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PROTOCOLO DE INCLUSO EM HISTORRESINA

por Bianca Brasil, maio de 2009.

Prefcio
O processo de incluso em historresina no segue um protocolo rgido, e isso se
aprende somente com a experincia com o seu prprio material. No comeo pode parecer
difcil (ou at impossvel!) que os cortes saiam bonitos, mas com o tempo, e as dicas que o
prprio material nos d, o protocolo pode ser ajustado de maneira eficaz.
sempre bom lembrar que cada material tem as suas particularidades, e isso deve
ser levado em conta em cada passo do processo de incluso. Nem todos os materiais so
fceis de incluir como a maioria das folhas ou tecidos primrios. Exemplos de tecidos
particularmente difceis de incluir em historresina so: materiais com tecidos muito
lignificados, com grande quantidade de tricomas, de mucilagem, de ceras e/ou cutcula
espessa, com tecidos macios alternados com rgidos, etc.
De uma maneira bem bsica, o processo de incluso em historresina pode ser
dividido em sete passos principais:

1. FIXAO
A fixao o primeiro passo e o mais importante, pois geralmente um material
bem fixado resulta em material bem includo. Basicamente, uma operao destinada a
bloquear instantaneamente o metabolismo das clulas de modo a conserv-las em um
estado mais parecido ao que tinham quando estavam vivas. Alm disso, os fixadores
retardam os efeitos post mortem do tecido, mantendo sua arquitetura original.

1.1. Agentes fixadores


Existe uma grande variedade de fixadores, de composies diversas, e que se
prestam melhor a cada material. A melhor maneira de saber qual deles melhor para o
seu material testando! Entretanto segue abaixo dicas sobre alguns tipos de fixadores e
que tipo de material que fixam melhor:
lcool 70% o lcool penetra no tecido rapidamente, mas causa sua contrao e
considervel endurecimento. Entretanto, pode-se preservar o material
indefinidamente em lcool. Os lipdeos so solveis ou so extrados no
subseqente manuseio do tecido. No um fixador recomendado para anlises
finas, como por exemplo, de contedo celular.

Fixador Carnoy composto por lcool absoluto, cido actico glacial e clorofrmio.
um fixador indicado para material que contenha muita cera e/ou cutcula espessa.
Penetra muito rpida e facilmente nos tecidos, entretanto tambm no indicado
quando se pretende observar contedo celular. No recomendvel deixar o
material no fixador mais do que 24 horas.
Fixador FAA composto por lcool etlico (50% ou 70%), formol e cido actico. O
formol preserva a estrutura fina do citoplasma, alm de reduzir a solubilidade dos
lipdeos nos solventes utilizados no processo de desidratao. O cido actico
penetra rapidamente nos tecidos, preservando principalmente a estrutura nuclear e
dos cromossomos. O material deve permanecer no fixador, em vcuo, de 24 a 48
horas; tempos muito prolongados podem resultar em material quebradio.
Fixador Karnovsky composto por glutaraldedo 1%, formaldedo 4% e tampo
fosfato 0,2M. A formulao final possui pH de 7,2, sendo levemente bsico ao
contrrio dos fixadores mostrados anteriormente, que so cidos. Por essa razo
um fixador recomendado para anlises mais finas, incluso Microscopia Eletrnica,
uma vez que a maioria das organelas e o citoplasma mantm-se ntegros.
Entretanto, um fixador de penetrao mais lenta, sendo recomendvel a
permanncia do material, em vcuo, por no mnimo uma semana. Alm disso, aps
a fixao, aconselhvel a lavagem do material em tampo fosfato 0,2M pH 7,2
antes de passar ao processo de desidratao (2x de 05min).
DICA

Em uma primeira coleta, leve a campo frascos com diferentes fixadores, para testar
qual deles mais apropriado ao seu material!

1.2. Processo de fixao


Dependendo do tipo de tecido a ser analisado e a qualidade esperada, o processo
de fixao pode variar. Se for desejada fixao altamente eficiente, deve-se fixar o material
ainda em campo, logo aps sua coleta. Para tal, o material deve ser cortado sob gua,
para evitar entrada de ar nos tecidos, e mergulhado em seguida no fixador. Bombas de
vcuo de campo auxiliam no processo de entrada do fixador nos tecidos.

Uma maneira bem fcil de realizar vcuo em campo a utilizao de frascos de vidro
com tampa de borracha e seringas comuns: deve-se tampar o frasco, inserir a seringa pela
tampa e puxar o ar existente diversas vezes.
importante ressaltar que quanto menor o tamanho do material a ser fixado, mais
rpida a penetrao do agente fixador e, portanto, melhor a preservao dos tecidos.
Deve-se evitar ao mximo a fixao de materiais muito volumosos, uma vez que o fixador
talvez no alcance o interior de tais peas, prejudicando as demais etapas do processo de
incluso.

necessria tambm a utilizao de um volume de fixador pelo menos 20 vezes


maior em relao ao volume de tecido, para que o material reaja satisfatoriamente. Isso
ocorre porque ao mesmo tempo em que a soluo fixadora penetra nos tecidos, a gua
presente sai, diluindo ento a soluo fixadora inicial e diminuindo sua eficcia.
DICAS:

Caso o material vegetal flutue no fixador, significa que ainda existe ar dentro dos

tecidos e que o fixador no penetrou de maneira satisfatria. Nesse caso, coloque o frasco
no vcuo por mais um dia.

Sempre que possvel, ou quando o material possui muita cera ou cutcula muito
espessa, interessante fazer pequenas incises para facilitar a penetrao do fixador.

2. DESIDRATAO
A desidratao deve ser realizada gradualmente, para que no se cause danos nas
clulas, como por exemplo a plasmlise. Tem a finalidade de retirar toda a gua ainda
existente nos tecidos assim como a soluo fixadora, trocando-as pelo lcool (etanol).
Deve-se passar o material em lcool de concentraes crescentes, geralmente
variando a concentrao de 10 em 10%, e seguindo at a concentrao final de 95% (uma
vez que a soluo de pr-infiltrao feita com essa concentrao de lcool).
Material fixado em Carnoy iniciar pela concentrao de 60%.
Material fixado em FAA iniciar pela concentrao de lcool correspondente
utilizada no fixador (50% ou 70%).
Material fixado em Karnovsky iniciar pela concentrao de 10%.
Depois de cada troca, colocar os frascos contendo o material no vcuo novamente
para facilitar a penetrao nos tecidos. O tempo de permanncia em cada concentrao
varia de acordo com o tamanho da amostra e sua permeabilidade, entretanto
recomendvel um mnimo de 2 horas em cada lcool; na concentrao final de 95%,
deixar o material overnight para melhores resultados.

3. INFILTRAO EM HISTORRESINA
A infiltrao o processo pelo qual a soluo de infiltrao vai penetrar nos tecidos
em troca do lcool l existente. um processo crucial na posterior incluso: caso no
ocorra penetrao da soluo de infiltrao, a incluso no ser bem sucedida e os cortes
sairo com falhas, rasgos e/ou com o material separando-se da matriz de resina do bloco.

A historresina composta basicamente por metacrilato, sendo comercializada em


kits, com os componentes e as propores de preparo dos reagentes. Tais kits trazem
instrues de como proceder os preparos e manuteno dos reagentes, cada qual tendo
caractersticas prprias.

AVISOS:

importante ressaltar que as solues de pr-infiltrao e infiltrao devem ser


mantidas sob refrigerao, na geladeira, visto que o a resina polimerizada sob
temperatura ambiente, ainda mais rapidamente em dias quentes.

Outro aviso importante que tais solues, apesar de serem atxicas, podem causar

irritao na pele e mucosas, sendo recomendvel portanto a utilizao de luvas e culos


de proteo, e manipulao em capela.

No laboratrio de Anatomia Vegetal da USP, utiliza-se principalmente o Kit de

historresina comercializado pela Leica Microsystems, sendo este composto por: resina
bsica, ativador e endurecedor.

3.1. Soluo de pr-infiltrao


A soluo de pr-infiltrao composta por 1g de ativador dissolvido em 50 ml de
resina bsica + 50ml de etanol 95%. Deve ser mantida na geladeira.
O material vegetal deve ser colocado na soluo de pr-infiltrao por no mnimo
uma semana, sendo recomendvel a utilizao de vcuo refrigerado (disponvel dentro
da geladeira).
Antes da passagem do material para a soluo de infiltrao, descartar a soluo de
pr-infiltrao em frasco etiquetado disponvel dentro da geladeira, para posterior
reutilizao.

3.2. Soluo de infiltrao


A soluo de infiltrao composta por 1g de ativador dissolvido em 50 ml de resina
bsica. Deve ser mantida na geladeira.
O material deve permanecer na soluo de infiltrao por no mnimo duas
semanas, sendo recomendvel a utilizao de vcuo refrigerado (disponvel dentro da
geladeira).

DICAS:

O perodo de permanncia em cada soluo pode variar de acordo com o tamanho do


material, rigidez dos tecidos e impermeabilidade. Para materiais pequenos e relativamente
macios, os perodos descritos acima podem ser reduzidos pela metade. Entretanto,
materiais maiores ou mais impermeveis devem permanecer em tais solues por perodo
mais prolongado. S testando voc poder saber qual o perodo mais adequado para o
seu material!

A infiltrao est terminada quando a amostra fica completamente translcida e afunda


no lquido, demonstrando que ocorreu penetrao satisfatria. Pequenos pontos
esbranquiados no material so sinal de que no ocorreu infiltrao.

aconselhvel a agitao dos frascos contendo o material durante o processo de

infiltrao, de modo que a soluo em contato com os tecidos se recicle, no perdendo


suas propriedades iniciais.

4. INCLUSO (montagem dos blocos)


A incluso o processo pelo qual o material envolvido e preenchido internamente
pela matriz, que posteriormente se solidifica, possibilitando a seco da amostra.
Para o processo de incluso, separar os seguintes materiais:
Soluo de infiltrao
Endurecedor
Moldes plsticos
Pipeta de 5ml e pipeta de 1ml
Tubo de ensaio pequeno
Pinas ou agulhas histolgicas para orientao do material nos moldes
Proveta ou tubo de ensaio contendo etanol comercial (para colocar pinas, pipetas e
vidrarias aps seu uso, evitando a polimerizao da resina)

Aps a separao dos materiais, para proceder a montagem dos blocos, siga as seguintes
etapas, sempre trabalhando na capela e com o auxlio de Microscpio Estereoscpio
(lupa):
a. Retire as amostras da soluo de infiltrao e coloque-as nos moldes.

b. Feito isso, misture (agite) a soluo de infiltrao com o endurecedor, na proporo


de 15:1, em um tubo de ensaio pequeno. Para a preparao de um molde plstico
pequeno, a quantidade de material que deve ser misturada : 5ml de soluo de
infiltrao + 0,33ml de endurecedor. Tome cuidado, pois a polimerizao da soluo
de incluso especialmente rpida em dias quentes e secos!
c. Com o auxlio de uma pipeta Pasteur, cubra as amostras com a soluo de incluso.
importante que as amostras fiquem orientadas na posio que se pretende
seccion-las; utilize pinas e/ou agulha histolgica para ajudar na orientao.
d. Uma vez que os blocos esto comeando a polimerizar-se (a polimerizao comea
na regio com menor quantidade de oxignio, ou seja, o fundo do molde), e as
amostras j esto na posio desejada, deixe os moldes terminando de polimerizar
temperatura ambiente. Somente aps total polimerizao, coloque os moldes em
estufa aquecida overnight, para finalizao do processo.

DICAS:

Tome cuidado na preparao da soluo de incluso: caso misture quantidades


desviadas dos reagentes, a polimerizao pode ser rpida demais ou vagarosa demais,
at o extremo em que no haja endurecimento total. Preste ateno tambm no prazo de
validade dos reagentes.

Em dias quentes e secos a polimerizao mais rpida, sendo o contrrio verdadeiro

tambm.

No coloque os moldes na estufa aquecida logo aps sua preparao; o processo de

polimerizao em temperatura ambiente mais lento, dando tempo para que a soluo de
incluso penetre satisfatoriamente nos tecidos.

Descarte a soluo de infiltrao em frasco apropriado existente na geladeira para sua


posterior reutilizao.

5. SECCIONAMENTO
O seccionamento dos blocos de historresina em micrtomo pode ser feito de 2 a 10
m; geralmente seces de 5-6 m de espessura do os melhores resultados, mas a
espessura pode variar de acordo com o material e com o tipo de anlise desejada.
desejvel que a temperatura da sala de microtomia no exceda os 25C, e no
esteja sujeita a ventilao direta.

5.1. Preparao do bloco


Retire os blocos dos moldes apertando levemente sua superfcie inferior, como se
fossem blocos de gelo. Caso necessrio, utilize pina ou agulha histolgica para facilitar a
retirada. Tome cuidado para no furar os moldes nesse processo, inutilizando-os.
Preste ateno se a orientao do material est de acordo com o desejado.
importante tambm lapidar os blocos com o auxlio de lminas de barbear, retirando o
excesso de resina que envolve o material. Durante esse processo, arredonde os cantos do
bloco de modo a diminuir o impacto com a navalha: reas menores resultam em menor
impacto, diminuindo o desgaste da navalha.
Cole os blocos lapidados em pequenos cubos de madeira utilizando cola do tipo
Super Bonder. Preste ateno para no colocar cola demais; se a cola cobrir parte do
bloco, nessa regio, os cortes sairo esquisitos, no se distendendo apropriadamente.
DICA:

Caso o bloco apresente regies esbranquiadas ou a resina no esteja aderida

completamente amostra, significa que o processo de infiltrao no ocorreu de maneira


satisfatria, ou que o bloco polimerizou muito rapidamente, no dando tempo da soluo
de incluso penetrar.

5.2. Ajuste do micrtomo rotativo


A escolha da navalha a ser utilizada depende do tamanho do bloco. A navalha de
ao utilizada para cortar os blocos maiores, enquanto nos menores utiliza-se navalha de
vidro.
Coloque o suporte adequado para cada navalha no micrtomo e ento a navalha,
cuidando para deix-la bem firme, evitando que ela pule durante o processo de seco, o
que poderia acarretar na quebra do bloco por exemplo. A angulao da navalha com
relao ao material aspecto fundamental; no Micrtomo Rotativo da marca Zeiss, por
exemplo, deve-se utilizar angulao 10. Caso a navalha esteja muito na vertical, o impacto
maior, podendo haver esmagamento do material ou at quebra do bloco.
Coloque ento o bloco no seu suporte, atentando tambm para que fique bem firme.
Sempre posicione o bloco de forma que sua menor rea fique voltada para a navalha,
diminuindo o atrito com esta, e resultando em cortes melhores. Aps verifique se a posio
do bloco est paralela com a superfcie cortante da navalha; caso no esteja paralela em
toda a sua extenso, ajuste com o auxlio dos parafusos do suporte. Se o material dentro
do bloco no estiver direcionado completamente na horizontal ou vertical (ou qualquer
outra orientao de interesse), pode-se ainda posicionar o bloco de maneira diferencial.

DICAS:

Mantenha as navalhas de vidro na geladeira para melhor rendimento.

Antes de comear a cortar, verifique se todos os parafusos e ajustes esto bem


apertados!

Caso seu material inclua tecidos rgidos e macios, como por exemplo, um pedao de
madeira contendo xilema e floema, deve-se orientar o bloco de modo que o tecido mais
macio seja cortado primeiro; caso contrrio ele pode ser esmagado devido ao atrito
causado pelo tecido rgido em relao navalha.

5.3. Processo de seccionamento


Os materiais necessrios para o seccionamento e montagem das lminas so:
Lminas limpas
Pina de ponta fina e sem dentes
Agulha histolgica
Pequeno retalho de tecido que no solte muitas fibras
Pisseta de gua destilada
Bquer contendo aproximadamente 100 ml de gua destilada misturada a 2 gotas
de detergente

Posicione a lmina sobre um suporte escuro para melhor visualizao dos cortes
por contraste. desejvel tambm iluminao indireta, ou seja, utilize a luminria no
diretamente sobre a lmina, mas um pouco afastada desta.
Antes de realizar os cortes, cobrir a lmina com uma fina pelcula da gua
preparada anteriormente. Para melhores resultados, deve-se umedecer o bloco antes de
cada seco utilizando-se o retalho umedecido em gua destilada (da pisseta). Quanto
mais seco o dia, maior deve ser o umedecimento. Este processo fundamental para que
os cortes no se enrolem com tanta facilidade, diminuindo ou at pulando o processo de
esticar os cortes sobre a lmina.
Feito isso, os cortes podem ser realizados e colocados sobre a lmina, atentando
para sua ordenao. Ao final da montagem de cada lmina, retirar o excesso de gua,
absorvendo-o com papel filtro ou higinico, e colocar a lmina para secar em placa
aquecedora em temperatura mdia de 35C.

Aps etiquetar cada lmina, coloc-las em estufa aquecedora overnight, para que os
cortes acabem de aderir lmina e esta esteja pronta para o processo de colorao.

DICAS:

Umedea o bloco antes de cada seco, nem muito nem pouco, de modo que o corte
saia levemente enrugado. Este corte enrugado e mido, quando em contato com a gua
da lmina, se distende momentaneamente, sem que voc precise ficar esticando com o
auxlio de pincis.

Caso o corte saia com pequenos riscos ou rasgos verticais, significa que a navalha

est sem fio ou que existe alguma sujeira sobre a superfcie cortante. Nesse caso, limpe a
navalha com algodo umedecido em lcool absoluto e volte a cortar; se os cortes
continuarem a sair riscados, troque a navalha.

Cortes apresentando a historresina levemente opaca tambm significam que a navalha


est sem fio.

Se aps trocar de navalha, os cortes continuarem a sair muito rasgados, ou com


pequenos buracos, significa que o processo de infiltrao no ocorreu de maneira
satisfatria, ou que o bloco polimerizou muito rapidamente, no dando tempo da soluo
de incluso penetrar.

Variaes de espessura, formando alternadamente um corte grosso seguido de outro

mais fino; quebra ou fragmentao do bloco; ou a existncia de barulhos no momento da


seco: significam que a navalha ou o bloco no esto bem seguros. Nesse caso, revise
os ganchos e parafusos de suporte.

6. COLORAO
A colorao consiste em passar o material em solues de corantes ou reagentes.
As coloraes so ditas permanentes quando tm grande durabilidade, resistindo ao
desbotamento, ou semi-permanentes, quando duram algum tempo (semanas ou meses),
mas vo desbotando aos poucos, pela instabilidade do corante ou reagente.
6.1. Azul de Toluidina
O Azul de Toluidina um corante metacromtico. Isso significa dizer que o corante
apresenta alterao de cor quando em contato com elementos orgnicos diferentes (do
tecido), resultando em uma colorao que vai do rosa, prpura, azul at o verde.

Para corar as lminas:


Mergulhar as lminas secas no Azul de Toluidina aquoso por aproximadamente 5-10
minutos em um frasco de Coplin
Mergulhar as lminas coradas em gua destilada por aproximadamente 30-40
segundos em um frasco de Coplin para retirada do excesso de corante. O ideal
que apenas o material vegetal permanea corado, e no a resina envolvente.
Deixe as lminas secarem a temperatura ambiente

Resultados:
RNA prpura
DNA azul ou azul esverdeado
Polifosfatos, polisulfatos, cidos policarboxlicos (incluindo cido pctico) rosa a prpura
Lignina e outros polifenis verde ou azul esverdeado

Desse modo, as paredes primrias se coram de rosa a prpura, enquanto as


secundrias lignificadas, de verde a azul.

DICAS:

O tempo de exposio varia de acordo com a concentrao do corante e com a

grossura dos cortes (quanto mais finos, maior deve ser o tempo de exposio).

importante que as lminas fiquem mergulhadas na gua por pelo menos 30


segundos para que ocorra a diferenciao das cores (rosa - verde)

6.2. Dupla colorao Azul de Astra e Fucsina aquosos


Para corar as lminas:
Mergulhar as lminas secas no Azul de Astra 3% aquoso por algumas horas a
overnight em um frasco de Coplin
Lavar em gua destilada 2x para retirar excesso do corante e deixar secar
Mergulhar as lminas em Fucsina Bsica 0,01% aquosa por aproximadamente 40
segundos em um frasco de Coplin
Lavar em lcool 50% 2x para retirar excesso do corante

Deixe as lminas secarem a temperatura ambiente


Resultados:
Azul de Astra cora principalmente polissacardeos cidos da parede celular primria
Fucsina Bsica possui afinidade por diversos constituintes celulares, mas principalmente por
tecidos com paredes cutinizadas, suberizadas e lignificadas. Cloroplastos e mitocndrias
tambm se coram fortemente.

DICAS:

A historresina dissolve se exposta ao lcool por muito tempo! Ento, atente para que
os corantes sejam aquosos.

Cuidado tambm ao lavar as lminas no lcool! Passe a lmina apenas rapidamente.


7. MONTAGEM DE LMINAS
A montagem das lminas consiste na colocao de um meio de montagem e de
uma lamnula por sobre a lmina anteriormente preparada para sua visualizao no
microscpio.
De maneira geral, deve-se colocar uma pequena gota (alongada de preferncia) do
meio de montagem por sobre a lmina e aps colocar lamnula devidamente limpa.
Durante o processo muito importante que a colocao da lamnula seja feita
vagarosamente para evitar a formao de bolhas de ar, que atrapalham na posterior
visualizao no microscpio. recomendvel encostar uma das extremidades da lamnula
na lmina e descer a outra vagarosamente. O excesso de meio de montagem pode ser
retirado nessa etapa, virando-se a lmina para que o excesso seja absorvido pelo papel
filtro.
Os meios de montagem podem ser permanentes ou no:
Meios de montagem no-permanentes utilizados para observao rpida do
material, sem interesse de preservao. Os mais utilizados so a gua destilada e a
glicerina. A glicerina solvel em gua e tem a vantagem de no secar rpido como
a gua destilada, de modo que as lminas podem ser visualizadas por alguns dias.
Meios de montagem permanentes os mais utilizados so o Blsamo do Canad
e o Entellan, ambos solveis em acetato de butila. A montagem das lminas
semelhante para os dois meios de montagem; o Entellan tem a vantagem de secar
mais rapidamente em temperatura ambiente, entretanto um meio muito mais caro
que o Blsamo.

Aps a colocao da lamnula, recomendvel pressionar levemente a mesma


para uma distribuio mais uniforme do meio de montagem; dependendo da
grossura do material, deve-se colocar pesos em cima da lamnula para evitar a
formao de bolhas. Feito isso, colocar as lminas em estufa aquecida para secar
por pelo menos 48horas (especialmente no caso do Blsamo). Uma vez seca, a
retirada do excesso do meio de montagem pode ser realizada atravs de raspagem
com gilete.

DICAS:

Meios de montagem muito espessos facilitam a formao de bolhas. Caso o meio de

montagem, Blsamo ou Entellan, esteja muito espesso, necessrio que voc faa a
diluio aplicando algumas gotas de Acetato de Butila e mexendo vagarosamente para
evitar a formao de bolhas no meio.

O corante Azul de Toluidina no permanente; as lminas vo perdendo a cor

gradativamente, com rapidez que depende de cada material e do processo de incluso. Se


voc tem o objetivo de manter as lminas observveis por muitos anos, no
recomendvel a utilizao de meios de montagem permanentes nesse caso.

Referncias Bibliogrficas

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Macdo, N.A. Manual de tcnicas em histologia vegetal. Feira de Santana: Universidade
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Anexo