II Curso de Sinalizao Celular no Cncer

Teoria e Prtica da Biologia Celular Tumoral

Laboratrio de Sinalizao e Plasticidade Celular

Morte Celular: uma abordagem

funcional da apoptose e de outros
mecanismos de morte
Andrew Oliveira Silva

De 22 a 26 de Outubro de 2012

morte (do latim mors)

bito (do latim obitu)
falecimento (falecer + mento)
desencarne (deixar a carne)
O Dia da Morte; pintura de WilliamAdolphe Bouguereau (1825-1905)

Cessamento permanente das atividades

biolgicas necessrias manuteno
da vida de um organismo

MORTE CELULAR
Clulas so expostas a uma perturbao da
homeostase, que transpassa um ponto
irreversvel de restaurao, levando a morte.

Caminho sem volta

Quantidade e
intensidade do sinal

MORTE CELULAR

INJRIAS

SINAIS DE MORTE CELULAR

ESTMULOS

RESULTADO

fisiolgico

MORTE
PROGRAMADA
brando

patolgico

severo

MORTE
TRAUMTICA

ADAPTADO DE: Carvalho e Recco-Pimentel (2007)

SINALIZAO DE MORTE CELULAR

ESTMULOS PATOLGICOS = MODIFICAES
AMBIENTAIS
ADAPTAO
LESO
REVERSVEL
MORTE
CELULAR

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

Criao de um Comit de Nomenclatura em Morte
Celular (2005)
Editores do peridico Cell Death and Differentiation

Guido Kroemer

Guido Kroemer et al. Cell Death and Diff. (2007)

Guido Kroemer et al. Cell Death and Diff. (2009)

Guido Kroemer et al. Cell Death and Diff. (2011)

COMO DEFINIR MORTE CELULAR???

Perda da estabilidade da Memb. Plasmtica

Fragmentao das clulas

Engolfamento por fagcitos

COMO DEFINIR MORTE CELULAR???

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

MORTE CELULAR

TRAUMTICA

PROGRAMADA

Traumatismo ou doena

Processo fisiolgico normal

Processo de morte passiva

Participao ativa da clula

Processo patolgico

Mecanismo altamente regulado

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

Clssicas:
NECROSE

APOPTOSE

ACIDENTAL

PROGRAMADA

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

Clssicas:
NECROSE

APOPTOSE

ACIDENTAL

PROGRAMADA

NECROSE: definio
Necrosis (do grego Nekros = morte;
+ Osis = estado alterado de sade)
Chamado, tambm, de Oncose (do
grego nkos = intumescimento)

Necrose: Caractersticas
Inchao Celular
Comprometimento Da Produo De Energia (ATP)
Reduo do Volume Nuclear Ncleo Picntico
Perda De Compartimentalizao Citoplasmtica

Perda Da Estabilidade Da Membrana Plasmtica

Rompimento
Extravazamento Do Contedo Intracelular

Syntichaki P. et al. Nature Ver. Neurosc (2003)

NECROSE em cncer
Zona interna do tumor HIPXIA necrose
Necrose fatores de inflamao neovascularizao

NECROSE PROGRAMADA

Necroptose
via de sinalizao
controladora da
necrose

RIP1
Necrostatina

Sobrevivncia
e proliferao

Necrose: metodologias de avaliao

Iodeto de Propdeo (PI)

Tamajusuku AS. Et al (2010);

http://beiresources.org/BEIHighlights/tabid/531/Default.aspx

Necrose: metodologias de avaliao

Iodeto de Propdeo (PI)
Citometria de fluxo

Tamajusuku AS. Et al (2010);

Necrose: metodologias de avaliao

Ensaio de ativao de proteases (calpana e catepsinas)
Medio dos nveis de ATP
Fosforilao de RIP1
Ubiquitinao de RIP1
Gerao de ROS

Clivagem especfica de PARP-1

PROLIFERAO
CELULAR

MORTE CELULAR
PROGRAMADA

Homeostase do
organismo
Regulao do nmero de clulas do organismo
Fiscalizao da integridade celular
Manuteno da capacidade proliferativa controlada

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

Clssicas:
NECROSE

ACIDENTAL

MORTE AUTOFGICA

APOPTOSE

PROGRAMADA

Autofagia: tipo de morte celular???

Processo fisiolgico de degradao e reciclagem
de molculas e organelas sobrevivncia

Autofagia: tipo de morte celular???

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

Clssicas:
NECROSE

ACIDENTAL

MORTE AUTOFGICA

APOPTOSE

PROGRAMADA

Apoptose: descoberta
John Foxton Ross Kerr (1965)
definiu a morte celular programada,
diferenciando-a da morte traumtica

nomeou este tipo de morte

de APOPTOSE

do grego, que significa

queda das folhas

Kerr, JF; J of pathology and bacteriology (1965)

Apoptose: definio
um processo de morte celular
programada, responsvel pela
remoo de clulas e tecidos
alterados ou dispensveis, exercendo uma
importante papel na manuteno da estrutura
dos rgos e tecidos, impedindo a proliferao
de clulas injuriadas e/ou desnecessrias que
podem comprometer o correto funcionamento
tecidual e a homeostase do organismo.

Apoptose: fisiolgica
Eliminao das membranas interdigitais

Zuzarte-Luis, (2002)

Apoptose: fisiolgica
Seleo de linfcitos hipereativos ou no reativos

http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/apoptose/apoptose-4.php

Apoptose: fisiolgica
Desenvolvimento e morfognese de anfbios

APOPTOSE: estmulos de induo

Radiaes

Drogas
Choque trmico
Infeces virais
Metais pesados

Agentes Oxidantes
Inibidores metablicos
Jejum
Hipxia
http://www.sciencephoto.com/media/151065/view

APOPTOSE: Caractersticas
Arredondamento da clula retrao de pseudpodes
Reduo do volume celular Piknosis
Condensao da cromatina
Fragmentao nuclear Karyorrhexis
Poucas ou quase nenhuma alterao
estrutural em organelas citoplasmticas
Blebbing na membrana citoplasmtica manuteno da
integridade sem extravazamento do contedo citoplasmtico

Engolfamento por fagcitos in vivo

Em mamferos, cerca de 100.000 clulas so

produzidas a cada segundo atravs de mitose e
um nmero similar morre por apoptose
(Vaux and Korsmeyer, 1999, Cell)

Apoptose: sinalizao

http://www.cellsignal.com/pathways/apoptosis.jsp

Receptores de morte (TNF)

Bid truncada (tBid)

Bcl-2
Bcl-xL
Mcl-1

Bax
Bak
Caspase 8
MITOCNDRIA
PRISON

Caspase 3
Cit.C, Smac e AIF

APOPTOSE
P53

PUMA, Noxa, Bim Bad

Apoptose: Vias de induo

VIA EXTRNSECA DE INDUO DE

APOPTOSE
VIA INTRNSECA DE INDUO DE
APOPTOSE

VIA EXTRNSECA DE INDUO DE APOPTOSE

http://www.cellsignal.com/pathways/apoptosis-signaling.jsp

Apoptose: Receptores de morte da famlia TNF

http://www.abdserotec.com

Apoptose: transduo do sinal

Apoptose: conexo entre vias

Bid pr-apopttico
da famlia Bcl-2
Substrato de caspases
iniciadoras

Forma truncada = ativada

Desestabilizao da
membrana mitocondrial
Ativao da via intrnseca

Apoptose: integrantes da via extrnseca

Apoptose: Vias de induo

VIA EXTRNSECA DE INDUO DE

APOPTOSE
VIA INTRNSECA DE INDUO DE
APOPTOSE

VIA INTRNSECA DE INDUO DE APOPTOSE

Apoptose e seus reguladores

Reguladores positivos
Protenas pr-apoptticas Morte
Genes supressores tumorais

Cncer genes inativados

Reguladores Negativos
Protenas anti-apoptticas Sobrevivncia
Proto-oncogenes
Cncer genes superexpressos

Apoptose: famlia bcl-2

Bcl-2 B-cell Lymphoma 2
diversos membros protenas pr-apoptticas

protenas anti-apoptticas

Domnios de homologia com Bcl-2 domnio BH

Domnio de interao entre os integrantes da famlia Bcl-2

Apoptose: famlia bcl-2

Strasser A. Nature Reviews Immunol (2005)

Apoptose: famlia Bcl-2 e a Mitocndria

Vaskivuo T. Regulation of apoptosis in the female reproductive system (2002)

Apoptose: famlia Bcl-2 e a Mitocndria

Ehrlich E. QUIAGEN reviews (2011)

Apoptose: anti-apopttico X pr-apopttico

Clarke &Tyler Nature reviews (2009)

Apoptose: Permeabilizao da Membrana

externa da mitocndria

Garrido C et al. Cell Death and Diff. (2006)

Apoptose: Apoptossomo

formao
dependente
de energia
(ATP)

Apoptose: Apoptossomo

http://stke.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/sigtrans;2001/93/re1/F1

Apoptose: Apoptossomo

Lindholm D. JCB (2004)

Apoptose: familia das IAPs

IAPs Inhibitors of Apoptosis
Domnio BIR (Baculoviral IAP repeat) 1 a 3 domnios
Inibem a ativao de pro-caspases
inibem a atividade de caspases ativadas:
Promover a degradao de caspases
Sequestro de caspases ativadas
Wei Y. ABBS (2008)

Apoptose: familia das IAPs

Wei Y. ABBS (2008)

Apoptose: familia das IAPs

http://www.cellsignal.com; http://www.abdserotec.com

Apoptose: caspases
CASPASE Cisteine ASPartic-acid proteASE

protease com um resduo de cistena

importante para a clivagem de protenas
clivagem aps resduos de cido asprtico
importantes em diversos mecanismos celulares alm da
apoptose

Apoptose: caspases
Sintetizadas na forma de pr-enzimas inativadas

PRCASPASES
Pr-domnio

Domnio principal

Ativao a partir da clivagem

2 grupos de caspases:

Caspases Iniciadoras (Casp 8,10) autoclivagem

Caspases Efetoras (Casp 3, 6, 7) clivadas pelas iniciadoras

Apoptose: caspases

Lavrik IN. (ActaNaturae)

Apoptose: caspases

Vaskivuo T. Regulation of apoptosis in the female reproductive system (2002)

Apoptose: integrantes da via intrnseca

Apoptose: p53 como supressor tumoral

http://www.weizmann.ac.il

Apoptose: apoptose e cncer

SILENCIAMENTO DE XIAP
combinado com
SUPEREXPRESSO DE p53

Silva AO et al. Unpublished data

Apoptose: apoptose e cncer

Apoptose: apoptose e cncer

Apoptose: metodologia de avaliao

Ensaio TUNEL
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase
dUTP nick end labeling
Deteco de DNA fragmentado
Resultado da induo de apoptose
Outros processos induo de fragmentao de DNA
ENSAIOS COMPLEMENTARES

Apoptose: metodologia de avaliao

Ensaio TUNEL

Apoptose: metodologia de avaliao

Ensaio de Cometa

Apoptose: metodologia de avaliao

Imunofluorescncia
Atividade de caspase
Substrato de caspase
Degradao do substrato
gera colorao vermelha
Anlise por microscopia de
fluorescncia

Apoptose: metodologia de avaliao

AnexinaV/IP
Marcao de fosfatidilserina
Externalizao de
fosfatidilserina apoptose
Anlise por citometria de fluxo ou microscopia de
fluorescncia
Um dos ensaios mais usados para indicar apoptose

Apoptose: metodologia de avaliao

AnexinaV/IP

Apoptose: metodologia de avaliao

Western blot

Apoptose: metodologia de avaliao

apoSTAIN
Cromatina condensada
Anticorpo anti-ssDNA
Desnaturao trmica

Na presena de formamida
Desnaturao apenas em clulas apoptticas

Apoptose: metodologia de avaliao

Microscopia eletrnica

Apoptose: metodologia de avaliao

Microscopia ptica

Mortes Atpicas

Mortes Atpicas
Catstrofe Mittica

Mortes Atpicas
Catstrofe Mittica

CLASSIFICAO DE MORTE CELULAR

Clssicas:
NECROSE
MORTE AUTOFGICA

Atpicas:

Anoikis

Necroptose

Cat. mittica

Excitotoxicidade

Degenerao Walleriana

APOPTOSE

Paraptose
Pironecrose

Cornificao

Entose

Piroptose

Necrose X Apoptose

Carvalho & Recco-Pimentel (2007)

Necrose X Apoptose

Carvalho & Recco-Pimentel (2007)

Necrose X Apoptose

Carvalho & Recco-Pimentel (2007)

Agradecimentos

Realizao

Obrigado!!!!