UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE INGENIERIA Y CIENCIAS QUMICAS

ZONA XALAPA
PROGRAMA EDUCATIVO
INGENIERA AMBIENTAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DEL SUELO

DEL CAMPO PETROLERO MIGUEL ALEMN, PARA SU POSIBLE
USO EN LA REMEDIACIN DE SUELOS CONTAMINADOS POR
HIDROCARBUROS
TESIS
QUE PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA EDUCATIVA
DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

PRESENTA
DANIELA MARGARITA COBOS CHONG

DIRECTOR
DR. BENITO HERNNDEZ CASTELLANOS

CO-DIRECTOR
DR. JOS ANTONIO GARCA PREZ
XALAPA, VER.

2014

AGRADECIMIENTOS
A Dios, por permitirme llegar hasta donde he llegado, por este logro ms en mi
vida y por la vida tan maravillosa que me ha otorgado. A sus arcngeles y ngeles
por acompaarme y guiarme a lo largo de la carrera, por su apoyo y fortaleza en
momentos difciles y su inmenso amor.
A mi mam, por todo su esfuerzo y sacrificio, por apoyarme en todo momento, por
los valores que me ha inculcado y, por haberme dado una excelente educacin.
Sobre todo por ser un gran ejemplo de fortaleza. Por haberme formado como una
mujer de bien, por ser la mujer que me dio la vida y me ense a vivirla no hay
palabras en este mundo para agradecerte, mam.
A mis abuelitos, Papi Toco y Mami Fina, por todo su apoyo y amor incondicional
en cada aspecto de mi vida.
Al Doctor Benito, por su orientacin, su disposicin y conocimientos brindados, su
motivacin y apoyo recibido y, por haberme brindado la oportunidad de desarrollar
esta tesis. Por darme la oportunidad de crecer profesionalmente y aprender cosas
nuevas.
Al Doctor Pepe Too, por su confianza y apoyo en la elaboracin de la tesis.
A Katy, por su gran ayuda y colaboracin en este trabajo, por todo el conocimiento
brindado, su apoyo incondicional, su tiempo y gran paciencia, por compartir
conmigo ese amor por la microbiologa. Sobre todo por ensearme a no darme por
vencida cuando las cosas no salen como esperaba, a seguir intentndolo una y
otra vez hasta obtener lo que se desea.
A Diana y Betty, que adems de ser mis mejores amigas fueron unas excelentes
compaeras de tesis, por su gran amistad, ayuda y apoyo en toda la carrera, por
todos esos momentos que hemos pasado juntas.
A Alejandro, por brindarme su cario desde el da que lo conoc, por estar conmigo
en mis peores y mejores momentos, por su amor y por esas emociones que no
saba que tena.
A Miguel, por su gran ayuda en el laboratorio.
A los miembros del jurado de esta tesis, por sus sugerencias y comentarios.

DEDICATORIAS
Esta tesis la dedico principalmente a mi mam, que estuvo siempre a mi lado
brindndome su apoyo, dndome a cada instante una palabra de aliento para
llegar a culminar mi profesin y por ser una mam bien padre. Gracias mami,
sabes que te estoy eternamente agradecida. Te dedico este trabajo con todo mi
corazn.
A Papi Toco, por su inmenso amor y por ser el pilar de la familia. Eres el hombre
de mis ojos. Gracias por estar conmigo a lo largo de toda mi vida, por esa felicidad
que irradias, tu gran sonrisa llena de amor, por las carcajadas y regaizas.
A Mami Fina, por estar siempre ah, cuidarme y amarme, por su lindo corazn y
por ser mi segunda madre.
A mi ta Eli, por abrirme las puertas de su casa. Porque te debo la fascinacin que
siento por la vida ms all de la muerte, sobre el alma, los seres de luz, porque
gracias a ti me acerqu a un mundo que no saba que exista y porque gracias a
eso me convert en una persona espiritual.
A mi prima Caro, mi hermanita, mi cmplice. Por tus palabras de nimo, tu apoyo,
tu compaa y todas las risas.

NDICE
NDICE DE FIGURAS ...................................................................................................................... 6
NDICE DE TABLAS ........................................................................................................................ 7
RESUMEN ......................................................................................................................................... 9
INTRODUCCIN ............................................................................................................................ 11
CAPTULO l. GENERALIDADES ................................................................................................. 13
1.2 Antecedentes........................................................................................................................ 13
1.3 Planteamiento del problema .............................................................................................. 15
1.4 Justificacin .......................................................................................................................... 17
Objetivo general ...................................................................................................................... 19
Objetivos especficos ............................................................................................................. 19
1.6 Hiptesis................................................................................................................................ 19
CAPTULO ll. MARCO TERICO................................................................................................ 20
2.1 El suelo .................................................................................................................................. 20
2.1.1 Suelo del rea de estudio............................................................................................ 22
2.2 Contaminacin del suelo .................................................................................................... 25
2.3 Derrames petroleros ............................................................................................................ 27
2.4 Hidrocarburos ....................................................................................................................... 28
2.4.1 Degradacin microbiana de los HAPs....................................................................... 33
2.4.2 Antraceno....................................................................................................................... 35
2.5 Tecnologas de remediacin .............................................................................................. 35
2.6 Biorremediacin ................................................................................................................... 39
2.7 Microorganismos del suelo................................................................................................. 40
2.8 Bacterias ............................................................................................................................... 41
2.9 Bacterias hidrocarburolticas .............................................................................................. 43
2.10 rea de estudio .................................................................................................................. 45
CAPTULO III. METODOLOGA .................................................................................................. 47
3.1 Muestreo ............................................................................................................................... 48
3.2 Anlisis fsicos y qumicos del suelo ................................................................................. 49
3.2.1 Textura ........................................................................................................................... 49
3.2.2 pH.................................................................................................................................... 49
3.2.3 Materia orgnica ........................................................................................................... 50

3.2.4 Nitrgeno ....................................................................................................................... 50

3.2.5 Fosforo extrable ........................................................................................................... 51
3.2.6 Cationes intercambiables (Ca2, Mg, Na y K) ............................................................ 51
3.3 Anlisis de los hidrocarburos ............................................................................................. 51
3.3.1 Hidrocarburos totales de petrleo fraccin pesada................................................. 52
3.3.2 Hidrocarburos aromticos policclicos ....................................................................... 53
3.4 Pruebas microbiolgicas..................................................................................................... 53
3.5 Pruebas bioqumicas ........................................................................................................... 54
3.6 Pruebas de degradacin de antraceno ............................................................................ 55
3.7 Anlisis estadsticos ............................................................................................................ 55
CAPTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIN.......................................................................... 56
4.1 Parmetros fsicos y qumicos del suelo .......................................................................... 56
4.2 Caracterizacin de hidrocarburos totales de petrleo fraccin pesada e
hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs) ....................................................................... 59
4.3 Aislamiento e identificacin de bacterias ......................................................................... 60
4.4 Pruebas bioqumicas ........................................................................................................... 62
4.5 Degradacin de antraceno por las bacterias ................................................................... 63
4.6 Conclusin ............................................................................................................................ 65
BIBLIOGRAFA ............................................................................................................................... 67
Anexo A: Glosario para la determinacin de parmetros fsicos y qumicos del suelo....... 79
Anexo B: Glosario para la determinacin de hidrocarburos poliaromaticos y fraccin
pesada.............................................................................................................................................. 95

NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Suelos del estado de Veracruz. .................................................................................. 25

Figura 2. Estructura qumica y sistema de numeracin de anillo de los 16 HAPs

prioritarios. ....................................................................................................................................... 30

Figura 3. Reacciones iniciales del metabolismo de los HAPs. .............................................. 34

Figura 4. Mapa de los sitios de muestreo en el campo petrolero Miguel Alemn, (los
nmeros indican los pozos petroleros en estudio con sus respectivos controles). ............. 46

Figura 5. Fotos de los monolitos realizados. .............................................................................. 48

Figura 6. Crecimiento del gnero Edwardsiella en el medio con antraceno como nica
fuente de Carbono.......................................................................................................................... 64

Figura 7. Crecimiento de Citrobacter en el medio con antraceno como nica fuente de

Carbono. .......................................................................................................................................... 64

Figura 8. Crecimiento de la especie C. Neteri en el medio con antraceno como nica

fuente de Carbono.......................................................................................................................... 65

NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Comparacin de los efectos de algunos contaminantes en suelo. ......................... 26

Tabla 2. Datos relativos a los efectos carcinognicos, genotxicos y mutagnicos de

algunos PAHs. ................................................................................................................................ 32

Tabla 3. Ventajas y Desventajas de las tecnologas de Remediacin, clasificadas de

acuerdo con el tipo de tratamiento. ............................................................................................. 38

Tabla 4. Poblaciones promedios de microorganismos determinados en suelos. ................ 41

Tabla 5. Parmetros fsicos y qumicos del suelo, comparacin entre el suelo contaminado
y el suelo no contaminado (suelo control). Letras minsculas iguales entre el suelo
contaminado y el no contaminado indican que no existen diferencias significativas (p
<0.05). .............................................................................................................................................. 57

Tabla 6. Parmetros fsicos y qumicos del suelo en los diferentes sitios de muestreo del
campo petrolero Miguel Alemn. ................................................................................................. 57

Tabla 7. Comparacin entre la concentracin de Hidrocarburos Fraccin pesada e

hidrocarburos aromticos policclicos entre el suelo contaminado y el suelo no
contaminado (suelo control) del campo petrolero Miguel Alemn, Letras minsculas
iguales entre el suelo contaminado y no contaminado indican que no existen diferencias
significativas (p<0.05). ................................................................................................................... 60

Tabla 8. Aislamiento de bacterias. ............................................................................................... 61

Tabla 9. Pruebas bioqumicas para la determinacin de bacterias. ....................................... 62

Tabla 10. Gnero y especies de bacterias encontradas en el campo petrolero Miguel

Alemn, con capacidad para utilizar el hidrocarburo antraceno como fuente de carbono. El
Signo indica que no hubo crecimiento, signo + indica crecimiento..................................... 63

Este estudio se realiz dentro del proyecto Efecto de la contaminacin por

derrames petroleros a los organismos del suelo en Poza Rica, Veracruz,
Mxico dentro del Programa Retencin y Repatriacin del Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnologa (CONACyT). Apoyos Complementarios para la
Consolidacin Institucional de Grupos de Investigacin. Convenio MODORD-12- 2013 PCI-1054-11-13(5521699).

RESUMEN
Los derrames petroleros vertidos al suelo resultan inevitables en la industria
petrolera, debido a los grandes volmenes de hidrocarburos que se manejan. En
sitios como Poza Rica Ver., donde existe una alta actividad petrolera las
contingencias ambientales son frecuentes.
Los derrames de hidrocarburos ocasionan impactos negativos a los
ecosistemas, adems, representan importantes prdidas econmicas y son un
peligro para la salud. Los derrames pueden ocurrir por fugas, rupturas de ductos,
por tomas clandestinas o durante su transporte.
En la actualidad existen diferentes tcnicas de remediacin, siendo las
biolgicas la mejor alternativa para la recuperacin de un suelo contaminado
adems de ser las menos costosas. Los tratamientos biolgicos consisten en el
uso de organismos vivos para atenuar o remover contaminantes, algunos de estos
organismos son las bacterias, las cuales han demostrado tener la capacidad de
transformar una gran variedad de contaminantes orgnicos e inorgnicos a
sustancias inocuas.
Por lo anterior en este estudio se caracteriz el suelo y los contaminantes
presentes del campo petrolero Miguel Alemn en Poza Rica Veracruz

y se

aislaron e identificaron los diferentes gneros y especies de bacterias del suelo.

Se observ que el suelo est contaminado con HTP fraccin pesada y dichos
contaminantes sobrepasan los niveles permitidos por la Norma Oficial Mexicana
138 y diferencias significativas fueron encontradas entre el P y la arena del suelo
contaminado y el no contaminado y al observar estas diferencias entre pozos
petroleros fueron encontradas en P, Na, K, Ca, Mg y arena. En el aislamiento ocho
gneros de bacterias fueron identificadas, las cuales fueron inoculadas en un
medio que utiliz como nica fuente de carbono al hidrocarburo poliaromtico

~9~

antraceno, con el objetivo de observar las capacidades de dichas especies en la

degradacin de este contaminante, de las cuales tres (Cedacea neteri, Citrobacter
y Edwardsiella) fueron capaces de degradar al antraceno. Con base en este
estudio estas especies podran ser utilizadas como una alternativa para la
remediacin de suelos contaminados por hidrocarburos en zonas petroleras como
Poza Rica Ver.

~ 10 ~

INTRODUCCIN
En Poza Rica, Veracruz la principal actividad econmica es la industria
petrolera por lo que hay mayor probabilidad de que el suelo de dicha zona est
contaminado debido a los derrames, por lo tanto es posible encontrar especies de
bacterias con potencial de

tolerar altos niveles

de

contaminacin

por

hidrocarburos, lo que convierte a este sitio en un lugar ideal para la bsqueda de

especies de bacterias con potencial capacidad para participar en la remocin de
estos contaminantes.
Segn estadsticas de la Procuradura Federal de Proteccin al Ambiente
(PROFEPA, 1999), entre los aos de 1997 y 2001, de 2,592 emergencias
ambientales con materiales peligrosos a nivel nacional, Petrleos Mexicanos
provoc 57 % de ellas. Entre los estados con mayores emergencias ambientales
se encuentra Veracruz, donde el 80 % de estos eventos son causados por
PEMEX. La mayora de las emergencias se presentan en ductos, provocando
derrames con sustancias como petrleo crudo, combustleo, diesel, gasolina,
turbosina, gas natural y amoniaco.
El desecho de mezclas de hidrocarburos tiene un efecto negativo en el suelo,
agua y aire. En el caso de suelo, los hidrocarburos estn expuestos a una serie de
transformaciones qumicas, fsicas y biolgicas, siendo las biolgicas las ms
interesantes debido a la posibilidad de resolver el problema.
Existen distintos mtodos para la recuperacin de un suelo contaminado pero
suelen ser muy costosas y complejas, los mtodos de biorremediacin suelen
tener un menor costo y suelen ser muy eficientes (Volke y Velasco, 2002).
En la actualidad diversos tipos de microorganismos han sido identificados
como capaces de degradar mezclas de hidrocarburos, entre ellos las bacterias
han sido las ms empleadas para los procesos de biorremediacin.

~ 11 ~

El presente estudio pretende conocer las diferentes especies de bacterias

existentes en un suelo con actividad petrolera. Al conocer que especies habitan en
este tipo de suelo, podremos saber cules tienen mayor resistencia a los
hidrocarburos, y el posible potencial de estas especies en la remediacin de
suelos contaminados por hidrocarburos. Este trabajo tambin pretende conocer
que especies de bacterias existentes en dicho suelo son capaces de llevar a cabo
la degradacin del antraceno, un hidrocarburo aromtico policclico.

~ 12 ~

CAPTULO l. GENERALIDADES
1.2 Antecedentes
Los microorganismos juegan un papel importante en la eliminacin de los
HAPs en los ecosistemas terrestres y acuticos, siendo la degradacin microbiana
el principal proceso de descontaminacin natural (Prince, 1993; Sutherland et al.,
1995). Por lo tanto es necesario un buen conocimiento y control de este proceso
natural para aplicarlo a tecnologas de biorremediacin (Whise, 2000).
La capacidad de degradacin de compuestos que contienen anillos
aromticos est ampliamente distribuida en la naturaleza, y de hecho, se han
aislado numerosas especies de bacterias y hongos degradadores de compuestos
aromticos conteniendo entre 2 y 5 anillos (Gibson y Subramanian, 1984; Cerniglia
et al., 1992; Sutherland et al., 1995; Kanaly et al., 2000).
Se han descrito una gran variedad de gneros bacterianos degradadores de
HAPs que incluyen: Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas,
Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia,
Comamonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Microbacterium, Micrococcus,
Moraxella,

Mycobacterium,

Porphyrobacter,

Pseudomonas,

Neptunomonas,
Ralstonia,

Nocardia,

Paenibacillus,

Rhodococcus,

Sphingomonas,

Streptomyces, Vibrio y Xanthomonas, segn The Biodegradative strain database

una base de datos, publicada por la Universidad de Michigan, que rene cepas
degradadoras de molculas orgnicas.
Aitken (1998) aisl 11 cepas de una variedad de sitios contaminados (aceite,
aceite de motor, tratamiento de la madera, y refinera) con la capacidad de
degradar BaP. Los organismos fueron identificados como, al menos, tres especies
de Pseudomonas, as como especies de Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia y
Sphingomonas.

~ 13 ~

Romero at al. (1998) aislaron Pseudomonas aeruginosa a partir de una

corriente fuertemente contaminada por petrleo de una refinera. Se encontr que
la especie est en crecimiento activo en altas dosis de fenantreno con la remocin
completa del contaminante en un perodo de 30 das.
Rehmann et al. (1998) aislaron Mycobacterium spp., de un suelo
contaminado por HAP de una planta de gas, que fue capaz de utilizar pireno como
nica fuente de carbono y energa.
Yuan et al. (2002) aislaron Pseudomons uoresens y Haemophilus spp de un
sitio de eliminacin de residuos petroqumicos con capacidad de degradar
fenantreno, antraceno, fluoreno y acenafteno.
Dean-Ross et al. (2002) aislaron dos cepas bacterianas (Mycobacterium
avescens y Rhodococcus spp) a partir de sedimentos del ro Grande Calumet de
dos sitios diferentes. Se comprob que ambas bacterias fueron capaces de
degradar HAP. M. avescens degrad antraceno y Rhodococcus spp pireno.
De acuerdo a Benavides et al. (2007) las cepas aisladas e identificadas de
los lodos contaminados con capacidad degradadora de hidrocarburos son
Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris,
Proteus penneri y Acinetobacter iwoffi.
Len et al. (2009) identificaron 5 gneros de bacterias diferentes con alta
capacidad hidrocarburoltica y de produccin de biosurfactantes: Enterobacter,
Pantoea, Citrobacter, Klebsiella y Comamonas.
En un estudio por Tang et al (2010) se aplicaron Edwardsiella tarda,
Bacterium aliphaticum, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Pseudomonas
maltiphilia,

Fusarium

vertiaculloide,

Botryodiphodia

thiobroma,

Fusiarum

oxysporum, Cryptococcus neofomas, Aspergillus niger y Candida tropicales como

microorganismos para remediar un suelo contaminado por petrleo.

~ 14 ~

1.3 Planteamiento del problema

La Industria petrolera es la actividad econmica ms rentable, no slo para
Mxico sino para muchos pases; el petrleo es el recurso natural que sustenta el
consumo energtico a nivel mundial. La industria petrolera Mexicana (PEMEX)
actualmente es la ms importante en Amrica Latina, generado por la enorme
produccin de crudo que se refleja en sus exportaciones.
Sin embargo las diferentes actividades de la industria petrolera como son la
perforacin, extraccin, refinacin y traslado traen consecuencias negativas al
medio ambiente y a la salud de los organismos.
En Mxico se estima que entre el periodo de 2000-2013 fueron derramados
un total de 13,176,654 litros de petrleo crudo (Comisin Nacional de
Hidrocarburos, 2013). De acuerdo a los informes de PEMEX, existe una amplia
diferencia entre la cantidad de derrames de hidrocarburos producidos en tierra y
mar, pues se calcula que ms del 80% de los casos de derrames reportados entre
el periodo de 2001 al 2007 se generaron en tierra (Rsendez, 2009). Los
derrames en tierra generalmente ocurren principalmente por ruptura de ductos, y
su transporte.
Los principales hidrocarburos derramados que afectan la salud de los
organismos son la fraccin pesada (por ser mayormente txicos y contaminantes)
y los hidrocarburos poliaromticos, la Agencia de Proteccin al Ambiente de los
Estados Unidos por sus siglas en ingls EPA (U.S. Environmental Protection
Agency) ha identificado 16 de ellos como prioritarios por ser potencialmente
carcinognicos, mutagnicos y teratognicos.
Adems se ha visto que los derrames tambin afectan las propiedades
fsicas y qumicas del suelo, como la materia orgnica, el P extractable, el N total y

~ 15 ~

el pH as como la biodiversidad biolgica, causando un deterioro ambiental y por

ello la modificacin de los procesos naturales.
En ciudades petroleras como Poza Rica, Ver, en donde existe una gran
cantidad de pozos petroleros y por consiguiente hay una gran cantidad de
derrames, la mayora de estos derrames no fueron remediados oportunamente y
siguen causando efectos negativos al ambiente.
El Activo de Produccin Poza Rica-Altamira fue el responsable del 28% de
las fugas en ductos e instalaciones registradas en el ao 2012 (Informe Anual
PEMEX, 2012). Cabe mencionar que tan solo en los primeros tres meses de ese
ao, se registraron 15 derrames petroleros en Poza Rica, Ver. (PROFEPA, 2012)
lo que nos da una idea de la magnitud del problema.

~ 16 ~

1.4 Justificacin
La industria petrolera en Mxico ha ocupado un papel fundamental en la
historia debido a la gran contribucin a la economa nacional. Debido a esto la
intensa actividad petrolera ha contribuido en gran medida a la contaminacin del
suelo provocada por derrames de petrleo. Tan slo en el 2012 la tendencia de
fugas y derrames en ductos de Petrleos Mexicanos present un incremento del
87% comparado con el cierre de 2011. Las principales causas de estos eventos
fueron daos por corrosin interior, corrosin exterior y falla de materiales
(PEMEX, 2012).
Los

derrames

petroleros

afectan

el

suelo,

agua,

aire

los

microorganismos que lo habitan, ocasionando la prdida de los servicios

ambientales que nos brindan.
Es importante conocer el grado de contaminacin existente en zonas
impactadas por derrames petroleros, para ejercer acciones de control y
remediacin de dichos sitios. Una alternativa para esto son los tratamientos
biolgicos como la biorremediacin al ser una tecnologa ms benfica para el
ambiente y econmicamente viable.
Algunos de los microorganismos presentes en el suelo son las bacterias las
cuales predominan por encima de los dems microorganismos.
Las bacterias son consideradas los componentes ms importantes del grupo
total de microorganismos del suelo. As, de todas las actividades del suelo
vinculadas a microorganismos, las bacterias son responsables de las ms
importantes (Alexander, 1961). Las bacterias tambin son las ms importantes en
la degradacin de hidrocarburos (Sarubbi, 2000).
Ambientalmente son muy importantes porque tienen la capacidad de
transformar los contaminantes en sustancias inocuas. Es por esto que son las ms
utilizadas para la biorremediacin de un sitio contaminado.

~ 17 ~

Este estudio en Poza Rica Veracruz cobra relevancia, ya que permitir la

bsqueda de organismos autctonos, con posible potencial en la remocin de
hidrocarburos de difcil degradacin como los poliaromticos, que podran ser
utilizados para futuras remediaciones de suelo en Poza Rica y la regin con
organismos propios del sitio, evitando el ingreso de organismos exticos y
ocasionando un desequilibrio a nivel ecolgico.
Zonas con una gran cantidad de sitios contaminados como Poza Rica
resultan ser muy interesantes para la bsqueda de nuevas especies de bacterias
que participen en la remocin de hidrocarburos por la adaptacin a dichos sitios
con ms de 20 aos de contaminacin.

~ 18 ~

1.5 Objetivos

Objetivo general
Aislar e identificar las bacterias existentes en el suelo del campo petrolero
Miguel Alemn y probar su capacidad en la degradacin de un hidrocarburo
poliaromtico, as como determinar los parmetros fsicos y qumicos del suelo y
caracterizar los hidrocarburos en dicho suelo.

Objetivos especficos

Determinar los parmetros fsicos y qumicos del suelo en la zona de

estudio (campo petrolero Miguel Alemn).

Caracterizar los hidrocarburos presentes en el suelo de la zona de estudio.

Aislar e identificar las bacterias en el suelo contaminado y no contaminado

del campo petrolero Miguel Alemn.

Determinar si las bacterias aisladas participan en la degradacin del

hidrocarburo poliaromtico antraceno.

1.6 Hiptesis
En sitios donde la principal actividad es la extraccin petrolera existen
bacterias en el suelo con capacidad para la degradacin de hidrocarburos
poliaromticos (hidrocarburolticas).

~ 19 ~

CAPTULO ll. MARCO TERICO

2.1 El suelo
El suelo puede definirse como aquel material no consolidado compuesto por
partculas inorgnicas, materia orgnica, agua, aire y organismos, que comprende
de la capa superior de la superficie terrestre hasta diferentes niveles de
profundidad; mientras que un suelo contaminado puede definirse como aqul
donde se encuentran presentes uno o ms materiales peligrosos y/o residuos de
toda ndole y que pueden constituir un riesgo para el ambiente y la salud (Medina
et al., 2001).
Se puede considerar al suelo como un gran reactor natural en el cual pueden
ser mineralizados los compuestos orgnicos y precipitados y/o adsorbidos otros
contaminantes (Bautista, 1999).
El suelo es uno de los recursos naturales ms importantes, de ah la
necesidad de mantener su productividad, es esencial para la vida, como lo es al
agua y el aire, y cuando es utilizado de manera prudente puede ser considera
como un recurso renovable.
El suelo constituye un recurso natural que desempea diversas funciones en
la superficie de la Tierra, proporcionando un soporte mecnico as como nutrientes
para el crecimiento de plantas y microorganismos. La matriz del suelo est
formada por cinco componentes principales: minerales, aire, agua, materia
orgnica y organismos vivos. Los materiales minerales son los principales
componentes estructurales y constituyen ms del 50% del volumen total del suelo.
El aire y el agua juntos ocupan el volumen de los espacios, y usualmente
conforman de 25% a 50% del volumen total. La proporcin relativa de aire/agua
flucta considerablemente con el contenido de humedad del suelo. El material
orgnico ocupa entre 3% y 6% del volumen promedio, mientras que los
organismos vivos constituyen menos del 1% (Eweis et al., 1998).

~ 20 ~

Las propiedades particulares de cada unidad de suelo, como pueden ser su

profundidad, textura, estructura, capacidad de intercambio catinico, entre otras,
determinan la capacidad de los suelos de cumplir con una o ms funciones en el
ecosistema. La funcin del suelo ms conocida es la de soporte y suministro de
nutrientes a la plantas (Brady y Weil, 1999).
Porta y Acevedo (2005) han establecido las siguientes funciones de los suelos:
Funciones ecolgicas:
Produccin de biomasa (suministro de nutrientes, aire y agua, y soporte para
las races de las plantas), proporcionando alimentos, energa renovable, materias
primas y rasgos naturales (las masas forestales proporcioan un hbitat importante
para muchas especies).
Funciones de filtrado, tampn, almacenamiento y transformacin. Estas
funciones tienen gran importancia en relacin con los contaminantes. As, por
ejemplo, el poder tampn del suelo permite que ste resista los procesos de
acidificacin o se recupere de ellos. Pero no slo esto, sino que tambin indica la
capacidad de un suelo para adsorber agroqumicos, para admitir purines como
nutrientes o sustancias que derivan de vertidos (aguas residuales, lodos de
depuradora, etc.) o de deposiciones atmoesfricas. La capidad tampn es, por
consiguiente, una funcin que hace que una sustancia aadida a un suelo pueda
ser inmovilizada y no sea tranferida a otro compartimiento ambiental.
Hbitat biolgico y reserva de genes: el conocimiento sobre la microbiologa
del suelo permite entender y cuantificar una serie de procesos que tienen lugar en
el suelo. La flora y la fauna del suelo son mucho menos aparentes que las que
estn encima del suelo, pero su papel resulta fundamental para el ciclo de muchos
elementos y para la vida de las plantas.

~ 21 ~

Funciones relacionadas con las actividades humanas:

Medio

fsico:

infraestructuras

funciones

tcnicas

de

los

suelos

industriales

como

espacio

actividades

soporte

de

socioeconmicas:

construcciones, vas de comunicacin, campos de deportes, reas recreativas,

vertidos de escombros y basura, etc.
Fuente de materias primas: gravas, arena, yeso, agua y minerales.
Herencia geognica y cultural: los suelos forman parte de un paisaje en el
que pudo haber habido asentamientos humanos, cuyos restos arqueolgicos
pueden estar enterrados y quiz permanezcan desconocidos. El suelo que tienen
encima desempea una funcin protectora, y determinadas acciones antrpicas
podran provocar su deterioro. Los suelos tambin contienen informacin
geolgica y geomorfolgica valiosa.
Por la gran importancia que representa el suelo para la vida del hombre y de
todos los seres vivos, es un recurso que se debe conservar.

2.1.1 Suelo del estado de Veracruz

En Veracruz las condiciones de temperatura y precipitacin han ocasionado

un fuerte intemperismo en las rocas sedimentarias, relativamente suaves, y aun en
las gneas, de tal manera que dominan los suelos profundos sobre los limitados
por rocas a menos de un metro de profundidad. Por otra parte, el relieve
predominantemente llano ha dado lugar a que los procesos de evolucin de los
suelos sean lentos, por lo que el 70 por ciento de los mismos son jvenes (en su
mayora arcillosos), pues no han perdido gran cantidad de sus nutrientes
naturales. Los suelos jvenes se distribuyen por todo el estado, en tanto que los
maduros, en los cuales la prdida de elementos esenciales para la nutricin de las

~ 22 ~

plantas ha sido considerable, se concentran en el sureste y representan el 30 por

ciento restante (Medina et al., 2010).
La Base Referencial del Recurso Suelo (WRB 2006), es la propuesta
vigente de clasificacin internacional para los suelos y fue elaborada en conjunto
por la International Society of Soil Science (ISSS), the International Soil Reference
and Information Centre (ISRIC) y la Food and Agriculture Organization of the
United Nations (FAO). En esta clasificacin se presentan 32 grupos de referencia
de suelos a nivel mundial, de los cuales catorce estn presentes en el estado de
Veracruz (figura 1), siendo en orden de importancia los siguientes: vertisoles,
feozems, leptosoles, cambisoles, regosoles, luvisoles, acrisoles, andosoles,
nitosoles, gleysoles, planosoles, solonetz, solonchaks y gypsisoles. Asimismo, el
INEGI (2001) en su informacin edfolgica menciona para el estado de Veracruz
la presencia de otros suelos, entre ellos: rendzinas, litosoles y xerosoles. Es
importante aclarar que tanto rendzinas como litosoles para la WRB 2006 estn
incluidos dentro del grupo de los leptosoles, mientras que los xerosoles quedan
dentro del grupo de los gypsisoles.

Los vertisoles (del latn vertere, invertir) son suelos de climas semiridos a
subhmedos y de tipo mediterrneo, con marcada estacionalidad de sequa y
lluvias. La vegetacin natural que se desarrolla en ellos incluye sabanas,
pastizales y matorrales. Se pueden encontrar en los lechos lacustres, en las
riberas de los ros o en sitios con inundaciones peridicas. Se caracterizan por su
alto contenido de arcillas que se expanden con la humedad y se contraen con la
sequa, lo que puede ocasionar grietas en esta ltima temporada. Esta propiedad
hace que aunque son muy frtiles, tambin sean difciles de trabajar debido a su
dureza durante el estiaje y a que son muy pegajosos en las lluvias (IUSS, 2007). A
nivel mundial ocupan alrededor de 335 millones de hectreas, de las cuales cerca
de la mitad se destinan al cultivo de maz (IUSS, 2007).

~ 23 ~

En Veracruz los vertisoles son, por su extensin, los suelos ms importantes, ya que representan el 17.07 por ciento de la superficie del estado. Se
localizan en diferentes zonas en la entidad, pero en el noreste son ms
abundantes. Se han formado a travs de lutitas, aresniscas, calizas, conglomerados, rocas gneas bsicas y aluviones. El horizonte A que presentan es
profundo, de textura arcillosa o de migajn arcilloso, que debido a su alto
contenido de material fino (arcillas montmorinolticas) los hace compactos y
masivos al estar secos y muy adhesivos y expandibles cuando se humedecen.
Estos cambios provocan la formacin de grietas en su superficie de por lo menos
un centmetro de ancho (Medina et al., 2010).
Para el estado de Veracruz dominan los vertisoles plicos, de color gris
oscuro, y en menor proporcin, los vertisoles crmicos, de tonos pardos, ambos
con un pH que vara de ligeramente cido a moderadamente alcalino. Su
contenido de materia orgnica es medio y la capacidad para absorber cationes de
calcio, magnesio y potasio va de alta a muy alta; encontrndose a disposicin de
las plantas cantidades altas de los dos primeros elementos, y bajas del ltimo. Los
vertisoles situados en las mrgenes del ro Pnuco contienen sales solubles y
sodio que limitan su uso agrcola; otros como los de Villa Tejeda y Paso del
Macho, son muy poco profundos; sin embargo, de manera global lo que impone
mayores restricciones para su manejo es el alto porcentaje de arcilla que los
integra, pues deben tener un grado de humedad adecuado, de otra forma si estn
muy secos o tienen exceso de agua es difcil introducir los implementos de
labranza. Actualmente en estos suelos se cultivan pastos, se realizan actividades
agrcolas de temporal y de riego, adems se desarrollan pastos inducidos, selva
mediana subperennifolia y baja caducifolia en estado secundario (Medina et al.,
2010).

~ 24 ~

Figura 1. Suelos del estado de Veracruz.

2.2 Contaminacin del suelo

El trmino contaminacin se refiere a la introduccin o incremento anormal
de sustancias que pueden ejercer un efecto daino sobre los organismos de los
ecosistemas. A veces, la contaminacin es de origen natural, pero en general,
est relacionada con la actividad del hombre, que en su bsqueda de
supervivencia dispersa sustancias agresivas, algunas de las cuales pueden ser
transformadas por organismos vivos (biodegradables) y otras que son persistentes
(no biodegradables) (Bautista, 1999).

~ 25 ~

Las sustancias naturales tambin pueden contaminar pero eventualmente

sern degradadas, en cambio las sustancias no biodegradables ingresarn a las
redes trficas y su concentracin permanecer a travs de los niveles trficos.
En el suelo, el tiempo de residencia de los contaminantes sueles ser alto y
generalmente los contaminantes tanto del agua como del aire llegan a l. El dao
a los organismos con frecuencia es de medio a alto; considerndolo medio para
los animales y alto para las plantas, y la uniformidad de la dispersin es de baja a
muy baja ya que a menudo la contaminacin es puntual (Bautista, 1999).
En la tabla 1 se muestran algunos contaminantes y sus posibles efectos sobre el
suelo de una forma muy general.
Tabla 1. Comparacin de los efectos de algunos contaminantes en suelo.

Contaminante
Sales
Fertilizantes
Metales pesados
Plaguicidas
H+
Lodos Residuales
Hidrocarburos

Suelo
X
B
?
X

?B
X

Fuente: Bautista, 1999

(X= daino; B= benfico; = sin efecto; ? = que puede ser daino o benfico dependiendo de las
condiciones en las que se presente).

Las fugas de hidrocarburos estn recibiendo ms atencin en los ltimos

aos tanto por la poblacin como por las autoridades ya que es un gran problema
ambiental que afecta al planeta. Los hidrocarburos pueden llegar al medio
ambiente, mediante fugas crnicas de pequea o gran intensidad. Ambas
contribuyen negativamente al equilibrio de los suelos.
Diversos ecosistemas han sido afectados por la contaminacin ocasionada
por las actividades de la industria petrolera, como son: la exploracin, extraccin,
traslado y refinacin, siendo los derrames de petrleo crudo la principal causa de
contaminacin de estos ecosistemas. Poco se sabe de la sensibilidad de los

~ 26 ~

organismos del suelo a la contaminacin, aunque es sabido que la contaminacin

por hidrocarburos reduce la macrofauna y microfauna del suelo. Derrames
petroleros han sido reportados como dainos para la flora y fauna (Perez et al.,
2010).

2.3 Derrames petroleros

Uno de los orgenes ms frecuentes de los accidentes en la industria
petrolera es el relacionado con las fugas de sustancias en forma de escapes
(gases y vapores) y derrames (lquidos) (Storch, 1998).
Las fallas humanas son la principal causa de un derrame, seguidas por
problemas de infraestructura por deterioro de equipos y materiales (Castro, 2009).
Todas las actividades que estn envueltas en la exploracin y explotacin del
petrleo provocan impactos potencialmente negativos sobre el medio ambiente y
sobre las personas que lo usan o que estn en contacto con l (Castro, 2009).
De acuerdo a la SEMARNAT las propiedades fsicas del suelo ms
afectadas por derrames de hidrocarburos son la estructura del suelo debido a la
ruptura de los agregados, aumento de la retencin del agua en la capa superficial
y el potencial hdrico
Las propiedades qumicas del suelo ms afectadas por un derrame de
hidrocarburos son el aumento de carbono orgnico, ya que el 75% del carbono del
petrleo crudo es oxidable, la disminucin del pH, debido a la acumulacin del
carbono orgnico y generacin de cidos orgnicos, el aumento del manganeso y
hierro intercambiable, el aumento del fsforo disponible (SEMARNAT, 1996).
Los efectos txicos de los hidrocarburos en el ambiente dependern de la
cantidad y composicin del petrleo, la frecuencia y tiempo de exposicin, el
estado fsico del derrame, las caractersticas del sitio donde sucedi el derrame,

~ 27 ~

las variables ambientales como temperatura, humedad y oxgeno, el uso de

dispersantes qumicos (est restringido su uso) y la sensibilidad de la biota
especfica del ecosistema impactado (SEMARNAT, 1996)
Segn un estudio realizado por el Centro de Derechos Econmicos y
Sociales (CDES), una ONG radicada en Nueva York desde 1992, las poblaciones
que viven en zonas contaminadas por petrleo se exponen a concentraciones de
hidrocarburos policclicos aromticos (HPA) y de componentes orgnicos voltiles
(COV) muy por encima de las normas sanitarias estadounidenses y europeas.
Esos productos pueden ser absorbidos por el organismo humano por va
oral, tctil o por inhalacin y generan diversas enfermedades que van desde las
infecciones secundarias como hongos cutneos, verrugas o eczema, hasta
cnceres de la piel, la sangre o el esfago, pasando por las neumonas y abortos
espontneos.

2.4 Hidrocarburos
Los hidrocarburos son compuestos formados por tomos de carbono e
hidrgeno, de gran abundancia en la naturaleza, presentes principalmente en el
petrleo (Chappn, 1988).
Se consideran como una mezcla compleja de gases, lquidos y slidos,
existiendo cantidades combinadas de nitrgeno, oxgeno y azufre, adems de
contener compuestos de hierro, nquel, vanadio y otros metales (PEMEX, 1988).
El petrleo tiene una proporcin de 76 a 86% de carbono y 10 a 14% de
hidrgeno. Los hidrocarburos se clasifican en biognicos y antrpicos.
Los hidrocarburos biognicos son sintetizados por casi todas las plantas,
animales terrestres y marinos, incluyendo a la microbiota, bacterias, plancton
marino, diatomeas, algas y plantas superiores (Bedair y Al-Saad, 1992).

~ 28 ~

Los hidrocarburos antrpicos son introducidos como resultado de la

actividad humana. Los procesos de combustin industrial contribuyen con la
contaminacin debido principalmente al humo generado por la quema del carbn,
combustibles fsiles y petrleo refinado, las descargas de aguas municipales, las
actividades de transporte y los derrames son algunas de las principales fuentes de
estos contaminantes (Bidleman et al., 1990).
Los hidrocarburos del petrleo se agrupan en las siguientes familias:
parafinas voltiles y no voltiles (alcanos), naftenos (cicloalcanos o cicloparafinas),
oleofinas (alquenos) y aromticos (monoaromticos y poliaromticos) (Vias,
2005).
Los hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs) son compuestos
orgnicos formados al menos por dos anillos fusionados de benceno, los cuales
difieren en el nmero y posicin del anillo aromtico (Furton y Pentzke, 1998).
La estructura de los HAPs consiste de tomos de carbono e hidrgeno
(Cutright and Hwang, 2006). Son compuestos no polares, neutros e hidrofbicos
(Juhasz and Naidu, 2000). Los HAPs poseen diferentes propiedades fsicas y
qumicas debido a su estructura qumica (Haritash y Kaushik, 2009)
La agencia de proteccin al medio ambiente de los Estados Unidos (EPA)
ha clasificado a 16 hidrocarburos poliaromticos (Figura 2) como contaminantes
prioritarios por el riesgo que representan al ambiente y a la salud. Entre los 16
destaca el benzo(a)pireno, fenantreno y antraceno (Hernndez, 2013).

~ 29 ~

Figura 2. Estructura qumica y sistema de numeracin de anillo de los 16 HAPs prioritarios.

Hay dos clases de hidrocarburos aromticos: los de bajo peso molecular

que tienen de 2 a 3 anillos aromticos como el naftaleno, fenantreno, antraceno y
derivados, y los de alto peso mo lecular que tienen de 4 a 7 anillos aromticos
como el criseno y benzo(a)pireno. Sus caractersticas fsicas y qumicas varan de
acuerdo con su peso molecular y, en consecuencia, en su distribucin y efecto en
el ambiente, lo mismo sus efectos en los sistemas biolgicos (Corona e Iturbide,
2004).
El comportamiento de estos compuestos depende en gran medida de su
nmero de anillos y, de hecho, se agrupan de acuerdo con este factor. Presentan
una fuerte adsorcin de materia orgnica y pueden ser biodegradados (Jimnez,
2001).
La importancia de los HAPs est relacionada con la movilidad debido a
su peso molecular: los HAPs de alto peso molecular son relativamente inmviles y,
por ende, de baja volatilidad y solubilidad. Algunos compuestos como naftaleno,

~ 30 ~

acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno, antraceno, fluoranteno y pireno por

mencionar algunos, son considerados como contaminantes prioritarios por la
Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (Por sus siglas en ingls,
EPA), la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y la Comunidad Europea (CE)
debido a sus efectos carcinognicos (Menzie et al., 1992).
Estos compuestos se encuentran distribuidos en el suelo, mar, sistemas
pluviales y sedimentos y su presencia se ha atribuido principalmente a los
derrames de petrleo y descargas de plantas petroqumicas, aun cuando se puede
deber al transporte atmosfrico por los aportes de la combustin (Padilla, 1989).
Entre los HAPs sobresalen los compuestos que tienen entre cuatro y seis
anillos aromticos por ser potencialmente carcingenos y mutagnicos (USEPA,
1987). La EPA ha clasificado a 16 hidrocarburos poliaromticos como
contaminantes prioritarios por el riesgo que reprsentan al ambiente y a la salud.
Entre los 16 destaca el benzo(a)pireno, fenantreno y antraceno.
Los HAPs son compuestos no polares o muy dbilmente polares que tienen
afinidad por las fases hidrofbicas, presentando una baja solubilidad en agua
(McBride, 1994).
La fuente ms importante de HAPs es la combustin incompleta de
cualquier material orgnico que contenga carbono e hidrgeno. Esto puede ocurrir
naturalmente por incendios forestales, actividad volcnica y procesos diagnicos
(Schnitzer y Khan; Wilcke y col., 2000; Thiele y Brummer, 2002). Pero se reconoce
que la mayora de los HAPs detectados en matrices ambientales provienen de
fuentes antopognicas debidos a la quema de madera y combustibles fsiles.
Muchos procesos de carbonizacin producen HAPs durante la degradacin
de material orgnico a bajas temperaturas (200C) y a altas presiones en un
periodo de millones de aos como es el petrleo y el carbn (Prince y Drake,
1999), por lo que el crudo y sus derivados representan una fuente importante de
HAPs en el ambiente en zonas de explotacin petrolera.

~ 31 ~

Se ha observado que las concentraciones de HAPs en el ambiente de

regiones tropicales son ms bajas que en las regiones polares debido a una rpida
degradacin microbiana, fotooxidacin y volatilizacin (Wilcke, 1999).
Los

HAPs

tienden

adsorberse

las

superficies

de

partculas,

especialmente a las constituidas por materia orgnica del suelo, lo que dificulta su
degradacin haciendo que estos compuestos tengan una gran persistencia en
condiciones naturales (Singleton, 2005).
Los HAPs pueden persistir en el medio durante largos periodos de tiempo sin
modificar sus propiedades txicas, con el consecuente riesgo para la salud
humana y el ecosistema. Se acumulan en diferentes puntos de la cadena trfica y
presentan toxicidad por inhalacin, contacto o ingestin (Eisler, 1987).
La baja hidrosolubilidad de los HAPs los convierte en compuestos altamente
liposolubles que se adsorben con facilidad a travs del tracto gastrointestinal de
mamferos distribuyndose rpidamente en los tejidos, preferentemente en el
tejido adiposo (Twiss et al., 1999).
En la siguiente tabla se muestran los efectos carcinognicos, genotxicos y
mutagnicos de algunos HAPs.
Tabla 2. Datos relativos a los efectos carcinognicos, genotxicos y mutagnicos de algunos
PAHs.

HAPs
Carcinogenicidad Genotoxicidad Mutagenicidad
Fenantreno
I
L
+
Antraceno
N
N

Pireno
N
L
+
Benzofluorenos
I
I
?
Benzo(a)antraceno
S
S
+
Benzo(e)pireno
I
L
+
Benzo(a)pireno
S
S
+
Dibennz(a)antraceno
S
S
+
Benzo(ghi)perileno
I
I
+
Dibenzopirenos
S
I
+
2-Nitronaftaleno
N
L

1-Nitropireno
I
S
+
Fuente: Mastandrea et al., 2005

~ 32 ~

(S= suficiente; I= insuficiente; N= no carcinognico; L= limitados.)

Mutagenicidad (Test de Ames): + (positivo); - (negativo); ? (inconcluso).

2.4.1 Degradacin microbiana de los HAPs

La degradacin de los HAPs que contienen hasta cuatro o cinco anillos

fusionados por bacterias y hongos ha sido bien documentado. El proceso que
implica la biodegradacin es inversamente proporcional al tamao del anillo de la
molcula del HAP. Los HAPs de menor peso se degradan ms rpidamente que
los HAPs de mayor peso que contienen tres o ms anillos fusionados.
Normalmente, los HAPs de mayor peso molecular no sirven como sustratos
susceptibles de metabolismo microbiano (Cerniglia et al., 1992).
En la figura 3 se muestran las primeras reacciones de transformacin
aerbica de los HAPs, siendo caracterstico de los hongos y los mamferos la
introduccin de un slo tomo de oxgeno mediante una monooxigenasa que
contiene el citocromo P-450, y la transfromacin a trans-dihidrodioles. En este
proceso de transformacin se generan metabolitos ms solubles, para su posterior
eliminacin (proceso de detoxificacin) (Cerniglia, 1984; Cerniglia et al., 1985;
Sutherland et al., 1995).

~ 33 ~

Figura 3. Reacciones iniciales del metabolismo de los HAPs.

Las bacterias inician la oxidacin del anillo aromtico mediante la

incorporacin de dos tomos de oxgeno catalizado por una diooxigenasa (figura
3). A partir de esta reaccin se forma un cis-dihidrodiol, a diferencia de los hongos
y mamferos que generan un trans-dihidrodiol, y el anillo pierde la aromaticidad. A
continuacin una deshidrogenasa NAD+ depediente, reconstituye el anillo
aromtico formando un catecol (diol). Los dioles son molculas a partir de las
cuales se produce la ruptura del anillo aromtico mediante dioxigenasas
estereoselectivas. La ruptura se puede dar entre dos grupos hidroxilos,
denominndose orto-ruptura, o adyacente a estos grupos, denominndose metaruptura.

~ 34 ~

2.4.2 Antraceno

El antraceno es no cancergeno as como sus metabolitos, su emisin al

medio ambiente en cantidades traza durante los procesos de gasificacin y
licuacin de carbn han despertado un inters considerable. Adems, el antraceno
se utiliza como modelo de sustrato en los estudios relativos a la degradacin
ambiental de HAPs, ya que su estructura se encuentra en HAPs cancergenos
tales como benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno y 3-metilcolantreno (figura 3).
Algunos microorganismos aislados del suelo tienen la habilidad de usar al
antraceno como nica fuente de carbono y energa.

2.5 Tecnologas de remediacin

En trminos generales las tecnologas de remediacin de suelos y/o aguas
subterrneas abarcan todas aquellas operaciones que tienen por objetivo reducir
la toxicidad, movilidad o concentracin del contaminante presente en el medio,
mediante la alteracin de la composicin de la sustancia peligrosa o del medio, a
travs de acciones qumicas, fsicas o biolgicas. La eleccin de cada tecnologa
depende de las caractersticas del suelo y del contaminante, de la eficacia
esperada y por supuesto de la factibilidad tcnico-econmica y el tiempo requerido
para su ejecucin (Alcaino, 2012).
Existe una gran variedad de tecnologas de remediacin, las cuales se
pueden clasificar bajo distintos criterios:
Segn objetivo de remediacin:
- Descontaminacin
- Contencin
- Confinamiento

~ 35 ~

Segn lugar de aplicacin de la remediacin:

- Ex Situ
- In Situ
Segn tipo de tratamiento:
- Biolgico
- Fisicoqumico
- Trmico
Segn grado de desarrollo:
- Tradicional
- Innovadora

Segn el objetivo de remediacin, las tcnicas de descontaminacin se

enfocan en la disminucin o eliminacin de la concentracin de los contaminantes
del medio, las tcnicas de contencin son las que aslan los contaminantes del
medio sin tener que actuar en l, y las tcnicas de confinamiento alteran las
condiciones fisicoqumicas del medio consiguiendo las reduccin de la movilidad
de los contaminantes (Alcaino, 2012).
Si se considera el lugar de aplicacin, las tcnicas In Situ son las que se
aplican directamente en el sitio contaminado y las tcnicas Ex Situ son aquellas en
que se requiere de la extraccin del medio contaminado para poder ser tratado
(Alcaino, 2012).
Si las tecnologas de remediacin se clasifican segn el tipo de tratamiento,
los tratamientos biolgicos (biorremediacin) utilizan las actividades metablicas
de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar (destruccin),
transformar o remover los contaminantes a productos metablicos inocuos. Los

~ 36 ~

tratamientos fisicoqumicos utilizan las propiedades fsicas y/o qumicas de los

contaminantes o del medio contaminado para destruir, separar o contener la
contaminacin. Los tratamientos trmicos utilizan calor para incrementar la
volatilizacin (separacin), quemar, descomponer o fundir (inmovilizacin) los
contaminantes en un suelo (Volke y Velasco, 2002).
Finalmente si se clasifica segn el grado de desarrollo, las tecnologas
tradicionales se refieren a las que son comnmente usadas a gran escala y cuyos
costos y accesos son relativamente fciles. Las tecnologas innovadoras
involucran a las que se encuentran recientemente propuestas o en etapas de
investigacin (Alcaino, 2012).
Por ejemplo, al basarse en el criterio del tipo de tratamiento utilizado, las
diversas tecnologas de remediacin se pueden agrupar como sigue (Alcaino,
2012).
Tratamientos biolgicos:
- Bioaumentacin
- Biodegradacin asistida
- Bioestabilizacin
- Bioventing
- Compostaje
- Fitorremediacin
- Losdos Biolgicos
Tratamientos fisoqumicos:
- Lavado de suelos
- Electrorremediacin
- Extraccin de agua
- Extraccin de aire
- Flushing

~ 37 ~

- Oxidacin UV
- Pozos de recirculacin
- Sellado de suelos
Tratamientos trmicos:
- Calentamiento por conduccin trmica
- Calentamiento por radiofrecuencia
- Calentamiento por resistencia elctrica
- Desorcin trmica
- Pirlisis
- Vitrificacin
En la siguiente tabla se presentara un resumen de las ventajas y
desventajas de los distintos tipos de tecnologas para remediacin de suelos:
Tabla 3. Ventajas y Desventajas de las tecnologas de Remediacin, clasificadas de acuerdo con el
tipo de tratamiento.

Tipo de
tratamiento
Tratamientos
Biolgicos

Ventajas

Desventajas

- Son efectivos en cuanto a -Requieren mayores tiempos de

costos.
tratamiento.
- Son tecnologas ms
benficas para el ambiente.
- Los contaminantes
generalmente son destruidos.

-Es necesario verificar la

toxicidad de intermediarios y/o
productos.
- No pueden emplearse si el tipo
de suelo no favorece el
crecimiento microbiano.

- Se requiere un mnimo o
ningn tratamiento posterior.
Tratamientos - Son efectivos en cuanto a - Los residuos generados por
Fisicoqumicos costos.
tcnicas de separacin, deben
tratarse o disponerse: aumento
- Pueden realizarse en
en costos y necesidad de
periodos cortos.
permisos.

- El equipo es accesible y no se -Los fluidos de extraccin

necesita de mucha energa ni pueden aumentar la movilidad
ingeniera.
de los contaminantes: necesidad
de sistemas de recuperacin.

~ 38 ~

Tratamientos
Trmicos

- Permite tiempos rpidos de

limpieza

- Es el grupo de tratamientos
ms costoso.

Fuente: Volke y Velasco, 2002

Como se puede observar en la tabla anterior los tratamientos biolgicos

(biorremediacin) son la mejor alternativa para la recuperacin de un suelo
contaminado.

2.6 Biorremediacin
Las prcticas de biorremediacin consisten en el uso de organismos como
plantas, hongos, bacterias naturales o modificadas genticamente para neutralizar
sustancias

toxicas,

transformndolas

en

sustancias

menos

txicas

convirtindolas en inocuas para el ambiente y la salud humana (Benavides et al.,

2005).
La degradacin microbiana es el principal proceso de descontaminacin
natural. Este proceso se puede acelerar y/o mejorar mediante la aplicacin de
tecnologas de biorremediacin (Alexander, 1999). El crudo de petrleo se
caracteriza por ser una matriz contaminante que contiene una elevada diversidad
de compuestos, por lo que es un sustrato ideal para evaluar el potencial catablico
de cepas o consorcios microbianos de inters en biorremediacin (Vias, 2005).
El petrleo crudo est compuesto por una mezcla de miles de compuestos
qumicos diferentes. Como la composicin de cada tipo de hidrocarburo es nica,
hay diferentes maneras de lidiar con ellos a travs de los microorganismos y la
flora. La biorremediacin puede ocurrir de manera natural o puede ser estimulada
con la adicin de microorganismos y fertilizantes (Vias, 2005).
Los principales organismos degradadores del petrleo son bacterias y
levaduras, y en menor cuanta, hongos oxidantes de los hidrocarburos.

~ 39 ~

La biorremediacin puede emplear organismos propios del sitio contaminado

(autctonos) o de otros sitios (exgenos), puede realizarse in situ o ex situ, en
condiciones aerobias (en presencia de oxgeno) o anaerobias (sin oxgeno) (Eweis
et al, 1998). Aunque no todos los compuestos orgnicos son susceptibles a la
biodegradacin, los procesos de biorremediacin se han usado con xito para
tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos del petrleo
(HTP), solventes (benceno y tolueno), explosivos (TNT), clorofenoles (PCP),
pesticidas (2,4-D), conservadores de madera (creosota) e hidrocarburos
aromticos policclicos (HAP) (Van Deuren et al. 1997, Semple et al. 2001).
La biorremediacin, mediante el uso de microorganismos es una buena
alternativa que puede ser utilizada para la recuperacin de suelos contaminados.

2.7 Microorganismos del suelo

Para los microorganismos, el suelo no solo aporta la materia necesaria para
la sntesis de sus clulas, sino que tambin la energa para sus actividades vitales.
Las caractersticas fsicas y qumicas del suelo, van a determinar el ambiente en el
que se desarrollan los microorganismos. Dichas caractersticas afectan la
composicin de la comunidad microbiana tanto cuantitativa como cualitativamente
(Alexander, 1961).
En la tabla 4 se presenta una estimacin del nmero de microorganismos
presentes en forma natural en los suelos.
Algunos tipos de microorganismos son capaces de degradar hidrocarburos
de petrleo y usarlos como fuente de carbono y energa como es el caso de
algunas algas, hongos y bacterias.

~ 40 ~

Tabla 4. Poblaciones promedios de microorganismos determinados en suelos.

Poblaciones promedios de microorganismos de suelo

superficial
Organismos
Valores tpicos
Extremos
(clulas/g de suelo)
(clulas/g de suelo)
Bacterias
0.1 1 billones
>10 billones
Actinomices
10 100 millones
100 millones
Hongos
0.1 1 millones
20 millones
Algas
10000 100000
3 millones
millones
Subsuelo (clulas/g de suelo)
Bacterias
1000 10 millones
200 millones
Fuente: Dragun (1988), citado por Sarubbi, (2000).

En la degradacin de los hidrocarburos del petrleo, se involucran consorcios

de microorganismos, incluyendo procariontes y eucariontes. Las bacterias y
levaduras son los organismos dominantes en la degradacin de compuestos del
petrleo en ecosistemas acuticos, mientras que bacterias y hongos son los que
dominan en muestras de suelo. Durante la biodegradacin, los microorganismos
estn equipados con la maquinaria metablica para utilizar al contaminante como
fuente de carbono y energa para su crecimiento, produciendo biomasa,
subproductos, dixido de carbono y agua (Eweis, 1998).

2.8 Bacterias
Las bacterias son organismos procariontes unicelulares rodeados por una
membrana lipdica (Verlag, 2007). Constituyen un grupo muy heterogneo de
organismos y predominan en el suelo por sobre los dems grupos de
microorganismos. La determinacin del nmero total de bacterias presentes en el
suelo se hace muy difcil y solo es posible lograr determinar solo algunas
poblaciones de estas (Alexander, 1991).
Las bacterias en el suelo, adems de requerir nutrientes para generar su
energa y multiplicarse, demandan de un entorno qumico y fsicamente adecuado

~ 41 ~

para vivir. La temperatura, el pH, presin parcial de oxgeno y la presin osmtica

son fundamentales para la sobrevivencia bacteriana (Rittmann, 2001). De acuerdo
a lo anterior, pueden mencionarse dos grandes poblaciones bacterianas presentes
en los suelos y en estrecho vnculo con sus propiedades: bacterias autctonas,
que son residentes verdaderos del suelo y aquellas bacterias alctonas
(Alexander, 1991).
Las poblaciones autctonas o nativas pueden presentarse en estados de
resistencia y perdurar por largos periodos de tiempo en el suelo. Estos
microorganismos son naturales de un hbitat determinado; en l pueden
sobrevivir, crecer y realizar sus actividades metablicas, ocupando los nichos
ambientales disponibles para las poblaciones microbianas de un ecosistema dado.
Estos organismos presentan generalmente caractersticas adaptativas que los
hacen fisiolgicamente compatibles con su ambiente fsico y qumico (Alexander,
1991). Por otro lado, las poblaciones alctonas, son miembros temporales de un
hbitat y no ocupan los nichos funcionales del ecosistema. Por regla general,
estos microorganismos han proliferado en otro lugar y han sido transportados a un
ecosistema que les resulta extrao, lo que no descarta su variabilidad en el
tiempo; algunos pueden desaparecer en menos de 24 horas, mientras que otros
pueden presentar adaptaciones a su nuevo medio y perdurar en l por largos
perodos de tiempo (Atlas y Bartha, 2002).
Dentro del grupo de las bacterias, se encuentran aquellas formadoras de
esporas y aquellas no formadoras de esporas, con forma de cocos, bacilos y
espirilos. Estas varan en el suelo en tamao, forma, requerimientos de oxigeno
(aerobias y anaerobias), obtencin de carbono (auttrofas y hetertrofas) y su
relacin con plantas y animales (saprofitos y parsitos). Los bacilos se encuentran
en mayor proporcin en los suelos y tienen la capacidad de persistir en estos bajo
situaciones desfavorables o extremas, mediante la formacin de esporas de
resistencia que funcionan como parte del ciclo de vida de dicho microorganismo
(Montenegro, 2007).

~ 42 ~

Las bacterias son consideradas los componentes ms importantes del grupo

total de microorganismos del suelo. As, de todas las actividades del suelo
vinculadas a microorganismos, las bacterias son responsables de las ms
importantes (Alexander, 1991).

2.9 Bacterias hidrocarburolticas

Ambientalmente, las bacterias son muy importantes, pues tienen la
capacidad de transformar una gran variedad de contaminantes orgnicos e
inorgnicos a sustancias inocuas, que pueden ser reciclados al medio ambiente.
Aquellas bacterias disponen de la capacidad de oxidar una gran cantidad de
compuestos orgnicos producidos y utilizados industrialmente (Rittmann, 2001).
Se estima, que de todos los microorganismos presentes en el suelo, las bacterias
son aquellas que se presentan en un mayor nmero y tambin las ms
importantes en la degradacin de hidrocarburos (Sarubbi, 2000).
Las bacterias son la clase de microorganismos que participan activamente en
la degradacin de contaminantes orgnicos procedentes de sitios contaminados.
Un nmero de especies bacterianas son conocidas por su capacidad para
degradar los HAP (Haritash y Kaushik, 2009).
El fundamento de la degradacin bacteriana de hidrocarburos, se basa en la
utilizacin de estos por los microorganismos como fuente de carbono y energa.
Los hidrocarburos en efecto, proveen de alimento a ciertas bacterias y
microorganismos (American Petroleum Institute, 1972).
Se estima que del total de microorganismos conocidos, un nmero
considerable de especies son capaces de utilizar los hidrocarburos como fuente
nutricional (Beerstecher 1954; Sharpley, 1966). Estos microorganismos logran
sobrevivir en hbitat contaminados pues son capaces de utilizar metablicamente
este recurso, de esta manera, el contaminante se transforma a la vez en una

~ 43 ~

potencial fuente de energa (Madigan, 1998; Ilyna et al., 2003). Existen ciertas
bacterias capaces de degradar hidrocarburos de petrleo, y que luego de una
exposicin por un periodo de tiempo determinado a stos, son capaces de
adecuarse y aumentar su poblacin. Lo anterior explicara que la mayora de los
microorganismos, si son capaces de sobrevivir en ese ambiente, pueden degradar
a aquellos compuestos sin mayor inconveniente (Parrish et al., 1999; Fontrbel y
Ach, 2000).
Esta tolerancia microbiana a la presencia de hidrocarburos de petrleo en el
suelo, induce a la selectividad y a la disminucin de la diversidad. Los
microorganismos tolerantes a este ambiente de estrs, desarrollan y utilizan
respuestas enzimticas y fisiolgicas especializadas para la degradacin del
hidrocarburo (Atlas et al. 1991; Rivera et al. 2002).
De todos los factores necesarios para desarrollar un sistema de
biorremediacin, es de importancia inmediata conocer la presencia o ausencia de
una poblacin bacteriana capaz de degradar el residuo peligroso (Levin y Gealt,
1997). Para Rittmann (2001), incluso a pesar que un contaminante sea fcilmente
biodegradable, la ausencia de poblacin microbiana con capacidad degradativa
puede constituirse en un factor limitante para la biorremediacin del suelo
afectado.
Se hace necesario por lo tanto, realizar antes de comenzar un proyecto de
remediacin biolgica, un estudio de factibilidad para caracterizar las propiedades
especficas del sitio. As, no solo la determinacin de las propiedades
fsicoqumicos del material a remediar es importante, otra caracterizacin no
menos importante es la determinacin de los potenciales microorganismos del sitio
con capacidad de utilizar los hidrocarburos (Adams, 1999).
Levin y Gealt (1997) estiman que son varios los microorganismos capaces
de llevar a cabo este proceso degradativo. En algunos casos se han identificado y
caracterizado, mientras que en otros ha sido extremadamente difcil cultivarlos e

~ 44 ~

inclusive aislarlos. Para tal objetivo, la primera etapa la constituye la toma de

muestras representativas, cuyos resultados se aplican a la totalidad de la
comunidad o del ecosistema. Cada muestra es, por necesidad, minscula en
comparacin con todo el medio; por lo tanto puede llevar a resultados
poblacionales muy por encima o muy por debajo de la abundancia real (Atlas y
Bartha, 2002).

2.10 rea de estudio

Los sitios de muestreo se encuentran ubicados en el campo petrolero

Miguel Alemn, localizado entre el municipio de Poza Rica y Papantla Ver., al
noreste del estado de Veracruz, los sitios seleccionados para el muestreo
sugeridos por PEMEX fueron las presas de recorte de perforacin de los
siguientes pozos: el pozo petrolero nmero 48 (20 2725.6 NL y 97 2113.6 WL),
pozo nmero 69 (20 2656.3 NL y 97 2141.5 WL) y el pozo nmero 98 (20
2722.6 NL y 97208.5 WL) (figura 4) dichos pozos se encuentran a una altitud de
200 m.s.n.m. Los suelos de estos sitios fueron contaminados por derrames de
petrleo ocasionados por las actividades de extraccin hace 20 aos
aproximadamente.
El clima es clido con una temperatura promedio de 24.4 C; su
precipitacin pluvial media anual es de 1,010 mm. Su vegetacin es de bosque
mediano o bajo subtropical perennifolio, entre las especies arbreas que
conforman este tipo de bosque se encuentran el guarumbo, frijolillo, caoba, palo
de rosa, humo, ceiba, alzaprima, chijol, chaca, gusima, guanacastle, sangregado
y cedro rojo. Se desarrolla una fauna compuesta por poblaciones de conejos,
armadillos mapaches, tlacuaches, tejones y coyotes.

~ 45 ~

El suelo es de tipo vertisol, con un alto contenido de arcillas expansivas que

forman grietas anchas y profundas en poca de sequa. Las principales
actividades en la zona son la industria petrolera, la agricultura y ganadera.

Figura 4. Mapa de los sitios de muestreo en el campo petrolero Miguel Alemn, (los nmeros
indican los pozos petroleros en estudio con sus respectivos controles).

~ 46 ~

CAPTULO III. METODOLOGA

Proceso Metodolgico

~ 47 ~

3.1 Muestreo
En la zona de estudio, en las presas de recorte de perforacin de cada uno
de los tres pozos petroleros seleccionados (P 48, 69 y 98) y un sitio aledao para
cada pozo libre de contaminacin los cuales sirvieron como control (P 48C, 69C y
98 C), se realizaron transectos a lo largo de las presas y de los sitios control y se
excavaron monolitos a los 10, 20, 30 y 40 m respectivamente, cada monolito tuvo
una dimensin de 25 x 25 x 30 cm (Anderson e Ingram, 1993). En total se tuvieron
24 monolitos equivalentes a 24 muestras (figura 5).
Los sitios aledaos para cada pozo libre de contaminacin se encontraban
fuera de las presas de recorte de perforacin aproximadamente a 300 m de
distancia a una pendiente mayor.
Para las pruebas microbiolgicas se tom una fraccin similar a 200 g de
suelo de cada monolito. Las muestras de suelo se depositaron en bolsas de
plstico y se colocaron en una hielera para su traslado al laboratorio de la Facultad
de Biologa de la Universidad Veracruzana. En el laboratorio, las muestras fueron
colocadas a 4 C.

Figura 5. Fotos de los monolitos realizados.

~ 48 ~

3.2 Anlisis fsicos y qumicos del suelo

En cada monolito se tom un kg de suelo y se deposit en su respectiva
bolsa de plstico debidamente etiquetada para su traslado, para determinar en el
laboratorio las caractersticas fsicas y qumicas del suelo. Una vez en el
laboratorio las muestras fueron secadas al aire y tamizadas a 2 mm. para la
identificacin de pH, textura, materia orgnica (MO), carbono, nitrgeno total (NT),
relacin C/N, fsforo extractable, sodio (Na), potasio (K), calcio (Ca) y magnesio
(Mg) y capacidad de intercambio catinico (CIC). Todas las tcnicas para la
determinacin de estos parmetros fsicos y qumicos estn incluidas en la Norma
Oficial Mexicana NOM-021-SEMARNAT-2000. sta se basa en la Soil Science
Society of America Methods of Soil Analysis (SSSA, 1996).
3.2.1 Textura

Se llev a cabo el mtodo de Bouyoucos que elimina la agregacin debida

a materia orgnica y la floculacin debida a los cationes calcio y magnesio. No se
eliminan otros cementantes como carbonatos. El tiempo de lectura se

ha

escogido de 40 segundos para la separacin de partculas mayores de 0.05 mm

(arena) y de 2 horas para partculas de dimetro mayores de 0.002 mm (limo y
arena). Estos lmites han sido establecidos por el Departamento de Agricultura de
Estados Unidos (U.S.D.A. por sus siglas en ingls) y se han usado para construir
el tringulo de texturas que se observa en la figura 7 (NOM-021-SEMARNAT2000).
3.2.2 pH

Mtodo electromtrico para la determinacin del pH en muestras de suelo

en una solucin de agua pura. La evaluacin electromtrica del pH se basa en la
determinacin de la actividad del ion H mediante el uso de un electrodo cuya
membrana es sensitiva al H. En el caso de los suelos el pH se mide

~ 49 ~

potenciomtricamente en la suspensin sobrenadante de una mezcla de relacin

suelo: agua 1:2 (NOM-021-SEMARNAT-2000).
3.2.3 Materia orgnica

La determinacin de Materia Orgnica (M.O.) del suelo se evala a travs

del contenido de carbono orgnico con el mtodo de Walkey y Black. Este mtodo
se basa en la oxidacin del carbono orgnico del suelo por medio de una
disolucin de dicromato de potasio (K2Cr2O7) y el calor de reaccin que se genera
al mezclarla con cido sulfrico (H2SO4) concentrado. Despus de un cierto tiempo
de espera la mezcla se diluye, se adiciona cido fosfrico (H3PO4) concentrado
para evitar interferencias de Fe +3 y el dicromato de potasio residual es valorado
con el sulfato ferroso. Con este procedimiento se detecta entre un 70 y 84% del
carbono orgnico total por lo que es necesario introducir un factor de correccin, el
cual puede variar entre suelo y suelo. (NOM-021-SEMARNAT-2000).
3.2.4 Nitrgeno

La determinacin de nitrgeno total por el mtodo de Micro-Kjeldahl

involucra dos pasos: (a) digestin de la muestra para convertir el nitrgeno a NH4
(b) la determinacin de NH4 en el digestado. La digestin de la muestra es
desarrollada por calentamiento de la muestra con cido sulfrico concentrado y
sustancias como el K2SO4 que promueven la oxidacin de la materia orgnica y la
conversin del nitrgeno orgnico a amonio por incremento de la temperatura de
digestin y tambin emplea catalizadores como el Cu y Se, que aumentan la
velocidad de oxidacin de la materia orgnica por el cido sulfrico. El amonio en
el digestado es determinado por titulacin del amonio liberado por destilacin del
digestado con lcali (NOM-021-SEMARNAT-2000).

~ 50 ~

3.2.5 Fosforo extrable

La determinacin del fosforo extrable por el mtodo Olsen es ampliamente

utilizado en estudios de fertilidad de suelos para la determinacin de fosforo
disponible tanto en suelo neutros como alcalinos. El fosforo es extrado del suelo
con una solucin NaHCO3 0.5 M ajustada a un pH de 8.5.
3.2.6 Cationes intercambiables (Ca2, Mg, Na y K)

Mtodo para la determinacin de la capacidad de intercambio catinico

(CIC) y bases intercambiables (Ca 2+, Mg 2+, Na+ y K+) de los suelos, empleando
acetato de amonio 1N, pH 7.0, como solucin saturante. El mtodo para la
determinacin consiste en la saturacin de la superficie de intercambio con un
catin ndice, el ion amonio; lavado del exceso de saturante con alcohol;
desplazamiento del catin ndice con potasio y determinacin del amonio mediante
destilacin. El amonio se emplea como catin ndice debido a su fcil
determinacin, poca presencia en los suelos y porque no precipita al entrar en
contacto con el suelo. La concentracin normal que se usa asegura una completa
saturacin de la superficie de intercambio y como est amortiguada a pH 7.0, se
logra mantener un cierto valor de pH. El lavado con alcohol pretende desplazar el
exceso de saturante y minimizar la prdida del amonio adsorbido (NOM-021SEMARNAT-2000).

3.3 Anlisis de los hidrocarburos

Adicionalmente 250 g de suelo fueron colectados en cada sitio y
depositados en frascos de vidrio y colocados en una hielera a 4C para la posterior
caracterizacin

de

los

hidrocarburos

poliaromticos,

siguiendo

las

recomendaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-138-SEMARNAT/SSA!2012, Lmites mximos permisibles de hidrocarburos en suelos y lineamientos

~ 51 ~

para muestreo en la caracterizacin y especificacin para la remediacin, que

tomando como referencia los mtodos establecidos por la Environmental
Protection Agency (EPA).
3.3.1 Hidrocarburos totales de petrleo fraccin pesada

Para los hidrocarburos totales fraccin pesada se utiliz el mtodo de reflujo

con equipo Soxhlet.
La extraccin de hidrocarburos del petrleo por Soxhlet provee fracciones
de C6 a C50. Para la ptima extraccin de los compuestos orgnicos, los slidos
deben de estar en partculas pequeas; mientras ms pequeas sean las
partculas, ms rea de superficie y contacto y, por lo tanto, mejor extraccin. As,
slidos de mayor tamao deben ser reducidos a pequeas partculas antes de la
extraccin. El desarrollo del mtodo de extraccin Soxhlet incluye encontrar un
solvente o mezclas de solventes que tengan una alta afinidad por los analitos y
una baja afinidad por la matriz de la muestra slida.
El solvente debe tener una alta volatilidad porque debe ser removido al final
de la extraccin para concentrar el analito de inters. Este mtodo consiste en
extraer los hidrocarburos contenidos en el suelo, mediante la accin de un
disolvente orgnico voltil apropiado, que es reflujado a travs de la muestra
varias veces durante un tiempo determinado. El disolvente es evaporado y
posteriormente condensado en un refrigerante, se le hace pasar por la muestra y
se le regresa al origen para ser nuevamente evaporado.
La muestra slida es mezclada con sulfato de sodio anhidro para eliminar el
agua residual, se le coloca en un dedal o cartucho de papel o fibra de vidrio y se
usa un solvente orgnico apropiado en este caso fue una mezcla de cloruro de
metileno y hexano para su extraccin en un equipo Soxhlet. Mediante los reflujos
del solvente y la temperatura se permite el contacto ntimo de la muestra con el
disolvente de extraccin, de esta manera se logra la liberacin de los

~ 52 ~

hidrocarburos presentes en la muestra. El extracto orgnico fue evaporado para

realizar el intercambio de solvente, acorde con el mtodo de cuantificacin.
3.3.2 Hidrocarburos aromticos policclicos

Para la determinacin de los hidrocarburos poliaromticos se pesaron 1.5 g

de suelo, se mezclaron con 3 g de sulfato de sodio anhidro y se aadi 10 ml de
acetona. La mezcla se agit en un vrtex por 20 minutos. Los HAPs extrados con
acetona fueron separados del suelo por centrifugacin a 13,700 x g durante 15
min. El mismo procedimiento se repiti tres veces y los extractos filtrados se
concentraron hasta 2 ml y despus se analiz en un 4890D Agilent GC equipado
con un detector FID fijado en 310 C equipado con una columna capilar HP-5 (15
m x 0.53 mm, espesor de pelcula 1.5 m).

3.4 Pruebas microbiolgicas

Para la primera siembra se tom una pequea porcin de suelo la cual se
suspendi dentro de unos tubos eppendorf previamente esterilizados que
contenan 1 mL de agua desionizada para su posterior sembrado.
Se sembr por estriado en agar MacConkey y en agar eosina azul de
metileno. Las muestras se incubaron a 37 C en la estufa durante 24 horas.
Se aislaron las colonias de las diferentes cajas, de acuerdo a su morfologa
de crecimiento. Luego se resembraron las colonias de bacterias por estriado en
agar eosina azul de metileno y se incubaron de nuevo a 37 C en la estufa durante
24 horas.
De esos aislamientos se llev a cabo la tincin de Gram. De acuerdo a los
resultados obtenidos las cepas bacterianas fueron agrupadas segn su morfologa
en cocos, bacilos y estreptobacilos y segn sus caractersticas tintoriales, en
bacterias Gram negativas y Gram positivas.

~ 53 ~

Tambin se les realiz la prueba de catalasa para demostrar la presencia de

la enzima catalasa.
Del aislamiento se realiz una resiembra en agar MacConkey y agar
Salmonella Shigella. La resiembra en el agar MacConkey se llev a cabo para
saber que colonias fermentaban lactosa y en el agar Salmonella Shigella para
saber si haba alguna especie de Salmonella.

3.5 Pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar
bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es
capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de
compuestos, mediante la produccin de compuestos coloreados. Por lo cual en
este experimento se utilizaron las siguientes pruebas bioqumicas para la
identificacin; TSI (agar hierro y triple azcar), LIA (agar de hierro y lisina), urea,
citrato de Simons y MIO (movilidad, indol y ornitina) (Faddin, 2003).
Se prepararon una serie de tubos con cada una de las pruebas
bioqumicas, tomando una asada de la cepa, iniciando por TSI, que es un medio
que se va a inocular por picadura y estra y as determinar si se lleva a cabo la
fermentacin de azcares, con la misma asada se procede a inocular el medio LIA
inoculando por picadura y estra para determinar la descarboxilacin oxidativa,
seguido de

Urea inoculando por estra para determinar la capacidad de un

organismo de desdoblar la urea, seguido de la inoculacin de citrato inoculando

por estra para determinar si la bacteria utiliza el citrato como nica fuente de
carbono, finalizando por la inoculacin del medio MIO que se inocula por picadura
en el cual observaremos la movilidad, indol y ornitina.

~ 54 ~

3.6 Pruebas de degradacin de antraceno

Se prepar un medio especfico con el antraceno el cual contena 2 g de
NaCl, 3.75 g de agar bacteriolgico y 0.1 g de antraceno. De esta forma se
asegur de que la bacteria tendra crecimiento en este medio si su nica fuente de
carbono haba sido el antraceno.
Se sembraron por estriado las 8 especies diferentes que se identificaron en
las pruebas bioqumicas en el medio especfico. Se incubaron a 37 C en la estufa
y se observ si haba crecimiento a las 24, 48 y 72 horas.

3.7 Anlisis estadsticos

Se realiz una evaluacin mostrando las diferencias significativas entre
cada sitio contaminado y su sitio aledao, como las caractersticas del suelo y la
concentracin de hidrocarburos poliaromticos, fueron determinados por anlisis
de varianza (ANOVA) de una va, y basadas sobre diferencias mnimas
significativas usando un modelo lineal generalizado (p<0.05), (PROC GLM,SAS
Institute Inc., 1989).

~ 55 ~

CAPTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1 Parmetros fsicos y qumicos del suelo
Los parmetros fsicos y qumicos analizados indican que tanto el suelo
contaminado como el libre de contaminacin son suelos ricos en nutrimentos, los
suelos son ligeramente alcalinos, poseen una gran cantidad de arcillas, presentan
una alta capacidad de intercambio catinico, por lo que existen niveles elevados
de Na, K, Ca y Mg, La Materia orgnica, el Carbono, el Nitrgeno Total y el
Fsforo se encuentran en concentraciones altas, as como la relacin C/N y la
conductividad elctrica.
Estas caractersticas fsicas y qumicas analizadas de los suelos
concuerdan con la descripcin general del INEGI (2006) para suelos vertisol,
aunque no se realizaron en este estudio perfiles de suelo para la caracterizacin
del sitio, los resultados obtenidos concuerdan con lo documentado para dichos
parmetros por INEGI.
Al comparar los parmetros fsicos y qumicos del suelo contaminado contra
el suelo control (suelo no contaminado) se observa que existen diferencias
estadsticamente significativas tanto en la concentracin del fsforo como en l
porcentaje de arena (p< 0.05). Todos los dems parmetros no presentaron
diferencias significativas entre el suelo contaminado y el suelo no contaminado
(Tabla 5).

~ 56 ~

Tabla 5. Parmetros fsicos y qumicos del suelo, comparacin entre el suelo contaminado y el
suelo no contaminado (suelo control). Letras minsculas iguales entre el suelo contaminado y el no
contaminado indican que no existen diferencias significativas (p <0.05).

Parmetros
pH
M.O. (%)
N T( %)
C/N
P mg kg-1
Na cmol kg-1
K cmol kg-1
Ca cmol kg-1
Mg cmol kg-1
CIC cmol kg-1
C.E. S/cm
Arcilla %
Limo %
Arena %

Suelo
F
p
contaminado no contaminado
7.60.2a
7.50.2a
1.2 0.28
7.93.9a
5.91.8a
2.5 0.12
0.30.1a
0.30.1a
0.1 0.75
12.53.6a
10.11.9a
3.8 0.06+
12.38.1a
4.51.3b
10.7 0.00**
0.90.2a
0.90.4a
0.0 0.97
0.70.4a
0.60.2a
1.3 0.25
14.410.6a
14.610.7a
0.0 0.96
1.70.6a
1.50.5a
0.6 0.42
28.36.1a
31.18.3a
0.8 0.36
178.920.8a
194.218.8a
3.5 0.07+
53.214.7a
45.87.5a
2.3 0.13
32.97.9a
29.18.6a
1.2 0.26
14.111.1a
2510.6b
5.9 0.02*

Al comparar los parmetros fsicos y qumicos del suelo por pozos de los
diferentes sitios se observa que existen diferencias significativas en el P, Na, K,
Ca, Mg, CIC, y Textura (tabla 6), pero no para pH, C.E, C, MO, NT, C/N.

Tabla 6. Parmetros fsicos y qumicos del suelo en los diferentes sitios de muestreo del campo
petrolero Miguel Alemn.

Suelo
pH
C.E. S/cm
P mg kg-1
M.O. %
C%
Na cmol kg-1
K cmol kg-1
Ca cmol kg-1
Mg cmol kg.1
CIC cmolkg-1
N%
C/N
Arcilla %
Limo %
Arena %

Pozo 48

Pozo 48C

Pozo 69

Pozo 69C

Pozo 98

Pozo 98C

7.50.118
181.95.47
10.663.22
6.190.76
3.590.44
0.960.08
1.170.16
0.670.05
2.210.12
34.141.83
0.310.03
11.51.65
67.77.04
28.784.03
4.54.5

7.30.094
179.18.2
4.640.66
5.530.41
3.210.24
1.350.17
0.860.14
0.640.03
1.860.15
40.41.96
0.360.02
90.40
52.22.75
20.70.95
271.91

7.60.115
176.315.12
6.630.55
10.132.23
5.881.29
1.10.10
0.670.05
23.281.69
1.840.22
27.882.225
0.330.01
14.252.05
43.22.5
36.284.12
20.56.18

7.70.064
211.28.10
5.470.19
4.500.35
2.610.20
0.90.04
0.640.03
19.880.68
1.770.12
24.471.09
0.280.02
9.50.64
48.20.5
38.783.09
133.31

7.70.070
178.611.57
19.684.42
7.532.46
4.371.42
0.790.11
0.530.07
19.371.55
1.200.27
23.012.25
0.340.09
11.751.88
48.75.7
33.783.77
17.52.5

7.40.095
192.23.96
3.620.66
7.810.83
4.530.48
0.590.04
0.450.06
23.422.23
1.070.25
28.433.47
0.390.06
121
37.21.70
27.781.5
352.51

~ 57 ~

2.77
1.96
6.95
1.88
1.88
6.28
6.29
66.30
4.62
8.25
0.58
1.77
6.42
4.29
7.95

0.05037
0.13338
0.00088
0.14776
0.14691
0.00153
0.00152
0.00000
0.00685
0.00033
0.70911
0.16840
0.00136
0.00979
0.00041

En diferentes estudios se ha observado que generalmente el pH del suelo

disminuye cuando este ha sido contaminado por hidrocarburos (Zamora et al.,
2012), sin embargo en este estudio esto no fue observado, esto podra deberse al
tiempo del derrame ya que al ser un pasivo ambiental de ms de 20 aos las
condiciones naturales se han restablecido paulatinamente. Por otro lado la MO y el
C incrementaron en los sitios contaminados esto es debido a que los
hidrocarburos son absorbidos principalmente sobre la materia orgnica, la cual
tiene una polaridad similar a los hidrocarburos (Cram et al., 2004) sin embargo
esto no fue estadsticamente significativo. En el caso del fsforo disponible este se
increment en los sitios contaminados significativamente (p<0.05), esto ha sido
observado en otros estudios, por ejemplo en Nigeria (Adenipekun et al., 2013)
encontraron que en un sitio contaminado por hidrocarburos el fsforo se
increment a travs del tiempo, esto podra deberse a la transformacin del P total
a fsforo disponible por accin de hongos y microorganismos (fosfatasas),
aumento del fsforo ha sido reportado como un efecto directo de la contaminacin
por hidrocarburos al suelo (SEMARNAT, 1996). En el caso del CIC se ha
observado que este disminuye en los sitios contaminados por hidrocarburos, esto
mismo pudo verificarse en este estudio al observarse una disminucin significativa
del CIC en los suelos contaminados (pozo 48 y 98), lo cual est relacionado con la
adsorcin de los hidrocarburos en las partculas minerales del suelo (Zamora et
al., 2012); Algunos autores (Martnez y Lpez, 2001; Okolo et al., 2005) indican
que la CIC disminuye debido a que los hidrocarburos interfieren en los sitios de
intercambio de los cationes y en las interacciones electrostticas (Pignatello y
Xing, 1996). En el caso de la textura del suelo est reportado que es uno de los
parmetros fsicos ms alterados durante los derrames petroleros debido a la
ruptura de agregados lo que genera una mayor acumulacin, el componente ms
importante del suelo en relacin con la persistencia de sustancias txicas son las
arcillas ya que estas partculas aportan una gran rea superficial para la absorcin
de productos qumicos contaminantes como los hidrocarburos (Imbellone et al.,
2009).

~ 58 ~

4.2 Caracterizacin de hidrocarburos totales de petrleo fraccin

pesada e hidrocarburos aromticos policclicos (HAPs)
En el campo petrolero Miguel Alemn en los sitios seleccionados para el
muestreo se caracterizaron los hidrocarburos aromticos policclicos y los
hidrocarburos totales de petrleo fraccin pesada, encontrndose la presencia de
estos hidrocarburos solo en las presas de recorte de perforacin de los pozos
estudiados, mientras que en los sitios donde no hubo extraccin petrolera no
fueron detectados dichos parmetros. En las presas de recorte de perforacin de
los pozos 48, 69 y 98 los niveles de contaminacin para la fraccin pesada son
superiores a los estipulados por la Norma Oficial Mexicana, NOM 138, mientras
que la concentracin de los hidrocarburos poliaromticos se encuentran dentro de
los lmites permisibles por dicha Norma.
Al comparar las concentraciones de hidrocarburos poliaromticos e
hidrocarburos totales de petrleo fraccin pesada entre el suelo contaminado y el
suelo no contaminado se observa que existen diferencias significativas entre todos
ellos (p< 0.05) (tabla 7).

~ 59 ~

Tabla 7. Comparacin entre la concentracin de Hidrocarburos Fraccin pesada e hidrocarburos

aromticos policclicos entre el suelo contaminado y el suelo no contaminado (suelo control) del
campo petrolero Miguel Alemn, Letras minsculas iguales entre el suelo contaminado y no
contaminado indican que no existen diferencias significativas (p<0.05).

Sitio
Hidrocarburos
Fraccin pesada
Benzo(B) fluoranteno
Benzo(k) fluoranteno
Benzo(a) pireno
Dibenzo(a,h) antraceno
indeno (1,2,3,c-d) pireno
Benzo (a) antraceno

Suelo
contaminado
838644.82
0.0400.003
0.0410.001
0.0390.002
0.0410.002
0.0430.001
0.0410.001

Suelo
No contaminado
ND
ND
ND
ND
ND
ND
ND

26251.5
141.6
930.2
380.2
240.2
1849.0
1681.0

0.0000
0.0002
0.0000
0.0000
0.0001
0.0000
0.0000

4.3 Aislamiento e identificacin de bacterias

Las diferentes muestras de suelo de los sitios contaminados (presas de
recorte de perforacin de los pozos petroleros) y no contaminados (suelos
aledaos a los sitios contaminados libres de contaminacin) sembradas en agar
eosina azul de metileno tuvieron crecimiento y fueron aisladas, excepto cuatro
muestras del suelo contaminado porque no hubo crecimiento (P48M1, P48M3,
P69M4, P98M3) y tres del suelo libre de contaminacin de igual manera sin
crecimiento (P48CM3, P48CM4, P98CM4) (Tabla 7).
Las diferentes cepas fueron diferenciadas mediante la tincin de gram
encontrndose que todas las cepas fueron gram negativo, excepto una cepa de la
muestra del pozo 69C que dio tanto positivo como negativo a la tincin de gram.
En la prueba de la catalasa todas las cepas dieron positivas a excepcin de
una cepa del suelo libre de contaminacin (P69CM2).
En otros estudios se ha observado que la mayor cantidad de bacterias en
suelo contaminado son gram (-) (Kaplan y Kitts, 2004) esto mismo fue observado

~ 60 ~

en este estudio, aunque recientes investigaciones han demostrado la presencia de

bacterias gram (+) en sitios contaminados (Quatrini et al., 2008).
En cuanto a la morfologa, tanto en el suelo contaminado como en el libre
de contaminacin la mayora de las especies present forma de bacilos, la forma
de cocos slo fue observada en el suelo contaminado (P 48,69 y 98). La forma de
estreptobacilos solo fue observada en el suelo libre de contaminacin (P69C)
(Tabla 8).
Tabla 8. Aislamiento de bacterias.
Suelo

1
Siembra

Aislamiento

Gram

Morfologa

Catalasa

P48M1
P48M2
P48M3

X
X
X

P48M4
P48CM1
P48CM2
P48CM3
P48CM4
P69M1
P69M2
P69M3
P69M4
P69CM1
P69CM2
P69CM3
P69CM4
P98M1
P98M2
P98M3
P98M4

X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X

P98CM1

P98CM2
P98CM3
P98CM4

X
X
X

NO
1
1
2
1
1
1
NO
NO
1
1
1
NO
1
1
1
1
1
1
NO
1
2
3
1
2
1
1
NO

NO

NO
NO

NO

NO

NO

NO
Cocos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
NO
NO
Bacilos
Cocos
Bacilos
NO
Bacilos
Estreptobacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
NO
Bacilos
Bacilos
Cocos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
NO

NO
+
+
+
+
+
+
NO
NO
+
+
+
NO
+
+
+
+
+
NO
+
+
+
+
+
+
+
NO

~ 61 ~

4.4 Pruebas bioqumicas

Las pruebas bioqumicas permitieron identificar 8 gneros de bacterias, el
gnero frecuentemente encontrado en el suelo contaminado como en el suelo libre
de contaminacin fue Arizona, el gnero Providencia slo fue encontrado en dos
sitios uno contaminado y otro libre de contaminacin (pozo 69 y 69C), la especie
Citrobacter slo se encontr en los pozos 48, 98 y 98C, la especie C. diversus y C.
freundi slo se encontraron en los pozos 48C y 98C, Cedecea neteri (C. neteri)
slo fue encontrada en un sitio contaminado (P98), la especie Klebsiella slo se
encontr en un suelo contaminado (P69), Edwardsiella slo se encontr en suelo
libre de contaminacin P69C (Tabla 9).
Tabla 9. Pruebas bioqumicas para la determinacin de bacterias.
Suelo

Prueba Bioqumica
TSI LIA UREA CS M I
P48M2
+
+

+ +
P48M3-1
+
+

+
+ +
P48M3-2
+
+

+
+ +
P48M4
+
+

+
+ +
P48CM1

+
+ +
P48CM2
+
+

+
+
P69M1

+

P69M2
+
+

+
+ +
P69M3

+ +
P69CM1

+ +
P69CM2
+
+

+
P69CM3

+
P69CM4
+
+

+
+ +
P98M1

+
+ +
P98M2
+
+

+
+ +
P98M4-1
+
+

+ +
P98M4-2
+
+

+
+ +
P98M4-3
+
+

+ +
P98CM1-1
+
+

+ +
P98CM1-2
+
+

+
+ +
P98CM2
+
+

+
+ +
P98CM3
+
+

+
+ +
TSI= Agar Hierro y Tripe Azcar; LIA= Agar Hierro y Lisina;
Movilidad, I= Indol y O= Ornitina.

~ 62 ~

Gnero/Especie
O
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
Urea;

Citrobacter
Arizona
Arizona
Arizona
C. diversus
C. freundi
Klebsiella
Arizona
Providencia
Providencia
Edwardsiella
Providencia
Arizona
C. diversus
Arizona
C. neteri
C. freundi
Citrobacter
Citrobacter
Arizona
Arizona
Arizona
CS= Citrato de Simmons, M=

De los ocho gneros identificados en este estudio solo tres Klebsiella,

Citrobacter y Edwardsiella han sido reportados como especies existentes en sitios
contaminados por hidrocarburos (Len et al., 2009).

4.5 Degradacin de antraceno por las bacterias

Los diferentes gneros y especies que fueron capaces de utilizar al
hidrocarburo poliaromtico antraceno como fuente de carbono fue Edwardsiella,
Citrobacter y C. neteri (Tabla 10; figura 6, 7 y 8).
El crecimiento de las tres cepas fue hasta las 48 horas de incubacin.

Tabla 10. Gnero y especies de bacterias encontradas en el campo petrolero Miguel Alemn, con
capacidad para utilizar el hidrocarburo antraceno como fuente de carbono. El Signo indica que no
hubo crecimiento, signo + indica crecimiento.
Gnero/Especie
Klebsiella

Degradacin de
Antraceno

C. neteri

C. freundi

C. diversus

Citrobacter

Edwardsiella

Providencia

Arizona

La especie que obtuvo mejor degradacin de antraceno fue Edwardsiella, al

tener mayor crecimiento en el agar (Figura 6).

~ 63 ~

Figura 6. Crecimiento del gnero Edwardsiella en el medio con antraceno como nica fuente de
Carbono.

Figura 7. Crecimiento de Citrobacter en el medio con antraceno como nica fuente de Carbono.

~ 64 ~

Figura 8. Crecimiento de la especie C. Neteri en el medio con antraceno como nica fuente de
Carbono.

4.6 Conclusin
En el campo petrolero Miguel Alemn, donde la contaminacin por
hidrocarburos est presente, la bacteria del gnero Arizona fue la especie ms
abundante, sin embargo, aunque presenta una alta tolerancia a los niveles de
contaminacin no fue capaz de incorporar al antraceno como fuente de carbono.
Los gneros de bacterias que demostraron actividad hidrocarburoltica
fueron Citrobacter, Edwardsiella y Cedecea neteri lo que indica que estas pueden
utilizar al hidrocarburo poliaromtico antraceno como fuente de carbono, por lo
que dichas especies podran ser utilizadas en la biorremediacin de suelos
contaminados por hidrocarburos por el potencial demostrado en este estudio.

~ 65 ~

Aunque la bacteria Edwardsiella present el mejor crecimiento en el agar

especfico para la degradacin de Antraceno, sta no fue encontrada en el suelo
contaminado, sino que se present en el suelo sin contaminacin.
La contaminacin por hidrocarburos si tuvo un efecto significativo sobre los
parmetros fsicos y qumicos del suelo, en el caso del fsforo disponible y la CIC.

~ 66 ~

BIBLIOGRAFA
Adams, R. 1999. A Full scale comparison of introduced vs. indigenous
microorganisms for bioremediation of a bulk plant. Proceedings of the VI
annual conference of the Colorado hazardous wastes management society.
Denver, Colorado, 22 y 23 de Octubre.

Adenipekun, A. Clementina, O. Ipeaiyeda R y Olayonwa J. 2013. Bioremediation

of soil contaminated with spent and fresh cutting fluids by Pleurotus
pulmonaris (fries) quelet. Academic Journals. Vol 12(42). Pp. 6091-6097.

Aitken, M.D., Stringfellow, W.T., Nagel, R.D., Kazunga, C. y Chen, S.H. 1998.
Characteristics of phenanthrene-degrading bacteria isolated from soils
contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons, Can. J. Microbiol.
Aug;44(8):743-52.

Alcaino, G. 2012. Anlisis y comparacin de tecnologas de remediacin para

suelos contaminados con metales. Tesis de licenciatura. Facultad de
ciencias qumicas y matemticas. Departamento de Ingeniera Qumica y
Biotecnologa. Universidad de Chile.

Alexander, M. 1991. Introduction to soil microbiology. Segunda edicin. John

Wiley. New York, USA. Pp 467.

Alexander, M. 1999. Biodegradation and bioremediation. Segunda edicin.

Academic Press, Inc., San Diego. P. 302

Altamirano, M. y Pozzo, M. 2000. Aislamiento e identificacin de bacterias

hidrocarburolticas provenientes de un suelo sometido a biorremediacin.
XXVII Congreso Interamericano de Ingeniera Ambiental y Sanitaria.

~ 67 ~

Buenos Aires, Argentina.

American Petroleum Institute (API). 1972. Detection, ampling, and analysis of

hydrocarbons. The migration of petroleum products in soil and ground water.
Washington, D.C., USA. (Publicacin 4149).

Arenas, S. 1999. Aislamiento y caracterizacin de bacterias de ambientes

contaminados con petrleo en refinera, La Pampilla. Tesis de Licenciatura.
Universidad Nacional de La Molina. Facultad de Ciencias Biolgicas. Lima,
Per.

Atlas, R. y Bartha, R. 2002. Ecologa microbiana y microbiologa ambiental. 4ta

Edicin. Addison Wesley. Madrid, Espaa. P 677.

Bautista, F.1999. Introduccin al estudio

de la contaminacin del suelo por

metales pesados. Direccin general de desarrollo acadmico subdireccin

de extensin departamento Editorial. Yucatn, Mxico. Pp. 17-20.

Bedair, H. M. y H. T. Al-Saad, 1992. Dissolved and particulade adsorbed

hydrocarbons in water of Shatt Al-Arab River, Iraq. Water, Air, soil pollution.
61: 397-408.

Benavides J., Quintero G. 2005, Biorremediacin de suelos contaminados con

hidrocarburos derivados del petrleo. Nova Publicacin cientfica. Nova. 4
(5): 1-116.

Benavides, L. J., Quintero, G, Guevara, V. A., Jaimes, D. C. 2006. Bioremediacin

de suelos contaminados con hidrocarburos derivados del petrleo.
Colombia. Nova Publicacin Cientfica 4 (006): 50-54.

~ 68 ~

Bidleman, T. F.; A. A. Castleberry; W. T. Foreman; M. T. Zaransk & D. W. Wall.

1990. Petroleum hydrocarbons in the surface water of two studies in the
Southeastern United States. Est. Coast Shelf Science. 30:91-109.

Brandy, N. C. y Weil, R. R. 1999. The Nature and properties of soils. Prentice Hall.
EE.UU. P. 960.

Castro, G. 2009. Impacto Ambiental generado por los derrames de petrleo en el

sote en el tramo comprendido entre Lago Agrio y Baeza. Tesis de maestra.
Ciudad de Ibarra. Facultad de Ingeniera en Ciencias Agropecuarias y
Ambientales. Instituto de postgrado. Universidad Tcnica del Norte.

Cerniglia, C. E. 1984. Microbial transformation of aromatic hydrocarbons. In

R.M.Atlas, editor, Petroleum Microbiology. Macmillan Publishing Co. New
York. Pp. 99-128.

Cerniglia, C. E., G. L. White y R. H. Heflich. 1985. Fungal metabolism and

detoxification of polycyclic aromatic hidrocarbons. Arch. Microbiol. 143:105110.

Cerniglia, C. E., J. B. Sutherland y S. A. Crow. 1992. Fungal metabolism of

aromatic hydrocarbons. Edit. G. Winkelmann. Microbial degradation of
natural products.VCH. Weinheim. Pg. 193-217.

Chappin, R. G. y L. R. Summerlin, 1988. Qumica. Publicaciones Cultural. Mxico.

Corona, L e Iturbide R. 2004. Atenuacin natural en suelos contaminados con

hidrocarburos. UNAM. Ingeniera Investigacin y Tecnologa VI. 2. 119-126.

~ 69 ~

Cram, S., C. Siebe, R. Ortz y A. Herre. 2004. Mobility and persistence of

petroleum hydrocarbons in tropical peat soils in southeastern Mexico. Soil
and Sediment Contamination 13 (5): 341-360.

Cubito, M. y Cabezali, C. 2000. Tipificacin y evolucin de la actividad

degradadora de hidrocarburos de una cepa bacteriana aislada del estuario
de Baha Blanca, Argentina. Revista Argentina de Microbiologa. Vol. 33 (3):
141-148.

Cutright, T. J., Hwang, S., 2006. Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs).

Encyclopedia of chemical processing (Lee, S. Ed.). Marcel Dekker, Inc. New
York, NY. Pp. 2291-2299.

Dean-Ross, D. Moody, J. Cerniglia, C.E. 2002. Utilisation of mixtures of polycyclic

aromatic hydrocarbons by bacteria isolated from contaminated sediment,
FEMS Microbiol. Ecol. 41:1-7.

Eisler, R., 1987. Polycyclic aromatic hydrocarbon hazards to fish, wildlife, and
invertebrates: a synoptic review. Patuxent Wildlife Research Center, Laurel,
MD USA. Fish and Wildlife Service Biological Report 85 (1.11).

Environmental Protection Agency (EPA) list. 16 Prioritary pollutant polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAHs). 1987.

Eweis, J.B., S.J. Ergas, D.P. Chang y E.D. Schroeder 1998. Bioremediation
Principles. McGraw-Hill International Editions. P. 296.

Fontrbel, F. y Ach D. 2000. Empleo del Mtodo de determinacin de biomasa

microbiana por fumigacin-extraccin para el estudio en suelos del Altiplano
Boliviano contaminados por hidrocarburos. Ciencia abierta. Disponible en

~ 70 ~

http://cabierta.uchile.cl. Consultado el 7 oct. 2014.

Furton K. G. y G. Pentzke. 1998. Polycylic aromatic hydrocarbons. Takayuki

Shibamoto Ed. chromatographic anlisis of environmental and food
toxicants. Marcel Dekker Inc., New York.

Gibson, D. T. y V. Subramanian. 1984. Microbial degradation of aromatic

compounds. In: Gibson DT (Ed), Microbial Degradation of Organica
compounds. Marcel Dekker, New York. Pp. 181-252

Haritash, A.K. y Kaushik, C. P. 2009. Biodegradation aspects of polycyclic

aromatic

hydrocarbons.

Department

of

Environmental

Science

&

Engineering, Guru Jambheshwar University of Science & Technology, Hisar,

Haryana, India. Journal of hazardous materials (Impact Factor: 4.14).
05/2009; 169(1-3):1-15.

Hernndez, Benito, 2013. Uso de lombrices de tierra en la remediacin de suelos

contaminados por hidrocarburos en Poza Rica Veracruz, Mxico. Tesis de
doctorado. Instituto de Biotecnologa y Ecologa Aplicada. UV.

Ilyna, A. Sanchez, C. Villareal, J. Ramirez, G. y Candelas J. 2003. Isolation of soil

bacteria for bioremediation of hydrocarbon contamination. Becth. Mock.
Mock.yh- ta.cep, 2003, 44(1), 88-91.

Imbellone, P., Alves, D. y Remn, L. 2009. Vinculacin de rasgos hidromorfcos

con suelos contaminados con hidrocarburos en la llanura costera del ro de
la Plata. Ctedra de Micromorfologa de Suelos (FCNyM). Pp. 1-13.

INEGI. Aspectos generales del territorio

Edafologa.

~ 71 ~

mexicano.

Recursos

Naturales.

http://mapserver.inegi.org.mx.

IUSS Grupo de Trabajo WRB. Base Referencial mundial del recurso suelo.
Primera actualizacin 2007. Informes sobre recursos mundiales de suelos
No. 103. FAO. Roma. 2007.

Juhasz, A. L., Naidu, R., 2000. Bioremediation of high molecular weight polycyclic
aromatic hydrocarbons: a review of

the microbial degradation of

benzo[a]pyrene. International Biodeterioration & Biodegradation. Volume,

45. Pagination, 57-88.

Kanaly, R. A., R. Bartha, K. Watanabe y S. Harayama. 2000. Rapid mineralization

of benzo(a)pyrene by a microbial consortium growing on diesel fuel. Appl.
Environ. Microbiol. 66:4205-4211.

Kaplan, C y Christopher L. 2009. Bacterial succession in a petroleum land

treatment

unit.

American

Society

for

Microbiology.

Appl.

Environ.

Microbiol. March 2004 vol. 70 no. 3 1777-1786.

Len, Y., De Sisto, A. Inojosa. Y., Malaver, N. y Naranjo, L. 2009. Identificacin de

biocatalizadores potenciales para la remediacin de desechos petrolizados
de

la

Faja

Petrolfera

del

Orinoco

RET.

Revista

de

Estudios

Transdisciplinarios. Fundacin Instituto de Estudios Avanzados Venezuela.

Vol. 1, nm. 2, julio-diciembre, 2009. Pp. 12-25.

Levin, M. y Gealt, M. 1997. Biotratamiento de residuos txicos y peligrosos.

McGraw-Hill. Madrid, Espaa. P. 21-40.

Mac Faddin. 2003. Pruebas bioqumicas para la identificacin bacteriana de

importancia Clnica. 3a edicin. Editorial panamericana. Pp. 73-92, 113-

~ 72 ~

127, 206-216, 223-235, 306-311, 397-410.

Martnez, V. y Lpes, F. 2001. Efecto de los hidrocarburos en las propiedades

fsicas y qumicas de un suelo arcilloso. Terra 19:9-17.

Mastandrea, C., Chichizola, C., Luduea, B., Snchez, H., lvarez3, O., Gutierrez,
A., 2005. Exposicin a hidrocarburos aromticos policiclicos. Alkemy-Center
Lab. Departamento de toxicologa clnica/laboral e higiene industrial. Acta
Bioqumica Clnica LatinoAmericana. V. 39. No. 1.

McBride, M. B. 1994. Environmental Chemestry of soils. Oxford University Press.

P. 406.

Medina, J. A., Vallejo S. A. y Rocha M. 2001. Bases de poltica para la prevencin

de la contaminacin del suelo y su remediacin. Instituto Nacional de
Ecologa.

Medina, A., Salazar, T. J.L. Alvarez. 2010. Atlas del patrimonio natural, histrico y
cultural de Veracruz. Gobierno del Estado de Veracruz: Comisin del
Estado de Veracruz para la conmemoracin de la independencia nacional y
la revolucin mexicana: Universidad Veracruzana. Pg. 36-39.

Menzie, C. A.; B. B. Potocki & J. Santodonato. 1992. Exposure to carcinogenic

polycyclic hydrocarbons in the environment. Environmental Science &
Technology. 26 (7), Pp. 1278-1284.

Merino,

F.

1998.

Estudio

de

microorganismos

nativos

productores

de

emulsificantes de petrleo. Tesis de Licenciatura. Universidad Nacional La

Molina. Facultad de Ciencias Biolgicas. Lima, Per.

~ 73 ~

Mohsenzadeh, F., Chehregani, A y Akbari, M. 2012. Evaluation of oil removal

efficiency and enzymatic activity in some fungal strains for bioremediation of
petroleum-polluted soils. Iranian Journal of Environmental Health Sciences
& Engineering, 9:26.

Montenegro, F. 2007. Aislamiento y seleccin de cepas bacterianas nativas de

suelos de XII regin de Chile, para la degradacin de crudos de petrleo.
Tesis de licenciatura. Facultad de Ciencias Agrarias. Escuela de
Agronoma. Universidad Austrial de Chile.

Okolo, J., Amadi, E. y Odu, C. 2005. Effects of soils treatments containing poultry
manure on crude oil degradation in a sandy loam soil. Applied Ecology and
Environmental Research 3(1): 47-53.

Padilla, R. M. Y. 1989. Determinacin de los niveles de hidrocarburos en

sedimentos recientes del Ro Calzadas en la regin del Bajo Ro
Coatzacoalcos, Veracruz. Mxico. Tesis de licenciatura. Facultad de
Ciencias. UNAM.

PEMEX, 1988. El Petrleo. Gerencia de informacin y relaciones pblicas. Mxico.

Perez, B., Martinez, D., Calixto, M., Alba J. y Rodriguez, R. 2010. Biostimulation of
micro-organisms from sugarcane bagasse pith for the removal of weathered
hydrocarbon from soil. Lett. Appl. Microbiol. 38, 373-377.

Petrleos

Mexicanos

Informe

Anual.

2012.

http://www.pemex.com/acerca/informes_publicaciones/Documents/informes
_art70/informe_anual_2012_art70.pdf

~ 74 ~

Pignatello, J. y Xing, B. 1996. Mechanisms of show sorption of organic chemicals

to natural particles. Environmental Science Technology 30: 1-11.

Porta, J. y Acevedo, M. L. 2005. Agenda de campo de suelos. Ediciones MundiPrensa. Mxico.

Prince, R. C. 1993 Petroleum spill bioremediation in marine environments. Crit.

Rev. Microbiol. 19, 217-242.

Prince, R. G. y Drake E. N. 1999. Transformation and fate of polycyclic aromatic

hydrocarbons in soil. Wisconsin USA. Pp. 89-110.

PROFEPA 1999. Restauracin de suelos contaminados. Grupo de trabajo sobre la

restauracin de suelos contaminados. Mxico.

Rehmann, K., Noll, H.P., Steiberg, C.E.. y Kettrup. A.A. 1998. Pyrene degradation
by Mycobacterium sp. Strain KR2, Chemosphere. 36(14):2977-92.

Rsendez, L. A. 2009. Anlisis Hiperespectral de suelos contaminados por

hidrocarburos y pesticidas. Instituto Tecnolgico de Estudios Superiores de
Monterrey. Nuevo Len. Mxico.

Rittmann, B. 2001. Biotecnologa del medio Ambiente, principios y aplicaciones.

McGraw-Hill. Madrid, Espaa. Pp. 745.

Rivera, M., Ferrera, R., Volke, V., Rodriguez, R. Y Fernandez, L. 2002. Adaptacin
y seleccin de microorganismos autctonos en medios de cultivos
enriquecidos con petrleo crudo. Publicado por Terra 20: 423-434.

Romero, M.C., Cazau, M.C., Giorgieri, S. y Arambarri, A.M. 1998. Phenanthrene

~ 75 ~

degradation by microorganisms isolated from a contaminated stream,

environ. Pollut. 101: 355-359.

Salazar, G. Almeida, A y Gmez, M. 2013. Infeccin de herida traumtica por

Cedecea lapegei. Comunicacin de un caso y revisin de la literatura.
Hospital Metropolitano. Quito, Ecuador. 30 (1). Pp. 86-89.

Sarubbi, A. 2000. Aspectos importantes en biorremediacin. AIDIS Argentina.

Schnitzer, M. Y Khan, S. 1978. Soil organic matter developments in soil science.

Elsevier, Holanda. Pp 1-64.

SEMARNAT 1996. Los Suelos de Tabasco restauracin, conservacin y uso.

Gobierno constitucional del Estado de Tabasco.

Sharpley, J. 1966. Petroleum Microbiology. Gulf publishing company. Houston,

Texas, USA. Vol. 7. Pp. 332.

Singleton, D. R., Ramirez, L. G., & Aitken, M. D., 2009. Characterization of a

polycyclic

aromatic

hydrocarbon

degradation

gene

cluster

in

phenanthrene-degrading Acidovorax strain. Applied and environmental

microbiology. Vol. 75. No. 9 2613-2620.

Storch de Gracia, J. M. 1998. Manual de Seguridad industrial en plantas qumicas

y petroleras, fundamentos, evaluacin de riesgos y diseo. McGraw-Hill.
Madrid, Espaa. Pp. 621-644.

Sutherland, J. B., F. Rafii, A. A. Khan y C. E. Cerniglia. 1995. Mechanisms of

polycyclic aromatic hydrocarbon degradation. En L. Y. Young y C. E.
Cerniglia (Eds), Micribialtransformation and degradation of toxic organic

~ 76 ~

chemicals. Wiley-Liss. New York. pp. 269-306.

Tang, L., Niu, X., Sun, Q. y Wang, R. 2010. Bioremediation of petroleum polluted
soil by combination of ryegrass with effective microorganisms. J Environ
Technol Engin. 3:80-86.

Twiss, M. R., Granier, L., Lafrance, P., & Campbell, P. G., 1999. Bioaccumulation
of

2,

2,

5,

5-tetrachlorobiphenyl

and

pyrene

by

picoplankton

(Synechococcus leopoliensis, cyanophyceae): Influence of variable humic

acid concentrations and pH. Environmental toxicology and chemistry. Vol.
18. Pp. 2063-2069.

Verlag, G. 2007. Color Atlas of Genetics. 3rd Edition. New York, USA. Pp. 138151.

Vias, Marc, 2005. Biorremediacin de suelos contaminados por hidrocarburos:

Caracterizacin microbiolgica, Qumica y Ecotoxicolgica. Tesis de
Doctorado. Universidad de Barcelona.

Volke, T., Velasco, J.A. 2002. Tecnologas de remediacin para suelos

contaminados. INE-SEMARNAT. Mxico. Pp. 27-51.

Walker, J. y Colwell, R. 1977. Role of autochthonous bacteria in the removal of

spilled oil from sediment. Environmental Pollution. Vol. 4. Pp. 389-406.

Whise, D. L. 2000. Bioremediation of contaminated soils. Marcel Decker.New York.

4(3): 297-304.

Yuan, S.Y., Shiung, L.C. y Chang, B.V. 2002. Biodegradation of polycyclic

aromatic hydrocarbons by inoculated microorganisms in Soil, Bull. Environ.

~ 77 ~

Conatm. Toxicol. Vol. 169. Pp. 1-15.

Zamora, A., Ramos, J., Arias, M. 2012. Efecto de la contaminacin por

hidrocarburos sobre algunas propiedades qumicas y microbiolgicas de un
suelo de sabana. Bioagro 24(1): 5-12.

~ 78 ~

Anexo A: Glosario para la determinacin de parmetros fsicos y

qumicos del suelo.

Textura
Determinacin de la Textura del suelo mtodo Bouyoucous
Reactivos
1. Agua oxigenada al 30%.
2. Oxalato de sodio saturado. Disolver 30 g de oxalato de sodio en 1 litro de
agua.
3. Metasilicato de sodio con 36 g L-1 de lectura con el hidrmetro. Disolver 50 g
de matasilicato de sodio en 1 litro de agua ajustar la solucin hasta que se
obtenga una lectura de 36 con el hidrmetro.
4. Hexametafosfato de sodio (calgn). Disolver 50 g de (Na 3PO3)6 en agua
destilada y aforar a un litro.
Material y equipo
1. Hidrmetro de Bouyoucos con escala de 0-60.
2. Probetas de 1000 cc.
3. Cilindro de Bouyoucos.
4. Agitador con motor para dispersin.
5. Agitador de mano.
6. Termmetro de -10 a 110C.

Procedimiento
1. Pesar 60 g de suelo de textura fino o 120 g de suelo de textura gruesa en un
vaso de precipitados de 500 ml agregar 40 ml de agua oxigenada y poner a

~ 79 ~

evaporar hasta sequedad, agregar otros 40 ml y observar la reaccin. Evaporar

nuevamente a sequedad. Repetir hasta que no haya efervescencia al agua
oxigenada.
2. En general dos ataques son suficientes para la mayora de suelos. Despus de
eliminar la materia orgnica y llevar a sequedad el suelo, pesar 50 g de suelo de
textura arcillosa o 100 g de suelo de textura arenosa y ponerlos en un vaso de
precipitados de 250 ml. Adicionar agua hasta cubrir la superficie con una lmina
de 2 cm. Agregar 5 ml de oxalato de sodio y 5 ml de metasilicato de sodio y dejar
reposar durante 15 minutos. Si el suelo tiene mucha arcilla puede prolongarse el
tiempo hasta media hora.
3. Pasar las muestras de los vasos de precipitado a las copas del agitador
mecnico, pasando todo el material con la ayuda de una piceta. Activar los
agitadores y proceder a dispersar cinco minutos. Al finalizar el tiempo de
agitacin, bajar la copa del dispersor y pasar el contenido a una probeta de 1000
ml o al cilindro de Bouyoucos enjuagando la copa con ayuda de una piceta.
4. Agregar agua destilada hasta completar un litro con el hidrmetro dentro de la
suspensin en el caso de la probeta y si utiliza el cilindro de Bouyoucos llevar a la
marca inferior (1113 ml) con el hidrmetro dentro de la suspensin. Sacar el
hidrmetro y suspender el suelo con un agitador de mano operando durante un
minuto.
5. Tomar las lecturas del hidrmetro a los 40 segundos y despus de 2 horas de
terminada la dispersin con el agitador de mano.
6. Para hacer una lectura, colocar el hidrmetro dentro de la probeta 20
segundos antes del momento de la determinacin, cuidando de alterar lo menos
posible la suspensin. Despus de hacer la lectura se seca el hidrmetro, se
lava, se seca y se toma la temperatura. Si por alguna razn al hacer la lectura se
acumula espuma alrededor del hidrmetro, agregar unas gotas de alcohol etlico.
Clculos

~ 80 ~

Corregir las lecturas del hidrmetro agregando 0.36 por cada grado centgrado
arriba de 19.5C restando la misma cantidad por cada grado abajo de dicha
temperatura (tabla de correccin por temperatura). La lectura a los 40 segundos
multiplicada por 2 es igual al porcentaje de arcilla ms limo. Restando de 100 se
obtiene el porcentaje de arena. La lectura obtenida a 2 horas multiplicadas por 2
es igual al porcentaje de arcilla. El porcentaje de limo se obtiene por diferencia.
Cuando se usan 100 g no debe multiplicarse por 2 ya que el hidrmetro est
calibrado en porcentajes considerando 100 g de suelo. Con los porcentajes de
limo, arena y arcilla se determina la textura correspondiente con el tringulo de
texturas.

pH
Determinacin de pH
Reactivos
Los reactivos utilizados en esta determinacin deben ser grado analtico y el
agua utilizada en la preparacin de las soluciones debe ser destilada o
desionizada.
1. Agua destilada o desionizada.
2. Soluciones reguladoras de referencia, pH 4.00, 7.00 y 10.00, las cuales se
adquieren preparadas o concentradas para diluirse de acuerdo a la instruccin.
Estas soluciones deben estar a temperatura ambiente al momento de calibrar el
medidor de pH.
Material y equipo
1. Potencimetro o medidor de pH equipado con electrodo de vidrio en
combinacin con electrodo de referencia.
2. Balanza con 0.1 g de sensibilidad.

~ 81 ~

3. Frascos de vidrio o plstico transparente de boca ancha con capacidad de 50 a

100 ml.
4. Pipeta volumtrica de 20 ml.
5. Varilla de vidrio que sirva como agitador manual.
6. Piceta.
7. Cinta mtrica.
Procedimiento
1. Pesar 10 g de suelo en un frasco de vidrio o plstico de boca ancha.
2. Adicionar 20 ml. de agua destilada al frasco conteniendo el suelo.
3. Con una varilla de vidrio, agitar manualmente la mezcla de suelo: agua a
intervalos de 5 minutos, durante 30 minutos.
4. Dejar reposar durante 15 minutos.
5. Calibrar el medidor de pH con las soluciones reguladores pH 4.00 y 7.00 o
7.00 y 10.00 segn el suelo, enjuagando con agua destilada los electrodos antes
de iniciar las lecturas de las muestras.
6. Agite nuevamente la suspensin e introduzca el electrodo en la suspensin.
7. Registre el pH al momento en que la lectura se haya estabilizado.
Informe de la prueba
Debe incluir la informacin que a continuacin se indica:
1. Datos completos de identificacin de la muestra.
2. Reportar el valor con nmero entero y una cifra decimal.
3. Fecha de realizacin de la prueba.

Materia Orgnica (MO):

~ 82 ~

Determinacin de materia orgnica Walkley y Black.

Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico a
menos que se indique otra cosa.
1. Dicromato de potasio 0.166 M o 1N.- Disolver 48.82 g de K2Cr2O7 en agua
destilada aforar a 1000 ml en un matraz volumtrico.
2. Acido sulfrico concentrado (H2SO4).
3. Acido fosfrico concentrado (H3PO4).
4. Indicador de difenilamina. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 ml de agua y
aadir 100 ml de cido sulfrico concentrado.
5. Sulfato ferroso 1.0 M (aproximadamente). Disolver 278 g de FeSO 4.7H2O en
agua a la que previamente se le aadieron 80 ml de H2SO4 concentrado, enfriar y
diluir a un litro. Esta solucin debe ser valorada con K2Cr2O7 1 N antes de realizar
la determinacin.
Material
Matraces Erlenmeyer de 500 ml.
Bureta para K2Cr2O7 (50 ml).
Bureta para FeSO4.7H2O (50 ml).
Pipeta volumtrica (10 ml).
Probeta de vidrio (25 ml).
Procedimiento
1. Pesar 0.5 g de suelo seco y pasado por un tamiz de 0.5 mm y colocarlo en un
matraz Erlenmeyer de 500 ml. Procesar un blanco con reactivos por triplicado.
2. Adicionar exactamente 10 ml de dicromato de potasio 1 N girando el matraz
cuidadosamente para que entre en contacto con todo el suelo.

~ 83 ~

3. Agregar cuidadosamente con una bureta 20 ml de H2SO4 concentrado a la

suspensin, girar nuevamente el matraz y agitar de esa forma durante un minuto.
4. Dejar reposar durante 30 minutos sobre una lmina de asbesto o sobre una
mesa de madera, evitando las mesas de acero o cemento.
5. Aadir 200 ml de agua destilada.
6. Aadir 5 ml de H3PO4 concentrado.
7. Adicionar de 5 a 10 gotas del indicador de difenilamina.
8. Titular con la disolucin de sulfato ferroso gota a gota hasta un punto final
verde claro.
Clculos
Donde:
B = Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar el blanco de reactivos (ml).
T = Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar la muestra (ml).
N = Normalidad exacta del sulfato ferroso (valorar por separado al momento de
analizar las muestras).
g = Peso de la muestra empleada (g).
mcf = factor de correccin de humedad.
% Materia orgnica = % C Orgnico x 1.724

Nitrgeno total (NT):

Determinacin de nitrgeno total
Reactivos
1. Acido sulfrico concentrado.

~ 84 ~

2. Solucin de cido brico con indicador. Colocar 80 g de cido brico (H3BO3)

en un frasco de cinco litros de capacidad en el cual se ha marcado el nivel de 4
litros, adicionar 3.8 litros de agua destilada, calentar y agitar hasta la completa
disolucin de cido. Enfriar la solucin y agregar 80 ml de la siguiente mezcla de
indicadores: 0.099 g de verde de bromocresol y 0.066 g de rojo de metilo
disueltos en 100 ml de alcohol etlico 95%.
El pH de la mezcla de H3BO3-indicador debe ser aproximadamente 5.0. Si fuese
ms cido agregar cuidadosamente gotas de NaOH 0.1 N hasta que la solucin
adquiera una coloracin purprea rojiza o se alcance el pH indicado. Completar a
4 litros con agua destilada y mezclar vigorosamente.
3. Mezcla de catalizadores-K2SO4. Mezclar perfectamente 1 kg de K2SO4, 100 g
de CuSO4, 5H2O y 10 g de Selenio metlico. La mezcla debe homogeneizarse
completamente para evitar agregacin de las partculas de los componentes.
4. Hidrxido de sodio 10 N. Colocar 4.0 Kg de NaOH en un botelln de vidrio
Pyrex de pared gruesa de aproximadamente 10 litros de capacidad. Adicionar 4
litros de agua destilada y rotar el botelln hasta que el hidrxido se disuelva.
Dejar que la solucin se enfre en el depsito al cual se debe proveer de una tapa
para evitar la absorcin de CO2 ambiental. Dejar decantar durante la noche, o
ms si es necesario, y sifonar el sobrenadante a otro botelln marcado a 10 litros
que contiene 1.5 litros de agua destilada libre de CO 2 (hervida). Completar al
volumen indicado con agua de igual calidad y agitar vigorosamente. El hidrxido
de sodio debe protegerse de CO2 atmosfrico utilizando un filtro de ascarita o
cualquier otro.
Acido sulfrico 0.01 N. Diluir 1 litro de cido sulfrico 0.05 N (1.4 ml por litro) a 5
litros con agua destilada. Estandarizar con Na2CO3 seco. Pesar 0.250 g de sal y
disolver en un matraz de 50 ml. Llevar a volumen. Titular 3 alcuotas de esta
solucin de 10 ml cada una, usando 5 o 6 gotas de anaranjado de metilo como
indicador. Calcular la normalidad mediante la frmula siguiente:
Normalidad (H2SO4) = (0.025 g/53) x (1/V H2SO4).

~ 85 ~

V = Volmenes de cido sulfrico gastado en la titulacin, expresado en litros.

Material y equipo
1. Balanza analtica.
2. Matraces semi-micro Kjeldahl de 50 ml.
3. Aparato de digestin semi-micro Kjeldahl.
4. Destilador con arrastre de vapor.
5. Matraces Erlenmeyer de 125 ml.
6. Microbureta de 10 ml.
Procedimiento
1. Colocar una muestra de suelo previamente tamizada a travs de malla 60 y
que contenga aproximadamente 1 mg de N en un frasco micro-Kjeldahl seco (1,
0.5, y 0.25 g de muestra para suelos con 2, 4 y 8% de materia orgnica,
respectivamente).
2. Adicionar 1.1 g de mezcla de catalizadores K2SO4, 3 ml de cido sulfrico
concentrado calentar en la unidad digestora a temperatura media alta hasta que
el digestado se torne claro.
3. Ebullir la muestra por 1 hr a partir del momento en que se torne claro. La
temperatura en esta fase debe regularse de modo que los vapores de cido
sulfrico se condensen en el tercio inferior del cuello del tubo de digestin.
4. Una vez completada esta fase, dejar enfriar el frasco y agregar suficiente agua
para colocar en suspensin, mediante agitacin, el digestado (15 a 20 ml son
generalmente suficientes).
5. Dejar decantar las partculas de slice evitando la precipitacin de cristales de
sulfato de amonio.

~ 86 ~

6. Transferir el contenido lquido a la cmara de destilacin del aparato, lavando

el matraz de digestin con pequeas porciones de agua.
7. Colocar en el tubo de salida del aparato de digestin un matraz Erlenmeyer de
125 ml conteniendo 10 ml de la solucin H3BO3 + indicadores.
8. Adicionar cuidadosamente 10 ml de NaOH 10 N de modo que la sosa se
deposite en el fondo de la cmara de destilacin.
9. Conectar el flujo de vapor e iniciar la destilacin. Destilar hasta que el volumen
alcance la marca de los 75 ml en el frasco Erlenmeyer.
10. Determinar el nitrgeno amoniacal presente en el destilado titulando con el
cido sulfrico 0.01 N. Debe usarse una microbureta de 10 ml con graduaciones
de 0.01 ml. El cambio de color de la mezcla de indicadores en el punto final de la
titulacin, es de verde a rosado fuerte. Se preparan blancos siguiendo
exactamente el mismo procedimiento que en las muestras.
Clculos
% N total = (Vm-Vb) x N x 14 /p x 10
Donde:
Vm = Volumen de cido sulfrico empleado en titular la muestra
Vb = Volumen de cido sulfrico empleado en titular blanco
N = Normalidad exacta del cido sulfrico
14 = Peso equivalente del nitrgeno
10 = Factor de conversin a porcentaje
P = Peso de la muestra de suelo en g.

Fosforo extrable (P):

~ 87 ~

Determinacin de fsforo extrable para suelos neutros y alcalinos mtodo de

Olsen.
Reactivos
1. Hidrxido de sodio 1M. Disolver 4 g de NaOH en 100 ml de agua.
2. Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0.5 M. Disolver 42 g de NaHCO3 en
aproximadamente 1 litro de agua. Ajustar el pH de esta solucin a 8.5 mediante
la adicin de solucin de NaOH 1 M. Llevar a volumen con agua destilada.
Algunos autores recomiendan adicionar aceite mineral para evitar la exposicin
de la solucin al aire. Guardar la solucin en un recipiente de polietileno y revisar
el pH de la solucin antes de usarse, de requerirse, volver a ajustar a 8.5.
3. Solucin de tartrato de antimonio y potasio al 0.5%. Pese 0.5 g de K(SbO)
C4H4O6.1/2 H2O, transfiralo a un matraz volumtrico de 100 ml disulvalo y
afore con agua destilada.
4. Solucin de molibdato de amonio [(NH4)6Mo7O24. 4H2O]. Disolver 20 g de
molibdato de amonio [(NH4)6Mo7O24. 4H2O]. en 300 ml de agua destilada.
Agregue lentamente bajo constante agitacin y con cuidado, 450 ml de H 2SO4 (14
N) (194.4 ml H2SO4 concentrado diluido a 500 ml con agua da una concentracin
de aproximadamente 14 N). Agregue 100 ml de una solucin al 0.5% (p/v) de
tartrato de antimonio y potasio. Diluya las mezclas a 1 L con agua destilada. Este
frasco se debe tapar y con papel aluminio, proteger de la luz.
5. Solucin reductora con cido ascrbico. Disolver 0.50 g de cido ascrbico con
un poco de solucin de molibdato de amonio y aforar a 100 ml con la misma
solucin. Esta solucin es preparada cada vez que se vaya a formar color.
6. Solucin patrn de fsforo (200 mg L-1). Pesar exactamente 0.8786 g de
fosfato de potasio monobsico (KH2PO4) seco al horno a 105C, disolver en agua
y aforar a 1 litro. Guardar en envase de plstico o vidrio y conservar en
refrigeracin. Algunos autores recomiendan adicionar 25 ml de H 2SO4 7 N antes
de aforar para conservar la solucin libre de contaminantes biolgicos.

~ 88 ~

7. Solucin patrn de 5 mg L-1 de P Diluir 5 ml de la solucin de 200 mg L-1 de P

a 200 ml con agua destilada. Preparar fresca cada 5 das.
Material y equipo
1. Tubos de polietileno de 100 ml.
2. Papel Whatman No. 42 o equivalente.
3. Agitador mecnico recproco, ajustado a 180 oscilaciones por minuto.
4. Balanza analtica.
5. Matraces volumtricos de 50 ml.
6. Bureta de 10 ml.
7. Espectrofotmetro para leer a 880 nm y celdas de vidrio.

Procedimiento
1. Pesar 2.5 g de suelo previamente tamizado por malla de 2 mm y colocarlos en
los tubos de polietileno.
2. Adicionar 50 ml de la solucin extractora tapar y agitar la suspensin en
agitador de accin recproca durante 30 min. a 180 oscilaciones por minuto.
3. Filtrar inmediatamente a travs de papel filtro Whatman No. 42 u otro de
calidad similar.
4. Preparar blancos a partir de alcuotas de solucin extractora y adicionando
todos los reactivos como en las muestras.
5. Tomar una alcuota de 5 ml (o 10 ml si la concentracin de P es muy baja) del
filtrado y colocarla en un matraz aforado de 50 ml.
6. Agregar 5.0 ml de la solucin reductora, agitar y aforar. Leer despus de 30
min. pero antes de una hora a una longitud de onda 882 nm (leer previamente la
curva de calibracin).

~ 89 ~

7. Preparar una curva de calibracin con patrones de 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y
1.0 mg L-1 de P.
8. Pipetear 0, 1, 2, 4, 6 y 10 ml de una solucin de 5 mg L -1 de P a matraces
aforados de 50 ml.
9. Adicionar un volumen de solucin extractante de NaHCO 3 0.5 M igual a la
alcuota empleada para medir en las muestras desconocidas.
10. Llevar a aproximadamente 40 ml con agua y adicionar 5 ml de la solucin
reductora con cido ascrbico, aforar.
11. Agitar nuevamente. Leer despus de 30 minutos pero antes de una hora a
882 nm, leer las muestras y los patrones al mismo tiempo de reaccin, contando
el tiempo desde que se agrega el reactivo que genera el complejo hasta el
momento de la lectura.
Clculos
P (mg Kg-1 de suelo) = CC x Vi/p x Vf/a
Donde:
CC= mg L-1 de P en la solucin. Se obtiene graficando la curva de calibracin
(absorbancia contra mg L-1) e interpolando en la misma los valores de
absorbancia de las muestras analizadas a las cuales previamente se les ha
estado el valor promedio de los blancos o por medio de una regresin simple.
Vi= volumen de la solucin extractora adicionada.
p= peso de la muestra de suelo seca al aire.
Vf= volumen final de la solucin colorimtrica a leer.
a= alcuota de la muestra empleada para la cuantificacin.

Cationes intercambiables (Ca, Mg, K y Na):

~ 90 ~

La

determinacin

de

la

capacidad

de

intercambio

catinico

bases

intercambiables del suelo se realizar a travs del mtodo AS-12, con acetato de
amonio.
Principio y aplicacin
Mtodo para la determinacin de la capacidad de intercambio catinico (CIC) y
bases intercambiables (Ca2+, Mg2+, Na+ y K+) de los suelos, empleando acetato de
amonio 1N, pH 7.0, como solucin saturante. El mtodo para la determinacin
consiste en la saturacin de la superficie de intercambio con un catin ndice, el
ion amonio; lavado del exceso de saturante con alcohol; desplazamiento del catin
ndice con potasio y determinacin del amonio mediante destilacin. El amonio se
emplea como catin ndice debido a su fcil determinacin, poca presencia en los
suelos y porque no precipita al entrar en contacto con el suelo. La concentracin
normal que se usa asegura una completa saturacin de la superficie de
intercambio y como est amortiguada a pH 7.0, se logra mantener un cierto valor
de pH. El lavado con alcohol pretende desplazar el exceso de saturante y
minimizar la prdida del amonio adsorbido.
Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan deben ser grado analtico a
menos que se indique otra cosa, cuando se hable de agua se debe entender
agua desionizada o destilada. Las soluciones para este anlisis deben
almacenarse en recipientes de polietileno.
1. Solucin de acetato de amonio 1.0N, pH 7.0. Diluir 57 ml de cido actico
glacial (99.5%) con agua a un volumen de aproximadamente 500 ml. Agregar 60
ml de hidrxido de amonio concentrado, diluir con agua a un volumen de 990 ml,
mezclar completamente, ajustar a pH 7.0 y diluir a un volumen final de 1 litro con
agua.
2. Una alternativa en el punto anterior consiste en pesar y disolver 77 g de
acetato de amonio (NH4C2H3O2) en 900 ml de agua y de ser necesario ajustar a
pH 7.0 y entonces completar a un litro con agua.

~ 91 ~

3. Alcohol etlico, usar CH3CH2OH grado industrial.

4. Solucin de cloruro de sodio al 10%. Pesar 100 g de cloruro de sodio grado
analtico y disolver en 1 L de agua empleando un matraz aforado.
5. Solucin de cloruro de amonio 1N. Pesar 53.50 g de NH4Cl y disolver en agua.
Ajustar a pH 7.0 con hidrxido de amonio y diluir a 1 litro empleando un matraz
aforado.
6. Solucin de cloruro de amonio 0.25N. Pesar 13.38 g de NH4Cl y disolver en
agua. Ajustar a pH 7.0 con hidrxido de amonio y diluir a 1 litro empleando un
matraz aforado.
7. Indicador mixto. Mezclar volmenes iguales de rojo de metilo al 0.66% y de
verde de bromocresol al 0.99%. Ambos disueltos en etanol al 95%.
8. Solucin de cido brico. Usar H3BO3 al 2% en agua destilada que contenga
10 ml del indicador por litro.
9. Acido clorhdrico diluido valorado. Usar HCl 0.01 N.
10. Hidrxido de sodio al 40%. Disolver 400 g. de NaOH en agua destilada y
llevar a 1000 ml.
11. Nitrato de plata 0.1 N. Disolver 16.98 g de AgNO3 en agua destilada y llevar a
1000 ml.
12. Solucin de lantano acidificada. Pesar 7.742 g de La(NO 3)36H2O en un
matraz volumtrico de 250 ml con agua destilada aadir 17.5 ml de
HNO3 concentrado y aforar.
13. Solucin diluida de lantano acidificada. Tomar 50 ml de la solucin de lantano
acidificada en un matraz volumtrico de 500 ml y aforar con agua destilada.
14. Solucin de cloruro de cesio acidificada. Disolver 11.12 g de CsCl y 250 ml de
Al(NO3)39H2O en 500 ml de agua en un matraz volumtrico de 1000 ml, aadir
20 ml de HNO3 2 M y aforar con agua.

~ 92 ~

15. Solucin de cido ntrico 2 M. Diluir 7 ml de HNO3 concentrado en agua,

aforar a 100 ml en un matraz volumtrico.
Material
1. Tubos de centrfuga de 50 ml con fondo redondo.
2. Agitador mecnico.
3. Centrfuga con capacidad para 8 o 16 tubos.
4. Matraces volumtricos de 100 ml.
5. Matraces Erlenmeyer de 125 ml.
6. Aparato de destilacin.
Procedimiento
1. Pesar 5 g de suelo secado al aire y tamizado por malla de abertura de 2 mm y
transferirlo a un tubo de centrfuga de 50 ml. Agregar 33 ml de solucin de
acetato de amonio. Tapar y agitar en posicin horizontal durante 10 minutos.
Luego, centrifugar hasta que el lquido sobrenadante est claro. Esto se logra
fcilmente centrifugando a 2500 rpm. Decantar el lquido en un matraz de 100 ml
y repetir la extraccin otras dos veces, aforar con acetato de amonio y guardarlo
para la posterior determinacin de las bases intercambiables (solucin A).
2. Agregar 30 ml de la solucin de cloruro de amonio 1N; agitar durante 10
minutos y luego centrifugar hasta que el lquido sobrenadante est claro y
desecharlo. Adicionar 30 ml de la solucin de cloruro de amonio 0.25N, agitar
durante 10 minutos, centrifugar y desechar el sobrenadante. Lavar la muestra
con porciones de alcohol de 30 ml agitando durante 10 minutos, centrifugar y
eliminar el sobrenadante cada vez. El lavado termina cuando la prueba de
cloruros en el decantado sea mnima.
3. Prueba de cloruros. Pipetear 10 ml del sobrenadante alcohlico en un tubo de
ensaye y agregar 4 o 5 gotas de nitrato de plata, si se observa un ligero

~ 93 ~

precipitado blanco, la reaccin es positiva y se debe continuar el lavado hasta

que la prueba de cloruros sea negativa.
4. Reemplazar el amonio adsorbido con tres porciones de 33 ml de cloruro de
sodio al 10%, agitando durante 10 minutos y centrifugando cada vez. Decantar
cada reemplazo en un matraz volumtrico de 100 ml y completar al volumen.
Determinar el amonio a partir de una alcuota de 10 ml, la cual se transfiere a un
matraz Kjeldahl de 300 ml, se le agregan aproximadamente 8 ml de NaOH al
40% y se conecta al aparato de destilacin microkjeldahl. Recoger el producto de
la destilacin en un matraz Erlenmeyer que contenga 10 ml de mezcla de
indicador y cido brico. Determinar por titulacin con HCl 0.01N.
Clculos
Si se pesan 5 g de muestra entonces la capacidad de intercambio catinico
expresado en Cmol(+) Kg-1 de suelo (CIC) se calcular de la forma siguiente:
CIC = 200 (V) (N)
En donde:
V = volumen (ml) de HCl empleado al titular lo destilado en la solucin valorada.
N = normalidad del HCl.
alcuota = 10 ml y peso de suelo = 5 g.
Determinacin de Ca y Mg intercambiables:
1. Pipetear 0.5 ml de la solucin A en un tubo de ensaye.
2. Aadir 9.5 ml de la solucin diluida de lantano y mezclar.
3. Medir la concentracin de Ca y Mg en las series estndar, el blanco y la
muestra por espectrofotometra de absorcin atmica a una longitud de onda de
422.7 y 285.2 nm, respectivamente, usando una flama de aire-acetileno.
Clculos
Donde:

~ 94 ~

a= Concentracin de Ca o Mg medido en la muestra (mg L -1).

b= Concentracin de Ca o Mg medido en el blanco (mg L-1).
w= Peso del suelo seco (g)
Determinacin de Na y K intercambiables:
1. Pipetear 1.0 ml de la solucin A en un tubo de ensaye.
2. Aadir 1.0 ml de la solucin de cloruro de cesio acidificada.
3. Aadir 8 ml de agua y mezclar.
4. Medir la concentracin de Na y K en las muestras el blanco y las series
estndar por espectrofotometra de emisin de flama.
Clculos
Donde:
a= Concentracin de Na o K medido en la muestra (mg L-1).
b= Concentracin de Na o K medido en el blanco (mg L-1).
w= Peso del suelo seco (g).

Anexo B: Glosario para la determinacin de hidrocarburos

poliaromaticos y fraccin pesada.

Determinacin de hidrocarburos de la fraccin pesada:

El anlisis de hidrocarburos de la fraccin pesada deber cubrir pesos
moleculares mayores a C18. Los mtodos de referencia son el EPA 9071B para la
extraccin de los HCFP del suelo con n-hexano y su purificacin y determinacin
gravimtrica por el mtodo EPA 1664A.

~ 95 ~

La determinacin cuantitativa se deber realizar gravimtricamente a partir del

extracto con n-hexano de la muestra de suelo cribada y secada con Na 2SO4
anhidro y procesada con slica gel estandarizada.
1. Preparacin de la muestra
Para el anlisis es necesario que la muestra de suelo homogeneizada y cribada
sea extrada con nhexano mediante cualquiera de las tcnicas que se enlistan a
continuacin.
a) Soxhlet. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con
sulfato de sodio anhidro hasta eliminar el agua contenida. Se coloca en un
cartucho de celulosa para extraer los hidrocarburos en un equipo tipo
Soxhlet con n-hexano.
b) Sonicacin. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con
sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua contenida. Se somete a
sonicacin en presencia del n-hexano de una a tres veces, segn el
contenido de hidrocarburos. El extracto se separa del suelo por filtracin al
vaco o por centrifugacin.

2. Limpieza de la muestra
Un aspecto importante para la confiabilidad de este anlisis radica en la limpieza
de la muestra, la cual se deber hacer con gel de slice en una proporcin de 30
gramos por cada gramo de material extrado, segn se refiere en el mtodo EPA
1664A.
Adems, se debe someter la muestra en su totalidad a un proceso de
homogeneizacin y cribado antes de iniciar el anlisis; este paso es necesario
para evitar sesgo en la seleccin de la submuestra que va a ser destinada para las
determinaciones analticas.

~ 96 ~

3. Calibracin
Se debe utilizar una balanza analtica calibrada y se debe estandarizar la gel de
slice como se especificaen el mtodo EPA 1664A.
Determinacin de hidrocarburos poliaromaticos (HPAs):
Los mtodos de referencia son el EPA 8310 1986 o el EPA 8270C 1996 o
versiones posteriores.
La determinacin cuantitativa de hidrocarburos poliaromticos se debe realizar en
un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin con detector de DAD acoplado con
un detector de fluorescencia (EPA 8310 1986) o por cromatografa de gases
acoplada a espectrometra de masas (EPA 8270C 1996).
Cuando existan interferencias que no permitan identificar o cuantificar los HPAs
por Cromatografa de Lquidos, se deber utilizar Espectrometra de Masas para la
identificacin y cuantificacin, los lmites de deteccin aumentarn dependiendo
de las interferencias, por lo que debern estimarse e informarse en el reporte de
resultados o aplicar un mtodo de limpieza adecuado al extracto obtenido y
analizar ya sea por Cromatografa de Lquidos o por espectrometra de masas.
Con estos mtodos se pueden identificar y cuantificar 16 HPAs diferentes, aunque
los importantes para efectos de aplicacin de esta Norma son: benzo(a)pireno,
dibenzo(a,h)antraceno,

benzo(a)antraceno,

benzo(b)fluoranteno,

benzo(k)fluoranteno e indeno(1,2,3-cd)pireno.
1. Preparacin de la muestra
Para el anlisis es necesario extraer previamente los hidrocarburos que estn
presentes en la muestra de suelo homogeneizada y cribada, mediante cualquiera
de las tcnicas que se enlistan a continuacin.
a) Soxhlet. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con
sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua contenida. Se coloca en un

~ 97 ~

cartucho de celulosa para extraer los hidrocarburos en un equipo tipo

Soxhlet. El disolvente puede ser una mezcla de acetona/hexano (1:1), o
bien, cloruro de metileno/acetona (1:1) (v/v).
b) Sonicacin. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con
sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua contenida. Se somete a
sonicacin en presencia de un disolvente orgnico de una a tres veces,
segn el contenido de hidrocarburos. El disolvente puede ser una mezcla
de acetona/hexano (1:1) (v/v), o bien, cloruro de metileno/acetona (1:1). El
extracto se separa del suelo por filtracin al vaco o por centrifugacin.
En cualquiera de los dos casos, se puede requerir una limpieza para eliminar
interferencias.
2. Calibracin
Para la calibracin del equipo se deber utilizar al menos los siguientes
compuestos puros certificados o una mezcla de materiales de referencia
certificados:

benzo(a)pireno,

dibenzo(a,h)antraceno,

benzo(a)antraceno,

benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno e indeno(1,2,3-cd)pireno. Se debern

cumplir los requisitos de calidad para mtodos analticos establecidos por la
normatividad correspondiente.
En el caso de Cromatografa de Lquidos, se deben programar los detectores para
tener las siguientes longitudes de onda de cuantificacin en el detector de
fluorescencia a los tiempos de retencin de cada uno de los compuestos, el
detector de DAD debe programarse de 200 a 350 nm con objeto de obtener los
espectros UV que ayudarn a identificar los picos de los HPAs detectados y
utilizar 270 nm para cuantificar los tres primeros HPAs.
Compuesto

Longitud de onda Longitud de onda de Longitud de onda de

UV

excitacin (nm)

emisin (nm)

pireno

237

385

benzo(a)antraceno

277

376

~ 98 ~

benzo(b)fluoranteno

255

420

benzo(k)fluoranteno

255

420

benzo(a)pireno

255

420

dibenzo(a,h)antraceno

300

415

indeno(1,2,3-cd)pireno

250

495

La curva de calibracin debe iniciar para cada compuesto en una concentracin 10

veces menor al lmite mximo permisible ms bajo de la NOM-138-SEMARNAT2003 y hasta el rango lineal de trabajo del mtodo.
3. Cuantificacin
Se deber considerar el rea bajo la curva de cada compuesto a partir de la lnea
base con la seal de la longitud de onda especificada en la tabla anterior.
En el caso de Espectrometra de Masas, no se debe utilizar el TIC para cuantificar,
la cuantificacin deber realizarse considerando la tcnica de Perfil de Extracto de
Iones con el rea bajo la curva del in principal de cada compuesto a partir de la
lnea base y se deber confirmar la identidad de cada compuesto por medio de la
comparacin del espectro de masas con la biblioteca de espectros del equipo.

~ 99 ~