La modulacin de las funciones de las clulas asesinas

naturales por las interacciones entre 2B4 y CD48 en cis y

en trans
Abstracto
Relacionados con los receptores SLAM-(SRR) son importantes moduladores de la
funcin de las clulas inmunes. Aunque la mayora de las RSR son homophilic, 2B4
(CD244) interacta con CD48, una protena anclada a GPI se expresa en muchas
clulas hematopoyticas. Aqu nos muestran que asesinas naturales (NK) de
clulas-2B4 expresado no slo se une en transde CD48 en las clulas vecinas, sino
tambin interacta en cis con CD48 en la misma celda.2B4 utiliza el mismo sitio de
unin para interactuar con CD48 en cis y en trans flexibilidad y estructural de 2B4
es necesario para la cis interaccin. Adems, el cis interaccin es suficiente para
inducir la fosforilacin basal de 2B4. Sin embargo, cis interaccin reduce la
capacidad de 2B4 para unir CD48 en trans . Como consecuencia de ello, la
fosforilacin estimulacin dependiente de 2B4 tras la unin a clulas diana
positivas CD48 se reduce. Interferir con el cisinteraccin, por lo tanto mejorado la
lisis de las clulas tumorales que expresan CD48-. Estos datos muestran que la
densidad de 2B4 y CD48 tanto en la clula NK y la clula diana potencial modula la
actividad de clulas NK.

1. Introduccin
Asesinas naturales (NK) las clulas son clulas linfoides innatas y son importantes
para la respuesta inmune temprana eficaces contra las infecciones virales y la
formacin de tumores. A travs de la participacin de la activacin de los
receptores, las clulas NK son capaces de reconocer selectivamente y matar
transformadas o clulas infectadas por virus [ 1 ]. Adems, pueden secretar
diversas citocinas y quimiocinas y estn implicados en la modulacin de la
respuesta inmune adaptativa [ 2 ].

La familia de receptores relacionados con SLAM-(SRR) tiene importantes funciones

en la modulacin de la reactividad de diversas clulas inmunes [ 3 ]. Las clulas NK
humanas expresan el SRR NTB-A, CRACC y 2B4 [ 4 ]. Mientras que todos los dems
son SRR homophilic, 2B4 reconoce el CD48 protena similar a Ig anclado a GPI que
se expresa en todas las clulas hematopoyticas, incluyendo las clulas NK
[ 5 , 6 ]. La unin de CD48 a 2B4 induce la fosforilacin de los motivos de
conmutacin basados en tirosina de cuatro inmunorreceptoras (SGSTI) en su cola
citoplasmtica y el reclutamiento de protenas de pequeo adaptador SAP y EAT-2
[ 7 ]. Esto a su vez activa cascadas de sealizacin que resulta en la citotoxicidad
de clulas NK y la produccin de citoquinas tales como IFN y TNF-. Mientras que
SAP puede unirse a las cuatro SGSTI fosforilados, la tercera ITSM puede contratar
adicionalmente las fosfatasas SHP-1, SHP-2, la nave y el inhibidor de la quinasa Csk
[ 7 , 8 ].
En reposo las clulas NK, 2B4 tiene funciones coestimuladoras y puede aumentar
la respuesta de otros receptores activadores de manera sinrgica [ 9 ]. En IL-2
clulas NK imprimados, provocando 2B4 por s solo es suficiente para inducir
funciones efectoras de las clulas NK [ 2 ].Adems, 2B4 parece jugar un papel
importante para la activacin de la integrina y la induccin de un estado de alta
afinidad de la LFA-1 [ 10 ]. Finalmente, la activacin de 2B4 por las clulas diana
que expresan CD48 o anticuerpo reticulacin induce una fuerte modulacin
negativa de 2B4 niveles de expresin en las clulas NK, lo que podra ser otro
mecanismo para la regulacin de la funcin NK celular [ 11 , 12 ].
La parte extracelular de 2B4 comprende un N-terminal V-tipo de dominio similar a
Ig, que contiene la interfaz de unin para CD48 [ 13 , 14 ], y una membrana
proximal C2-tipo de dominio similar a Ig. Los dos dominios de tipo Ig estn
conectados por un enlazador de seis aminocidos, y un corto parejas tallo el C2dominio para el segmento de transmembrana [ 13 ,15 ].
Varios receptores de la superficie se ha demostrado que interactuar con su ligando
en la superficie de la misma clula. Tales cis interacciones han demostrado durante
varios

receptores

de

clulas

NK

inhibitorios

con

sus

ligandos

MHC

[ 16 ]. Especialmente, la relevancia funcional de cis interaccin entre el ratn

Ly49A y su ligando H-2D

para la funcin de clulas NK fue ampliamente

estudiado. Los autores demostraron que cis interaccin es enmascarar el receptor

para la interaccin con ligandos en trans , reduciendo de este modo el
reclutamiento del receptor a la sinapsis inmunolgica [ 17 , 18 ]. Adems, el
secuestro de Ly49A travs cisinteraccin se demostr que era necesaria para la
educacin de las clulas NK mediante la reduccin del efecto supresor de receptor
Ly49 unengaged durante la maduracin [ 19 , 20 ].Adems de los receptores Ly49,
tambin se encontr que las protenas similares a Ig de la familia LILRB para
interactuar con MHC en cis . Para el PIRB homlogo de ratn, se demostr que
este cis interaccin est implicada en la regulacin de la actividad de los
mastocitos. En contraste con Ly49A, la clase I del MHC PIRB- cis interaccin se
supone que debe generar seales tnica inhibitoria de contrarrestar la activacin
de Fc RI [ 21 , 22 ].
Aqu se describe la interaccin del receptor de clulas NK activante 2B4 con su
ligando

CD48

en cis y

la

necesidad

de

flexibilidad

estructural

de

esta

interaccin. Por otra parte, nos encontramos con que este cis interaccin modula la
expresin de la superficie celular 2B4 y la fosforilacin basal. Finalmente, se
muestran las consecuencias funcionales para 2B4 fosforilacin despus del
contacto con clulas diana susceptibles y la posterior citotoxicidad.

2. resultados

Dentro de la familia SRR, 2B4 es el nico receptor heterophilic y se une a la

protena CD48 anclada a GPI. Para estudiar el impacto de esta interaccin sobre la
funcin de las clulas NK, se determin la unin de la protena de fusin soluble
CD48-OSR (sCD48) para 2B4 en clulas primarias NK y la lnea de clulas NK
NK92.C1. Mientras que la expresin superficial de 2B4 era claramente detectable

por tincin de anticuerpos ( figura 1 un , panel superior), que no manche las 2B4
en las clulas NK con sCD48 ( figura 1 un , panel inferior). Como control, se logr
una clara tincin de 2B4 en las clulas HEK293T-2B4 transfectadas de forma
estable utilizando sCD48, lo que demuestra la funcionalidad de este reactivo. Una
diferencia entre las clulas HEK293T-2B4 y NK es que este ltimo tambin
expresan CD48. La cuantificacin de 2B4 y CD48 revel que los niveles de
expresin CD48 en las clulas NK mayor que el nmero de molculas de 2B4 en
alrededor de cinco veces ( Figura 1 B ). Asumimos que un posible cisinteraccin
entre 2B4 y CD48 sobre la misma clula NK podra interferir con la unin del sCD48
en trans . Para probar esta hiptesis, se trataron las clulas con NK92.C1 especfica
de fosfatidilinositol fosfolipasa C (PI-PLC) para eliminar CD48 y todas las otras
protenas ancladas a GPI de la superficie celular. Esto result en una fuerte
reduccin de las molculas de CD48 por clula, mientras que el nmero de
eptopos 2B4 no se vio afectada ( figura 1 b ). Es importante destacar que,
despus del tratamiento con PI-PLC ahora podramos detectar la unin de sCD48
de las clulas NK 2B4 ( figura 1 c ).

Figura 1.
2B4 en clulas NK est enmascarado
por cis interaccin con CD48 sobre
la misma clula. ( Un ) NK92.C1,
clulas NK y clulas primarias HEK2B4 se tieron de 2B4 utilizando
anti-2B4 mAb C1.7 (fila superior) o
protenas
de
fusin
CD48-ILZ
solubles (fila inferior). Controles de
tincin IgG1-PE o NKp30-ILZ (clulas
NK)
y
CS1-ILZ
(HEK),
respectivamente, se muestran en
gris. Se muestra un experimento
representativo
de
tres. ( B fue
determinada) Nmero absoluto de
2B4 y CD48 molculas en NK92.C1 y
clulas NK primarias antes y
despus del tratamiento con PI-PLC
utilizando el kit QiFi. Los datos se
muestran como media desviacin
estndar de tres experimentos
independientes. ( C )
NK92.C1
y
clulas NK primarias se dejaron sin
tratar o se trataron con 1 U ml -1 PIPLC durante 1 hora a 37 C. Las
clulas se tieron para 2B4 con
protenas de fusin CD48-ILZ solubles. NKp30-ILZ se utiliz como control
negativo. Se muestra un experimento representativo de al menos tres.

Para confirmar la posible cis interaccin entre CD48 y 2B4, nos aprovechamos de
una lnea celular Jurkat defectuoso en la sntesis de anclaje GPI. La lnea celular
J7.X lleva una mutacin en el glicano-A fosfatidilinositol ( PIG-A de genes) y por lo
tanto no expresa las protenas ancladas a GPI en la superficie celular [ 23 ]. La lnea
celular J7.P ha sido re-transfectadas con intacta PIG-A cDNA y por lo tanto es
positivo para las protenas ancladas a GPI. Como todas las lneas celulares Jurkat se
derivan de CD4 + clulas T, no expresan 2B4 endgeno. Con este sistema celular,
hemos sido capaces de generar lneas celulares que expresan CD48 o 2B4 o
ambos. Para probar directamente para la interaccin entre CD48 y 2B4, se utiliz el
bis reticulantes qumicos (sulfosuccinimidil) suberato impermeable a las clulas

(BS 3 -D0). Debido a un corto espaciador de 11,4 este reticulante slo puede unir
covalentemente dos protenas cuando estn en contacto directo. Se han tratado
las clulas Jurkat que expresan 2B4 (J7.X-2B4), CD48 (J7.P) o ambos (J7.P-2B4) ya
sea solos o en experimentos de mezcla con el reticulante de clulas y
posteriormente analizados el lisado celular por anti- 2B4 y el Western Blot antiCD48 ( figura 2 ). En las muestras que contienen slo clulas 2B4-expresin, se
detect una banda prominente a 75 kDa, que corresponde al tamao esperado de
2B4 completamente glicosilada. Esta banda estaba ausente en lisados de clulas
Jurkat transfectadas. CD48 madura en clulas J7.P se detect como una banda de
aproximadamente 43 kDa. Cuando 2B4 y CD48 estaban presentes en la misma
clula Jurkat (J7.P-2B4) una banda adicional de aproximadamente 125 kDa se
detect slo cuando se trataron las clulas con el agente de reticulacin. Esta
banda era detectable por anticuerpos anti-CD48 anti-2B4 y, lo que sugiere que
representa un complejo de 2B4 y CD48. Esto demuestra que 2B4 y CD48 puede
interactuar no slo en trans cuando est presente en clulas diferentes, sino
tambin encis cuando ambas molculas estn presentes en la misma celda.

Figura 2.
Cis interaccin entre 2B4 y CD48 sobre las clulas Jurkat. Las clulas
Jurkat J7.X y J7.P que expresa CD48 y / o 2B4 fueron expuestos a la BS
qumico reticulante 3 -D0. Los lisados celulares se analizaron por SDSPAGE y Western Blot. Las membranas se sondearon con un anticuerpo
biotinilado contra 2B4 (panel izquierdo) y volvieron a sondar para
detectar CD48 (panel derecho).2B4 aparece como banda prominente
con un tamao de 75 kDa (smbolo negro), CD48 se detecta en 43 kDa
(smbolo blanco). Despus de BS 3 tratamiento de una banda adicional
de aprox. 125 kDa slo aparece en la muestra co-expresin de 2B4 y
CD48 sobre la misma clula.Se muestra un experimento representativo
de cuatro.
Para investigar los requisitos estructurales para esta interaccin en un sistema ms
controlable, que de forma estable las clulas transfectadas HEK293T con vectores
que codifican 2B4 o CD48. Habamos demostrado previamente que 2B4 se
internaliza cuando se acopla mediante su ligando [ 11 ]. Podramos reproducir este
hallazgo cuando nos comprometimos 2B4 en transmediante la mezcla de clulas
HEK que expresan CD48 2B4 con clulas que expresan, lo que result en una
fuerte modulacin negativa de la expresin en la superficie 2B4 ( figura 3 una ,

izquierda). Para investigar la co-expresin de CD48 2B4 y en la misma clula,

clulas HEK-2B4 fueron transfectadas transitoriamente con CD48 o vector
vaco. Esto tambin result en una disminucin de la expresin de superficie
2B4; Sin embargo, en condiciones normales de cultivo que no podan discriminar si
esto era debido a la interaccin entre CD48 y 2B4 en cis , o debido a la
participacin de las clulas CD48 2B4 de la vecina que expresan en trans . Por lo
tanto, las clulas cultivadas HEK-2B4 a una densidad muy baja para limitar
drsticamente

el

contacto

celular

por

lo

tanto

prevenir trans interacciones. Tambin bajo estas condiciones se observ una

modulacin negativa de 2B4 que era debido a la presencia de CD48 en la misma
clula (Figura 3 una , derecha). Esto indica que la interaccin entre 2B4 y CD48
en cis tambin se produce en las clulas HEK transfectadas y que el cis interaccin
es suficiente para la modulacin de la expresin en la superficie 2B4.

Figura 3.
La interaccin CD48 en cis y trans modula la superficie nivel de
expresin de 2B4 en clulas HEK a travs de la misma interfaz de
unin. ( Un ) Panel izquierdo: clulas HEK293T que expresan
establemente 2B4 se mezclaron con cantidades iguales de HEKCD48. Nivel de expresin 2B4 se determin por citometra de flujo
despus de 24 h de co-cultivo usando un anticuerpo anti-2B4. Panel
derecho: clulas HEK293T que expresan establemente 2B4 se
transfectaron con pBABE-CD48 o el vector vaco como control; 24 h
despus de la transfeccin las clulas se separaron y se cultivaron
durante 24 h en un 75 cm 2 matraz sin contacto de clula a clula. 2B4
niveles de expresin se determinaron a continuacin por citometra de

flujo utilizando un anticuerpo anti-2B4. Tincin de control (ctrl) con IgG1PE se muestra en gris. ( B ) las clulas HEK293T fueron transfectadas
establemente con pBABE-2B4wt o pBABE-2B4KHT. Expresin en la
superficie de la clula de 2B4 se detect por tincin con anti2B4. Tincin de control (ctrl) con IgG1-PE se muestra en (panel superior)
gris. La unin de la protena de fusin CD48-OSR (panel inferior) a las
clulas transfectadas se analiz mediante citometra de flujo como se
describe enla figura 1 . Control de tincin OSR (ctrl) se muestra en
gris. ( C clulas) HEK293T que expresan establemente 2B4KHT se
analizaron para la modulacin a travs de CD48 como se describe en
(un ). Se muestra un representante de al menos tres experimentos
independientes.
A continuacin, hemos querido investigar la base estructural de la 2B4 /
CD48 cis interaccin.Para ello se quiere utilizar un mutante 2B4 que ya no pueden
interactuar con CD48 en trans .En nuestras manos, la public anteriormente 2B4
mutante K68A / E70A [ 24 ] no interfieren con la unin de sCD48 y no mostr
ninguna alteracin en un ensayo funcional (material complementario electrnico,
la figura S1). Por lo tanto, genera un nuevo mutante defectuoso (2B4KHT) en base
a la estructura cristalina publicada de ratn 2B4 unido a su ligando de unin
[2B4 13 ]. La introduccin de tres sustituciones de alanina K54A, H65A y T110A
dentro del sitio de unin de ligando putativo completamente interrumpidas unin
del sCD48 a clulas HEK que expresan de forma estable 2B4KHT ( figura
3 b ). Como consecuencia, el co-cultivo de clulas HEK-2B4KHT con clulas HEKCD48 no dio lugar a la modulacin negativa de la expresin 2B4, lo que confirma la
eliminacin de la trans interaccin ( figura 3 c ). Curiosamente, tambin no
observamos una modulacin negativa de 2B4KHT la interaccin con CD48
en cis cuando co-expres el mutante junto con CD48 en la misma celda y se
elimina trans interaccin mediante el cultivo de las clulas sin contacto clula a
clula

( figura

3 c ). A

partir

de

estos

resultados,

se

concluye

que cis y trans interaccin con CD48 estn mediados por el mismo eptopo de
unin de 2B4.

El uso de la misma interfaz en 2B4 tanto para cis y trans de unin implica ya sea la
flexibilidad de la membrana celular, o la flexibilidad intramolecular de 2B4 o CD48
con el fin de interactuar con las molculas vecinas. La flexibilidad intramolecular
de 2B4 podra ser proporcionado por el corto enlazador entre los dominios

similares a Ig de dos o el tallo entre el dominio similar a Ig de membrana proximal

y el segmento transmembrana. Por lo tanto, hemos creado 2B4 mutantes de
delecin que carecen de la enlazador (127-132) o el motivo de tallo (211-223) y
transitoriamente ellos transfectadas en clulas HEK293T. Desafortunadamente,
tanto los mutantes 2B4 receptores se expresan slo escasamente en la superficie
celular (material complementario electrnico, figura S2) hacer anlisis funcional
imposible. Sin embargo, eran detectables en las clulas permeabilizadas, lo que
indica que la regin del tallo y el dominio enlazador son indispensables para el
plegamiento correcto o el trfico de 2B4 a la superficie celular. Adems, hemos
generado clulas HEK293T que expresan de forma estable un mutante de delecin
que carecen de toda la membrana-proximal de dominio similar a Ig de 2B4 (Ig, aa
141-210). Co-expresin

de

CD48

en

estas

clulas

dirigidas

una

fuerte

disminucin de la expresin en la superficie 2B4 comparable con la de 2B4 en peso

(material complementario electrnico, la figura S3). Se obtuvieron resultados
similares cuando la membrana-proximal de dominio similar a Ig de CD48 (Ig, aa
132 a 212) tambin fue eliminado, lo que indica que la membrana distal dominios
similares a Ig son suficientes para trans y cis interacciones entre 2B4 y CD48.
Para explorar el impacto del enlazador 2B4 en cis de unin con ms detalle que
intercambian enlazador aa residuos 127-132 (DKVEKP) con el motivo de -captulo
ms rgida que conecta los dominios similares a Ig D1 y D2 en las clulas CD4
humana (114-127, QKEEVQLLVFGLTA) [25 ] para generar una ms rgida 2B4
variante (2B4 betaS). El mutante 2B4 betaS se expresa en las clulas HEK293T,
aunque en un grado menor que 2B4 peso. Por otra parte, se podra manchar el
mutante 2B4 betaS con CD48 soluble-OSR, la verificacin de la capacidad de 2B4
betaS para interactuar con CD48 en trans ( figura 4 una ). Adems, co-cultivo de
clulas HEK que expresan de forma estable 2B4 betaS con HEK-CD48 dio lugar a
una modulacin negativa considerable de 2B4 betaS expresin similar a 2B4 en
peso de superficie ( figura 4 b , c ). Es importante destacar que la co-expresin de
2B4 betaS y CD48 sobre la misma clula no afect el nivel de expresin de 2B4
betaS ( figura 4 b , c ), lo que indica que el enlazador rgido entre los dominios
similares a Ig interfiri con eficacia con la interaccin de 2B4 y CD48 en cis . Esto
demuestra que la flexibilidad estructural proporcionado por el enlazador de bucle y

los motivos tallo de 2B4 son suficientes para permitir cis interaccin entre 2B4 y
CD48.

Figura 4.
2B4 mutante -captulo no
interacta
con
CD48
en cis . ( Un )
las
clulas
HEK293T fueron transfectadas
establemente
con
pBABE2B4wt
o
pBABE-2B4
betaS. Expresin
en
la
superficie
celular
(panel
superior) y la unin de la
protena de fusin CD48-OSR
(panel inferior) se analiz
mediante
citometra
de
flujo. ( B ) HEK-2B4 en peso y
betaS HEK-2B4 se analizaron
para la modulacin a travs de
CD48 como se describe en la figura 3 una . Se muestra un experimento
representativo de tres. ( C ) Para el anlisis estadstico de la RFI se
calcul a partir 2B4 MFI y normalizado a 2B4 ctrl en peso. Media
desviacin estndar de los datos se muestran de tres experimentos
independientes. *** P <0,0001, ** p = 0,0013, * p = 0,0306.

El acoplamiento de 2B4 resultados en la fosforilacin de la tirosina rpida de los

motivos de ITSM en su parte citoplasmtica [ 26 , 27 ]. Sin embargo, incluso en la
ausencia de contacto clula diana se podra detectar alguna fosforilacin
constitutiva de bajo nivel 2B4 en las clulas NK [ 28 ]. Por lo tanto, especul que
esta fosforilacin basal puede ser debido a la cisinteraccin entre 2B4 y CD48. Para
investigar esta hiptesis se utilizaron las clulas Jurkat que expresan CD48 2B4, o
ambas molculas y analizamos la fosforilacin 2B4. En las clulas que expresan
CD48 2B4 y, detectamos fcilmente una fosforilacin basal de 2B4, incluso cuando
slo se permite cis interaccin mediante el cultivo de las clulas sin contacto de
clula a clula (Figura 5 una ). Detectamos una cantidad similar de fosforilacin 2B4
cuando slo se permitetrans interaccin entre las clulas Jurkat-CD48 Jurkat-2B4
y. Sin embargo, en ausencia de CD48 se detect la fosforilacin no 2B4,
demostrando que el acoplamiento de 2B4 por CD48 en cis o en trans entre clulas

vecinas es necesario para la fosforilacin basal del receptor. Para confirmar este
hallazgo en las clulas NK se utiliz la lnea celular NK NK y la reduccin de la
expresin de superficie CD48 mediante tratamiento con PI-PLC. De manera similar
a nuestros resultados con clulas Jurkat, cis unin de 2B4 a CD48 fue suficiente
para inducir la lnea de base 2B4 fosforilacin ( figura 5 b ). Como 2B4 se expresa
por prcticamente todas las clulas NK, que era difcil de evaluar el papel de slo
el trans interaccin entre 2B4 y CD48. Por lo tanto, expresamos la expresin de
CD48 2B4 HA-etiquetado en NKL y manipulado por tratamiento con PI-PLC. De
manera similar a las clulas Jurkat que podamos mostrar en estas clulas NKL
que cis interaccin era suficiente para inducir 2B4 fosforilacin en un grado similar,
ya que slo el trans interaccin, mientras observamos el nivel de fosforilacin ms
fuerte cuando se les permite, tanto para las interacciones que se produzca ( figura

5 c ) . Estos datos demuestran que el cis interaccin es suficiente para inducir la

fosforilacin basal de 2B4.

Figura 5.
La regulacin de la fosforilacin por
2B4 cis y trans interaccin
con
CD48. ( Un ) clulas Jurkat que
expresan
establemente
2B4
(smbolos negros) y / o CD48
(smbolos blancos) se cultivaron
durante 2 h con o sin contacto de
clula
a
clula. 2B4
inmunoprecipitados se analizaron
para la fosforilacin de tirosina. El
anlisis densitomtrico se realiz
utilizando I MAGE J y p2B4 se calcul
como la densidad Py dividido por la
densidad total de 2B4 y normalizado
a trans . Los datos se presentan
como media desviacin estndar
de
dos
experimentos
independientes. ( B) NKL se trataron
con PI-PLC y se cultivaron en
ausencia o presencia de contacto de
clula a clula. A continuacin, las
clulas se analizaron para la
fosforilacin de 2B4 como se
describe en ( un ). 2B4 fosforilacin se calcul como la densidad Py
dividido por la densidad total de 2B4 y normalizado a ' trans + cis '. Los
datos se presentan como media desviacin estndar de al menos dos
experimentos independientes. ( C ) NKL HA-2B4 se trataron con o sin PIPLC y se cultivaron en ausencia de contacto de clula a clula. Entonces,
NKL HA-2B4 se mezclaron con NKL normal y estimulada, ya sea a 37 C
o se mantuvo en hielo. Inmunoprecipitados HA-2B4 se analizaron para
p2B4 como se describe en ( un ). 2B4 fosforilacin se calcul como la
densidad Py dividido por el total de densidad HA-2B4 y normalizado
a trans . Los datos se presentan como media desviacin estndar de
al menos dos experimentos independientes. ( D , e ) NKL ( d ) o primaria
NK clulas ( e ) se trataron previamente con o sin PI-PLC y se cultivaron
sin contacto clula a clula para establecer cis fosforilacin basal
mediada de 2B4. Las clulas se mezclan con clulas diana Ba / F3-CD48
para
desencadenar
2B4
a
travs
de
CD48
en trans . 2B4
inmunoprecipitados se analizaron para la fosforilacin de tirosina. El
anlisis densitomtrico de la fosforilacin de tirosina en relacin con 2B4
se llev a cabo como en ( a ). Los datos se muestran como media
desviacin estndar de tres (NK) o cinco (NKpop) experimentos
independientes.Densidad relativa de la trans muestra se pone a 1. Para
una mejor comparabilidad, carriles blot se muestran en el orden en que

aparecen en los grficos de barras. Borrones originales se muestran en

el material suplementario electrnico, figura S4.

Estos resultados plantean la cuestin de si el grado de fosforilacin basal podra

afectar el nivel de fosforilacin inducida que es causada por la activacin de 2B4
en trans por las clulas diana que expresan CD48-. Por lo tanto, las clulas NKL se
pre-trataron con PI-PLC y se cultivaron con o sin contacto clula a clula para
establecer los niveles de fosforilacin de lnea de base.Posteriormente, estas
clulas se mezclaron con clulas Ba / F3 que expresan CD48 para desencadenar
2B4 en trans . Como era de esperar, la celda de mezcla con las clulas diana
susceptibles conducido a una induccin adicional de 2B4 fosforilacin ms all de
los niveles de referencia ( figura 5 d ). Curiosamente, la cantidad de fosforilacin
inducida 2B4 fue menor en las clulas donde 2B4 tambin interactu con CD48
en cis . Resultados similares tambin se obtuvieron con las clulas NK recin
aisladas primaria humanos ( figura 5 e ), lo que sugiere que el cis interaccin
entre 2B4 y CD48 puede limitar la trans interaccin con clulas diana CD48 que
expresan y como resultado reducir 2B4 fosforilacin inducida por contacto con
CD48 expresando clulas diana.
Por lo tanto, si el tratado cis interaccin entre CD48 2B4 y tiene consecuencias
para las funciones efectoras de clulas NK. La eliminacin de CD48 mediante el
tratamiento con PI-PLC aument la lisis mediada por clulas NK de HEK293T CD48
que expresan y las clulas diana Ba / F3 ( figura 6 ). Sin embargo, el tratamiento
con PI-PLC elimina todas las protenas de superficie ancladas a GPI, lo que podra
influir en la actividad de las clulas NK de manera independiente de 2B4. Por lo
tanto, tambin a prueba para la lisis de, control transfectadas las clulas diana
CD48 negativas. Es importante destacar que esta lisis no se vio afectada por el
tratamiento con PI-PLC, lo que sugiere que el efecto era especfico para la
activacin de clulas NK mediada por 2B4 y fue probablemente debido a la
eliminacin de CD48 de las clulas NK.Esto demuestra que el cis interaccin entre

2B4 y CD48 en la superficie de las clulas NK puede limitar la trans interaccin de

2B4 y por lo tanto modular la 2B4 compromiso, la fosforilacin y, posteriormente,
mediada por 2B4 citotoxicidad de clulas NK.

La Figura 6.
Modulacin de la citotoxicidad de clulas NK CD48 por
2B4- cis interaccin. Citotoxicidad mediada por 2B4 de NK92.C1 se
determin en un 4 h estndar 51 ensayo de liberacin de Cr contra
clulas diana que expresan CD48. Los datos muestran un experimento
representativo de al menos tres, cada uno realizado por triplicado.

3. Discusin
Nuestros datos muestran que 2B4 no slo puede unirse a CD48 en trans , pero
tambin interacta con CD48 en cis mediante el uso de la misma interfaz de
unin. Como se propone 2B4 a adoptar una estructura en forma de varilla durante
la interaccin con CD48 en trans [ 13], la unin a su ligando en la misma clula
en cis requiere grandes reordenamientos intramoleculares e implica una gran
flexibilidad estructural de la parte extracelular de 2B4 y posiblemente tambin de
CD48. Otros receptores han demostrado que la interaccin con sus ligandos

en cis y el enlazador flexible entre los dominios similares a Ig se proponen ser

crucial para cis interaccin de LILRs con MHC I [ 16 ]. Anlisis funcional y modelado
de los dominios similares a Ig de LILRB2 [ 29 ] y Drosophila Dscam [ 30 ] apoyan
nuestra conclusin de que el corto enlazador entre los dominios similares a Ig de
2B4 es esencial para proporcionar flexibilidad estructural para permitir la unin a
CD48 en cis y en trans . De hecho, nuestra betaS variante rgida 2B4 llevar el
motivo -captulo CD4 ms rgida entre los dos dominios similares a Ig era
defectuoso en cis interaccin, mientras que la unin a CD48 soluble o CD48 sobre
las clulas vecinas quedaron intactas. Los mutantes de delecin que carecen de
toda la membrana proximal de dominio similar a Ig de CD48 2B4 o an eran
capaces de interactuar en cis . Por lo tanto, las regiones tallo de las molculas de
la

superficie

podran

proporcionar

una

flexibilidad

adicional

para

permitir cis vinculante.

Hemos demostrado que la fosforilacin constitutiva de 2B4 SGSTI se produce slo
en presencia de CD48, y que cis de unin es suficiente para inducir niveles
sustanciales

de

la

fosforilacin

de

la

lnea

de

base. Hemos

demostrado

anteriormente que 2B4 es reclutado activacin-dependiente de microdominios de

membrana y que este reclutamiento es esencial para la fosforilacin del receptor
[ 28 ]. A medida que el CD48 anclado a GPI est asociada constitutivamente con
microdominios de membrana, su cis interaccin con 2B4 podra ayudar a localizar
2B4 en estos dominios de membrana especializadas y con ello inducir la
fosforilacin del receptor. Similares resultados se describen para un nmero
creciente de receptores. En las clulas B, cis unin de CD22 a los cidos silicos
conduce a la fosforilacin de CD22 ITIMs y asociacin constitutiva con SHP1
[ 31 , 32 ]. Esta sealizacin inhibidora tnica se cree que aumenta el umbral para
la activacin de clulas B y para prevenir la activacin de clulas B no deseada /
espontnea [ 33 , 34 ]. Del mismo modo, la unin de PIRB ratn para MHC I en la
misma celda se muestra para amortiguar la activacin de mastocitos accidental
por asociacin constitutiva con SHP1, lo que aumenta el umbral para la activacin
de las seales [ 29 ]. Estos resultados plantean la cuestin de si cis interaccin de
2B4 puede influir en las funciones de clulas NK de una manera similar. 2B4
tambin puede tener funciones inhibitorias en la ausencia de SAP [ 35 ] y hemos

demostrado anteriormente que Csk, SHP1 / 2 y barco puede unirse a la tercera

ITSM de 2B4 [ 8 ] para mediar estas seales negativas. Sin embargo, hasta ahora,
no hemos podido demostrar una correlacin entre cis interaccin y asociacin con
molculas de sealizacin inhibitoria. Adems, la interaccin entre 2B4 y CD48
puede ser importante para algunas funciones de CD48, como se demostr la
reticulacin de CD48 en las clulas NK de ratn para inducir la produccin de IL-13
a travs de co-agrupacin de 2B4 y la sealizacin posterior a travs de 2B4 [ 36 ].
Cis unin de Ly49A a MHC I no induce la fosforilacin del receptor [ 37 ], pero en
lugar reduce Ly49A accesibilidad para la unin a MHC I ligando en trans mediante
el enmascaramiento del receptor [ 18 , 37 ]. Este secuestro de Ly49A inhibitorios
accesibles en trans se cree que reducir el umbral para la activacin de seales. Un
nmero cada vez mayor de los receptores, se mostr a encontrarse con sus
ligandos en cis . Ejemplos de ello son la NK receptores de las clulas NKp44 [ 38 ],
Siglec7 [ 39 ] y la entrada de herpesvirus mediador (HVEM) unin a BTLA (B y T
atenuador de linfocitos) en las clulas T [ 40 ]. De manera similar a los receptores
Ly49,cis unin no induce la fosforilacin del receptor o la sealizacin aguas abajo,
lo que sugiere que la modulacin del umbral de activacin se produce por
inhibicin competitiva de encuentro de los ligandos activadores en trans . Del
mismo modo, nuestros datos muestran que el enmascaramiento de 2B4 por CD48
de clulas NK suprime la unin de CD48 soluble e interfiere con la sealizacin
mediada por 2B4 durante el encuentro de las clulas diana que expresan CD48. Por
lo tanto, se podra considerar un papel general de cis interacciones en la
regulacin de la funcin del receptor mediante la modulacin del umbral para el
acoplamiento del receptor en trans .
Adems de su papel en la configuracin de umbral de activacin de las clulas NK,
Ly49 cisunin fue tambin demostrado su impacto en la educacin de las clulas
NK de ratn [ 20 ].Ambos cis y trans unin de Ly49A parecen importantes para la
educacin, como mutantes Ly49 solamente capaces de interactuar en trans no son
suficientes para la educacin [ 41 ]. No hay evidencia de cis unin del inhibidor
NKG2 / CD94 o KIR2DL1 [ 42 ], que son necesarios para la educacin de las clulas
NK en los seres humanos [ 43 ]. El SAP adaptador de sealizacin est ausente en

el desarrollo de clulas NK temprano, lo que resulta en inhibidora 2B4 funciones

[ 44 , 45 ]. Es, por lo tanto, interesante especular que la 2B4 cis interaccin
tambin puede jugar un papel durante el desarrollo de las clulas NK. HPN
(hemoglobinuria paroxstica) pacientes llevar una mutacin somtica en el PIGA gen. Mosaicismo de clulas madre hematopoyticas resultados en la expansin
clonal de clulas de la sangre que carecen de protenas ancladas a GPI. Un
subconjunto de clulas NK de donantes PNH carece de CD48. La consiguiente falta
de 2B4 cis interaccin puede ser una razn por la que estas clulas NK muestran
un repertorio sesgada KIR [ 46 ]. Adems, un nmero reducido de clulas NK se
encuentran en la periferia debido a la funcin de quimioquinas defectuoso
[ 47 ]. En ensayos funcionales, las clulas NK de pacientes PNH no mostraron
defectos de la citotoxicidad [ 48 ].Sin embargo, estos ensayos se realizaron con
clulas diana K562 que carecen de CD48. Por lo tanto, no se sabe cmo la ausencia
de CD48 2B4 afecta a las funciones mediadas en estas clulas NK.
2B4 pertenece a la familia de las RSR. Con la excepcin de 2B4 todos estos
receptores son homophilic [ 4 ]. Como consecuencia, cualquier clula que expresa
un SRR tambin expresa el ligando para este receptor en su superficie. Est, por lo
tanto,

interesante

especular

a cis interacciones. Si

bien

que
es

estos
difcil

receptores

tambin

distinguir

se

dedican

experimentalmente

entre trans y cis interacciones de los receptores homoflicas, es probable que su

funcin tambin est regulada por cis interacciones en la superficie de la misma
clula.

4. Material y mtodos
4.1. Reactivos y clulas
Por citometra de flujo Los siguientes anticuerpos (Abs) fueron utilizados. Marcado
con PE anti-CD56 (MEM-188), conjugado con FITC anti-CD48 Ab (MEM-102),
marcado con PE anti-2B4 (C1.7) marcado con FITC, PE y APC o de burro anti-IgG de
cabra fueron adquiridos de BioLegend. Marcado con PE de cabra anti-IgG de ratn
se adquiri de Jackson ImmunoResearch. El mAb anti-isoleucina cremallera (ILZ-11)
[ 49 , 50 ]

conejo-anti-2B4

[ 26 ]

Los

anticuerpos

se

han

descrito

anteriormente. Protenas de fusin CD48-ILZ y respectivos controles negativos

NKp30-ILZ, NKp44-ILZ y CS1-ILZ se produjeron y se purific como se describe
anteriormente [ 49 , 50 ].
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para la inmunoprecipitacin y el
Western Blot.MOPC21 (Sigma), ratn-anti-2B4 (C1.7 clon) y de conejo anti-HA (clon
C29F4, Cell Signaling Technology) se utilizaron para la inmunoprecipitacin. Las
membranas se sondearon con biotinilado anti-fosfotirosina (4G10, Upstate),
policlonal de cabra anti-CD48 y anticuerpos de cabra anti-2B4 biotinilados (ambos
de R & D Systems) y de conejo anti-2B4 [ 26 ], y conjugado con HRP secundaria
anticuerpos

de

cabra

-anti-conejo,

cabra

anti-ratn,

burro

anti-cabra

estreptavidina (todo Dianova / Jackson).

Todos los medios se adquirieron de Gibco, Life Technologies y se complementaron
con 10% de FCS y penicilina / estreptomicina a menos que se indique lo
contrario. Clulas NK primarias policlonales (NKpop) se purificaron a partir de PBMC
utilizando la clulas NK kit humano Original (Invitrogen), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Las clulas NK fueron entre 90% y 99% NKp46
CD3 - y CD56

, como se confirma por citometra de flujo, y se cultivaron en IMDM,

suero humano al 10%, 1% de aminocidos no esenciales, piruvato de sodio 1% y

100 U ml

-1

IL-2 (NIH repositorio de citoquina), o IMDM, 10% FCS, penicilina /

estreptomicina y 100 u ml

-1

IL-2.

Las lneas celulares utilizadas fueron clulas HEK293T, estable o transitoriamente

transfectadas con pBABEplus-CD48, pBABEplus-2B4 y el vector vaco pBABEplus,
respectivamente, cultivadas en DMEM que contena 0,5 mg ml
el anlisis de la expresin de superficie 2B4, 2 10
placas de 48 pocillos (de contacto celular) o 75 cm

5
2

-1

puromicina. Para

clulas se cultivaron en

frascos (contacto clula)

durante 8-24 h. La lnea de clulas pre-B murina Ba / F3 que expresan

establemente CD48 fue cultivada en RPMI suplementado con 50 mM -ME y 1 mg
ml-1 puromicina. La lnea celular Jurkat deficientes GPI-J7.X y la lnea celular Jurkat
de rescate J7.P [ 23 ] eran una especie de regalo de Frank Momburg, DKFZ,
Heidelberg, Alemania. Las clulas se mantuvieron en RPMI, J7.P se mantuvieron
bajo seleccin con 750 mg ml

-1geneticina.

Clulas Jurkat transfectadas de manera

estable con pMOW-2B4 se cultivaron con 0,5 mg ml

-1

puromicina. La lnea de IL-2

independiente de clulas NK NK92.C1, de forma estable que expresa IL-2, se

cultiv en alphaMEM que contiene 12,5% de FCS, 12.5% de suero de caballo, 1%
de penicilina / estreptomicina y 50 mM -ME.
4.2. mutagnesis
Variantes mutadas de 2B4 y CD48 se generaron mediante el uso de tcnicas de
PCR estndar como se describe en otro lugar. El mutante E70A K68A 2B4 se ha
generado utilizando el cebador publicado en Mathew et al. [ 24 ]. Los siguientes
cebadores se utilizaron para la mutagnesis.

4.3. Citometra de flujo

Se realiz un anlisis de citometra de flujo de clulas intactas y permeabilizadas
utilizando mAbs o protenas de fusin ILZ como se describe [ 49 ].La cuantificacin
de 2B4 y CD48 eptopos por clula se realiz utilizando el Kit de QiFi (Dako) segn
las instrucciones del fabricante. Todas las muestras se midieron en un citmetro o
LSR Fortessa y los datos fueron analizados utilizando el F BAJA J O software
(TreeStar, Inc.). El ndice de fluorescencia relativa (RFI) para la comparacin de 2B4
niveles de expresin se calcul restando la intensidad media de fluorescencia (MFI)
de tincin con el anticuerpo de control de la IMF de la tincin especfica y
dividiendo el resultado por el MFI de la tincin de control: RFI = (IMF especfica - el
control de las IFM) de control / IMF. Significaciones estadsticas se calcularon con
ANOVA de dos vas y despus de la prueba de Bonferroni.

4.4. La reticulacin qumica

Para la reticulacin qumica, 2 10

clulas Jurkat por muestra se lavaron dos

veces con PBS enfriado en hielo y luego se resuspendieron en 250 l de PBS que
contiene 0,7 mM bis (sulfosuccinimidil) suberato (Pierce, Thermo Scientific). Las
muestras se incubaron durante 30 min a 4 C. La reaccin se inactiv mediante la
adicin de 20 mM (fc) de Tris-HCl, pH 7,4. Las clulas se lisaron en 50 l de tampn
de lisis (NaCl 150 mM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10% de glicerol, 0,5% Triton X-100,
EDTA 2 mM, NaF 10) suplementado con 0,1% de SDS, 0,5% de Na -deoxycholate,
PMSF 1 mM y 0,1 mg ml

-1

equivalente de 0,5 10

DNasa. Los lisados se aclararon por centrifugacin y un

6

clulas se analiz para 2B4 y CD48 mediante la

reduccin de SDS-PAGE y Western Blot.

4.5. tratamiento PI-PLC

Las clulas se resuspendieron en medio a una concentracin de 1 x 10
ml

-1

clulas

y se incubaron durante 1 h a 37 C en la ausencia o presencia de 1 U ml

-1

PI-

PLC (Sigma-Aldrich) y despus se lavaron con medio de . La eliminacin de CD48

se control por citometra de flujo y las clulas se us inmediatamente en ensayos
funcionales.
4.6. Determinacin de 2B4 fosforilacin
Para el establecimiento de 2B4 fosforilacin lnea de base, 1 10

clulas Jurkat

por muestra se incubaron sin contacto de clula a clula en un 175 cm

con el contacto de clula a clula en un 9,6 cm

frasco o

(placa de 6 pocillos) bien para al

menos 2 horas a 37 C. Luego, las clulas se pusieron inmediatamente en hielo y

se sometieron a lisis y la inmunoprecipitacin.Alternativamente, PI-PLC-tratada o
clulas NKL no tratados (1 10
un 175 cm

) se incubaron sin contacto de clula a clula en

frasco o con el contacto de clula a clula en un 9,6 cm

tambin (de

6 pocillos placa) durante 1 hora a 37 C. Luego, las clulas se enfriaron en hielo,

se sedimentan por centrifugacin y se lisaron. Fosforilacin 2B4 se analiz por
inmunoprecipitacin y Western Blot.
NKL HA-2B4 se trataron con o sin PI-PLC, se lav y se incub durante 30 min sin
contacto de clula a clula en un matraz T175 para eliminar basal 2B4
fosforilacin, y a continuacin, poner inmediatamente en hielo. -Pre tratada NKL
HA-2B4 se mezclaron con una cantidad igual de clulas normales NKL, se
centrifuga para establecer el contacto de clula a clula y se incubaron durante 10
min ya sea en hielo o en un bao de agua 37 C. La incubacin se detuvo por
adicin

de

PBS

enfriado

en

hielo. Las

clulas

se

lisaron

HA-2B4

se

inmunoprecipit.
Para determinar objetivo 2B4 fosforilacin inducida por clulas, NKL o clulas NK
primarias (1 10

) fueron tratados con o sin PI-PLC, se lavaron y se incubaron

durante 30 min sin contacto de clula a clula en un matraz T175 para eliminar
basal 2B4 fosforilacin, y luego poner inmediatamente en hielo. Clulas NK Pre-

tratadas se mezclaron con (0,5 10

) Ba / F3-CD48, se centrifuga para

establecer el contacto de clula a clula y se incubaron durante 10 min ya sea en

hielo o en un bao de agua a 37 . La incubacin se detuvo por adicin de PBS
enfriado en hielo. Fosforilacin 2B4 se analiz por inmunoprecipitacin y Western
Blot.
4.7. La inmunoprecipitacin y el Western Blot
Para la inmunoprecipitacin, las clulas se lisaron en tampn de lisis (NaCl 150
mM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10% de glicerol, 0,5% Triton X-100, EDTA 2 mM, NaF
10) suplementado con 1 mM Na-ortovanadato, PMSF 1 mM. lisados Pre-despejadas
se incubaron primero durante 1 hora a 4 C con 0,5 g de IgG1 control (MOPC21),
seguido de incubacin con 0,5 mg del anticuerpo especfico indicado, cada uno
acoplado a la protena de 10 l G Dynabeads (Life Technologies). Las perlas se
lavaron tres veces en tampn de lisis fro y se eluyeron las protenas en 2,5
tampn de muestra reductor (5% de SDS, 25% de glicerol, 12,5% de 2-ME, 0,156 M
Tris-Cl (pH 6,8), y 0,01% de azul de bromofenol) . Para el Western Blot, las
protenas se separaron en geles de SDS al 4-12% NuPAGE (Life Technologies) y se
transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). Membrana se bloque con 5%
de leche en polvo en PBS-T y se incubaron a 4 C durante la noche con los
anticuerpos primarios indicados. Despus del lavado, la membrana se incub con
el respectivo anticuerpo secundario conjugado con HRP y desarrollado utilizando
SuperSignal West Pico o Dura (Pierce).
4.8.

51

ensayo de liberacin de cromo

Las clulas diana se marcaron en 100 medio de ensayo l (IMDM con 10% de FCS y
1%

de

penicilina

estreptomicina) con

100

Ci

51

Cr

(Hartmann

Analytik,

Braunschweig, Alemania) durante 1 h a 37 C en una atmsfera humidificada 5%

de CO
10

incubadora . Las clulas se lavaron dos veces y se resuspendieron a 5 x

clulas ml

-1

en medio de ensayo. Cinco mil clulas diana / pocillo se utilizaron

en el ensayo. NK92.C1 se distribuyeron en una placa de 96 pocillos de fondo en

U. Los efectores se mezclaron con clulas diana marcadas en diferentes relaciones
de efector a diana. Mxima

51

de liberacin Cr se determin incubando clulas

diana en 1% de Triton X-100. Para la liberacin espontnea, los objetivos fueron

incubados sin efectores en medio de ensayo solo. Las placas se incubaron durante
4 horas a 37 C y se recogi el sobrenadante.

51

Cr liberacin se midi en un

contador gamma. Liberacin especfica porcentual se calcul como [(liberacin

experimental

liberacin

espontnea)

(liberacin

mxima

liberacin

espontnea)] x 100. Todas las muestras se realizaron por triplicado.

Contribuciones de los autores

MC realiz experimentos, analizados los datos y escribi el manuscrito; SW realiz
experimentos y analizaron los datos; CW analizaron los datos y escribi el
manuscrito.

Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Fondos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft
(DFG, WA-1552 / 5-1). La publicacin de este artculo fue financiado por el fondo de
acceso abierto de la Asociacin Leibniz.

Reconocimiento
Estamos muy agradecidos a Peter Sun para proporcionar asesoramiento sobre la
estructura y 2B4 a Frank Momburg para proporcionar reactivos.

Recibido 1 de febrero de 2016.

Aceptado 24 de de abril de 2016.

2016 Los Autores.

Publicado por la Royal Society, en los trminos de la licencia Creative Commons

Atribucinhttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ , que permite el uso
ilimitado, siempre que el autor original y la fuente se acreditan.