. Studu
biokimia memberikan gambaran singkat. Protein DnaA menghidrolisi ikatan ATP nya
sendiri dengan lambat (sekitar 1 jam) untuk membentuk DnaA-Adp kompleks yang
tidak aktif. Pengaktivan kompleks ini (mengganti ADP dengan ATP) dimudahkan
dengan interaksi antara protein DnaA dan pospolipid acidic pada membrane plasma
bakteri. Inisiasi pada waktu yang tidak sesuai dicergah dengan keberadaan komplek
DnaA-ADP yang tidak aktif, melalui ikatan protein yang disebut IciA (inhibitor of
chromosomal initiation) dengan pengualang 13 pasangan basa , dan mungkin juga
dengan faktor yang lain. Menguraikan interaksi kompleks pada jaringan regulasi masih
merupakan lahan bagus untuk penelitian.
Pemanjangan (elongation)fase pemanjangan pada replikasi terdiri atas dua operasi yang
sama yang secara mekanis berbeda: sinstesis strand leading dan sisntesis strand lagging.
Beberapa enzim pada cabang replikasi sangat penting untuk sintesis kedua strand. DNA
helicase melepaskan DNA induk. DNA topoisomerase membebaskan penekanan
topologi yang dipengaruhi oleh helicase, dan SSB menstabilisasi strand yang dipisahkan.
Dengan kata lain, sintesis DNA pada dua strand sangat jauh berbeda. Kami akan mulai
dengan sintesis strand leading, yang paling terlihat diantara dua sintesis strand.
Sintesis strand leading dimulai dengan sintesis yang dilakukan primer dari primer RNA
pendek (10 sampai 60 nukleotida) di origin replikasi. Deoksirebunukleotida
ditambahkan kemudian pada promer ini dengan bantuan DNA polymerase III. Setelah
mulai, sintesis strand leading berlangsung secar berkelanjutan, menjaga proses pada
cabang replikasi (Gb. 24-12)
Sintesi strand lagging, yang seharusnya diselesaikan pada fragmen pendek (fragmen
Okazaki) yang disintesis dengan arah berlawanan perpindahan cabang, merupakan
permasalahn rumit. Permasalahn ini diselesaikan dengan mesin protein yang
menggabungkan beberapa protein khusus termasuk juga polymerase III. Masing-masing
fragmen harus memiliki RNA primernya sendiri-sendiri, yang disintesis primer, dan
memposisikan primers harus dikontrol dan dikoordinasikan dengan perpindahan cabang.
Alat regulasi sintesis strand lagging merupakan mesin protein berpindah (traveling
protein machine) yang disebut primosome, yang terdiri ayas tujuh protein berbeda
termasuk protein DnaB, DnaC, dan primase seperti disebutkan diatas (table 24-4).
Primosome bergerak sepanjang template strand lagging arah 53, menjaga
pergerakan terhadap cabang replikasi. Karena pergerakannya, primosom pada interval
mendorong primase untuk mensintesi residu pendek (10 sampai 60) RNA primer pada
DNA kemudian ditambahkan dengan bantuan DNA polymerase III (Gb. 24-13). Perlu
diperhatikan bahwa arah reaksi sintesis primase dan polymerase III berlawanan dengan
dengan arah pergerakan primosome. Ketika frgamen Okazaki yang baru selesai
tebentuk, RNA primer dihilangkan dengan DNA polymerase I (menggunakan aktivitas
eksonulease 53) dan digantikan dengan DNA dengan bantuan enzim yang sama.
Torehan yang tertinggal ditutup dengan bantuan DNA ligase (Gb. 24-14). Protein yang
berperang pada cabang replikasi ditabel pada table 24-4.
DNA ligase mengkatalisasi formasi ikatan pospodiester antara hidroksil 3 pada ujung
salah satu strand DNA dan fospat 5 pada ujung strand yang lain. Pada bateri E. coli
fospat diaktifkan dengan NAD+ (ATP digunkan pada beberapa organisme) untuk
menyediakan energy kimia yang dibutuhkan. Jalur reaksi, seperti yang diajukan I.
Robert Lehman dan rekan-rekannya, diperlihatkan pada gambar 24-15. Penggunaan
oleh nukleotida NAD+ E. coli LIgase-kofaktor yang berfungsi secara normal pada
hydrid untuk menyalurkan reaksi (lihat Gb. 13-16)-sebagai sumber kelompok pengaktif
AMP merupakan sesuatu yang luar biasa. DNA ligase merupakan enzim lain dari
metabolime DNA yang menjadi reagen penting dalam percobaan DNA rekombin. (Bab
28)
Pada E. coli, sintesis strand leading dan lagging bisa digabungkan seperti yang
ditunjukan Gb 24-16. Penggabungan ini bisa diselesaikan dengan template strand
looping dan lagging sehingga sintesis bisa dilaksanakan secara bersamaan pada kedua
strand dengan polymerase III domeric tunggal yang berperan dengan primosome dan
semua protein pada cabang replikasi (Tabel 24-4).
Penghentian (termination), dengan cepat, dua cabang replikasi bertemu pada sisi yang
alain dari kromosom lingkar E. coli. Sangat sedikit yang diketahui tentang reaksi ini,
meskipun aksi topoisomerase tipe 2 , DNA topoisomerase IV, merupakan enzim yang
diperlukan untuk pemisahan akhir dua molekul DNA lingkar ynag sudah lengkap.
Proses penyekatan dua moleku DNA pada ini pun belum banyak diketahui divisi sel
anang.
Perbaikan DNA
Umumnya, sebuah sel hanya memiliki satu atau dua set DNA genomic, dan sementara
molekul protein dan RNA dapat, jika rusak, tergantikan dengan cepat dengan informasi
yang dikode dalam DNA, molekul DNA sendiri tak dapat tergantikan. Memelihara
integritas informasi yang terkandung dalam DNA merupakan sebuah lingkar penting
dan merupakan kumpulan rumit sistem perbaikan DNA yang ada pada setiap sel.
Seperti yang dijelaskan pada bab 12, DNA dapat dirusak oleh berbagai proses, beberapa
secara spontan, beberapa dikatalisasi oleh agen lingkungan. Disamping itu, replikasi
kadang-kadang tidak terjadi pada pasangan basa yang salah. Kimia dari DNA yang
rusak madalah berbeda dan kompleks. Tidak mengejutkan, respon seluler termasuk
jarak lebar dari sistem enzimatik yang mengkatalisasi beberapa dari banyak
trnasformasi kimia yang menarik yang ditemukan pada metabolism DNA. Kami akan
meneliti pengaruh perubahan pada susunan DNA dan kemudian pada sistem perbaikan
khusus.
dimmers dan luka besar pada DNA diperbaiki. Banyak dari luka tersebut dipengaruhi
oleh sinar UV (lihat Gb. 12-33), dan pasien dengan penyakit ini secara berangsur-angsur
menderita kangker kulit jika terkena cahaya matahari.
Genom dari sel mamalia khusus mengakumulasi banya luka dalam periode 24 jam.
Namun, sebagai hasil dari perbaikan DNA, kurang dari satu luka dalam 1000 luka
menjadi mutasi. DNA merupakan molekul yang stabil, namun tanpa sistem perbaikan
pengaruh kumulatif dari banyak yang jarang, tapi reaksi berbahaya akan membuat
hidum menjadi tidak mungkin.
Proses ini membutuhkan aksi kombinasi DNA helicase II, SSB, eksonuklease I (yang
hanya mendegradasi DNA strand tunggal pada arah 35), DNA polymerase III, dan
DNA ligase (Gb. 24-19). Jalur perbaikan kesalahan pemasangan pada sisi 3 daerah
perpecahan adalah sama, kecuali eksonukleus VII (yang mendegradasi strand DNA
tunggal 53 atau 35) atau protein RecJ (eksonuklease yang mendegradasi strand
DNA tunggal 53) mengganti eksonuklease I.
Secara enerjik, perbaikan kesalahn pemasangan umumnya merupakan proses yang
sangat susah. Kesalahan pemasangan bisa pada 1000 pasangan basa. Atau dari susunan
GATC, dan degradasi serta penggantian segmen strand susunan ini menunjukan
sejumlah besar investasi pada precursor nukleotida aktif untuk memperbaiki kesalahan
pemasangan DNA tunggal. peristiwa ini sekali lagi menggambarkan pentingnya
perbaikan DNA pada sel.
Semua kesalahan pemasangan diakui dan diperbaiki oleh sistem, namun belum baik.
Kesalahan pemasangan G-T, yang umumnya diperbaiki lebih efisien dari pada yang lain,
dan kesalahan pemasangan C-C, yang diperbaiki dengan tidak baik.
bahwa daerah AP muncul dari sesuatu yang lambat, hidrolisis spontan ikatan
N-glycosyl pada DNA (lihat Gb. 12-32b).
Ketika daerah AP dibentuk, grup lain dari enzim harus memperbaikinya. Perbaikan
tidak dilakukan dengan hanya penyelipan basa yang baru dan pembentukan kembali
ikatan N-glycosyl. Selain, deoxyribose 5fospat tertinggal setelah dihilangkan dan
digantikan dengan nukleotida yanga baru . Proses ini dimulai dengan enzim yang
disebut AP endonuklease, yang memotong strand DNA yang mengandungdaerah AP.
Posisi torehan nisbi dengan daerah AP (5 atau 3) bervariasi dengan endonuklease AP
yang berbeda. Segmen DNA termasuk daerah AP kemudian dihilangkan, DNA
digantikan dengan aksi DNA polymerase I, dan luka yang tertinggal ditutup dengan
DNA ligase (Gb. 24-20)
Perbaikan nukleotida-penghilangan (excision) luka DNA yang menyebabkan distorsi
besar pada struktur helix DNA umunya diperbaiki oleh sistem penghilangan nukleotida.
Pada bakteri E. coli enzim kunci yang dipakai dapat dibagi menjadi tiga subunit, produk
gen uvrB, uvrB, dan uvrC, dan disebut ABC eksinuklease (Mr 246.000). Enzim ini
menyadari banyak tipe luka, termasuk siclobutane pyrimidine dimmers, 6-4
photoproduct (lihat Gb. 12-33), beberapa tipe basa yang lain (adducts). Aktivitas
nukleolitik ABC eksinuklease merupakan sesuatu yang baru bahwa dua ptongan dibuat
dalam DNA (Gb. 24-21). Istilah eksinukleaseberati untuk membedakan aktivitas ini dari
aktivitas endonuklease standar.
Perbaikan langsung. Beberapa tipe kerusakandiperbaiki tanpa menghilangkan basa
ataupun nukleotida. Contoh yang bagus adalah fotoreaktivasi langsung cyclobutane
pyrimide dimmers, reaksi yang dipertimbangkan oleh DNA potoliase. Pyrimidine
dimmers berasal dari reaksi yang dipengaruhi cahaya (light-induce) fotoliase
menggunakan energy yang berasal dari penyerapan cahaya pada arah kebalikan dari
kerusakan tersebut (Gb. 24-22). Fotoliase umumnya mengandung dua kofaktor yng
bertindak sebagai E. coli dan yeast.
Contoh yang lain adalah perbaikan O6metilguani, yang membentuk dalam agen
alkylating dan merupakan luka mutagenic yang umum. Agen ini cenderung berpasangan
dengan timin daripada sitosin selama proses replikasi, sehingga menyebabkan mutasi
G C menjadi A=T (Gb. 24-23).
banyak sel. Hal ini merupakan keharusan bilogi untuk memberikan rintangan
replikasi dan membiarkan sedikit sel mutan untuk tetap bertahan.
pada
Replikasi antar luka membutuhkan DNA polymerase III, dan juga protein UmuC,
UmuD, dan RecC aktif. Mekanisme dimana kemudian tiga protein tersebut membiarkan
DNA polymerase III mereplikasi luka DNA masin belum diketahu sampai saat ini.
DNA polymerase II juga bisa memengan peranan pada ketidak berhasilan perbaikan
DNA (error-prone). Polymerase yang dipengaruhi sebagai bagian dari respon SOS,
berbeda halnya dengan DNA polymerase III, mampu membatas replikasi luka seperti
pada daerah AP. Enzim ini memiliki beberapa subunit seperti hanya DNA polymerase
III.
Protein RecA memberikan patut untuk diperhitungkan karena protein ini memiliki
beberapa fungsi berbeda (disamping mutagenesis) pada sel bakteri. Protein RecA
terlibat pada rekombinasi dan pada regulasi respon SOS, dan pada kasus ini fungsi
molekulernya dikaraterisasi dengan baik. Regulasi respon SOS dijelaskan pada bab 27.
Sekarang kita beralih pada pembahasan rekombinasi genetic.