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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS


SEGUNDA ESPECIALIDAD EN HEMOTERAPIA Y BANCO
DE SANGRE
CURSO

SEROLOGIA Y SEROPREVALENCIA

TEMA

PARTICIPANTE:

TECNICAS DE ELISA EN INMUNOSEROLOGIA PARA UN


BANCO DE SANGRE

CARMITA ADELAIDA JORGECHAGUA SAAVEDRA


MARLENE TALLEDO PANTA
ELVIRA AVALOS CONTRERAS
LILIANA MORI UBILLUS

DOCENTE:

LIC. WALTER PINILLOS.

LIMA 13 JUNIO 2015

INTRODUCCION
La salud es el regalo ms preciado de la vida, sin esta es difcil disfrutar al mximo de todos
los acontecimientos especiales en los que res, juegas, amas, sientes, sueas, anhelas, viajas
y dems momentos que se presentan en la vida.
La transfusin de sangre o de sus derivados se ha convertido en una parte imprescindible en
la actual asistencia sanitaria. El incremento de los accidentes de trnsito, las importantes
necesidades de algunos enfermos que antes eran considerados irrecuperables son algunos de
los elementos que han provocado esta demanda creciente de sangre. Estos y otros problemas
tambin han hecho aumentar extraordinariamente las necesidades de derivados de la sangre,
por lo tanto la necesidad contar con sangre se ha convertido en un factor importante de la
salud pblica.
La transfusin de sangre y sus componentes, son una necesidad permanente y exige que se
garantice la mxima calidad de ellos para garantizar la seguridad y eficacia de la transfusin,
evitando en particular, la transmisin de agentes infecciosos transmitidos por la
transfusionales como el Virus de la inmunodeficiencia adquirida, el HTLV I-II, la Hepatitis
b, la Hepatitis C, El Sfilis y el Chagas.
El desarrollo de tcnicas de deteccin de estos agentes biolgicos han evolucionado en el
tiempo conocindose varias de ellas, en lo que respecto a este trabajo nos ocuparemos de las
tcnicas de Elisa Ensayo Inmunoenzimtico para la deteccin de antgenos o anticuerpos
de los microorganismos de importancia transfusional.
En los ltimos aos se hecho necesario limitar al mximo la transfusin de sangre debido
fundamentalmente a la posibilidad de transmitir por esta va algn virus, bacteria o parasito
de enfermedades infecciosas (SIDA, hepatitis B y C,) vricas y prinicas. (1). El
desarrollado de nuevas medidas de diagnostico con el fin de reducir al mnimo la
utilizacin de sangre y sus componentes, entre las que destacan diferentes modalidades
tcnicas de ELISA normalmente dentro de un programa multidisciplinario de transfusin de
sangre son destinadas a la reduccin de la transmisin de estos agentes patgenos. Estas
medidas, aunque no limitan totalmente la contaminacin por transfusiones, si disminuyen de
manera importante las mismas.
Si bien la seguridad biolgica de los componentes sanguneos se ha incrementado, el aspecto
ms reciente ha sido el desarrollo de las tcnicas de deteccin por enzima inmuno ensayo y
el empleo de equipos automatizados , lo que disminuye la posibilidad de obtener falsos
resultados positivos por contaminacin de las muestras en el proceso por manipulacin
humana del operador o mala interpretacin de valores de lectura y sus posibles
consecuencias en el aumento de las infecciones post transfusionales y el costo que implica la
eliminacin no solo de la sangre, del consumo de los reactivos sino de las consecuencias de
la informacin generada tanto en los pacientes como en los donantes de sangre del que se
cuestiona la relacin costo-eficacia y que no est exento de riesgos.
2

Se han empleado diferentes sistemas de ELISAS en diferentes formatos dependiendo de las


casas fabricantes de los reactivos y al metodologa empleada y del tamao de los equipos
tanto automticos como semiautomticos para procesar dichas pruebas de ELISA las cuales
constituyen un mtodo eficaz y seguro, fcil de manejar y rpido de montar , de tal manera
que en muchos hospitales constituye ya una tcnica habitual y una pieza clave en los
protocolos de de tamizaje para los donantes de sangre.
En el futuro las estrategias deteccin de antgenos o anticuerpos de virus, parsitos o
bacterias de importancia transfusional destinadas al tamizaje de donantes de sangre debern
tener presente el desarrollo tecnolgico de estas pruebas y determinar cul es el mejor
mtodo y de que formato para utilizarlo en un banco de sangre y as tener mayor seguridad y
certeza de que por lo menos estamos haciendo lo mejor posible para reducir la trasmisin de
enfermedades por va transfusional , sin dejar de hacer una buena seleccin e indagacin
epidemiolgica de los antecedentes de los donante para hacer una combinacin de estos
conocimientos y resultado en beneficio del paciente y al responsabilidad que nos toca a
cada uno de los profesionales y tcnicos de la salud que laboran en un banco de sangre o
centro de hemoterapia.
Que cada vez la edad avanzada es un grupo de la poblacin creciente, adems las estrategias
de ahorro de sangre deben ir a incluir la ciruga de urgencias. (1)

MARCO TEORICO
ANTECEDENTES
El empleo de las enzimas como marcadores immunoqumicos en sustitucin de los radioisiotopos ,
para su utilizacin en los anlisis de enlace competitivo, fue descrito por primera vez en 1971
(Avrameas,1971). (1)
Los nombres ms utilizados son: ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay o anlisis de
inmunoabsorcin enzimtica; EIA: Enzyma immunoassay o inmunoanlisis enzimtico, y EMIT:
Enzyme-multiplied immunoassay technique o tcnica de inmunoanlisis con multiplicacin
enzimtica, que es una marca registrada de SYVA Co (D. Behering Inc. cupertino, CA 95041)
(Rubestein, 1972).(1,2).

El EIA es capaz de detectar cantidades muy pequeas de reactivos inmunolgicos. (1).


Esencialmente, los EIA heterogneos son similares a los RIA, excepto que emplean enzimas
como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogneos, eliminando los pasos
de lavado para la separacin de B/F que de otro modo son necesarios. Mejoras en los EIA
han aportado muchos formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad,
simplicidad y precisin (2).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL INMUNOENZIMOANALISIS.


3

Tabla 34.5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo enzimtico


VENTAJAS
DESVENTAJAS
1. Pueden desarrollar anlisis sensibles por 1. La medida de la actividad enzimtica
el efecto de amplificacin de las enzimas.
puede ser ms compleja que la medida
(a)(b)
de la actividad de algunos tipos de
2. Los reactivos son relativamente baratos y
radioistopos (b).
pueden alcanzar una larga vida media de 2. La actividad enzimtica puede verse
conservacin en almacenaje. (a)(b)
afectada por algunos componentes del
3. Pueden desarrollar mltiples anlisis
plasma(b)
simultneamente. (a)(b)
3. Los ensayos homogneos actualmente,
4. Se puede realizar una amplia variedad de
poseen una sensibilidad de 10-9M y no
configuraciones analticas. (a)(b)
son tan sensibles como la que se
5. El equipo necesario no es necesariamente
consigue con los radioinmunoensayos.
caro (barato) y ampliamente disponible.
(a, b).
Asequible (a)(b)
4. Los EIA homogneos para molculas
6. No hay riesgo de radiacin durante el
proteicas grandes se han desarrollado,
marcado ni en la eliminacin de
pero
se
requieren
reactivos
productos de desecho. (a)
inmunoquimicos complejos.(a, b)
7. Se puede desarrollar un EIA rpido y
simple, adaptable a la automatizacin.(a)
8. Se puede desarrollar un EIA homogneo
para los ptenos y las protenas. (a)
Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio. 9 Edicin, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 887b. Henry John Bernard.. Laboratorio en el Diagnstico Clnico. Tomo 2. Edicin Homenaje a Todd Stanfor & Davidsohn. Madrid : Marbn,
c2007 pp833

La calificacin de los EIAs depende de.


a) El reactivo que hay que determinar es decir,
b) El antgeno o el anticuerpo.
c) El Reactivo marcado, la naturaleza competitiva o no del anlisis, y
d) El mtodo de separacin de los reactivos unidos libres.
Existen varios criterios importantes para determinar la seleccin de un marcador enzimtico
en particular, entre otros:
a) El nmero de recambio o de molculas de sustrato que se convierten en productos
por lugar enzimtico/unidad de tiempo,
b) Pureza
c) Sensibilidad
d) Facilidad de velocidad de deteccin
e) Ausencia de factores que pueden interferir en el lquido que hay que analizar
f) Grupos reactivos potenciales
g) Estabilidad y
4

h) Idoneidad para un EIA homogneo. (2)


Existen dos tipos fundamentales de EIA: El heterogneo y el homogneo, en el primer
sistema la reaccin antgeno- anticuerpo no modifica la actividad del marcador enzimtico.
En el segundo, la interaccin antgeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima, lo que
hace que desaparezca la necesidad de un paso de separacin.
En la siguiente tabla se enumeran las enzimas empleadas con ms frecuencia en los anlisis
heterogneos y homogneos: (1)
Tabla 34.5 Enzimas de utilizacin ms frecuente en los distintos EIA
Enzimas usados en EIA heterogneos
Enzimas usados en EIA homogneos
Peroxidasa de rbano
Lisozima
Fosfatasa alcalina
Malato-deshidrogenasa
-D-Galactosidasa
Glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
Glucosa-oxidas
Fosfolipasa-C
Glucoamilasa
-D-Galactosidasa
Anhidrasa carbonica
Acetil colin esterasa
Catalasa

Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio. 9 Edicin, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 888)

Tabla:35.6 Caractersticas de las Enzimas Tpicas empleadas en los inmmunoensayos enzimticos


Caracteristicas
Persoxidasa(Ec1.11.1.7) -D-Galactosidasa
Fosfatasa alcalina
(EC: 3.2.1.23)
Fuente
Tamao molecular
Actividad especfica
Tasa de renovacin*
Medida de la enzima
Medida de alta sensibilidad
Mtodo de marcaje de la enzima

EC 3.1.3.1)

Rbano
E. coli
intestino bovino
ca. 40,000
ca. 530,000
140,000
250U/mg
600U/mg
1000 U/mg
10,000
318,000
250, 0000
colorimetra, fluorimetra, colorimetra, fluorimetra, colorimetra, fluorimetra
Luminometra
luminometra
luminometra
Luminometra
Fluorimetra
Luminometr
Oxidacin del periodato mtodo de la dimaleimina, mtodo del glutaraldedo
(mtodo de Nakane)
reactivo de entrecruzamiento 1 reactivo de entrecruzamiento 1

*Nmero de molculas del sustrato producidas por una molcula en una reaccin de un minuto/nmero de molculas/min
1 el reactivo contienen grupos qumicamente reactivos como la malemida y el succinamida
. Henry John Bernard.. Laboratorio en el Diagnstico Clnico. Tomo 2. Edicin Homenaje a Todd Stanfor & Davidsohn. Madrid : Marbn, c2007 pp834(2)

ENZIMA INMUNOENSAYO ENZIMATICO HETEROGENEOS

El concepto de EIA heterogneo lo present por primera vez miles (1968), quien describi el
uso de anticuerpos marcados con isotopos en los RIA no competitivos y sugiri que las
enzimas o coenzimas podran reemplazar el marcador isotpico. Fueron engvall (1971) y
van Weemen (1971) los que informaron sobre el uso de los conjugados enzima-antgeno y
enzima-anticuerpo en el inmunonalisis.
El ELISA es un EIA heterogneo basado en el mismo principio que el RIA. En el ELISA l,
la actividad enzimtica en la fraccin unida y en la libre se cuantifica por la conversin,
catalizada por la enzima, de un producto relativamente incoloro o no fluorescente. (1).
Es decir, el principio de los ensayos EIA heterogneos es similar a los del RIA, excepto que,
lo que se mide es la actividad enzimtica y no la radioactividad. Los EIA requieren de un
proceso secundario para obtener seales mediante la reaccin cataltica de las enzimas. (2).
Todos lo es EIA heterogneos tiene, al menos, un paso de separacin para diferenciar entre
el material que ha reaccionado y el que no lo ha hecho. En el sistema de EIA heterogneo, la
enzima sobre el antgeno o el anticuerpo marcados conservan su actividad, incluso despus
de la reaccin con el anticuerpo o el antgeno recprocos.(1) la eleccin de la fase de
separacin en este procedimiento slo se encuentra limitada por el gran tamao del
marcador enzimtico.(1)Como fase solida para separar los conjugados libres de los unidos,
pueden utilizarse placas de microtiter, partculas de plstico, tubos de plstico, partculas
magnticas, y ltex con filtros, entre otros. El uso de pequeas partculas magnticas y de
ltex permite acortar el tiempo total que requiere el ensayo. (2). El desarrollo de sustratos
que escindan las enzimas, estuvo marcado por la introduccin de sustratos colorimtricos y
fluorimetricos, y ms tarde de sustratos quimioluminiscentes, que incrementan la
sensibilidad de la seal. Algunas de las enzimas ms utilizadas en varios EIA heterogneos
son la peroxidasa de rbano, la fosfatasa alcalina, la -galactosidasa, la glucosa oxida, la
ureasa y al catalasa. Las enzimas ms usadas junto con sus caractersticas aparecen en la
tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando se utilizan enzimas puede determinarse por la
tasa de recambio de cada enzima y por la seleccin de la medida de la seal, entre los que al
quimioluminiscencia es el mtodo ms sensible. (2).
El concepto del ensayo de los EIAs heterogneos, al igual que de los RIA, se puede dividir
entre ensayos competitivos y no competitivos (ver Fig. 35-14). Los ensayos competitivos
(exceso de analito) usan conjugados de antgeno enzima 8fig.35-13)), mientras que los
ensayos no competitivos (exceso de reactivo) incluyen los ensayos inmunomtricos de
sndwich de dos dianas y los ensayos indirectos para medir anticuerpos. (Figs. 35-13B y C).
Los ensayos inmunomtricos de sndwich han aumentado su popularidad para la
determinacin de antgenos como hormonas, marcadores tumorales, protenas plasmticas y
agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para al medida de anticuerpos (Fig.35-13C) se
han adoptado para la deteccin de anticuerpos frente a antgenos infecciosos (p.e. VIH,
HBV, HCV) y auto anticuerpos.(2).
Tabla 34.6 Clasificacin de las Tcnicas de ELISA
6

Anlisis competitivos empleados


1. Conjugado antgeno-enzima
2. Anlisis de anticuerpo marcado con enzima
Anlisis no competitivos
1. Anlisis inmunoenzimomtrico sndwich de dos sitios
2. Anlisis indirecto para medir el anticuerpo
Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio. 9 Edicin, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 888

Fuente: Henry John Bernard.. Laboratorio en el Diagnstico Clnico. Tomo 2. pp833 (2)

U n EIA heterogneo (Fig. 35-12) consta de los siguientes pasos.


1. La fase solida unida a los reactivos s e mezcla con el analito, independientemente de
si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo.
2. Despus de la adicin del conjugado y la incubacin, hay unos pasos de lavado con
una solucin tamponada que contiene un detergente, uno o dos pasos despus de al
inmunorreaccin . La reaccin inmunolgica debe alcanzar determinados niveles para
obtener un ensayo preciso y estable.
3. La fase solida, con el complejo inmune que contiene el antgeno conjugado a una
enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solucin de sustrato
enzimtico.

4. La reaccin enzimtica se detiene (no es necesario en el ensayo de las tasas) y el


producto de la reaccin se mide con varios detectores dependiendo del sustrato
empleado. (2).
Fig. 35-13. Principios del inmunoensayo enzimtico (EIA) empleando la fase slida,
(A) ensayo de sndwich competitivo y (B y C) No competitivo. Fuente: (2)

ENSAYO ENZIMTICO COLORIMTRICO

En este ensayo, la reaccin enzimtica se realiza utilizando sustratos, magnticos para


desarrollar un color mediante la reaccin cataltica principal. Por ejemplo, la Peroxidasa de
rbano, catalizando el ABTS (Sal de diamonio de 2,2-azino-di (3-etil-benzotiazolina-6sulfonato) con H2O2 para dar un color verde y la fosfatasa alcalina, especifica para el pnitrofenil fosfato para da un color amarillo . Ambas son los tipos ms utilizados en lso
inmunoensayos enzimticos colorimtricos. Se utiliza un espectofotmetro para medir la
densidad ptima del cromgeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que
permiten medir al densidad ptica en tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema
completamente automatizado que hace desde el pipeteo de al muestra hasta la o impresin
de los resultados, hasta instrumentos manuales ms sencillos. Cuando la reaccin EIA se
hace sobre una membrana de nitrocelulosa (mtodo de transferencia western) u otras
membranas, se emplean sustratos que generan tintes insolubles. U n test de embarazo para la
hCG en un formato de inmune ensayo se vende sin receta mdica, a menudo utiliza
derivados de la bencidina que reacciona con la peroxidasa , o derivados del indoxil fosfato
que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El precipitado
de color que se acumula en la fase slida por la accin de la enzima puede detectarse a
simple vista. Tericamente, la medida de la densidad ptica est limitada por un rango de
entre 0 y2.0. As, la determinacin de la densidad ptica de los analitos que requieren un
amplio rango puede resultar problemtica, incluso cuando se emplean un exceso de
conjugado y fase slida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo sndwich.
(2).
Los esfuerzos para mejorar los EIA, u n punto clave en el desarrollo de los inmunoensayos
no isotpicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs como son los residuos
radioactivos, radiolisis de lso analitos marcados, y la corta vida media del 125I. Ishikawa,
(1989), desarrollo un EIA ultrasensible que puede detectar 3 moles de una IgG especfica.
Para alcanzar este nivel de sensibilidad se requieren pasos tediosos, como la transferencia
del inmunocomplejo de una primera fase slida a otra distinta para reducir las seales de
fondo.(2)
ELISA COMPETITIVO.
ELISA COMPETITIVO CON EMPLEO DE ANTIGENO MARCADO POR
ENZIMAS
Este tipo de ELISA se sirve de un antgeno marcado enzimticamente, con el anticuerpo
especifico inmovilizado en una fase solida.
Las concentraciones del producto sustrato son inversamente proporcionales a las del
antgeno estndar o de pruebas aadidos. Este tipo competitivo de ELISA se ha aplicado
para analizar una amplia gama de antgenos, incluidas IgG y gonadotropina corionica
humana. Es particularmente til para analizar haptenos o frmacos en los que el anticuerpo
especfico es univalente.
El anlisis consta de los siguientes pasos ( Fig. 34-15, 1):
9

1. El anticuerpo especfico se adsorbe fsicamente o se une de modo covalente a una


fase slida.
2. El anticuerpo no unido se elimina por lavado.
3. En antgeno marcado enzimticamente se incuba en presencia de antgeno estndar o
de prueba que se ha de analizar.
4. Lavado con tampn que contenga un agente humectante, despus que la reaccin
antgeno-anticuerpo haya llegado a una situacin de equilibrio.
5. La fase slida con el complejo antgeno-anticuerpo marcado enzimticamente, se
incuba a temperatura constante con la solucin de sustrato enzimtico.
6. Se detiene la reaccin enzimtica y se mide el producto de la reaccin del sustrato
espectofotomtrica o fluoromtricamente. (1)

ELISA COMPETITIVO MEDIANTE CONJUGADO DE ENZIMAS-ANTICUERPO


En esta tcnica el antgeno esta unido a una fase slida. La unin del anticuerpo marcado
enzimticamente y el antgeno en fase slida disminuye competitivamente si se aade
antgeno estndar o desconocido de prueba.
10

Los pasos en este anlisis son similares a los del ELISA con antgeno marcado
enzimticamente. El producto medido de reaccin es inversamente proporcional a al
concentracin del antgeno estndar o de prueba. El mtodo puede usarse para analizar una
amplia gama de antgenos y ah demostrado una especial utilidad en el anlisis del antgeno
carcinoma embrionario. (1).
ELISA NO COMPETITIVO

Las 6tecnicas de ELISA no competitivo constituyen un ejemplo de los anlisis de tipo I (con
exceso de anticuerpo) . A menudo se denominan anlisis inmunoenzimomtricos, en los que
el analizado, o antgeno, reacciona con un exceso estoiquiomtrico de anticuerpo. , y el
grado de reaccin antgeno-anticuerpo se mide en un segundo paso. Los anlisis de
inmunoenzimomtricos con anticuerpo marcado gozan de ciertas ventajas:
1) No es necesario aislar el analizado puro
2) Con un paso de separacin suele eliminarse la interferencia no deseada de la
muestra, antes de la reaccin con el anticuerpo especifico marcado enzimticamente,
3) El procedimiento analtico requiere menos tiempo de reaccin que en el ELISA
competitivo , y
4) Es posible que a la sensibilidad sea superior a la del ELISA competitivo comparable.
5) Los ELISA no competitivos se han de controlar cuidadosamente; de los contrario,
puede haber dificultades en cuanto a la precisin y reproductibilidad del anlisis.
Existen ELISA no competitivos para antgenos y anticuerpos (1).
ELISA TIPO SANDWICH NO COMPETITIVO

En este mtodo, que se muestra en al Fig. 34-16, se conoce tambin con el nombre de
anlisis de inmunoezimomtrico. Solo es aplicable a antgenos bivalente o polivalente.
E estas tcnicas, el anticuerpo inmovilizado en la fase slida se incuba con el antgeno
estndar o de prueba. Despus del lavado, el complejo anticuerpo inmovilizado-antgeno se
incuba con un exceso de anticuerpo marcado enzimticamente, que se fija a uno de los sitios
antignicos restantes. Despus de otro paso de lavado, se aade la solucin de sustrato
enzimtico y se incuba. La reaccin del producto de reaccin enzimtica es directamente
proporcional a la concentracin del antgeno estndar o analizado.
El ELISA tipo sndwich se ha empleado para cuantificar de manera sensible los marcadores
tumorales, como el antgeno carcinoma embrionario, la - fetoproteina y muchos otros
antgenos , incluidos protenas y virus.
Con el advenimiento de la tecnologa los anticuerpos monoclonales, es posible realizar
simultneamente la incubacin del anticuerpo inmovilizado en la fase solida con el
analizado de prueba o antgeno. El anticuerpo monoclonal que se emplea para la fase slida
11

debe reaccionar con un determinante del antgeno polivalente que sea diferente a aquel con
el que reacciona el anticuerpo monoclonal especfico marcado enzimticamente.(1)

ELISA INDIRECTO PARA MEDIR EL ANTICUERPO


Se trata de otro tipo de ELISA para medir la concentracin de anticuerpo en las muestras de
lquidos biolgicos: En este procedimiento se emplea antgeno inmovilizado, que reacciona
12

con la muestra de anticuerpo (fig.34-16). El paso siguiente consiste en un lavado y la


reaccin posterior con anticuerpo marcado enzimticamente y especifico para la
inmunoglobulina de la especie que se trata de analizar. Con este mtodo es posible
cuantificar una amplia gama de anticuerpos especficos, particularmente vricos, como
contra el virus del sarampin, citomegalovirus y virus Epstein-barr(1).
La aplicacin ms frecuentemente citada del ELISA es probablemente la medicin de los
anticuerpos IgG e IGM en diversas infecciones y en enfermedades de causa inmunolgica.
Se ha usado mltiples variantes y tcnicas. En el ELISA para los anticuerpos IgM existe un
problema con respecto a la competencia de la IGG especfica y de los factores reumatoides
(1).
CARACTERISTICAS DE LA FASE SOLIDA
Los Principios en que se basan los EIA heterogneos son similares a aquellos en que se
funda los RIA.; sin embargo, en los primeros es importante elegir adecuadamente la fase de
la separacin ya que se afecta por el tamao molecular de los marcadores enzimticos.
Los mtodos de separacin que e emplean ms comnmente en los EIA son los de fase
slida y a la precipitacin inmunolgica con un segundo anticuerpo: La inmovilizacin en
fase slida del antgeno o del anticuerpo se logra por unin covalentes. Se han empleado
partculas de agarosa, poliacrilamida y poliestireno. Tambin han usado partculas de oxido
de hierro, que pueden separase en un campo magntico, (1).
La inmovilizacin sobre la superficie de plstico ha conducido al desarrollo de EIA capaces
de realizar un gran volumen de trabajo : El uso de placas de plstico para micro titulacin
ha servido para desarrollar una amplia gama de instrumentos en los EIA heterogneos , que
actualmente estn reemplazando a los RIA..
LIMITACIONES Y SENSIBILIDAD DEL EIA HETEROGENEO
Los factores de sensibilidad, especificidad, precisin o reproductibilidad de cualquier
anlisis dependen del diseo de configuracin, la matriz de fase slida, el anticuerpo, el
conjugado enzima-anticuerpo, la enzima y el mtodo de medicin de sta. (1).
Otros factores de importancia son los siguientes:
1. Adsorcin inespecfica, que influye significativamente sobre la medicin de
cantidades extremadamente pequeas del analizado.
2. La naturaleza y al extensin de la reaccin antgeno-anticuerpo son factores
limitantes del anlisis. En experimentos con EIA para IgE a concentraciones de 0,05
a 0,1 ng de IgE/ml, el factor limitante no fue la deteccin del nivel enzimtico, sino
la naturaleza de la reaccin del anticuerpo(1).
3. El efecto prozona, o gancho de dosis altas , que puede conducir a una menor
reactividad cuando estn presentes niveles altos del analizado.
En el desarrollo de un mtodo determinado de ELISA hay que averiguar cuales son las
condiciones ptimas para cada estado de la prueba, por ejm:
13

a) Concentracin ptima del antgeno o del anticuerpo para la inmovilizacin o


recubrimiento de la fase solida.
b) Tiempos de incubacin ptimos para cada paso del anlisis, los anlisis competitivos
requieren un tiempo mayor para el equilibrio;
c) Tipo de sustrato, tiempo y temperatura ptimos para que a la reaccin enzimtica
desarrolle el producto (1).
d) Es posible desarrolla ELISA precisos y ultrasensibles. Con un ELISA, en el que se
empleo el complejo de anticuerpo Fab--galactosidasa de conejo y el anticuerpo IgG
de conejo unido a varias varillas de vidrio, pudieron detectarse 0.03 fmol de antgeno
ornitin transferasa de hgado de rata y 0,3 fmol de antgeno IgG humano.
Ishikawa, en 1981, desarrollo un EIA ultrasensible que detecta 0,45 ng (3fmol) de
anticuerpo IgG especfico por mililitro de suero. Para lograr este grado de sensibilidad es
necesario recurrir a varios pasos complejos de lavado, con el empleo de un anticuerpo
enzimtico.
En el futuro, el uso de anticuerpo monoclonales altamente especficos y vidos incrementar
el grado de sensibilidad de los mtodos EIA.

INMUNOENZIMA ENSAYOS HOMOGNEOS


ORIGEN
El trmino de inmunoanlisis homogneo puede ser aplicado a cualquier sistema de reaccin
antgeno-anticuerpo, en el que sea posible medir el grado de reaccin inmunolgica sin
separacin de los componentes libres libres y marcados con anticuerpo. Estos mtodos son
menso sensibles que los heterogneos, ya que estos ltimos han conseguido igualar al
sensibilidad de lso RIA en muchos casos. .Los EIA pueden precisar reactivos
inmunoquimicos complejos, pero ofrecen la ventaja de ser rpidos, sencillos, y adaptables a
la automatizacin. Lo stipo de EIA homogneos se enumeran en la tabla 34.7.
Tabla 34.7 Tipos de EIA homogneos marcados
1. Anlisis con antgeno o analizado marcados
2. Inmunoanalisis de fluorescencia con sustrato enzimtico
3. Anlisis con cofactor enzimtico marcado
4. Anlisis con grupo prosttico marcado
5. EIA con avidin-biotina
6. Anlisis con anticuerpo hbrido
7. Inmunoanalisis con enzima marcada con anticuerpo
a) Anlisis con fosfolipasa C
b) Inmunoanalisis con refuerzo
8. EIA con inmunoanalisis de sustrato enzimtico insoluble
9. Inmunoanalisis con donador enzimtico clonado
10. Inmunoanalisi con modulador enzimtico
14

11. Inmunoanalisis de canalizacin enzimtica


12. Inmunoanalisis con liposomas enzimticos
13. Inmunoanalisis electroqumico
Fuente: a.Henry John Bernard. Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio. 9 Edicin, edit. Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 890

Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es disear
instrumentos totalmente automatizados con acceso continuo a tipos heterogneos de
reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado
complicados, como requieren los EIA heterogneos. Las enzimas y sus cofactores son
sondas ventajosas en los EIA homogneos porque la actividad enzimtica se puede modular
fcilmente cambiando lso factores presnetes en el microambiente de la reaccin Ag-Ab.
Actaulamnete los EIA son menos sensibles que sus equivalentes heterogneos. Los EIA
heterogneos convencionales tienen una sensibilidad equivalente a la de los RIA en muchas
aplicaciones, mientras que el EIA homogneo mantiene una sensibilidad de uno o dos
rdenes de magnitud inferior. Los EIA homogneos pueden necesitar reactivos
inmunoquimicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rpidos y sencillo, y se pueden
adapatar a instrumentos convencionales . hay varios tipos de EIA homogneos. En cada uno
de estos ensayos, la interaccin antgeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de
la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulacin de la actividad
enzimtica refleja el grado de reaccin inmunoquimkica . En la tabla 35-7 aparece una lista
de caractersticas de los EIA homogneos tpicos.

Los EIA homogneos se pueden clasificar en ensayos de unin competitivos o no


competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antgenos acoplados a
una enzima que funciona como sonda . Sin embargo , en otros formatos de ensayo, el
antgeno ( analito) se puede conjugar al sustrato o a un grupo prottico de la enzima. Por el
contrario, los ensayos de uni no competitivos emplean un conjugado compuesto por un
15

anticuerpo acoplado a una enzima. De entre los distintos tipos de mtodos mencionados, s
presta especial atencin a cinco EIA homogneos:

INMUNO ENSAYO DE MULTIPLICACIN ENZIMATICA (EMIT)


EMIT, el primer EIA homogneo, fue desarrollado por Rubesntein (1972). El sistema de
EMIT esta esquematizado en al fig. 35-15. En el EMIT, la conjugacin de las enzimas a
haptenos no afecta a la actividad enzimtica; sin embargo, la unin de anticuerpos
especficos para haptenos y su ligando causa la inhibicin de la actividad enzimtica. Los
haptenos libres presentes en al muestra o en el estndar liberan esta inhibicin compitiendo
por la unin a los anticuerpos. As la actividad enzimtica es proporcional a la concentracin
de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima induciendo o
impidiendo cambios conformacionales necesarios para la actividad enzimtica. (2)

OTRAS CONSIDERACIONES A TENER EN CUENTA


Principios de Diagnstico Inmunolgico
Afinidad y avidez
Afinidad: fuerza de interaccin entre Ac y Ag en un solo determinante antignico, en la
mayora de las circunstancias prcticas nos preocupamos por la interaccin del antisuero con
un Ag multivalente. Fuerza o intensidad de la unin entre un determinante
antignico y su sitio de unin al Ac.

16

Avidez: fuerza con la que el Ac multivalente se une a un Ag multivalente. Fuerza total de


la unin entre AgAc (suma de fuerzas de atraccin y de repulsin).

Reproductividad: Es la capacidad del ensayo para ofrecer los mismos resultados cuando
se repite su aplicacin en circunstancias similares.
Sensibilidad: Capacidad de un mtodo para detectar positivos.

Especificidad : Capacidad para detectar negativos

Pruebas de tamizaje alta sensibilidad para poder captar a todos los


enfermos

Pruebas confirmatorias : alta especificidad, para evitar falsos


positivos

Valor de corte: cutoff: Mxima Sensibilidad + Mxima especifidad

PREVALENCIA: Nmero de casos de una infeccin/ enfermedad en un


determinado punto en el tiempo, dentro de una poblacin especfica

A menor prevalencia poblacional,


Resultados falso-positivos

VPP : Es la probabilidad de padecer la enfermedad si se obtiene un

mayor

probabilidad

resultado positivo en el ensayo

VPN : Es la probabilidad de que un sujeto con un resultado negativo en la


prueba est realmente sano

Sensibilidad y Especificidad : son propiedades intrnsecas a la prueba


diagnstica : definen su validez independientemente de cul sea la
prevalencia de la enfermedad en la poblacin

ELISA: Adems, algunos ensayos usan tcnicas de amplificacin para


acelerar la reaccin o para mejorar la seal y as aumentar la
sensibilidad. El ms comn es usar un sistema de dos pasos: el
conjugado primario es etiquetado con biotina. Un segundo
componente consiste en anti-biotina marcado con enzima, o enzima
marcada con estreptoavidina.

ELISA: ENSAYOS DE DETECCIN DE AG:

Posteriormente se introdujo el ensayo de Ag p24 para HIV en USA para disminuir el


perodo de ventana.

El ELISA fue el ensayo de


eleccin para detectar HBsAg por muchos aos. Las pruebas modernas
son capaces de detectar niveles de menos de 0,2 IU/ml de muestra
(0,1ng/ml).

17

Ms tarde se introdujo el ensayo de Ag de HCV para disminuir el perodo de ventana


como alternativa al NAT,
ELISA: ENSAYOS DE DETECCIN DE AC
Se utilizan para deteccin de muchas infecciones.
Para deteccin de infecciones recientes se requiere determinacin de IgM.
Para determinar si los donantes han estado expuestos previamente a un agente
infeccioso se debe detectar IgG : Ensayo
antiglobulina , Ensayo
sandwich , Ensayo competitivo , Ensayo de captura

ELISA: ENSAYOS DE DETECCIN DE AC ENSAYO ANTIGLOBULINA

Ag unido a fase slida.

Incubacin con la muestra diluida, el Ac se une al Ag.

Lavado para eliminar protenas no unidas.

Adicin de conjugado anti globulina humana unida a la enzima


marcada que se une a los Ac unidos a la fase slida.

Lavado de conjugado no unido

Sustrato (OPD o TMB)

Frenado de la reaccin con cido sulfrico

Lectura
VENTAJAS

Los reactivos son genricos y reaccionarn contra todo Ac


humano.

Buffers y sustratos pueden usarse en una gran variedad de


ensayos diferentes.

Disminucin de costos y procedimientos simplificados.


DESVENTAJAS

La unin de Ac no especficos pueden dar resultados falsos


positivos.

Los kits anti-IgM han sido propensos a dar interferencia con


factor reumatoideo

18

ELISA: ENSAYOS DE DETECCIN DE AC ENSAYO SANDWICH

, Ag unido a fase slida.

Incubacin con la muestra, el Ac se une al Ag.

Lavado para eliminar protenas no unidas.

Adicin de conjugado: el mismo Ag que el unido a la fase solida pero en


solucin y unido a la enzima marcada que se une a los Ac unidos a la fase
slida: queda formado el sndwich Ag-Ac-Ag.

Lavado de conjugado no unido

Sustrato (OPD o TMB)

Frenado de la reaccin con cido sulfrico

Lectura

19

VENTAJAS
Altamente especficos
Detectan IgG e IgM
DESVENTAJAS
Los antgenos conjugados son especficos a un solo tipo de test
No son econmicos
Algunos antgenos son lbiles y no soportan la unin al conjugado
ELISA: ENSAYOS DE DETECCIN DE AC ENSAYO COMPETITIVO
Ag unido a fase slida.
El conjugado es el Ac unido a la enzima con la misma especificidad que el Ac que
se quiere ensayar
Tanto la muestra como el conjugado se agregan al mismo tiempo: incubacin. Si no
hay Ac en la muestra, el Ac conjugado se une al Ag de la fase slida.
Lavado de conjugado no unido.
Sustrato (OPD o TMB).
Frenado de la reaccin con cido sulfrico.
Lectura.
Si en la muestra hay Ac, va a competir por unirse al Ag con el Ac conjugado y
en este caso no hay desarrollo de color: ES REACTIVA

20

Ventajas
el conjugado y la muestra se agregan al mismo tiempo reduciendo incubaciones y
pasos de lavado.
El mtodo detecta tanto IgG como IgM.
Desventajas
Muchos falsos positivos (3)
ELISA: ENSAYOS DE DETECCIN DE AC ENSAYO DE CAPTURA
Anti gama globulina humana unida a fase slida. (anti IgM, anti.IgG o ambas)
Cuando se incuba con la muestra, los Ac se unirn, cualquiera sea la especificidad.
Luego de incubacin se lava la protena no unida.
El conjugado es antgeno especfico marcado con la enzima que se unir solo si hay
Ac especfico en la fase slida.
Lavado de conjugado no unido.
Sustrato (OPD o TMB).
Frenado de la reaccin con cido sulfrico.
Lectura.

21

Ventajas
La placa es genrica (puede ser usada como la base para muchos ensayos, con
buffers y cromgenos comunes pero con conjugados especficos).
Puede detectar IgG o IgM
Desventajas
Falsos IgM positivos por la presencia de factor reumatoideo.
Los Ags conjugados son caros y difciles de producir.
La sensibilidad es baja en muestras de seroconversin temprana por la pequea
cantidad de Ac presentes

ENSAYOS COMBINADOS
Varios fabricantes estn produciendo kits para detectar individuos infectados
recientemente:
HIV Ag/Ac
HCV Ag/Ac (3)
PERODO DE VENTANA
Lapso durante el cual el donante est infectado pero los resultados de la pesquisa de
marcadores son negativos
Ventana HVC HCV AG: Anti- HCV 3 gen ventana 7-8 semanas
ELISA PARA LA DETECCIN DE HEPATITIS B
ELISA HBsAG
La presencia del antgeno HBs en el suero indica una infeccin por el virus de la herpatitis
B. es el primer marcador que aparece y puede preceder de 2 a 3 semanas a los signos
clnicos y biolgicos de la enfermedad. Su presencia puede ser muy breve. ( algunos das) o
muy larga (varios aos) . Cuando la persistencia del virus del Ag HBs supera los 6 meses,
la hepatitis se considera crnica.
La existencia de numerosos portadores crnicos asintomticos hace que la hepatitis B
represente un importante riesgo transfusional . La prevencin dela transmisiones basa en la
deteccin del AgHBs en cada donacin.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA MONOLISA HBs AG ULTRA:
Monolisa HBsAg Ultra es una tcnica inmunoenzimatica de tipo sndwich en 1 tiempo
utilizando anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales seleccionados por su
capacidad de unirse a los diferentes subtipos del Ag Hbs actualmente reconocidos por la
OMS y la mayora de las cepas variantes de la hepatitis B.
La fase solida del Monolisa HBsAg Ultra esta sensibilizada con anticuerpos monoclonales
de ratn y de anticuerpos policlonales de cabra contra el Ag HBs. Estos anticuerpos estn
conjugados con peroxidasa.
22

Los estudio de sensibilidad que efectuaron en 428 muetras positivas procedentes del
seguimiento de pacientes que presenta hepatitis B aguda, han demostrado una sensibilidad
de 100%: Con Monolisa HBsAG Ultra se ah ensayado y se ha detectado totalmente un
panel de 15 protenas recombinantes reproduciendo las ms importantes mutaciones en las
secuencias de aminocidos del Ag HBs. Se ha ensayado un total de 60 paneles de
seroconversiones comerciales de hepatitis B (293muestars) y se ha comparado con las
pruebas inmunoenzimaticas disponibles en el mercado. Monolisa AgHBs ha mostrado
resultados equivalentes a Monolisa Plus en 29 seroconversiones. Monolisa AgHbs ha
detectado las seroconversiones con 1 muestra de adelanto en 28 seroconversiones, con 2
muestras de adelanto de seroconversiones y 5 muestras de adelanto en 1 seroconversin. 25
muestras adicionales positivas y recin colectadas (con menos de 1 da) fueron analizadas y
todas resultaron positivas.
Precisin
La precisin del ensayo Monolisa AgHBs Ultra se ha determinado con el anlisis de 4
muestras: 1 muestra negativa, 2 muestars positivasen AgHBs(m.2 y 3) y una muestar muy
positiva en AgHBs.
La repetabilidad (intra ensayo) se ah evaluado con el anlisis de estas 4 mismas muestars ,
que se han ensayado por duplicado durante 20 das a razn de 2 ensayos independientes cada
da.
La valoracin incluye las siguientes etps:
1. Distribucin de la muestra y de los sueros controles en los pocillos de la micro placa
2. Esta distribucin puede controlarse visualmente. Puede diferenciarse entre un pocillo
vacio y otro que contenga la muestra
3. Distribucin del conjugado
4. Esta distribucin tambin puede controlarse visualmente, tras aadir el conjugado de
color rojo, el pocillo se colorea de rojo.
5. Tras la incubacin durante una hora y media a 37C, el conjugado no unido se
elimina con el lavado.
6. Distribucin de solucin de revelado de la actividad enzimtica. Esta distribucin
puede controlarse visualmente hay una clara diferencia entre un pocillo vacio y otro
pocillo conteniendo sustrato color rosa.
7. Tras 30 minutos de incubacin en presencia del sustrato, en oscuridad y a
temperatura ambiente (18-30C), la presencia de conjugado se demuestra con un
cambio de color.
8. Distribucin de solucin de parada. Esta distribucin tambin puede controlarse
visualmente. La coloracin del sustrato rosa da (para las muestras negativas) o azul
(para las muestras positivas) , desaparece de los pocillos que se vuelven incoloros
( en el caso de muestras negativas) o amarillos en el caso de de muestras positivas)
tras la adicin de la solucin de parada.
9. Lectura de densidades pticas a 450/620-700 nm e interpretacin de los resultados.
LIMITES DE LA PRUEBA:
23

Un resultado negativo significa que la muestra no contiene el AgHBs detectable con


la prueba Monolisa AgHBs ultra. No obstante, en la medida en al que no pueden
detectarse valores muy bajos de Ag HBs, ese resultado negativo no excluye la
posibilidad de una infeccin por el virus de la hepatitis B.
Segn el equipo usado, (lavador, lector, procesador automatizado) se puede observar
una variabilidad dbil de los resultados.
Adems, varios autores han comunicado en la literatura casos de hepatitis vrica B
aguda o crnica, en los que es detectable DNA vrico e ausencia del Antgeno de
superficie (pacientes HBsAG negativos). Estos perfiles anormales, si bien son raros,
son consecuencia de una posible mutacin gentica, bien a nivel del gen S y pre-S
(impidiendo el reconocimiento del Ag por algunos reactivos inmunolgicos)o,
normalmente a nivel del gen X y pol, induciendo una replicacin vrica dbil. Se
recomienda ensayar marcadores adicionales (anticuerpos especficos del Hbs Ag, o si
es posible DNA vrico amplificado) para establecer el diagnostico final de la
infeccin en estos casos muy particulares.
Para comprobar la especificidad de la reaccin , toda muestra que resulte positiva
(segn los criterios de interpretacin del ensayo Monolisa AgHBs ultra ) deber
confirmarse mediante una tcnica de neutralizacin de los Ag Hbs eventualmente
presentes en la muestra.
El mtodo colorimtrico de comprobacin de la distribucin de las muestras y/o de
los conjugados/o de la solucin de revelado no permiten comprobar la exactitud de
los volmenes dispensados .nicamente seala la presencia de muestras y/o
conjugado. el grado de respuesta errneas obtenidas con este mtodo est
relacionado a la precisin del sistema utilizado (los CV acumulados de pipeteo de
lectura superiores al 10% pueden rebajar significativamente la calidad de esta
comprobacin).
Trabajos comparativos respecto de los antgenos purificados y/o antgenos recombinantes
empleados en diferentes kits comerciales de ELISA para el HBsAG han dado interesantes
resultados, por ejemplo el prestigioso Journal de Microbiologa Clnica del ao 2008 donde se compara
diferentes marcas y metodologas para el reconocimiento de los anticuerpos contra el antgeno de superficie de
la hepatitis B -Comparison of Nine Commercially Available Assays for Quantification of Antibody Response
to Hepatitis B Virus Surface Antigen- (7) en lo que se refiere a los antigenos purificados seala lo siguiente:
Anfgenos purificados
Con respecto al empleo de antgenos purificados y/o recombinantes, se ha tomado como referencia la reciente
publicacin independiente aparecida en

El pedido de una prueba que incluya antgenos recombinantes y/o purificados obedece al principio de trato
igualitario y estudio de posibilidades de tecnologas automatizadas existentes para la prueba de anticuerpos
contra el antgeno de superficie solicitada.
En la Tabla 1 se observa que diferentes marcas usan antgenos o purificados o recombinantes;

24

Si bien es cierto que estas comparaciones se hicieron para el mtodo de quimioluminiscencia, (tabla 7), los
resultados presentados nos parecieron importantes para este trabajo porque nos permite tener una idea de cmo
seleccionar un mtodo de trabajo para tamizar el HBsAG en un banco de sangre , lo que se observa en esta
tabla es que comparan los resultados para la especificidad entre el test de la marca Abbot Axsym y Roche
Elecsys donde lo publicado seala que la especificidad de la tecnologa MEIA (Axsym) , que es un ensayo
EIA en su fase solida de micro partculas, es inferior a la del reactivo propuesto por Roche: 87.2% vs 93.6%
respectivamente .

Por otro lado, en este mismo estudio, con respecto a la sensibilidad de ambas metodologas, se aprecian que
son iguales a 100% (tabla 9), por lo que queda demostrado que el empleo de antgenos recombinantes o
purificados para este tipo de anlisis muestra que el empleo de antgenos purificados nos dan una mayor
especificidad del reactivo y los antgenos recombinantes mayor sensibilidad.

25

Cabe indicar tambin que el grado de concordancia (tabla 13) entre las pruebas de Architect y Axsym (ambas
de Abbott con antgenos recombinantes es de 0.730 mientras que este ndice es superior si se compara la
tecnologa de Roche (antgenos purificados) con el mismo Architect (0.838) o con el Axsym (0.809), lo cual
evidencia que el empleo de antgenos recombinantes para este tipo de anlisis, an perteneciendo a la
misma casa comercial no garantiza una mejor concordancia entre los resultados obtenidos.

Por lo tanto, es que el empleo de antgenos recombinantes para la deteccin del HBsAg es ms sensible y
menos especifico que los antgenos purificados que son ms especficos.

ANTICORE TOTAL
El anticore total es un importante marcador para confirmar la presencia de una infeccin
pasada(anti-HBc Total) o reciente (anti-HBc IgM) por el virus de la Hepatitis B.
Los pacientes con infeccin crnica por el virus de la hepatitis B muestran niveles elevados
anti HBc. Los anticuerpos pueden persistir durante largos periodos, y se han observado en al
menos tres situaciones clnicas. Asociadas con el HBsAg , asociados con el anticuerpo antiHBcs y, algunas ocasiones solos.

26

La comprobacin de la sangre donada y los productos derivados para detectar anticuerpos


anti-HBc constituye una herramienta til para prevenir la transmisin del virus de la
hepatitis B.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Monolisa Anti-HBc Plus, es un inmunoanalisi enzimtico (del tipo ELISAindirecto) para al
deteccin simultnea de anticuerpos contra el nucleo del virus de la hepatitis B en suero o
plasma humano.
Monolisa Anti-HBc Plus se basa en el uso de una fase solida eleborada con antgeno HBc
recombinante.
Pasos de la manipulacin:
1. Se aaden a los pocillos los sueros a comprobar y el control. Si existen anticuerpos
anti-HBc, estos se unirn a los antgenos fijados en la fase slida.
2. Tras un paso de lavado, se aaden los anticuerpos anti-IgG y anti_IgM humano,
marcados por peroxidasa . estos, a su vez, se unen a los anticuerpos especficos
capturados en la fase slida.
3. Tras retirar el conjugado enzimtico no unido, se revela el complejo antgenoanticuerpo mediante la adicin de un substrato.
4. Una vez retenida la reaccin , se leen los valores de la absorbancia utilizando un
espectrofotmetro a 450/620-700nm. La absorbancia medida para una muestra
permite determinar la presencia o ausencia de anticuerpos anti-HBc. La intensidad
del color es proporcional a la cantidad de anticuerpos anti HBc unidos en la fase
slida.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS:
Las muestras con una densidad ptica inferior al valor del punto de corte se consideran
inicialmente positivas y deben ensayarse de nuevo, por duplicado, antes de su interpretacin
final. No obstante, los resultados que queden justo por debajo del valor de corte del p, Vs10%<DO, deben interpretarse con precaucin ( se aconseja volver a comprobar las muestras
correspondientes por duplicado cuando los sistemas utilizados y los procedimientos del
laboratorio lo permitan). Para las muestras iniciales reactivas o dudosas (0.9>ndice>1), tras
la repeticin de las pruebas, la muestra se considera positiva con la prueba Monolisa antiHBc Plus, si al menos una las dos mediciones resulta positiva, es decir, mayor o igual que
el valor del punto de corte. La muestra se considera negativa con la prueba Monolisa antHBc Plus si ambos valores son inferiores al valor del punto de corte.

27

ELISA PARA HEPATITIS C

Diagnstico de la hepatitis C.
La hepatitis C es una enfermedad que permanece desconocida y es raramente
diagnosticada hasta la aparicin de sus complicaciones crnicas. A partir de
1989 despus de la secuenciacin del genoma y la descripcin del virus
mediante tcnicas de ingeniera gentica (7) se hizo posible el diagnstico de
laboratorio de la infeccin por el VHC.
Para la deteccin o diagnstico de la infeccin por el VHC y el estado de
progresin de la enfermedad, existen diferentes pruebas (1). Los ensayos
serolgicos, que detectan anticuerpos al VHC (anti-VHC), se subdividen en
ensayos de escrutinio como los inmunoenzimticos, principalmente los "Enzyme
Linked Immunosorbent Assay" (ELISA) (20), que usan anticuerpos policlonales o
monoclonales (para detectar antgenos) o virus completos, pptidos sintticos o
antgenos recombinantes (para detectar anticuerpos) (12,25,62) y ensayos
suplementarios como los "Recombinant Immunoblot", entre ellos el de tercera
generacin para IgG (RIBA 3.0).
Los ELISA de tercera generacin son tiles en la deteccin de las regiones
estructural y no estructurales del VHC, de la protena GOR que se ha visto que
est presente en algunos pacientes con VHC (63) y son sensibles y especficos
para el estudio en pacientes con trasplante renal (64). En el diagnstico del VHC
en pacientes hemodializados, es til el empleo de un ELISA con un pptido
quimrico obtenido de la unin mediante Glicina-Glicina (Gly- Gly) de dos de los
pptidos sintticos de las regiones NS4 y NS5 y protenas recombinantes
(ncleo y NS3) (65).
Las pruebas confirmatorias de anticuerpos para conocer qu antgenos virales
son los responsables de la reactividad obtenida en una prueba ELISA, se
realizan sobre un soporte de nitrocelulosa al que se adhieren pptidos en
diferentes lugares, la adicin de la muestra y su revelado pondr de manifiesto
la existencia de anticuerpos (25).
En casos de hepatitis aguda, problemas en la interpretacin de los resultados de
los ensayos de ELISA, o pacientes inmunodeprimidos, es necesario analizar el
ARN del VHC (27).
Ensayos moleculares detectan, cuantifican y caracterizan el genoma del VHC
(66). Mediante tcnicas moleculares es posible incluso establecer el origen
comn de brotes epidmicos. Ello requiere, una vez establecido el genotipo, la
amplificacin y secuenciacin de una regin variable, y el anlisis filogentico
de las secuencias problema y los controles adecuados. Mediante estas tcnicas
se ha podido confirmar casos de transmisin materno-fetal, sexual y nosocomial
28

(26) y es el mejor mtodo para detectar el ARN del virus en pacientes


inmunosuprimidos despus de trasplante de hgado (67).
Los ensayos que permiten detectar, clonar y secuenciar genomas virales, son
ms sensible que las pruebas convencionales aun en pacientes con niveles
bajos del ARN viral y permiten la deteccin precoz del virus (11, 13). Sin
embargo, son altamente costosos, muy sofisticados, requieren de un
seguimiento cuidadoso para reducir la contaminacin, una correcta coleccin y
almacenamiento de las muestras y con problemas especiales en la
amplificacin, debido a la variabilidad de la secuencia del ARN (9, 11).
El diagnstico molecular incluye (1):
a) La deteccin cualitativa o cuantitativa del RNA viral en suero, plasma o tejido
mediante tcnicas de PCR o RT-PCR competitiva (SuperQuant, NGI, CA) o no
(Amplicor HCV y Amplicor HCV Monitor, Roche Molecular Systems); de
amplificacin de seal por DNA ramificado (bDNA) (QuantiplexHCV RNA, Bayer
Diagnostics), mtodo quimioluminiscente, sencillo y rpido, que se basa en que
la regin 5 (UTR) del ARN viral es hbrida con una sonda especfica, a la que se
unen molculas quimioluminiscentes que permiten amplificar la seal, en vez
del genoma (11, 12); de RT-PCR en tiempo real (Taqman, Roche Molecular
Systems) (9,11); mediado por transcripcin (TMA) que amplifica secuencias
especificas del RNA viral y los PCR de nica etapa (ss-PCR), uno basado en la
deteccin de los productos de PCR por hibridacin lquida con una sonda
marcada de P32 (ss-PCR isotpico) y el otro un mtodo colorimtrico (ss-PCR
colorimtrico) que usa microplacas de hibridacin con una sonda especfica de
cido nucleico (Amplicor HCV PCR, Roche Diagnostics System), ambos con
buena sensibilidad (68). Las pruebas de carga vrica miden la cantidad de virus
que circula por la sangre. La ms sensible es la del ARN del VHC mediante la
RCP, que puede detectar hasta 50 partculas (copias) de virus por cada mililitro
de sangre. Las nicas pruebas de carga vrica aprobadas por la FDA son
Amplicor y Amplicor Cobalt para el VHC, ambas de Roche (1).
b) La determinacin del genotipo/subtipo mediante tcnicas serolgicas o
moleculares. Las pruebas genotpicas se utilizan para determinar qu tipo de
VHC se tiene. Esta informacin es muy til en estudios de transmisin del VHC,
imprescindible para establecer tipo y tiempo del tratamiento antiviral y es el
primer paso en cualquier estudio de epidemiologa molecular (1, 12). Existen
diversas tcnicas para la determinacin del genotipo viral, unas basadas en la
amplificacin de secuencias (5'UTR, core, NS5b) con cebadores tipo-especficos,
o seguidas de hibridacin a sondas tipo-especficas, o de anlisis de restriccin
de producto amplificado; y otras basadas en la determinacin de anticuerpos
frentes a pptidos tipo- especficos (12, 26, 69, 70). Estas ltimas son sencillas y
en pacientes inmunocompetentes tienen buena concordancia con las tcnicas
moleculares, pero su uso est limitado en pacientes inmunodeprimidos y en el
anlisis de determinados genotipos. La determinacin del genotipo viral es
29

imprescindible para establecer la duracin del tratamiento antiviral y es el


primer paso en cualquier estudio de epidemiologa molecular (26). Para la
serotipificacin existe un ELISA de deteccin de anticuerpos especficos de la
Virus de la hepatitis C.
regin NS4 (70). Uno de los mtodos ms confiables, convenientes, especficos
y reproducibles es un RIBA "immunoblot" en tiras, de cinco canales con pptidos
serotipo-especficos inmovilizados de la regin no estructural NS4 y de las
regiones del ncleo de los tipos 1, 2 y 3 (69).
c) La determinacin de la complejidad de la cuasiespecie viral (26).
Otras pruebas tiles para integrar la presuncin diagnstica de la infeccin por
el VHC son las pruebas funcionales hepticas. Lo ms comn es medir la
aminotransferasa de alanina (ALT) y la aminotransferasa de aspartato (AST).
Muchas personas portadoras del VHC muestran elevaciones ligeras o
moderadas de estas enzimas, por lo que stas suelen ser los primeros
indicadores de la presencia del virus. Otras medidas son las de la fosfatasa
alcalina (ALK) y las de la gamma-glutamil-transferasa (GGT), los resultados
anormales pueden indicar cirrosis y bloqueo del tracto biliar, as como otras
anomalas.

Evolucin de los ensayos de deteccin del virus de la hepatitis C.


En 1989 la compaa norteamericana Chiron clon el genoma del VHC del
plasma de chimpancs infectados con agentes etiolgicos de la hepatitis no- A,
no-B, y obtuvieron por el mtodo de ADN recombinante en levadura una
protena (C100-3) codificada por la regin correspondiente a NS4 que contiene
la regin 5-1-1. Esta protena recombinante de 363 aminocidos, fusionada a
una molcula de superxido dismutasa (SOD), fue la base del primer sistema
diagnstico (EIA-1) (11). Estos sistemas de primera generacin mostraron baja
sensibilidad y especificidad, debido a la alta diversidad gentica de la secuencia
nucleotdica (11,13) y a que no detectaban anticuerpos en la etapa temprana
de la infeccin.
Esto motiv el desarrollo de sistemas diagnsticos de segunda generacin que
incorporaron, adems de la C100, una protena recombinante del ncleo del
virus (c22), ya que alrededor del 93-95% de las personas infectadas desarrollan
anticuerpos contra la protena del ncleo (anti-c22c), los que aparecen ms
temprano y continan presentes por ms tiempo (17), y otra de la regin no
estructural NS3 (c33c) ya que los anticuerpos anti-c33c aparecen primero y con
ms frecuencia que C100-3 (11,13). Se sustituy, adems, la SOD por la CKS

30

("citidin- monofosfato-2-ceto-3-desoxi-octanato-sintetasa"). Estos sistemas


incrementaron la sensibilidad de deteccin a 99% (11).
Actualmente existen ensayos de tercera generacin que detectan los
anticuerpos del ncleo y los antgenos de las regiones no estructurales NS3 y
NS5 (11,13). El siguiente esquema muestra la evolucin de los ensayos segn
Padrn y Morales, 1998 (figura 2).

Ensayos comerciales para el diagnstico de la hepatitis C.


Enzymun-Test Anti-HCV de Boehringer Mannheim Immunodiagnostics (ES
700/ES 607/ES 600/ES 300) (1994). Ensayo inmunoenzimtico para la
determinacin de anticuerpos contra protenas estructurales y no estructurales
del VHC. Es un ELISA tipo "sandwich" en dos pasos con tecnologa de
estreptavidina (71).
MONOLISAanti-HCV,tcnicainmunoenzimtica indirecta para la deteccin de
anticuerpos al virus de la hepatitis C. Utiliza una fase slida con antgenos
purificados: dos protenas recombinantes producidas por Escherichia coli, de
clones de la regin no estructural del virus (NS3 y NS4) y dos pptidos
codificados de la "capside" del genoma (9).
UBI HCV EIA 4.0, ensayo inmunoenzimtico cualitativo (EIA) para la deteccin in
vitro de anticuerpos contra el VHC en suero o plasma humano. Utiliza pptidos
sintticos altamente antignicos de las regiones estructural y no estructurales
(NS4 y NS5) (9).
Ensayo Quimioluminiscente, mtodo alternativo para la deteccin de
anticuerpos al VHC. Este ensayo tiene 100% de sensibilidad y 99.9% de
especificidad (9).

Genoma de VHC

31

AxSYM HCV, ensayo inmunoenzimtico de micropartculas (MEIA), para la


deteccin cualitativa de anticuerpos contra las protenas estructurales y no
estructurales del genoma de VHC, en suero o plasma humano. Utiliza las
protenas recombinantes c200 (de los aminocidos 1192-1931 de las regiones
NS3 y NS4, es quimrica de fusin con 154 aminocidos de la SOD), c22-3
(aminocidos 2-120, del "core", es una protena de fusin con 154 aminocidos
de la SOD), HC-34 (239 aminocidos de la protena CMP- KDO sintetizada en
Escherichia coli, 7 aminocidos de enlace y los aminocidos del 1-150 de "core")
y HC-31 (protena recombinante quimrica, de fusin con 239 aminocidos de la
CKS de Escherichia coli, 8 aminocidos de enlace, los aminocidos 1192-1457
de NS3, los aminocidos 1676-1931 de NS4 y 10 aminocidos de enlace
agregados en el grupo carboxilo terminal). Los coeficientes de variacin intra e
inter-ensayo son menores del 6%, la sensibilidad de 99.69% y la especificidad
de 99.69% (79).
ABBOTHCVEIA3.0,ensayoinmunoenzimtico, que utiliza los siguientes antgenos
recombinantes: HC- 34 (contiene secuencias de la protena estructural), HC- 43
(contiene secuencias de la protena estructural y de NS3), c100-3 (contiene
secuencias de NS3 y NS4) y NS5 (secuencias de NS5). Posee coeficientes de
variacin inter e intra-ensayo menores del 12.5% y una especificidad de 99.6%
(80).
RIBA 3.0, ensayo "Recombinant Immunoblot" de tercera generacin para la
deteccin de IgG, que en la fase slida utiliza antgenos recombinantes de la
regin estructural C22-3 (core) y de las regiones no estructurales NS4 (C100-3),
NS3 (C33C) y NS5 (66,81,82).
Murex anti-HCV (Versin III), ensayo inmunoenzimtico para la deteccin de
anticuerpos del VHC, en plasma o suero humano. Utiliza antgenos
recombinantes de la regin estructural ("core"), y de las no estructurales NS3,
NS4 y NS5. Su especificidad para muestras de donantes es 99.85% y en
muestras clnicas es 100% (83). (9)

32

Monolisa HCV Ag-Ab ultra es una prueba inmunoenzimatica cualitativa para poner de
manifiesto la infeccin por el VHC que se basa en la deteccin de los anticuerpos y del
antgeno de capsida asociados a una infeccin por el virus de la hepatitis C en el suero o en
el plasma humano.(9)

PRINCIPIO DE LA PRUEBA
La microplaca se sensibiliza mediante:
Un anticuerpo monoclonal dirigido contra la capsida de la hepatitis C.
2 protenas de recombinacin correspondiente a la regin NS3: genotipo 1 y 3a.
Una protena de recombinacin correspondiente a la regin NS4.
Un pptido mutado correspondiente a la regin capsida de la hepatitis C.
Los conjugados utiliados son:
Conjugado 1: Un Ac monoclonal murino biotinado dirigido contra la capside del VHC .
este

anticuerpo

monoclonal

no

reacciona contra el pptido mutado cpsida

utilizado en la fase slida.

Conjugado 2: es una mezcla de anticuerpos murinos anti-IgG humanos revelados de


manifiesta afinidad por la peroxidasa y de estretavidina revelada por la peroxidasa.

La realizacin de la prueba comprende las etapas de reaccin siguientes.


1. En los pocillos de microplaca se distribuyen el conjugado 1, las muestras que se
vayan a estudiar y los sueros de control. Si los anticuerpos anti- VHC estn
presentes, se unen a los antgenos fijados en la fase solida. Si los antgenos de la
capside de la hepatitis C estn presentes , se unirn con los anticuerpos
monoclonales de al fase solida y los anticuerpos monoclonales biotinados del
conjugado1.
2. Despus de una incubacin de 90 minutos a 37C y una etapa de lavado, el
conjugado 2, que contienen los anticuerpos anti-IgG humano afines a al peroxidasa y
a al estreptavidina revelada por la peroxidasa, se aade a cada pocillo de microplaca.
En el caso de la presencia de IgG humanoque reacciones con la fases slida, el
conjugado anti-IgG humano se unir anticuerpos humanos. El conjugado
peroxidasa/estreptavidina queda fijado a la biotina del conjugado 1 en el caso de que
exista presencia del antgeno de capsida del virus de la hepatitis C en la muestra.
3. Transcurridos 30 minutos de incubacin a 37C y eliminados los conjugados
enzimticos que no se hayan unido a causa del lavado, al presencia de complejos
antgeno-anticuerpo-peroxidasa se pone de manifiesto.
4.
Al cabo de 30 minutos de incubacin a temperatura ambiente del laboratorio y
cuando se interrumpe al reaccin, se efectua la lectura en el espectrofotmetro a
450/620-700 nm . La absorbancia medida por una muestra permite sacar
conclusiones respecto de la presencia o ausencia de3 anticuerpos anti-VHC y/o
33

antgeno de capsida de la hepatitis C en la muestra analizada. La intensidad de


coloracin es proporcional a la cantidad de anticuerpos anti-VHC y/o antigeno
cpsida de la hepatitis c que se haya unido en la fase slida.
5. El Monolisa anti- HVC detecta de promedio de 24 das antes la infeccin por VHC ,
esta ventaja se debe principalmente a la deteccin del antgeno de al capside del
VHC que se utiliza en el kit.
LIMITES D ELA PRUEBA
El motivo de la diversidad de respuesta inmunolgicas de pacientes afectados por la
hepatitis C (principalmente durante al seroconversin) , se puede n observar las
reaccin entre distintas pruebas en funcin de la naturaleza de las protenas
analizadas. Un resultado analtico negativo durante un diagnostico precoz no excluye
la posibilidad de exposicin o de una infeccin por el virus de la hepatitis C.
Cualquier tcnica de ELISA puede producir reacciones falsamente positivas. Se
aconseja ver la especificidad de la reaccin para cualquier muestra que de positivo
repetidas veces, segn la interpretacin del reactivos Monolisa HCV Ag-Ab Ultra ,
mediante un mtodo de confirmacin de un test ELISA de deteccin de los
anticuerpos anti-HCV solo, o me inmunoblot de deteccin de los anticuerpos antiHVC para probar la presencia de anticuerpos. Si e necesario, utilizar un test de
bsqueda del genoma viral del VHC o un test de confirmacin de los antgenos del
VHC seguido de neutralizacin.

1 GENERACION: c-100-3 PERIODO DE VENTANA: 150 DIAS

2 GENERACIN :NS-3 NS-4 PERIODO DE VENTANA: 82 DIAS

3 GENERACION NS 5 : 70 DIAS.

Resultados de ELISA dispares


La reactividad baja indicara una infeccin temprana o una tarda
resolvindose.
baja especificidad: falso positivo

Con respecto al NS5:


Curr Stud Hematol Blood Transf. Basel, Karger, 1998, No 62, pp 6475

34

En lo que se refiere a los ensayos de Screening , que en 1992, se notific de una


nueva generacin de ensayo denominado de tercera generacin y que fue introducido
por Ortho, Abbott and Sanofi Diagnostics Pasteur . Estos ensayos fueron llamados
Sistema de ensayo ELISA Ortho anti HCV 3.0, Abbott HCV EIA 3rd generation and
Monolisa anti-HCV new antigens , respectivamente, En comparacin con los ensayos de
segunda generacin the main improvement fue la reactividad incrementada del
antgeno NS3. En adicin, el antgeno de la regin NS5 fueron incluidos en
los ensayos de Ortho y Abbot

El agregado del NS5 no define que el kit sea de 3ra generacin, como
podemos apreciar sanofi no lo tiene en el documento y es considerado
de tercera generacin. Adicionalmente, lo nico que ha aportado el NS5
es incrementar la tasa de falsos positivos con el consiguiente sobrecosto
para los laboratorios, pero en los bancos de sangre si importara que esta
sensibilidad sea incrementada, no as en el caso del diagnostico.:
La especificidad de los ensayos de tercera generacin fueron tambin improved
by a decrease por un decremento de falsos positivos del core y del NS4
reactions. SDin embargo, la reactividad de falsos positivos con ensayos
escrening y confirmatorios aun remain y la adicion del antgeno NS5 ha
resultado en un nueva variedad de sueros falso positivos.
Specificity of the third-generation assays was also improved by a decrease of
false-positive core and NS4 reactions. However false-positive reactivities with
screening and confirmatory assays still remain and the addition of the NS5
antigen has resulted in a new variety of false-positive sera.

Adicionalmente, en el inserto del reactivo Roche observamos lo


siguiente:
35

Inserto de reactivo de Abbott (Axsym) para USA:

http://www.abbottdiagnostics.com/webapp/index.cfm?
event=getPDF&controlNumber=345497R8

En su ms reciente tecnologa (Architect) no consideran el NS5 a nivel


mundial

Reactividad que persiste de muestra a muestra


Se debe a la presencia de Acs, no especficos para el agente infeccioso pero
especficos para componentes del ensayo.
Los diluyentes, buffers, etc usan albmina animal o productos sricos. Los Acs
microbianos tambin son comunes y pueden reaccionar con las protenas de los
vectores recombinantes.

VENTANA SEROLGICA PARA INFECCIN DE HIV, HBV Y HCV


Riesgo: 1:103.000 por unidad transfunida

36

Ref. Schreiber GB et al. N Engl J Med, 1996;334: 1685 (4 en 3)

CARACTERSITICAS DE Los ELISA


No distingue entre infeccin aguda, crnica o resuelta
No mide la presencia de virus circulante
En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta
95% en poblacin de riesgo
P y PPV VALORES DE RP ALTOS CON VPP > 95%

ENSAYO

FABRICANTE

RP

ORTHO 3.0 ELISA

Ortho

3.8

ABBOTT HCV ELISA 2.0 Abbott

3.8

VITROS ANTI HCV CLIA Ortho

8.0

ARCHITECT HCV CLIA

Abbott

5.0

ADIVIA CENTAUR HCV

Siemmens

11.0

OMS

Para minimizar el riesgo de transmisin de HCV por transfusin:


Una prueba de tamizaje altamente sensible y especfica para HCV o una
combinacin Ag -Ac (ELISA/CLIA). El ensayo debe ser capaz de detectar genotipos
especficos del pas o regin
Un ensayo de tamizaje rpido altamente sensible y especfico en laboratorios de baja
cantidad de muestras en reas remotas o en situaciones de emergencia.

SIFILIS:
TREPONEMA PALLIDUM (SFILIS)
37

La Sfilis, llamada tambin chancro duro, enfermedad de Lues, es una infeccin producida
por Treponema pallidum sub especie pallidum, bacteria en forma espirilada, ampliamente
distribuida en el mundo. En los Estados Unidos, en el ao 2002, se registraron 32,000 casos
de sfilis, de los cuales 6,862 eran casos de sfilis primaria y secundaria, asimismo, se
reportaron 412 casos de sfilis congnita ( fuente
), El PRONAHEBAS, para el ao
2005 reporto reactividad en 1.30 %
El hombre es el nico husped para esta bacteria la cual produce lesiones ulcerativas
indoloras de evolucin crnica, la infeccin suele presentarse en 3 fases definidas: primaria,
secundaria y terciaria, sin embargo puede aparecer un periodo de latencia (sfilis latente)
pudiendo sta ser temprana o tarda dependiendo del tiempo en que aparecen las lesiones.
La principal va de transmisin de esta enfermedad es la sexual, puede haber otras formas de
transmisin: madre - nio, transfusin sangunea, manipulacin de lesiones sifilticas y todo
tipo de muestras biolgicas de pacientes sifilticos.
El tamizaje para sfilis se realiza mediante pruebas serolgicas, utilizndose antgenos no
treponmicos (RPR, USR).
Las pruebas de ELISA son pruebas treponmicas utilizadas en Centros de Hemoterapia y
Bancos de sangre donde existe gran demanda de muestras por da, por lo que estas pruebas
son procesadas por equipos automatizados
SIFILIS

SIFILIS

ELISA- recombinante v.4.0

ELISA anticuerpos totales

MARCA WIENER

MARCA FORESIGHT

METODO:

METODO: Inmunoensayo enzimtico


(EIA) para la deteccin cualitativa de
Ensayo inmunoenzimtico (ELISA) para anticuerpos totales (IgG, IgA e IgM) contra
la deteccin de anticuerpos anti- Treponema Pallidum (TP) en suero o
Treponema pallidum
plasma humano
FUNDAMENTO DEL METODO:

PRINCIPIO:

Los pocillos de la policubeta estn


recubiertos con antgenos recombinantes de
la bacteria Treponema pallidum (p15, p17 y
p47). La muestra diluida se incuba en los
pocillos. Si los anticuerpos contra la bacteria
estn presentes en la muestra, stos se unen a

La prueba ELISA de Sfilis de Anticuerpos


Totales es un inmunoensayo enzimtico
cualitativo de fase slida basado en el
principio sndwich para la deteccin de
anticuerpos totales (IgG, IgM, IgA) a
Treponema Pallidum en suero o plasma
humano. Los micro pozos de la placa vienen

38

los antgenos del pocillo. El material no


unido es removido por lavado. En el paso
siguiente se agrega el conjugado, que
consiste en un anticuerpo monoclonal antiIgG humana conjugado con peroxidasa. Este
se une a los complejos antgeno-anticuerpo,
formados previamente. El conjugado no
unido
se
remueve
por
lavado.
Posteriormente, se agrega una solucin
conteniendo tetrametilbencidina y perxido
de hidrgeno. Las muestras reactivas
desarrollan color celeste que vira al amarillo
cuando se detiene la reaccin con cido
sulfrico.

recubiertos de antigenos recombinantes de T.


Pallidum. Para efectuar la prueba se agrega
el espcimen y los antigenos T. Pallidum
conjugados a enzima a los micro pozos
recubiertos de antigenos y se incuban en
seguida. Si el espcimen contiene
anticuerpos TP estos se acoplan a los
antigenos recubiertos en la placa de micro
pozos y simultneamente al conjugado
formando complejos inmovilizados de
antgeno TP - conjugado. En ausencia de los
anticuerpos TP estos complejos no se
forman. Despus de la incubacin inicial se
procede con un lavado de la placa de micro
pozos para efectos de remover cualquier
material no acoplado. Terminada la
incubacin inicial se agregan el Substrato A
y el Substrato B y se incuban se formar un
color azul indicando la cantidad de
anticuerpos T. Pallidum presentes en la
muestra. Finalmente se agrega una solucin
de acido sulfrico a los micro pozos para
detener la reaccin lo que hace virar el color
de azul a amarillo. La intensidad del color
amarillo que va en funcin de la cantidad de
anticuerpos T. Pallidum presente en la
muestra se mide por medio de un lector
ELISA de micro placas a 450 / 630-700 nm
450 nm.

MUESTRA: Suero o plasma. Para las


muestras de plasma se puede emplear
heparina,
citrato
o
EDTA
como
anticoagulante.

MUESTRA : Suero o plasma .Pueden usarse


los tubos de recoleccin con EDTA, heparina
sdica y ACD . El preservante azido de sodio
causa resultados errneos ya que desactiva a
la peroxidasa de rbano

ESPECIFICIDAD : 99.4%

ESPECIFICIDAD: 99.9%

SENSIBILIDAD

SENSIBILIDAD : 99.9%

39

PRESENTACIN: Kit de Elisa de doble antgeno sndwich para la deteccin de


anticuerpos totales (IgG+IgM) para el Treponema pallidium en suero o plasma, en pozos
fraccionables con cdigo de color; con reactivos lquidos y listo para su uso, con sistema de
verificacin de adicin de muestra por el cambio de color del diluyente; en cantidad
suficiente para el procesamiento; en empaque de 96 o ms pruebas.
MTODO:
Enzimoinmunoensayo
(ELISA),
inmunoensayo
Fluorescente,
inmunoquimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, tipo sndwich de doble
antgeno, para la deteccin de anticuerpos totales (IgG+IgM) para el T. pallidium (Sfilis) en
la muestra, con antgenos recombinantes en E. coli, tipo p15 y p17 impregnados en los
pozos y como reactivo conjugado listo par su uso.
Sensibilidad: 100% y Especificidad: 100%

ESPECIFICACIONES TECNICAS Y CONDICIONES DE CALIDAD


Denominacin: ANTICUERPO ANTI-TRYPANOSOMA CRUZI (CHAGAS) ELISA
PRESENTACIN: Kit de Elisa indirecto para la deteccin de anticuerpos totales (IgG+IgM)
para el Tripanosoma cruzi en suero o plasma, en pozos fraccionables, con reactivos lquidos,
en cantidad suficiente para el procesamiento; en empaque de 96 o ms pruebas.
MTODO:
Enzimoinmunoensayo
(ELISA),
inmunoensayo
Fluorescente,
inmunoquimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, tipo indirecto, para la deteccin
de anticuerpos para el Trypanosomacruzi, con antgenos recombinantes TcF impregnados en
los pozos y como conjugado una anti-IgG y anti-IgM de suero de conejo.
MUESTRA BIOLGICA: Suero o plasma
Sensibilidad: 100% y Especificidad: >99.4%

40

PRESENTACION: Microplacas recubiertas con Antigenos Recombinantes de Treponema


Pallidum
de
96
pocillos
c/una.
METODOLOGIA: Micro ELISA que detecta anticuerpos totales (IgG + IgM) con
microplaca recubierta de antgenos recombinantes de Treponema Pallidum (p15, p17, p47).
Sensibilidad no menor de 99% y especificidad no menor al 99.5%. Protocolos deben ser
validados
para
autoanalizadores
automticos.
ACCESORIOS: Equipo Analizador automatizado de Inmunoensayos en microplaca segn
cuadro de listado de equipos. Reactivos, complementos en cantidad suficiente para la
realizacin completa de la prueba y sus controles. Incluir 10% de pruebas adicionales para
los controles, asimismo suero control de 2da opinin (marca diferente) en volumen
suficiente para procesar 01 control por placa; o control de calidad externo (de 03 a 04 por
ao).
MUESTRA
BIOLOGICA:
Suero

Plasma.
REQUERIMIENTO : 1 EQUIPO N 29
PRESENTACION: Microplacas recubiertas con Antigenos Recombinantes de Trypanosoma
Cruzi
de
96
pocillos
cada
una.
METODOLOGIA: Micro ELISA tipo sandwich con antigeno recombinante para detectar 4
epitopes como mnimo del Trypanosoma cruzi, deteccin de anticuerpo Total (IgG + IgM).
Sensibilidad 100% y especificidad no menor al 99.5%. El reactivo debe adjuntar gua de
resolucin de problemas. Protocolos deben ser validados para autoanalizadores automticos.
ACCESORIOS: Equipo Analizador de Inmunoensayos en Microplaca segn cuadro de
listado de equipos. Reactivos, complementos en cantidad suficiente para la realizacin
completa de la prueba y sus controles. Incluir 10% de pruebas adicionales para los
controles, asimismo suero control de 2da opinin (marca diferente) en volumen suficiente
para procesar 01 control por placa; o control de calidad externo (de 03 a 04 por ao).
MUESTRA
BIOLOGICA:
Suero

Plasma.
REQUERIMIENTO : 1 EQUIPO N 29

Tcnica ELISA
Es una de las pruebas serolgicas ms utilizadas en el tamizaje de las unidades de
sangre en los Centros de Hemoterapia y Bancos de Sangre.
ELISA (EnzymeLinkedInmunoSorbentAssay) es una tcnica sensible que nos permite
detectar antgenos o anticuerpos en fluidos biolgicos. Este inmunoensayo involucra la
fijacin de antgeno o anticuerpos sobre una fase slida.
En ambos casos se formar el complejo antgenoanticuerpo, el cual ser unido por una antiinmunoglobulina marcada inmunoenzimaticamente.
Las enzimas son fosfatasa alcalina o peroxidasa, estas enzimas son capaces de modificar un
sustrato en presencia de un cromgeno (componente productor de color) produciendo un
41

producto coloreado que puede ser medido utilizando un espectrofotmetro (lector de


ELISA), es directamente o inversamente proporcional a la concentracin del antgeno o
anticuerpo presente en la muestra, dependiendo del tipo de ELISA..
Una reaccin tpica enzima-sustrato puede ser la siguiente:
H2O2

(sustrato)

OPD/TMB
(cromgeno)
O-

(radical)

Peroxidasa de rbano

(enzima)
OPD/TMB

H2O+

O-

(agua) (radical)
Producto coloreado

(cromgeno oxidante)

El exceso de reactantes en cada paso es eliminado con los sucesivos lavados.


El producto coloreado detectado por el espectrofotmetro debe ser medido en una especfica
longitud de onda lumnica en la que el color absorbe la luz incidente. Esto resulta en una
seal que con el instrumento se convierte usualmente en unidades de densidad ptica (DO).
Existen una variedad de pruebas ELISA, las ms utilizadas son:
ELISA Directo
Esta prueba es generalmente de tipo sndwich, con revelado enzimtico, utilizando un
anticuerpo monoclonal ligado a una fase slida (pocillo, esfera plstica) el cual capta al
antgeno presente en el suero. A continuacin se agrega un anticuerpo policlonal marcado
con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina) y se promueve el desarrollo de color tras la
adicin de substrato cromognico.
ELISA Indirecto
Se basa en la fijacin de un antgeno en la fase slida, el cual atrapa los anticuerpos de la
muestra que posteriormente son identificados con un anticuerpo anti Inmunoglobulina
humana especfico marcado con una enzima. En estos casos la cantidad de Anticuerpo es
directamente proporcional a la cantidad de producto enzimtico formado, por lo cual se
produce ms color a medida que la concentracin de anticuerpos aumenta en la muestra
dando lecturas de DO altas, y viceversa.

ELISA Competitivo: Se basa en la competencia que se establece entre el anticuerpo de la


muestra y el conjugado (que es un anticuerpo dirigido contra el antgeno) para ocupar sitios
reactivos en el antgeno fijado. En este ELISA de tipo competitivo tanto la muestra que
contiene el anticuerpo como el conjugado se agregan al mismo tiempo. Si la concentracin
de anticuerpos en la muestra es alta muy poco conjugado puede fijarse en los antgenos
inmovilizados, por lo tanto habr ausencia de coloracin por la poca fijacin de la enzima
42

con el sustrato. Inversamente con muestras que contienen poco o nada de anticuerpos, ms
conjugado se fijar al antgeno y la posterior adicin de sustrato producir la presencia de
color.
En estos casos la cantidad de anticuerpos en la muestra es inversamente proporcional a la
cantidad de producto enzimtico formado (producto coloreado).
ELISA de Captura de Anfgeno

La prueba ELISA de captura puede ser de tipo indirecto o competitivo y solo difiere en la
etapa inicial de fijacin del antgeno en la fase slida. Un anticuerpo monoclonal (anticuerpo
muy especfico dirigido slo a un determinante antignico) es fijado al soporte slido para
capturar a un antgeno especfico. Esto tiende a disminuir la cantidad de sustancias
contaminantes adheridas al soporte slido resultando una menor fijacin no especfica. Estas
pruebas son consideradas ms especficas que las pruebas indirectas que incorporan
protenas totales del microorganismo.
Aunque las pruebas de ELISA utilizadas para detectar los anticuerpos son sumamente
sensibles, especficas y reproducibles, ninguna es infalible; por lo tanto se requiere que las
pruebas de tamizaje tengan una sensibilidad 100 % y no menor de 98% de especificidad.
Consideraciones generales previas al desarrollo de la Tcnica
a) Toda muestra de sangre debe ser considerada como material potencialmente infeccioso
y seguir las medidas de bioseguridad establecidas en el Manual de Bioseguridad
vigente.
b) Las muestras a procesar no deben presentar hemlisis ni turbidez. Deben estar
rotuladas con el cdigo y fecha de obtencin de muestra y ser conservadas en
refrigeracin (4C), hasta su procesamiento.
c) Utilizar kits con fecha de vencimiento vigente. No mezclar reactivos procedentes de
diferentes lotes.
d) Conservar los kits a temperaturas especificadas por el fabricante.

e) Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiental (18-25C) antes de
empezar el ensayo.
f) Mezclar suavemente los reactivos lquidos antes de su uso.
g) Diluir la solucin de lavado concentrada segn lo indicado por el fabricante,
empleando agua destilada. Rotular el frasco con fecha de preparacin y el kit al que
43

pertenece. Debido a su alta concentracin en algunos kits, pueden formar cristales


por lo cual se debe homogenizar previamente a la dilucin. El remanente de la
solucin diluida debe conservarse segn las indicaciones del fabricante,
h) Seguir estrictamente las instrucciones proporcionadas por el fabricante y descritas en
el inserto del kit tanto para el procesamiento de las muestras como para analizar la
validez. Incluir todos los sueros controles positivos, negativos, pocillo blanco
indicados en el inserto.
i) La validez del ensayo debe de hacerse de acuerdo a las indicaciones del kit ms el
suero control de calidad interno.
j) Calcular el valor de corte y la zona indeterminada segn indicaciones del kit. Todo kit
debe indicar la zona gris o indeterminada
k) Utilice protocolos de trabajo de acuerdo a la tcnica a utilizar (ver Anexo F y G)
l) Emplear equipos e instrumentos en buenas condiciones de operatividad con
mantenimiento preventivo y calibrado (incubadora, potencimetro, lector ELISA,
lavador de placas, micropipetas, termmetro ambiental).
m)Seguir los instructivos de uso de cada equipo, chequear los filtros del lector ELISA
antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de tiempo de uso.
n) Preparar los protocolos de trabajo o mapas de distribucin de muestras que sern
procesadas.
o) Realizar y registrar el control diario de la temperatura ambiental del laboratorio y de
los siguientes equipos: Refrigerador donde se conservan los kits, incubadora
empleada para los pasos de incubacin 37 C y congeladora donde se conservan los
sueros controles y otros reactivos.
p) Utilizar agua destilada o desionizada, de alta calidad.
Procedimiento de la Tcnica de ELISA
a) Determinar el nmero total de pocillos teniendo en cuenta todos los controles que
indica el inserto del kit y control de calidad interna. Retire las tiras necesarias.
b) Dispensar los microlitros indicados (segn el inserto) de sueros controles positivos y
negativos, sueros problema y sueros control interno en los respectivos micropocillos,
mezclar suavemente.

44

c) Incubar a la temperatura indicada por el tiempo necesario, generalmente en esta etapa


se cubren los micropocillos con papel adhesivo que acompaa al kit, para evitar su
evaporacin.
d) Retirar el material adhesivo y proceder con los ciclos de lavado teniendo en cuenta el
volumen dispensado y el tiempo de remojo indicados en el instructivo. Despus del
ltimo lavado secar la microplaca sobre un papel absorbente dndole pequeos golpes
para remover cualquier exceso de lquido de los pocillos.
e) Colocar la cantidad necesaria de conjugado en cada pocillo, la dilucin del conjugado
debe realizarse durante el ltimo ciclo de lavado.
f) Cubrir la placa con el papel adhesivo e incubar a la temperatura indicada por el
tiempo necesario.
g) Retirar el material adhesivo y proceder con los ciclos de lavado de acuerdo al paso 4.
h) Durante el lavado prepare el volumen requerido de la solucin substrato-cromgeno,
la cual debe estar a temperatura ambiente y debe ser incolora, si se observa alguna
coloracin descartar la solucin.
i) Colocar la cantidad necesaria de substrato en cada pocillo e incubar en oscuridad a
temperatura ambiente por el tiempo indicado.
j) Detener la reaccin agregando la cantidad indicada de solucin de parada en la misma
secuencia que se agreg el substrato.
k) Leer la absorbancia de los pocillos en un lector de ELISA teniendo en cuenta los
filtros indicados. Es recomendable una lectura bicromtica teniendo como filtro de
referencia 620-630 nm. l Leer la microplaca en el tiempo indicado por el inserto.
l) Evaluar la prueba teniendo en cuenta los criterios de validacin que se indican en el
instructivo del kit y suero control interno. Si la prueba es vlida calcular el valor de
corte e interpretar los resultados.
m)Las muestras con resultados no reactivos se informan como tales.
n) Las unidades de sangre cuyas muestras tienen resultados reactivos debern
eliminadas.

ser

o) Los donantes cuyos resultados son reactivos deben ser remitidos a la unidad de
epidemiologa.

INTERPRETACIN DE RESULTADOS

45

REACTIVO

: Se detecta la presencia de antgeno y/o anticuerpo del agente

etiolgico correspondiente.
NO REACTIVO

: No se detecta la presencia de antgenos y/o anticuerpos del agente

etiolgico correspondiente.
ZONA GRIS : Valores comprendidos inmediatamente por debajo del valor de corte
de la prueba de acuerdo a lo indicado en el inserto.
Observacin: En la tcnica ELISA competitiva inversa los resultados NO REACTIVO son
mayores al cut-off, y las lecturas menores que el cut-off son REACTIVO.

TRYPANOSOMA CRUZI (ENFERMEDAD DE CHAGAS)


La enfermedad de Chagas, es causada por un parsito flagelado el Trypanosoma cruzi. El
mecanismo natural de transmisin al ser humano, es mediante un insecto que funciona como
vector, situacin que se observa en el 80% de los casos de enfermedad. La transmisin por
transfusin ocurre en el 16% de los casos; mientras que la va congnita que ocurre hasta en
el 10% de las madres afectadas y en proporcin menor al 1% de los casos se dan por
transplante de rgano de un sujeto portador proveniente del area endmica o la transmisin
accidental en laboratorios por la ingesta oral de tripomastigotes metacclicos.
La etapa crnica del paciente con enfermedad de Chagas dura el resto de la vida.
Aproximadamente el 65 80 % de los sujetos expuestos se comportar aparentemente sano
y son potenciales transmisores de la parasitosis mediante la transfusin.
El sujeto chagsico crnico asintomtico funciona como vector, que migra desde las zonas
endmicas hacia las reas urbanas, es requerido para donar sangre y es ah donde puede ser
detectado. El paciente receptor de la transfusin que recibe la sangre no tiene ningn patrn
epidemiolgico especial salvo el haber recibido sangre de un sujeto infectado con el
flagelado
La Organizanizacin Panamericana de la Salud, defina al caso con infeccin por T. cruzi,
sea mediante la positividad con dos pruebas serolgicas con distinto principio
(hemaglutinacin indirecta, ELISA, fijacin de complemento
inmunofluorescencia
indirecta, entre otras).
El ensayo Inmunoenzimtico ELISA, es la tcnica de eleccin para realizar el tamizaje de la
infeccin, por presentar la mayor sensibilidad y tener la capacidad de detectar anticuerpo

46

anti - Trypanosoma cruzi despus de los 20 das de ocurrida la infeccin. As mismo puede
evaluar mayor nmero de sueros por corrida.
La sensibilidad y especificidad de la tcnica est en funcin de la calidad del antgeno, los
extractos antignicos totales del parsito muestran una alta sensibilidad; y los recombinantes
y pptidos sintticos, buena especificidad.
Se estima que en el Per existen 24,170 infectados por Tripanosoma cruzi, de los cuales
1,209 corresponden a formas agudas u oligosintomticas y 22,962 a formas crnicas de la
enfermedad. La infeccin por sexo es equitativa y el grupo de edad ms afectado est entre
los 20 a 50 aos. (MINSA/OGE-1998). La seroprevalencia de la infeccin en reas de riesgo
oscila entre 1,3% y 12%, en donantes de sangre a nivel nacional entre 0.14% y 0.5%. En
el 2005 el porcentaje de unidades que resultaron reactivas en el tamizaje para Chagas
alcanz el 0.57%. (PRONAHEBAS).
ENFERMEDAD DE CHAGAS Y TRANSFUSIN
La transfusin constituye la segunda causa ms frecuente de transmisin de la enfermedad
despus de la transmisin vectorial. La capacidad de infeccin a travs de la sangre y
componentes depende de varios factores: tipo y cantidad del componente transfundido, de la
cepa del propio parsito, de la presencia de parasitemia en el momento de la donacin, del
estado inmune del receptor, y de la realizacin o no, de las pruebas de cribado. Existe la
posibilidad, de que casos de Chagas postransfusionales no sean diagnosticados.

MICROELISA CHAGAS
La enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, se estima afecta en la actualidad
cerca de 8 a 10 millones de personas, siendo uno de los principales problemas de salud
pblica que confrontan los pobladores de pases latinoamericanos (OMS/TDR, 2007). En
general, el diagnstico para la deteccin de la dolencia se basa en el anlisis de variables
diversas, entre las cuales destacan la presuncin clnica, los datos epidemiolgicos y los
resultados de laboratorio, incluyendo pruebas parasitolgicas, serolgicas, bioqumicas
y/o moleculares (Lpez et al., 2000). En relacin con el diagnstico serolgico existe
consenso en recomendar, al menos, dos tcnicas con la finalidad de tener un alto grado
de confiabilidad en el despistaje de la dolencia, sugirindose una tercera prueba
confirmatoria en caso de conflicto de diagnstico entre ellas (OMS, 2002). Las tcnicas
mas comnmente utilizadas incluyen, entre otros, procesos de hemaglutinacion (HAI),
fluorescencia (IFI), Aglutinacin (TAD) y ensayos inmunoenzimticos (ELISA).
Aunado a stos, recientemente se han desarrollado poderosas herramientas
moleculares como la prueba de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) y otras
metodologas serolgicas (TESA- blot), las cuales han contribuido a la obtencin de un

47

despistaje ms certero de la enfermedad de Chagas En Venezuela, el sero-diagnstico de la enfermedad de


Chagas es comnmente realizado en centros pblicos y privados utilizndose principalmente pruebas
expendidas comercialmente por varios laboratorios nacionales y extranjeros, la mayora de los cuales estn
basados en ensayos inmunoenzimticos cualitativos (Vielma, 2005). En este respecto, algunos investigadores
han informado sobre resultados inconsistentes registrados en pacientes diagnosticados en estos centros, cuando
se comparan con los obtenidos en laboratorios especializados en el estudio de la enfermedad de Chagas (DazBello et al., 2008). Esta informacin parece corroborarse en nuestro laboratorio donde se ha detectado que
diagnsticos provenientes de laboratorios privados, arrojan falsos positivos cuando se cotejan con pruebas
especficas. (12)
En el presente estudio se evalan simultneamente mtodos serolgicos usados de forma rutinaria en el
despistaje de la enfermedad de Chagas en Venezuela, con la finalidad de detectar tcnicas confiables para el
diagnstico preciso en muestras de pacientes de reas endmicas las cuales, a su vez, resulten de utilidad
general y corrijan la inconsistencia diagnstica registrada en algunos centros.
Se utiizaron tcnicas de diagnostico Los mtodos serolgicos convencionales
utilizados para detectar anticuerpos circulantes anti-T. cruzi incluyeron las pruebas de aglutinacin directa
(TAD), inmunofluorescencia indirecta (IFI) y el ensayo inmunoenzimtico (ELISA), siguiendo procedimientos
previamente publicados (Vattuone & Yanovsky, 1971;
Camargo, 1966; Voller et al., 1975). Las condiciones y procedimientos de estos mtodos han sido indicados en
previas publicaciones (Aez et al., 1999a,b; 2001). Las pruebas serolgicas denominadas comerciales
incluyeron los tests inmunoenzimticos Pharmatest (Laboratorios Pharmatest, Miranda-Venezuela);
Chagatest ELISA (Laboratorios Wiener, Rosario- Argentina); Chagatest ELISA Recombinante V.3.0
(Laboratorios Wiener, Rosario-Argentina); Test ELISA para Chagas III (Laboratorios BiosChile, SantiagoChile); y el ensayo inmunocromatogrfico comercial Chagas stat-pak assay (Laboratorios Chembio, New
York-USA). Cada prueba fue ejecutada e interpretada segn indicaciones del fabricante
La evaluacin comparativa de la sensibilidad
detectada entre los diferentes mtodos serolgicos convencionales ensayados en el presente trabajo, revel
valores de 77% para la prueba TAD y 100% para las pruebas IFI y ELISA y sobre el 85% en los restantes tests
comerciales utilizados. La comparacin estadstica de la sensibilidad entre los mtodos ensayados no arroj
diferencias significativas (P>0.05). En relacin con la variable especificidad, valores similares fueron
detectados en los diferentes mtodos comparados con un rango que oscil entre 68% para Chagatest ELISA y
86% para TAD. Similar a lo observado en la variable sensibilidad, los valores de especificidad tampoco

48

arrojaron diferencias estadsticamente significativas entre las pruebas (P>0.05). Detalles particulares sobre
cada mtodo se muestran en la Tabla III.

La estimacin de los valores predictivos positivos (VPP) permiti, en general, detectar cifras superiores al 85%
en la mayora de los mtodos serolgicos, lo cual sugiere que las pruebas utilizadas tienen estadsticamente alta
probabilidad de detectar las muestras seropositivas. Esta similitud se mantiene cuando se comparan los valores
de razn de verosimilitud positiva (RVP), es decir, cuantas veces ms probable es la deteccin de un
seropositivo. En este caso los mayores valores obtenidos oscilaron entre 4,40 (IFI, ELISA) y 5,64 (TAD),
resultando el mtodo menos confiable el Chagatest ELISA el cual arrojo un valor de RVP de 2,77.Detalles
sobre la comparacin estadstica de variables entre los mtodos
son presentados en la Tabla III.

Relacin costo-beneficio de las tcnicas serolgicas


evaluadas

Siguiendo parmetros similares a los


sealados por Bulcao & Yasuda (2003) en el presente trabajo se detect que los menores requerimientos en
equipo, recurso humano especializado e infraestructura fueron precisados para la prueba de TAD y el kit de
diagnstico inmunocromatogrfico comercial Chagas Stat Pak Assay. En relacin con el tiempo de
ejecucin, los mtodos ms rpidos fueron el kit inmunocromatogrfico (Chagas Stat Pak Assay) e
inmunoenzimticos comerciales con un rango de 15 minutos a 2 horas, mientras que los ms consumidores de
tiempo fueron las tcnicas serolgicas convencionales (TAD, IFI y ELISA). Al considerar el costo por prueba,
los mtodos ms costosos resultaron los kits de diagnstico serolgico comerciales Chagatest ELISA
Recombinante V.3.0 y Chagas Stat Pak Assay, con estimados entre Bs.F. 38,5 (USA $ 17,90) y Bs.F. 40
(USA $ 18,6) por muestra respectivamente. Las pruebas ms econmicas fueron las tcnicas serolgicas
convencionales (TAD, IFI, ELISA) y los kits de diagnstico serolgico comerciales Pharmatest, Chagatest
ELISA y Test ELISA para Chagas III. Los costos incluyeron estimaciones de gastos operativos, equipos y
reactivos para finales del ao 2009. Detalles sobre la relacin costo-beneficio se muestran en la Tabla IV.

49

Prdida de reactividad en pruebas diagnsticas

El efecto de sucesivos cambios de temperatura


en el tiempo sobre los resultados obtenidos con un kit serolgico comercial (Test ELISA para Chagas IIIBiosChile) fue evaluado en 99 muestras de sueros de individuos previamente diagnosticados por otros mtodos
como seropositivos o seronegativos a T. cruzi. Los resultados revelaron que los rangos de densidades pticas
entre muestras de pacientes seropositivos o seronegativos a T. cruzi, fueron disminuyendo progresivamente en
el tiempo. Este hecho revel el acercamiento de los valores de seropositivos y los seronegativos,
incrementando el nmero de muestras con un resultado impreciso, determinado por valores cercanos al 10%
del punto de corte recomendado, segn especificaciones de los fabricantes del test. Detalles sobre el resultado
comparativo en el tiempo se muestran en la Fig. 1, en la cual se nota que la reactividad del antgeno se
mantiene por alrededor de 30 das cuando se somete a cambios de temperatura entre 8C y 22C.

DISCUSION

En el presente trabajo todos los mtodos seleccionados para la deteccin de seropositividad a T. cruzi en
muestras de pacientes escogidos aleatoriamente fueron capaces de detectar tal condicin, cumpliendo con los
requisitos aqu establecidos. Este propsito se refleja en el anlisis de los resultados obtenidos, el cual revel
valores de sensibilidad y especificidad
Tabla III. Evaluacin estadstica comparativa de pruebas serolgicas empleadas en el despistaje de la
enfermedad de Chagas en el occidente de Venezuela.

50

Relacin costo-beneficio de las tcnicas serolgicas


evaluadas
Siguiendo parmetros similares a los sealados por Bulcao & Yasuda (2003) en el
presente trabajo se detect que los menores requerimientos en equipo, recurso humano
especializado e infraestructura fueron precisados para la prueba de TAD y el kit de
diagnstico inmunocromatogrfico comercial Chagas Stat Pak Assay. En relacin con
el tiempo de ejecucin, los mtodos ms rpidos fueron el kit inmunocromatogrfico
51

(Chagas Stat Pak Assay) e inmunoenzimticos comerciales con un rango de 15


minutos a 2 horas, mientras que los ms consumidores de tiempo fueron las tcnicas
serolgicas convencionales (TAD, IFI y ELISA). Al considerar el costo por prueba, los
mtodos ms costosos resultaron los kits de diagnstico serolgico comerciales
Chagatest ELISA Recombinante V.3.0 y Chagas Stat Pak Assay, con estimados entre
Bs.F. 38,5 (USA $ 17,90) y Bs.F. 40 (USA $ 18,6) por muestra respectivamente. Las
pruebas ms econmicas fueron las tcnicas serolgicas convencionales (TAD, IFI,
ELISA) y los kits de diagnstico serolgico comerciales Pharmatest, Chagatest
ELISA y Test ELISA para Chagas III. Los costos incluyeron estimaciones de gastos
operativos, equipos y reactivos para finales del ao 2009. Detalles sobre la relacin
costo-beneficio se muestran en la Tabla IV.
DISCUSION

En el presente trabajo todos los mtodos


seleccionados para la deteccin de seropositividad a T. cruzi en muestras de pacientes
escogidos aleatoriamente fueron capaces de detectar tal condicin, cumpliendo con los
requisitos aqu establecidos. Este propsito se refleja en el anlisis de los resultados
obtenidos, el cual revel valores de sensibilidad y especificidad.
cercanas al 100% en casi todas las tcnicas evaluadas.
Asimismo, el anlisis estadstico comparativo no revel diferencias significativas entre
ellas, lo cual pareciera indicar que cualquiera de las tcnicas podran ser de utilidad
para llevar a cabo el diagnstico serolgico en individuos sospechosos de padecer
infeccin por T. cruzi. Por otra parte, este hecho pareciera simplificar la escogencia
para implementar la ejecucin de ms de un mtodo para realizar un diagnstico
serolgico de certeza en la enfermedad de Chagas. En este caso, la primera prueba a
ser implementada, la cual puede considerarse como prueba de rutina, debera
caracterizarse por poseer alta sensibilidad permitiendo detectar los casos sospechosos
de infeccin. Esta propuesta coincide con una similar de previos autores (Enciso et al.,
2004., Avila et al., 1993) y corrobora la opinin de otros quienes sostienen que la misma
podra resultar particularmente importante en bancos de sangre, evitando
transmisiones de T. cruzi por la va transfusional (Krauts et al., 1995., Affrachino et al.,
1989). La segunda prueba a ser implementada o prueba confirmatoria debera
garantizar una alta especificidad, permitiendo discriminar entre reacciones cruzadas
ocurridas con otras infecciones, evitando as alarmas innecesarias a causa de un falso
resultado positivo. Si existiera discordancia entre ambas pruebas, debera ejecutarse
una tercera tcnica diagnstica, tal como ha sido sugerido para estudios
epidemiolgicos en reas de Colombia y Venezuela donde la enfermedad

52

de Chagas es endmica (Guhl et al., 2002; Aez et al.,


1999a).

Siguiendo las sugerencias anteriormente


mencionadas, y basados en el anlisis de los resultados obtenidos en este estudio, los
mtodos serolgicos convencionales IFI y ELISA, los cuales arrojaron un 100% de
sensibilidad, as como 3 de los kits de diagnstico serolgico comerciales (Pharmatest,
Chagatest ELISA y Chagatest ELISA Recombinante V.3.0) con valores de
sensibilidad entre 88% y 9 2 % , pu d ier an p r o p o n er s e co mo p r u eb as d e r u
tina, mientras que las pruebas comerciales (Pharmatest, Chagatest ELISA
Recombinante V.3.0 , test ELISA para Chagas III y Chagas Stat Pak Assay) adems
de la prueba convencional TAD, las cuales arrojaron especificidad de 82% y 86%
respectivamente, podran ser utilizadas como mtodos confirmatorios para el
diagnstico serolgico. Esta propuesta pareciera corresponderse en parte, con la
prctica rutinaria de diagnstico serolgico en Venezuela, considerando que los kits
serolgicos comerciales Pharmatest y Chagastest ELISA se encuentran entre las
pruebas ms usadas para realizar el despistaje de la enfermedad de Chagas en el pas
(Vielma, 2005). No obstante esto, fue la prueba Chagatest ELISA la que arroj el
menor valor de RVP en el anlisis estadstico realizado. Esto indica que la mencionada
tcnica presenta una mayor probabilidad de generar resultados errneos. En
consecuencia, se recomienda que en centros donde se
emplee esta prueba, debera haber un estricto control de calidad antes de emitir algn
resultado diagnstico de pacientes que resulten seropositivos, lo cual podra lograrse
implementando la ejecucin de alguna de las pruebas confirmatorias sugeridas aqu
(Pharmatest, Chagatest ELISA Recombinante V.3.0 , Test ELISA para Chagas III,
Chagas Stat Pak Assay y TAD).

El anlisis comparativo de la relacin


costo-beneficio entre las pruebas ensayadas, indic que los mtodos con menores
requerimientos en equipos, personal e infraestructura fueron la tcnica de aglutinacin
directa (TAD) y el kit de diagnstico inmunocromatogrfico comercial Chagas Stat Pak
Assay. Considerando los bajos requerimientos de la tcnica de aglutinacin directa
(TAD) sumado a su relativamente alta sensibilidad y a su alta especificidad y bajo
costo, podra sugerirse su uso potencial como prueba de rutina a ser implementada en
reas rurales donde no se cuenta con infraestructura adecuada ni equipos requeridos
para ejecutar los complejos protocolos de la mayora de las tcnicas empleadas en el
despistaje de la enfermedad de Chagas, lo cual coincide con previas recomendaciones
53

(Roddy et al., 2008; Wendel & Gonzaga, 1993). Adems de esto, el kit de diagnstico
inmunocromatogrfico comercial Chagas Stat Pak Assay resultara, a pesar de su
relativamente alto costo unitario, ideal en centros pblicos y privados, rurales y
urbanos del pas por su eficiencia como prueba de alta especificidad y bajos
requerimientos, ofreciendo ventajas para ser utilizada en estudios poblacionales de
levantamientos epidemiolgicos, dada la facilidad para obtener resultados in situ en
pocos minutos, sin requerir personal especializado (Luquetti et al., 2003; Ponce et al.,
2005).

A pesar de los requerimientos, las tcnicas


basadas en ELISA presentan la posibilidad de automatizacin simplificando su
ejecucin y permitiendo el procesamiento de un gran nmero de muestras en cortos
periodos de tiempo (Wendel & Gonzaga, 1993; Knecher et al., 1994; Guhl et al., 2002).
Adicionalmente, estas tcnicas en formato cuantitativo podran eliminar la
subjetividad caracterstica de la mayora de las pruebas serolgicas (Zicker et al.,
1991). Por estas razones, y dada su alta sensibilidad, las tcnicas basadas en ELISA
resultan particularmente tiles como pruebas de rutina en centros pblicos y privados
del pas, en especial en aquellos donde se requiera el procesamiento de un gran nmero
de muestras diarias, como ocurre en

24

54

bancos de sangre de centros hospitalarios, opinin esta


compartida con previos autores (Winkler et al., 1995; Guhl et al., 2002).

La prueba diagnstica con mayores


requerimientos en equipos, personal e infraestructura fue la tcnica de
inmunofluorescencia indirecta (IFI). An as, algunos autores sealan que esta tcnica
es tr ad ic io n almen te u s ad a d ad a s u alta s en s ib ilid ad (Oelemann et al., 1998;
Malan et al., 2006) lo cual se corrobora en el presente estudio. Sin embargo, su uso se
ha restringido a laboratorios debidamente equipados con microscopios de
fluorescencia, requirindose para su ejecucin de tcnicos capacitados, ya que la
interpretacin de los resultados por personal inexperto puede llegar a ser cuestionable
(Malan et al., 2006; Andrade et al., 1989). Por estas razones, la tcnica de IFI se
recomienda slo como prueba de rutina en centros especializados, para los casos en los
que se requiera determinar la fase de la infeccin chagsica en individuos en los que se
deba tomar la decisin de aplicar algn tratamiento tripanocida (Camargo et al., 1986;
Luquetti & Rassi, 2000; Aez et al., 2001).

Otro aspecto valorado en el presente trabajo


fue la demostracin de la prdida de reactividad de un test comercial (Test ELISA para
Chagas III- BiosChile) luego de haber sido sometido a sucesivos cambios de
temperatura por cortos periodos de tiempo. Como resultado fue detectado un
progresivo estrechamiento entre las densidades pticas de los sueros de pacientes
seropositivos y seronegativos con el consecuente aumento de diagnsticos errneos o
inconsistentes. La razn de la escasa o nula reactividad pudiera deberse a la prdida de
estabilidad y la consecuente degradacin del antgeno como c o n s e c u e n c ia d e l o s
s h o c k t r m i c o s r e c i b i d o s e n e l t i e m p o , a rg u m e n t o e s t e c o m p a r
t i d o c o n D e L i m a et al. (2001) en sistemas inmunodiagnsticos an tratados con
inhibidores de proteasas. Estos hallazgos plantean la necesidad de que cada prueba
empleada en el despistaje de la enfermedad de Chagas en centros pblicos y/o privados
sea ejecutada en su totalidad en un tiempo breve, con la finalidad de garantizar un
resultado confiable en la deteccin de la infeccin chagsica.

En conclusin, tomando en consideracin


55

los aspectos analizados en el presente estudio, podra proponerse una combinacin de


pruebas candidatas a ser utilizadas como tcnicas de rutina y/o mtodos confirmatorios
de acuerdo a las condiciones presentes en cada centro diagnstico(11)

PRINCIPIO DEL MTODO:


Se basa en la utilizacin de una enzima como marcador de la reaccin Ag-Ac. El complejo
formado tiene actividad enzimtica sobre un sustrato especfico que se manifiesta por el
desarrollo de un color. El antgeno solubles fijado a materiales de fases slidas como
microplacas plsticas de fondo plano. En cada experimento deben incluirse controles
adecuados para descartar la hidrlisis espontnea del sustrato, adsorcin inespecfica del
antgeno, del suero y del conjugado.
Los antgenos utilizados en el IVIC son producto de la purificacin
de aminocidos de cepas de T. cruzi autctonas, mientras que los utili
zados en Banco de Sangre provienen de un "Kit" comercial (Labotec
Chagas).

PROCEDIMIENTO:
Para la realizacin de esta prueba se utilizaron placas de plstico de 98 pozos (Inmunolon n,
Dynatech Laboratories). En cada pozo se colocaron 1, 5 Y 10 ug de antgeno
respectivamente incubando a 372C toda la noche a fin de evaporar el solvente y fijar
totalmente el antgeno al plstico encontrndose que la cantidad de 5ug produjo el valor
ptimo de densidad ptica a 405nm en la reaccin serolgica, por lo cual fue la cantidad de
antgeno utilizada en la prueba. En experimentos previos se pudo constatar que la mayor
reproducibilidad de los resultados y el mximo en la actividad de la reaccin de ELISA se
obtuvo adhiriendo el antgeno a la placa e incubndolo por toda la noche a 372C. Una vez
adherido el antgeno se lavaron las placas tres veces con SST (solucin salina tamponada)0.05% (v/v) Tween-20 con un lavador automtico de placas, y luego se bloquearon los sitios
que en la placa no reaccionaron con el antgeno con 1% (p/v) de albmina srica bovina en
SST por 30 mino a temperatura ambiente. Posteriormente se incubaron con los sueros
humanos diluidos en SST 1:1000 una hora a 372C al trmino de la cual, se lavaron 3 veces
con SST-Tween-20 y se les aadi (Fab') 2 anti-inmunoglobulinas humanas marcadas con
peroxidasa de rbano diluidas 1:1000 en SST (0.01 M P04, 0.15M NaCl, pH 7.4), por toda la
noche a 42C (Amersham). Seguidamente se lavaron 3 veces con SST Tween-20 colocndose
56

100 ul del sustrato de la enzima consistente de ABTS (2.2' - amino-di-3-etnyl


benzothiazoline sulphonate) en el "buffer" que suministra la casa comercial.
La reaccin de la ABTS con la peroxidasa produjo un color verde que se cuantific a 405
nm en un lector de placas de ELISA Titerteck, con sustraccin automtica del valor del color
producido por todos los reactivos presentes en el pozo a excepcin del antisuero positivo
usado Estudio comparativo de las Tcnicas de Machado Guerrero y Elisa...
en
la
reaccin. Todos los experimentos se hicieron por duplicado, ~ encontrndose que la
desviacin estndar oscil, entre 0.1 - 0.2% del valor del promedio.
De la evaluacin a la cual fueron sometidas las 241 muestras de sueros sanguneos
provenientes de donantes voluntarios del Banco de Sangre del Estado Zulia, se obtuvo que
con la tcnica de Machado Guerreiro, 7 fueron positivos y 234 negativos, con ELISA
(Banco de Sangre) 21 positivos y 220 negativos. Con ELISA (IVIC) 32 positivos y 209
negativos. (10)
Como se puede observar, utilizando la Tabla de Contingencia 2 x 3 (Tabla No. 1) Y el
mtodo de anlisis Ji-cuadrado modificado por Brand-Snedecor, hubo diferencia
significativa entre las tcnicas evaluadas.
Estudio comparativo de las Tcnicas de Machado Guerreiro y Elisa revel que las
diferencias observadas entre los resultados de ambas tcnicas fueron significantes; igual
anlisis demostraron los resultados obtenidos de la evaluaci6n entre Machado Guerreiro y
ELISA (IVIC) (10)
La reaccin de Fijaci6n de Complemento (Machado Guerreiro) por su alta sensibilidad y
especificidad, es tradicionalmente considerada como prueba patr6n para el diagn6stico de la
enfermedad de Chagas, es por ello que la hemos utilizado para evaluar la tcnica
inmunoenzimtica de ELISA.
Numerosos autores confinan la sensibilidad de la reacci6n de Fijaci6n de Complemento
empleando un extracto proteico de T. cruzi, exento de fosfolpidos por extracci6n con ter o
benzol(10).
Histricamente corresponde a Engval y Perlmann2s la descripcin de la primera tcnica de
Ensayo Inmunoenzimtico especfico para protenas sricas, siendo un ensayo muy promisor
para el diagn6stico de Chagas. (10)
Kagan y cols.S afmnan que la prueba de ELISA es altamente sensible y especfica para
cuantificar anticuerpos circulantes de T. cruzi en el suero.
Entre las modificaciones a la tcnica de ELISA, Castilla y col. en
1988, se utilizaron el Ensayo Inmunoenzimtico por Difusin en Gel (DIG-ELISA),
comparndola con Hemaglutinacin Indirecta (HAO ) alcanzando mayor porcentaje de
positividad de casos para ELISA al realizar la evaluacin de ambas pruebas. (10)
57

En 1991, Lorca y Thiermann27 realizaron un estudio comparativo entre la tcnica de ELISA


por anticuerpos IgG e IgM contra T. cruzi y la prueba de Anticuerpos Inmunofluorescentes
(IFA1), confirmando que ELISA es mucho ms sensible que la prueba IFAT por anticuerpos
IgM. (10)
Contreras y cols. en 1992 estudiaron sueros por ELISA-IgG y por pruebas de
Hemaglutinacin Indirecta, demostrando que ambos mtodos presentaron concordancia de
93,3% y 100,0%, respectivamente. (10)
Figueredo y cols.29 realizaron un estudio de la prevalencia de infeccin por T. cruzi en 265
individuos
utilizando
examen
microscpico,
hemocultivo,
InmunofluorescenciaIndirecta(IFI), ELISA yELISA competitiva (C-ELISA), arrojando una
seropositividad de 14.3% por IFI, 14.7% por ELISA y 13.2% por C-ELISA. (10)
Estudios comparativos de cuatro mtodos serolgicos de diagnstico de la enfermedad, de
Chagas fueron aplicados por Schattschneider y cols. en 1992, reportando que las pruebas de
Aglutinacin por Ltex,
IFAT Y ELISA identificaron el 81 % de los pacientes con infeccin aguda, la prueba de
Fijacin de Complemento no present un diagnstico potencial en esta fase de la
enfermedad. En estados tardos la prueba de Fijacin de Complemento mostr una
sensibilidad del 69% compa rado con ell00% para pruebase aglutinacin por ltex, IFATy
ELISA.
Requejo y cols.,31 en 1991 realizaron comparaciones entre las pruebas serolgicas
convencionales, tales como Inmunofluorescencia Indirecta (IFI), Hemaglutinacin Pasiva
(PHA), Fijacin de Complemento y DIG-ELISA, concluyendo que esta ltima representa
una tcnica alternativa para la deteccin de infecciones chagsicas.
Estudio comparativo de las Tcnicas de Machado Glierreiro y Elisa...
Basados en la
utilidad reconocida de Machado Guerreiro para eldiagnstico de la infeccin T. eruzi, se
tom como parmetro esta prueba, para determinar si hay diferencia significativa de sus
resultados con los obtenidos al utilizar la prueba de ELISA. En este estudio se obtuvo una
diferencia significativa entre Machado Guerreiro y ELISA confirmando la superioridadde
esta ltimaen ladeteccinde anticuerpos anti-T. eruzi. (10)
La sensibilidad de EUSA permite detectar anticuerpos que han persistido durante ms
tiempo que aqullos detectados por Machado Guerreiro, adems la facilidad y rapidez para
el montaje de la misma y lo sencillo del equipo a utilizar, hacen de sta una prueba til en
los laboratorios de bancos de sangre, ya que no requiere de infraestructura compleja, ni
aparatos costosos ni personal altamente especializado. (10)
La positividad de EUSA (Banco de Sangre) y EUSA-IVIC no mostr una diferencia
significativa en relacin a la encontrada en ambas tcnicas con la de Machado Guerreiro, a
pesar de que por ELISA-IVIC se obtuvo un mejor resultado, ya que se utilizaron antgenos
58

de cepas puras de T. eruzi por lo que en relacin a futuros trabajos se debe hacer hincapi en
la necesidad de emplear antgenos puros para obtener resultados ptimos en la ejecucin de
dicha prueba. (10)

Anez y colb realizaron el trabajo Valoracin comparativa de pruebas serodiagnsticas


utilizadas para detectar enfermedad de Chagas en Venezuela , la Se presenta la
valoracin comparativa de 8 tcnicas de uso comn en el despistaje serolgico de la
enfermedad de Chagas utilizando muestras de pacientes de diversas procedencias del
occidente de Venezuela. En el estudio fueron utilizados mtodos serolgicos convencionales
(TAD, IFI, ELISA) y pruebas de diagnstico comercialmente expendidas en el pas
(Pharmatest, Chagatest ELISA, Chagatest ELISA Recombinante V.3.0, Test ELISA
para Chagas III y Chagas Stat PakTM Assay). La comparacin de los resultados no
revel diferencias estadsticamente significativas entre los niveles de sensibilidad y
especificidad de las tcnicas evaluadas (P>0.05). Se sugiere, para la obtencin de un
diagnstico preciso, la implementacin de pruebas de rutina y pruebas confirmatorias. El
anlisis de la relacin costo-beneficio reflej diferencias entre las tcnicas evaluadas,
sugiriendo su uso de acuerdo a las condiciones de servicio presentes en cada centro
diagnstico, para lo cual se proponen pruebas candidatas para la rutina y la confirmacin
diagnstica. Se demuestra la disminucin progresiva de reactividad, con el consecuente
incremento de resultados errneos, en una prueba comercial sometida a sucesivos cambios
de temperatura en el tiempo. (12)
Los ensayos de Wiener y Biokit utilizan tecnologa de protenas recombinantes y son
capaces de detectar inmunoglobulinas de tipo IgG e IgM. Los otros dos ensayos, el de
BiosChile y Biomerieux, utilizan extractos totales y son capaces de detectar slo IgG.(13)
Los resultados obtenidos muestran que la sensibilidad y especificidad es mejor en el caso de
los ensayos basados en extractos totales. De ellos el que dio los mejores resultados fue el de
BiosChile, con un 100% de sensibilidad y especificidad(13)

Test Elisa para Chagas III

59

METODO: Ensayo inmunoenzimtico in vitro para la deteccin cualitativa de anticuerpos


de la clase IgG dirigidos contra el Trypanosoma cruzi en muestras de suero o plasma
humano
BiosChile Ingeniera Gentica S.A. ha desarrollado el ensayo Test ELISA para Chagas III
pensando en aportar al Banco de Sangre un producto confiable, seguro y fcil de usar. Es as
como el ensayo se presenta en placas de 96 pocillos desmontables, cada solucin y control
tiene un color diferente, la solucin de dilucin cambia de color al agregar la muestra,
diferenciando claramente los pocillos que contienen muestras de los que contienen controles
y de los que an no han sido cargados. Adems, el sustrato viene premezclado, lo que
permite disminuir el nmero de pasos a realizar
FUNDAMENTOS DEL ENSAYO
El Test ELISA para Chagas III es un ensayo inmunoenzimtico en fase slida para la
deteccin cualitativa de anticuerpos contra T. cruzi. Se realiza en placas cuyos pocillos han
sido activados con extractos totales de las cepas de T. cruzi Tulahun y Mn (6), incluyendo
antgenos de membrana altamente inmunognicos. El recubrimiento de los pocillos se
realiza mediante una novedosa tecnologa consistente en la utilizacin de un adhesivo
biolgico que facilita la inmovilizacin de los antgenos y aumenta la estabilidad de la placa
activada (7). Si las muestras analizadas contienen anticuerpos especficos para T. cruzi, stos
formarn un complejo estable con los antgenos que recubren los pocillos. El material unido
en forma inespecfica ser eliminado por medio del lavado. Durante la incubacin con el
conjugado, los anticuerpos anti-IgG humana marcados con peroxidasa se unirn al complejo
formado. Finalmente, en la etapa de incubacin con el sustrato cromognico, la peroxidasa
unida al complejo producir una coloracin que permitir detectar las muestras reactivas
para T. cruzi. La reaccin enzimtica se detendr por la adicin de cido sulfrico,
midindose luego la intensidad del color en un lector colorimtrico para placas de ELISA.

ADVERTENCIA:
Muestras hemolizadas o turbias alterarn el color final sin afectar el resultado.
El cambio de color es proporcional al volumen de muestra agregado. Un viraje de menor
intensidad, indicar que se dispens un volumen inferior o que la muestra no se encuentra en
las condiciones adecuadas.

DETERMINACION DE LOS RERSULTADOS:


Una muestra ser positiva cuando su absorbancia sea mayor que el cut off. Un suero ser
negativo cuando su absorbancia sea menor que el cut off. Las muestras cuya absorbancia
60

se encuentre en un rango de cut off 10%, deben considerarse dudosas y debern ser
analizadas nuevamente en duplicado. Si al menos uno de los replicados mantiene una lectura
en esta zona, considere la muestra como positiva.
En casos excepcionales en los que no se cuente con un lector colorimtrico, se puede realizar
un lectura visual. Los pocillos positivos sern de color amarillo y podrn diferenciarse de los
pocillos negativos, los que sern incoloros o presentarn una leve coloracin amarilla. Este
tipo de lectura no permite verificar los criterios de validacin, por lo que se recomienda slo
en situaciones excepcionales.
Estudio de especificidad: se analizaron 1060 plasmas frescos provenientes de Bancos de
Sangre, de los cuales tres fueron reactivos. Estas muestras fueron confirmadas como
positivas, indicando que el ensayo tiene un 100% de especificidad
Estudio de sensibilidad: se analiz un total de 100 plasmas positivos para Chagas obtenidos
en la Fundacin Pro Sangre del Hemocentro de Sao Paulo, Brasil, obtenindose un 100% de
sensibilidad
Tabla IV: resultados estudio comparativo
Ensayo
BiosChile

Ensayo B

Ensayo C

Ensayo D

Neg.

Neg.

Neg.

Neg.

Pos.

Pos.

Pos.

Pos.

Resultados

353/353 271/271 342/353 269/271 351/353 271/271 350/353 270/271

Falsos
positivos*

0/16

11/16

2/16

3/16

Falsos
negativos+

0/3

2/3

0/3

1/3

97,9%

99,7%

99,4%

Concordancia 100,0%

(*) 16 muestras fueron reactivas slo en uno de los ensayos. Estas muestras fueron
negativas por Western Blot.
(+) 3 muestras fueron reactivas slo en tres de los ensayos y adems fueron positivas
por Western Blot.
Los ensayos de BiosChile y Ensayo C utilizan extractos del parsito y detectan IgG.
Los ensayos B y D utilizan antgenos recombinantes y detectan IgG e IgM.
Chagatest
61

Tipo de ensayo: ELISA indirecto


Antgeno: Lisado parasitario
Muestra: Suero o plasma humano
Conjugado: Anti-IgG monoclonal/Peroxidasa
Tiempo de reaccin: 90 minutos
Lectura: Monocromtica 450nm/ bicromtica 450/620-650nm
METODO: Ensayo inmunoenzimtico (ELISA) para la deteccin de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi
FUNDAMENTOS DEL METODO
Chagatest ELISA lisado es un ensayo inmunoenzimtico "in vitro" para la deteccin
cualitativa de anticuerpos anti-T. cruzi en muestras de suero o plasma humano.
La muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se encuentran sensibilizados con
antgenos de T. cruzi, correspondiente a zonas altamente conservadas entre distintas cepas.
Si la muestra contiene anticuerpos especficos, estos forman un complejo con los antgenos
y permanecen unidos a la fase solida. La fraccin no unida se elimina por lavado y luego se
agrega el conjugado (ant icuerpo monoclonal anti-IgG humana conjugado con peroxidasa) el
cual reacciona especficamente con los anticuerpos anti-T. cruzi inmunocapturados. El
conjugado no unido se elimina por lavado. La presencia de peroxidasa unida al complejo se
revela mediante el agregado del sustrato cromognico, tetrametilbencidina. Las muestras
reactivas desarrollan color celeste. La reaccin enzimtica se detiene mediante el agregado
de acido sulfrico, produciendo un viraje del color celeste al amarillo. La densidad ptica se
mide en forma bicromtica a 450/620-650 nm o a 450 nm.

62

Chagatest ELISA recombinante v. 4.0


Mtodo:
Ensayo inmunoenzimtico (ELISA) recombinante para la deteccin de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi.

CARACTERSTICAS TCNICAS
Tipo de ensayo: ELISA indirecto
Antgeno: Mezcla de 6 antgenos recombinantes conservados de fases epi y tripomastigote
(SAPA, 1, 2, 13, 30 y 36)
Muestra: Suero o plasma humano
Conjugado: Anti-IgG monoclonal/Peroxidasa
Tiempo de reaccin: 120 minutos
Lectura: Monocromtica 450nm/ bicromtica 450/620-650nm
Presentacin: 96 determinaciones

FUNDAMENTOS DEL METODO


Chagatest ELISA recombinante v. 4.0 es un ensayo inmunoenzimtico "in vitro" para la
deteccin cualitativa de anti cuerpos anti-T. cruzi en muestras de suero o plasma humano
La muestra se diluye en la policubeta, cuyos pocillos se encuentran sensibilizados con seis
antgenos recombinantes (SAPA, 1, 2, 13, 30 y 36) especficos de los estadios epimastigote y
tripomastigote del T. cruzi correspondientes a zonas altamente conservadas entre distintas
cepas.
Si la muestra contiene anticuerpos especficos, stos formarn un complejo con los
antgenos permanecern unidos a la fase slida. La fraccin no unida se elimina por lavado y
luego se agrega el conjugado (anticuerpo monoclonal anti-IgG humana conjugado con
peroxidasa) el cual reacciona especficamente con los anticuerpos anti-T. cruzi
inmunocapturados. El conjugado no unido se elimina por lavado. La presencia de peroxidasa
63

unida al complejo se revela mediante el agregado del sustrato cromognico,


tetrametilbencidina. Las muestras reactivas desarrollan color celeste.
La reaccin
enzimtica se detiene mediante el agregado de acido sulfrico, produciendo un viraje del
color celeste al amarillo. La densidad ptica se mide en forma bicromtica a 450/620-650
nm o a 450 nm.
ESTABILIDAD DE LA MEZCLA DE REACCION FINAL
El color de la reaccin es estable durante 10 minutos, por lo que los resultados deben leerse
dentro de ese lapso

PARA CONOCIMIENTO PERSONAL:

SAPA (Shed Acute Phase Antigen)

el antgeno SAPA (Shed Acute Phase Antigen) fue propuesto como marcador de fase aguda
de la infeccin, el diagnstico de la infeccin congnita y el seguimiento del tratamiento
etiolgico especfico6-9. Diversos estudios evidenciaron diferentes resultados en cuanto a la
proporcin de reactividad de SAPA frente a sueros de pacientes chagsicos en las fases
indeterminada y crnica de la infeccin9-12.
La protena TS-SAPA (trans-Sialidase-SAPA) se encuentra en la superficie de los
trypomastigotes y cumple un rol importante en la invasin a la clula husped. Esta protena
cuenta con dos dominios: uno enzimtico (TS) y otro repetitivo (SAPA). El dominio
repetitivo induce una acentuada y permanente respuesta inmunolgica tanto humoral como
celular6, 14, 15.
Chagatest ELISA recombinante v. 4.0

64

Chagatest ELISA recombinante v.3.0


Mtodo de 3 generacin para la deteccin de anticuerpos contra el Trypanosoma cruzi

FUNDAMENTOS DEL METODO


En esta tcnica cualitativa para la deteccin de anticuerpos anti-T. cruzi, la muestra se diluye
en el soporte en el que se encuentran inmovilizados antgenos recombinantes
(1, 2, 13, 30, 36 y SAPA), obtenindose un mtodo de 3 generacin. Estos antgenos se
obtienen por tcnica de ADN recombinante a partir de protenas especficas de los estadios
epimastigote y tripomastigote del T. cruzi, correspondientes a zonas altamente conservadas
entre distintas cepas. La tecnologa empleada permite asegurar una mezcla antignica de
composicin conocida y constante lote a lote, brindando resultados reproducibles,
especficos y con una elevada sensibilidad. Si la muestra contiene los anticuerpos
especficos, stos formarn un complejo con los antgenos y permanecern unidos al
soporte. La fraccin no unida se elimina por lavado tras lo que se agregan anticuerpos antiinmunoglobulina humana conjugados con peroxidasa. Si se produjo la reaccin en la
primera etapa del proceso, se unir el conjugado. Luego de un nuevo lavado se agrega el
sustrato enzimtico. En los casos en que se haya unido el conjugado habr aparicin de color
celeste. La reaccin se detiene con cido sulfrico, con lo que el color celeste vira al
amarillo
Chagatest ELISA recombinante v.3.0

65

CONCLUSIONES
1.
2.

ELISA para HTLV I/II


El Enzimoinmunoalisis HTLV I/II cualitativo para la deteccin de los
anticuerpos frente al virus T-linfotrpico humano de tipo I y II (HTLV-I y
HTLV-II) en suero o plasma.
Se considera al HTLV-I como el causante de la leucemia de las clulas T del
adulto, de la mielopata relacionada con el HTLV-I, parapesia espstica
tropical y la uvetis HTLV. La infeccin por HTLV-II no se asocia con una
enfermedad definida.
La transmisin es por va sexual, sangunea o perinatal.
El tamizaje debe ser realizado a travs de tcnicas de ELISA. Los ensayos
que emplean lisados virales o protenas recombinantes presentan un alto
ndice de inespecificidad y reaccin cruzada con el HTLV II.
66

Los reactivos que emplean pptidos sintticos especficos permiten


diferenciar las infecciones HTLV-1 de las HTLV-2 como es el caso de las
pruebas confirmatorias.
La primera generacin de ensayos HTLV que utilizaban un diseo de
anticuerpos antihumanos y protenas del HTLV-1 solo detectaban
anticuerpos IgG y dependan de un nmero limitado de eptopos con
reactividad cruzada para detectar HTLV-II.
Un ensayo ELISA de tipo sandwich que utiliza protenas recombinantes
derivadas de protenas transmenbranales del HTLV-I y HTLV-II y pptidos
sintticos de las protenas de la membrana exterior del HTLV-I y del
HTLV-II. Los antgenos se han elegido para maximizar la sensibilidad y
especificidad para el HTLV-I y el HTLV-II y se utilizan con un diseo
seleccionado para permitir la deteccin de los anticuerpos IgA, IgG e IgM
Principios del Ensayo
-Se han recubierto las microplacas con antgenos inmunodominantes

sintticos especficos de HTLV I/II derivados de gp46-I, gp46-II y gp21-I.


-La fase solida se trata primero con la muestra y se capturan los anticuerpos
anti HTLV I/II, si existen, mediante los antgenos recubiertos en la
microplaca.
-Despus del lavado, se elimina el resto de los componentes de la muestra.
-En la segunda incubacin se detectan los anticuerpos totales anti HTLV I/II
unidos mediante la adicin de antgenos sintticos especficos derivados de
gp46-I, gp46-II y gp21-I, marcados con peroxidasa (HPR).
-La enzima capturada en la fase slida, combinada con la mezcla
substrato/cromgeno, genera una seal ptica proporcional a la cantidad de
anticuerpos anti HTLV I/II presentes en la muestra.
-Tras bloquear la reaccin enzimtica, su densidad ptica se mide mediante
un lector ELISA.
-La versin ULTRA resulta especialmente adecuada para cribados
automatizados.
67

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS


La interpretacin de los resultados se realiza como la relacin entre el valor
de D.O. 450 nm de la muestra (M) y el valor de corte (Co o M/Co).
-Un resultado NEGATIVO indica que el paciente no est infectado por
HTLV I/II o que la unidad de sangre se puede transfundir.
-Las pacientes cuya muestra resulte equivoca deben someterse a una nueva
prueba con una segunda muestra tomada del paciente 1 o 2 semanas despus.
La unidad de sangre no se puede transfundir.
-Un resultado positivo indica infeccin por HTLV I/II y, por lo tanto, el
paciente debe ser tratado en consecuencia o la unidad de sangre debe
descartarse.

ELISA HIV I/II TIPO SANDWICH:


Los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2) son retrovirus
ARN con envoltura se transmiten por va sexual, sangunea y perinatal,
primariamente infectan a los linfocitos..
El tamizaje para VIH tiene por objetivo la deteccin de anticuerpos y/o
antgenos de este virus en el donante. A pesar que las pruebas de
tamizaje son muy sensibles, la ausencia de anticuerpos contra el virus
no descarta totalmente la infeccin ya que durante la primera infeccin,
existe replicacin viral sin que haya una expresin serolgica de los
anticuerpos contra el VIH. Esta etapa denominada perodo ventana
puede prolongarse por varias semanas.
Las pruebas de tamizaje con resultados reactivos indican la
probabilidad de que la sangre est infectada. Toda muestra reactiva
debe repetirse por lo menos una vez con la misma prueba de tamizaje.
Aunque las pruebas utilizadas para detectar los anticuerpos anti-VIH
son sumamente sensibles, especficas y reproducibles, se debe
requerir que las pruebas de tamizaje tengan una sensibilidad 100% y
68

por lo menos, un 97% de especificidad.


La prueba de tamizaje mas utilizada en los Centros de Hemoterapia y
Bancos de Sangre para la deteccin de anticuerpos y/o antgeno antiVIH es la tcnica ELISA. Las primeras pruebas desarrolladas utilizaron
lisados virales (antgenos utilizados en estas pruebas se prepararon a
partir de viriones del VIH). Estas tcnicas son conocidas como ELISA
de primera generacin las cuales tienen alta sensibilidad pero poca
especificidad.
Posteriormente se desarrollaron las ELISA de segunda generacin las
cuales utilizaron antgenos recombinantes preparados por ingeniera
gentica, luego las ELISA de tercera generacin cuyos antgenos son
pptidos sintticos obtenidos por sntesis qumica y finalmente las
ELISA de cuarta generacin que adems de detectar anticuerpos
detecta el antgeno p24 del VIH-1 mediante la introduccin de
anticuerpos monoclonales en el soporte slido.

PRINCIPIO DEL TEST


El test Genscreen ULTRA VIH Ag-Ac es un inmunoanlisis enzimtico
basado en el principio de la tcnica de intercalado para la deteccin del
antgeno del HIV y de varios anticuerpos anticuerpos asociados con el VIH1 Y EL VIH-2 en el suero o el plasma humanos.
La fase slida est recubierta de:
-Anticuerpo monoclonales contra el antgeno VIH-1 p24.
-Antgenos purificados: protena biotecnologa gp160, un pptido sinttico,
totalmente artificial, que imita a un eptopo especfico del VIH-1 del grupo
O (es decir, un virus codificado, pero inexistente) y un pptido que imita el
eptopo inmunodominante de la protena de la envoltura del VIH-2.
Los conjugados se basan en el uso de:
-Anticuerpos policlonales biotinilados con el Ag VIH (conjugado 1)

69

-Estreptavidina y antgenos VIH conjugado de peroxidasa (pptidos gp41 y


gp36, que imitan los eptopos inmunodominantes de las glucoprotenas de
envoltura del VIH-1 y del VIH-2, y el mismo pptido sinttico, totalmente
artificial, que imita el eptopo del VIH-1 del grupo O especfico usado para
la fase solida) (2 conjugado).
El procedimiento del ensayo incluye los siguientes pasos de la reaccin:
1. El conjugado 1(anticuerpo policlonal biotinilado contra el Ag VIH-1 p24)
se aade en los pocillos de la microplaca.
2. Las muestras de suero que se han de analizar y los controles se pipetean
en los pocillos.
-Los anticuerpos del VIH, si estn presentes, se ligan con el anticuerpo
monoclonal fijado a la fase slida y al conjugado 1.
-Los anticuerpos de los VIH-1 y VIH-2, si estn presentes, se ligan a los
antgenos inmovilizados en la fase slida.
-La disposicin del conjugado 1 y de la muestra se valida mediante un
cambio de color, desde amarillo verdoso a azul.
3. Tras la incubacin a 37C y el lavado, se aade el conjugado 2:
-La estreptavidina reacciona con los complejos biotinilados Ab-Ag-Ab.
-La peroxidasa marcada, los antgenos VIH-1 y VIH-2 purificados se fijan
a su vez a los anticuerpos IgG, IgM o IgA capturados en la fase slida.
4. Despus de la incubacin a 18-30C, la fraccin libre del conjugado 2 se
elimina mediante el lavado. Tras la incubacin, en presencia del sustrato a
temperatura ambiente (18-30C), se muestra la presencia del complejo
conjugado por un cambio de color.
5. Se detiene la reaccin y se leen las absorbancias por medio de un
espectrofotmetro a 450/620-700 nm.
La absorbancia obtenida en una muestra determina la presencia o ausencia
de Ag VIH o de anticuerpos contra el VIH-1 o el VIH-2.
INTERPRETACIN DE RESULTADOS
70

Las muestras con valores d absorbancia inferiores al calor discriminatorio se


consideran negativos.
Los resultados justo inferiores al valor discriminatorio se deberan
interpretar con precaucin (se debe repetir el test en las muestras
correspondientes)
Las muestras con valores de absorbancia iguales o superiores al valor
discriminatorio se consideran inicialmente positivas. Se debera repetir el
test antes de una interpretacin final.
Si despus del nuevo test de una muestra, los valores de absorbancia de los 2
duplicados son menores que el valor discriminatorio, el valor inicial no es
repetible y la muestra se considera negativa.
Si despus de un nuevo test la absorbancia de uno de los duplicados es igual
o mayor que el valor discriminatorio, el resultado inicial es repible y la
muestra se considera positiva.

71

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.

3.
4.
5.

Henry John Bernard. Diagnstico y Tratamiento Clnicos por el Laboratorio. 9 Edicin, edit.
Masson-salvat Medicina. 1993. Pp. 887-909
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Todd Stanfor & Davidsohn. Madrid : Marbn, c2007 pp821-849
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BIORAD. MONOLISA HBsAg Ultra.Kit para la deteccin de HBsAG,
BIORAD. MONOLISA HBsc Plus .Kit para la deteccin de HBsAG,

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75

1.
2.

72

9.

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S. Rivera,. J.O'Dalys,A. Fuenmayor, O. Briceo,A M. Abdul,A C.


Caldern, A T. Molero, A N. Urdaneta . estudio comparativo de las tcnicas de
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11.

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+Y+C&source=bl&ots=bF8K_hrtUg&sig=rEPzucXVI26gqOg2jQ1evljgus0&hl=es&sa=X&ei
=xm92VZvMLMeYNuq8gPAH&ved=0CD8Q6AEwBQ#v=onepage&q=ESTUDIOS
%20COMPARATIVOS%20DE%20KIT%20COMERCIALES%20DE%20HEPATITIS%20B
%20Y%20C&f=false

12.

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Amb, Maracay, v. 50, n. 1, jul. 2010 . Disponible en
<http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S169046482010000100003&lng=es&nrm=iso>. accedido en 09 jun. 2015.
Ren Daz R.Jefe de Control de Calidad Bios Chile.
http://www.chagas.cl/3_evaluaciones/estudio_comparativo.html

13.
14.

73

74

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de HBsAG que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre
ENSAYO FABRICAN MTODO
TE

Fase solida

MONOLI BIORAD Inmunoensa


SA
yo de tipo
HBsAg
sndwich en
ultra 3.0
1 tiempo
ELISA

Pocillos
sensibilizada
con
acs
monoclonales
anti
HBs
(raton)

ABBOT
2.0

Abbott

3.8

VITROS

Ortho

8.0

ARCHITE Abbott
CT

5.0

ADIVIA

11.0

Siemmens

Conjug Diluyente deControl


ado
conjugado
positivo:

Enzima

Ac
Inmunoglobuli SAB adicionadoperoxidasa
monoclonales na de buey ycon una mezcla
anti-Hbs dede ratn
+de
AgHBs
ratn y acs.indicador
purificado de los
Policlonales
subtipos ad y ay,
anti-Hbs de
(humanos)
conjugados
con
peroxidasaca
bra contra el
Ag HBs

75

Tampn
Solucin
Sustrato deelavado
la peroxidas

dCromogeno Solucion
parada

deSensibil Especificida
idad
d

Solucin deTampn
Tris,Cloredo enSoklucion de100%
Acido ctricoNaCl, Ph=7.4 rosa
.Acido
y acetato de
solucin quesulfrico 1N
sodio
pH
contiene
4,0
que
tetrametilben
contienen
cidina
0,015% de
(TMB)
H2O2 y 4% de
dimetilsulfoxido
(DMSO)

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de HBc Total que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre

ENSAYO

FABRICAN MTODO
TE

Fase solida
microplaca

Conjugado

Anticuerpos deTampn PBS conSuero


humanoperoxidasa
cabra marcadosun control
deque
contiene
por peroxidasacolor para laanticuerpos anticontra el IgG ydeposicin
delHBc
el
IgMmuestra(prpura)
humanos
8verde)
.

MONOLI BIORAD
SA
Monolisa
Anti-HBc
Plus . AgAc ultra
3.0 ELISA

Inmunoanlisis
enzimtico
ELISA
indirecto para
al
deteccin
simultanea del
de anticuerpos
contra
el
nucleo
del
virus de la
hepatitis. B

Pocillos
sensibilizada
con
acs
monoclonales
anti Hbc y
de antgenos
de
recombinacin
purificado
(sistema
de
expresin
E.coli)

Bioelisa
anti-HBc

Inmunoenzim
aensayo
competitivo
para determina
acs contra el
HBcAg.
Competencia
entre
Acs
humanos
presentes
y
Acs IgG de
conejo
antiHBc
conjugado con
peroxidasa.
Pocillos
separables
individuales

Microplaca
cubierta coin
HBCAg
recombnate
(E.coli)

biokit

Acs IgG
de
conejo
antiHBc
conjuga
dos on
peroxida
sa.

Diluyente
conjugado

deControl
positivo:

Acs IgG
de coinejo
anti-HBc
diluidos en
tampon
fosfato.

76

Enzima

Tampn Sustrato de laSolucin


peroxidas
elavado

dCromogeno

Solucion deSensibilidadEspecifici
parada
dad

Solucin de AcidoTampn
Tris,Cloredo en rosa .Soklucion de100%
ctrico y acetato de NaCl, Ph=7.4 solucin
queAcido
sodio
pH 4,0 que
contiene
sulfrico 1N
contienen 0,015% de
tetrametilbencidi
H2O2 y 4% de dimetilsulfoxido
na (TMB)
(DMSO)

Tampn
de
citrato
acetato
que
contienen
perxido
de
hidrogeno.

Tampon
fosfato
concentrad
o

Tetrametil
bencidina.
TMB
disiuelta
en
dimetilsulf
oxido(DM
SO).

Acido
sulfuri
co 1N

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de HCV Total que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre

ENSAY FABRICAN METODO


O TE
MONO BIORAD
LISA
HCV
Ag-Ac
ultra 3.0
ELISA

Fase solida
microplaca

Enzimainmunoen Pocillos
sayo cualitativo
sensibilizada con
acs
monoclonales
anti capsida del
VHC
y
de
antgenos
de
recombinacin
purificados
(NS3, NS4) y un
pptido mutado
de la regin
capsida del VHC.
NS3: genotipo 1
y 3a.

ABBOT Abbott
T HCV
ELISA
2.0

3.8

VITRO Ortho
S ANTI
HCV
CLIA

8.0

ARCHI
TECT
HCV
CLIA

Abbott

5.0

ADIVI
A

Siemmens

11.0

Conjugado

Diluyente
conjugado

deControl positivo: Enzima

Conjugado 1: AcInmunoglobulin Suero humano queperoxidasa


monoclonal murinoa de buey y decontienen
dirigido contra laratn
+anticuerpos anti
capside del VHCindicador
VHC y negativo
revelado
por
l
apra el HBs y los
biotina. Coloreado
acs anti HIV1 y
de violeta.
HIV2 diluido en
Conjugado
2:
regulador
SAB.
Anticuerpos
Control antgeno
murinos
anti-IgG
positivo sintetico
humanos revelados
de control que
por la peroxidasa y
contienen
un
estreptoavidina
pptido
de la
sealada por la
capside
peroxidasa.
liofilizado. SAB
Coloreada de verde.

77

Tampn SustratoSolucin
de la peroxidas
elavado

dCromogeno

Solucion
parada

deSensibilid Especifici
ad
dad

Solucin de AcidoTampn Tris,Cloredo


enSoklucion
de100%
ctrico y acetato deNaCl, Ph=7.4 rosa . solucin Acido sulfrico
sodio pH 4,0 que
que contiene1N
contienen 0,015% de
tetrametilbenci
H2O2 y 4% de dimetilsulfoxido
dina (TMB)
(DMSO)

CENTA
UR
HCV

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de HIV 1,2 que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre

ENSA FABRICANTE Fase solida


YO
microplaca
Genscreen
BIO-RAD
ULTRA HIV
Ag-Ab

Conjugado

Diluyente
conjugado

deControl positivo: Enzima

Pocillos recubiertosCONJUGADO
1DILUYENTE CONTROL
con
anticuerposAnticuerpos policlonalesCONJUDO 2POSITIVO
Ab
monoclonales contrabiotinilados frente al p24solucin
deVIH
plasma
p24 VIH-1(ratn) yVIH-1(carnero)
leche desnatada humano
antgenos purificadosCOJUGADO 2 peroxidasa
inactivado al calor
VIH-1 y VIH-2
liofilizada
etiquetada
positivo frente al
estreptavidina y antgenos
Ag HBs,al Ag
purificados VIH 1 y VIH 2
VIH, al los Acs
anti VIH-1,antiVIH-2,y
antiVHC en diluyente
sintetico
CONTROL
POSITIVO
Ag
VIH
Diluyente
sintetico
que
contiene antgeno
VIH-1 purificado
inactivado
en
presencia de un
agente disociamte

78

Tampn SustratoSolucin
de la peroxidas
elavado

dCromoge Solucion
no
parada

Citrato sdico yTampn Tris-Solucin H2SO4 1N


solucin de acetatoNaCl pH 7.4 que
de sodio pH 4.0 que
contiene
contiene
tetrametilb
H2O2(0.015%)
y
enzidina
DMSO (4%)
(TMB)

deSensibilid Especificid
ad
ad
100%

98.72%

Muerx HIV DiaSorin


Ag/Ab
Conbination

Recubiertas
recubiertos
de
antigenos del VIH y
anticuerpos
monoclonales

Antgenos del VIHSolucin


y
anticuerposamarilla
moniclonales
compuesta por
conjugados
conprotena bovina
peroxidasa
desoponina
y
rabano y liofilizados detergente

Control 1
para antiVIH
1
suero
humano
inactivado
en tampn
con
protena
bovina
Cnntrol
Positivo
para antiVIH-2
suero
humano
inactivado
en tapon de
protena
bovina
Control
Positivo
para
p24
del VIH-1
contiene
p24(antigen
o
recombinan
te
en
tampn de
protena
bovina

79

Tetrametilben
zidina TMB

Borato
glicina

Tetr H2SO4 1N
ame
tilb
enzi
dina
en
solu
cin
de
citr
ato
tris
odic
o y
per
oxi
dos
o de
hidr
oge
no

100
%

99.7
8%

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de HTLV I-II que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre
ENSAYO

FABRICANT Fase solida


E
microplaca

Conjugado

Diluyente
conjugado

HTLV I/II AbDIA.PRO


versin
ULTRA

Pocillos recubiertosContiene
mezcla
de
con
Agsantgenos sintticos de
inmunodominantes HTLV,marcados con HRP,
sntticos especficos5% de BSA, tampn Tris
de
HTLV
I/II10mM a pH 6.8 +/- 0.1,
derivados de gp46-0.3 mg/ml de sulfato de
1,gp46-II y gp21-1. gentamicina y Kathon GC
al 0.1% como conservantes

HTLV
I+II Wienner-lab
ELISA
recombinante

Pocillos recubiertos
con
antgenos
recombinantes
y
potidos de los virus
HTLV IyII

deControl positivo: Enzima

Anticuerpo
Buffer
slino
monoclonal anti-Igcon protenas
humana conjugado
con peroxidasa

Contiene 5% de
BSA,
tampn
fosfato 10mM a
pH 7.4 +/- 0.1,
azida
sdica
0.09%,
suero
humano positivo a
anticuerpos HTLV
inactivado Kathon
GC al 0.1%.

Suero
humano
inactivado
conteniend
o
anticuerpos
contra
HTLVI y/o
HTLV ii

80

Tampn SustratoSolucin dCromogeno Solucion


de la peroxidas
elavado
parada

deSensibilid Especifici
ad
dad

Solucin
Contiene
Acido
100%
tampn
tampn
sulfrico
fosfato10m citratoH2SO4 0.3M
M a pH 7.0fosfato
y Tween 2050mM a pH
al 0.05%
3.5-3.8,
dimetilsulfo
xido
4%,
tetra-metilbenzidina
(TMB)
0.03%,
y
perxido de
hidrogeno
Buffe
r
Salin
o
tensio
activo

Soluci Acido
n desulfurioco 2N
teram
etilbe
nzidin
a
(TMB
) con
peroxi
do de
hidrog
eno

99.5%

100
%

99%

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de Sifilis que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre
ENSAYO

FABRICANT Fase solida


E
microplaca

Conjugado

Diluyente
conjugado

deControl positivo: Enzima

81

Tampn SustratoSolucin dCromogeno Solucion


de la peroxidas
elavado
parada

deSensibilid Especifici
ad
dad

ANEXO: tabla comparativa de diferentes mtodos de ELISA para tamizaje de Chagas que existente en el mercado para proveer
reactivos a los bancos de sangre

ENSAYO

FABRICANT Fase solida


E
microplaca

Conjugado

Diluyente
conjugado

deControl positivo: Enzima

82

Tampn SustratoSolucin dCromogeno Solucion


de la peroxidas
elavado
parada

deSensibilid Especifici
ad
dad

83