CURSO BIOTECNOLOGIA AGRICOLA

Ing. Benito Saue Carrasco

OBJETIVO GENERAL DE LA MATERIA
Objetivo del curso:
El alumno adquirir los conocimientos, proyectara sus alcances y conocer las limitaciones en
la aplicacin de tcnicas biotecnolgicas, en la propagacin vegetal, diagnostico y
mejoramiento de la produccin agrcola.
1.1. GENERALIDADES
En trminos generales biotecnologa se puede definir como el uso de organismos vivos
o de compuestos obtenidos de organismos vivos para obtener productos de valor para
los seres humanos. ejemplo en actividades tales como la preparacin del pan y de
bebidas alcohlicas o el mejoramiento de cultivos y de animales domsticos. Procesos
como la produccin de cerveza, vino, queso y yogurt implican el uso de bacterias o
levaduras con el fin de convertir un producto natural como la leche, en un producto de
fermentacin ms apetecible como el yogurt.
Es la aplicacin comercial de organismos vivos o sus productos, la cual involucra la
manipulacin deliberada de sus molculas de DNA.

Por tanto, podemos decir que la biotecnologa abarca desde la biotecnologa tradicional,
muy conocidas y establecidas, y por tanto utilizadas, como por ejemplo la fermentacin
de alimentos, hasta la biotecnologa moderna, basada en la utilizacin de las nuevas
tcnicas del DNA recombinante (ingeniera gentica), los anticuerpos monoclonales y los
nuevos mtodos de cultivo de clulas y tejidos.
1.1.1 RESEA HISTORICA DE LA BIOTECNOLOGIA
Historia de la biotecnologa:
La biotecnologa es la tecnologa basada en la biologa.
Podemos decir que la biotecnologa abarca desde la biotecnologa tradicional (muy conocida y
establecida, y por tanto utilizada) como por ejemplo la fermentacin de alimentos, hasta la
biotecnologa moderna, que est basada en la utilizacin de las nuevas tcnicas del DNA
recombinante (ingeniera gentica), los anticuerpos monoclonales y los nuevos mtodos de
cultivo de clulas y tejidos. Es decir, tcnicas derivadas de la investigacin en biologa
molecular y celular, que pueden usarse en cualquier industria que utilice microorganismos o
clulas vegetales o animales.

Escala temporal:
Hace 10-12 millones de aos: La biotecnologa se remonta a la agricultura del neoltico,
cuando el cultivo de plantas se convirti en la principal forma de obtener alimentos. A medida
que la cantidad de alimentos acumulados se fue incrementando, se requirieron otras tcnicas
biotecnolgicas para mantenerlos. As surgieron la rotacin de cultivos, el control de plagas, la
domesticacin de animales.
Hace 6000 de aos: Los sumerios y los babilonios fueron los primeros en producir pan y
cerveza mediante levaduras.
Hace 4000 aos: Los chinos desarrollaron hace procesos de conservacin de alimentos como
la fabricacin de yogur, queso, vinagre y vino mediante fermentacin lctica utilizando bacterias
Hace 2300 aos: Los egipcios producan pan con levadura.
En 1590: Zacaras Jenssen inventa el microscopio.
En 1665: Robert Hook acua el trmino clula en su libro Micrographia.
En 1676: Se confirma la reproduccin sexual de las plantas.
En 1838: Se descubre que todos los organismos vivos estn compuestos por clulas.
En 1856: Estudios de Mendel en guisantes sobre los fundamentos de la herencia de los
caracteres adquiridos.
En 1859: Darwin hace pblica su teora sobre la evolucin de las especies.
En 1871: Se asla el ADN en el ncleo de una clula.
En el siglo XIX: Pasteur establece la ciencia de la microbiologa.
En 1909: Las unidades fundamentales de la herencia biolgica reciben el nombre de genes.
En 1919: El ingeniero hngaro Karl Erky utiliza por primera vez el trmino biotecnologa.
En 1943: El ADN es identificado como la molcula de la herencia.
En 1953: Watson y Crick describen la estructura de doble hlice del DNA.
En 1961: Desciframiento de las primeras letras del cdigo gentico.
En 1965: Robert W.Holley ley por primera vez la informacin total de un gen de levadura.
En 1966: Se descifra el cdigo gentico completo del ADN.
En 1970: se reconstruy in vitro un gen completo.
En 1973: se desarrolla la tecnologa de recombinacin del DNA.
En 1976: Robert Swanson y Herbert Boyer crean Genentech la primera compaa de
biotecnologa.
En 1982: se sintetiza la primera hormona (insulina) mediante biotecnologa.
En 1983: se aprueban los alimentos transgnicos.
En 1983: Se inventa la tcnica PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), que permite copiar
genes especficos con gran rapidez. Es una tcnica muy poderosa para producir millones de
copias de una regin especfica de ADN, que permite analizarla tan rpido como se puede
purificar una sustancia qumica. PCR ha sido el instrumento esencial en el desarrollo de
tcnicas de diagnstico, medicina forense y la deteccin de genes asociados con errores
innatos del metabolismo.
En 1996: Por primera vez se completa la secuencia del genoma de un organismo eucaritico, la
levadura de cerveza.
En 2003: se termina de secuenciar el genoma humano.
1.1.2. BIOTECNOLOGIA DE PRIMERA, SEGUNDA Y TERCERA GENERACION
Primera generacin:
Biotecnologa de primera generacin, tradicional, antigua, emprica o pre Pasteur que cubre
procesos como la elaboracin de bebidas alcohlicas, vinagre, productos lcteos, alimentos
fermentados tradicionales, etc. En general procesos desarrollados en pocas tan remotas que
ni siquiera se tiene un registro histrico claro de su surgimiento y evolucin temprana. En esa
poca, la biotecnologa se refiere a las prcticas empricas de seleccin de animales, plantas y
sus cruzas, y a la fermentacin como un proceso para preservar y enriquecer el contenido
proteico de los alimentos. Este periodo se extiende hasta la segunda mitad del siglo XIX.
Segunda generacin:
Biotecnologa de Segunda generacin industrial es aquella que se desarrolla a partir de la
segunda mitad del siglo XIX, con los conocimientos incipientes de la microbiologa y la
bioqumica, y que culmina con la consolidacin de la ingeniera bioqumica. Para algunos

autores este periodo se divide en dos etapas: correspondiente al desarrollo inicial de la

microbiologa y la bioqumica. (Etapa denominada era de Pasteur o segunda generacin) y la
segunda corresponde al surgimiento de la ingeniera bioqumica (era de los antibiticos o
tercera generacin) Una segunda etapa del desarrollo de la biotecnologa se inicia con los
trabajos de Louis Pasteur (1822-1895) en la identificacin de los microorganismos causantes
de la fermentacin en la segunda mitad del siglo XIX, lo que contribuyo a impulsar la
incorporacin de la tcnica de fermentacin en algunas reas industriales.
Otro investigador de esta etapa Robert koch (1843-1910) que tambin hizo importantes
aportaciones a la bacteriologa. La tercera poca en la historia de la biotecnologa se
caracteriza por desarrollos en cierto sentido puestos, ya que por un lado la expansin
vertiginosa de la industria petroqumica tiende a desplazar los procesos biotecnolgicos de la
fermentacin, y por otro lado el descubrimiento de la penicilina por Fleming en el ao 1928
sentara las bases para la produccin en gran escala de antibiticos a partir de la dcada de los
aos cuarenta. Ingenio la obtencin de productos de utilidad incuestionable, que continan
siendo indispensables para la vida de la humanidad, ejemplo de estos productos son: los
antibiticos, las vacunas naturales, vitaminas, protenas unicelulares, enzimas, polisacridos,
alcohol industrial, entre otros. Destaca el descubrimiento de la estructura helicoidal del ADN por
Cricky Watson en 1953, seguido por los procesos que permiten la inmovilizacin de las
enzimas, los primeros experimentos de ingeniera gentica realizados por Cohen y Boyer en
1973 y la aplicacin en 1975 de la tcnica del hibridoma para la produccin de anticuerpos
monoclonales, gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.
Tercera generacin (Nueva biotecnologa)
Es la que se sirve de las tcnicas de ADN recombinante para realizar la mejora de los seres
vivos, con miras a su utilizacin. El impacto del ADN recombinante ha sido profundo. Se habla
hoy, por tanto, de que nos encontramos en la era de la biotecnologa. Se combinan las Ciencias
de la Informacin con la Biologa y surge la Bioinformtica desarrollndose una nueva
plataforma de trabajo en la bsqueda de nuevos productos, y donde la satisfaccin del hombre
sigue siendo el principal objetivo.
Como resultado de este desarrollo se acelera el descifrado de genoma completos de
organismos, lo que unidos a la aplicacin de la geonmica y la protemica genera una enorme
cantidad de datos que proporcionan la informacin de las bases moleculares de los fenmenos
y el camino para el diseo racional de molculas.
La terapia gnica, los medicamentos dirigidos, la obtencin de rganos y organismos productos
de la clonacin y otros productos altamente novedosos son representativos de esta poca.

1.1.3. IMPORTANCIA ECONMICA, ECOLGICA Y ONOMICAIMPORTANCIA ECONMICA:

Las biotecnologas han tenido un considerable impacto econmico en el sector de la
alimentacin, pues desde 1990 se han hecho operativos sistemas de diagnstico y
bioconversin de almidn; se han comercializado edulcorantes y saborizantes, se han diseado
procesos de produccin de jugos, aminocidos, pigmentos y vitaminas; productos de
fermentacin, enzimas para elaboracin de quesos, productos lcteos y levaduras hbridas.
Para el perodo 1995-2000 se prev comercializar bacterias y enzimas modificadas
genticamente, como elementos flavorizantes que mejoran la calidad de los alimentos, as
como biocatalizadores y biosensores para la industria de produccin y monitorizacin.
BIOTECNOLOGA EN EL SECTOR SALUD
Desarrollo de vacunas. un centro virtual para el desarrollo y evaluacin de vacunas que
coordine el esfuerzo de los grupos que realizan actualmente investigacin en este campo.
Produccin de medicamentos genricos (frmacos y protenas teraputicas) que permitan
cubrir las principales causas de demanda mdica y social, y disminuir nuestra grave
dependencia del exterior
Caracterizacin de los alelos asociados a enfermedades genticas en la poblacin
nacional. Esto, debiera apoyarse en el contexto de centros de investigacin y servicio, tales
como el recin creado Instituto de Medicina Genmica de la Secretara de Salud.
IMPORTANCIA ECOLGICA:
Es de gran importancia ya que la biotecnologa ha influido en los sistemas de produccin de
metano o etanol, por fermentacin anaerobia de biomasa, y en el crecimiento selectivo y
propagacin de rboles y plantas ornamentales. Las tcnicas ms utilizadas son las de
ingeniera de protenas y procesos e ingeniera de produccin de anticuerpos monoclonales -un
rea muy limitada de la biotecnologa-, que han revolucionado en un corto espacio de tiempo
campos como el diagnstico de enfermedades infecciosas y genticas, la monitorizacin de
procesos industriales y la produccin de variedades de microorganismos capaces de elaborar
sustancias farmacolgicas o alimenticias y de metabolizar aceites para eliminar
contaminaciones.
BIOTECNOLOGA EN EL SECTOR MEDIO AMBIENTE Y BIODIVERSIDAD
En el rea de agua. Profundizar en el conocimiento de los procesos biolgicos de tratamiento
de aguas residuales, para optimizar su diseo y operacin; desarrollar biosensores optimizados
para mejorar el control de procesos biotecnolgicos y seguimiento de la calidad de agua en
drenajes y cuerpos de agua; desarrollar procesos especializados, con base en
microorganismos modificados genticamente, para el tratamiento, en las fuentes de
contaminantes xenobiticos problemticos, antes de mezclarlos con otras corrientes;
desarrollar mtodos modernos para detectar microorganismos patgenos en aguas tratadas;
uso de la biodiversidad para aislar y aplicar microorganismos capaces de degradar
contaminantes especficos, acelerando las cinticas de los procesos y trabajando en
condiciones extremas; desarrollar y adaptar tecnologa biolgica que asegure alcanzar los
requerimientos de tratamiento que marca la normatividad mexicana.
En el rea de biodiversidad. Descubrimiento y caracterizacin de nuevas especies,
especialmente de microorganismos, hongos y especies incospicuas, que constituyen la
frontera actual del conocimiento de las especies en el planeta; desarrollar y optimizar mtodos
para el marcaje y el monitoreo de ejemplares, especialmente de acuerdo a los requerimientos
del comercio internacional y a los emergentes mercados verdes, que requieren de
certificaciones de origen; conservacin de la biodiversidad, especialmente en lo que se refiere a
diagnsticos veterinarios y forenses aplicados a fauna silvestre; anlisis de las ventajas y los

riesgos para el medio ambiente de los organismos genticamente modificados (OGM);

utilizacin respetuosa y sustentable de la biodiversidad.
En el rea de suelos. Diagnstico y seguimiento del tratamiento de suelos contaminados;
seleccin y estandarizacin de mtodos analticos, para el monitoreo de suelos contaminados;
identificacin y modificacin de las especies participantes en los consorcios responsables de la
biorremediacin de suelos; desarrollo de procesos de modificacin biocataltica (oxidativa
principalmente), para modificar/degradar contaminantes, en particular compuestos aromticos y
azufrados, mutagnicos, derivados del petrleo (combustibles) y de pesticidas; anlisis de
compuestos recalcitrantes en suelos contaminados con hidrocarburos y en suelos agrcolas
contaminados con pesticidas; establecimiento de normas para suelos contaminados; estudios
toxicolgicos de sustancias contaminantes y subproductos de degradacin; desarrollo de
procesos biolgicos para eliminar iones metlicos pesados.
En el rea de aire. Desarrollar la ingeniera necesaria para construir sistemas adecuados a las
necesidades de tratamiento; desarrollo de inculos microbianos avanzados y adaptados para
aplicaciones especficas no convencionales. Avanzar en la implementacin de biosensores
para la medicin in situ de la actividad de microorganismos en biopelculas.
IMPORTANCIA AGRONOMICA:
En el sector agrcola, los cultivos son de gran importancia ya que existen variedades
transgnicas de tomates, patatas, algodn, tabaco y soja, experimentadas al nivel de campo en
pequeos reductos que presentan caractersticas de resistencia a herbicidas, virus, insectos y
cualidades especficas. Algunos estn comercializados ya en 1995.
BIOTECNOLOGA EN EL SECTOR AGRCOLA
En los campos de la biologa molecular, fisiologa vegetal y bioqumica, habra que apoyar los
esfuerzos en las reas de desarrollo y reproduccin de plantas; genes de resistencia a
enfermedades; genes que controlan la tolerancia a estrs abitico; ingeniera metablica;
bioinformtica; genmica funcional; desarrollo de sistemas de transformacin de plantas de
inters social, econmico o industrial en Mxico; uso de plantas como biorreactores e
implementacin y uso de marcadores moleculares en programas tradicionales de
mejoramiento.
Apoyar la consolidacin del recin creado Centro Nacional de Genmica Vegetal.
En el campo de la biotecnologa agroecolgica, las reas estratgicas a apoyar seran:
sistematizacin de la diversidad agrcola por medio de marcadores moleculares; conservacin y
aprovechamiento de la diversidad de recursos genticos agropecuarios y forestales a travs de
la biotecnologa moderna; bioseguridad; monitoreo de productos novedosos y anlisis de
impacto en el agroecosistema ; ecologa y evolucin molecular.
1.2 TERMINOLOGA GENERAL DE LA BIOTECNOLOGA
Acido abscsico: Hormona vegetal que cumple importantes funciones en el crecimiento y
desarrollo de las plantas, cuyos efectos son especialmente inhibidores, y distribuido
preferentemente en hojas, yemas, tubrculos, semillas y frutos. Es una sustancia qumica de la
familia de los terpenoides y su frmula abreviada es C 16H 20O 4. Tambin se conoce con el
nombre de hormona del estrs y antiguamente como abscisina y dormina.
Anticodn: Secuencia de tres ncletidos en el ARN transferente que se emparejan
de forma complementaria con un codn especifico del ARN mensajero durante
la sntesis proteica para determinar un aminocido concreto de la cadena polipeptdica.
Autoclave: Aparato destinado a la esterilizacin por calor hmedo. Consta de un recipiente
hermtico, provisto de un manmetro y una vlvula de seguridad, formado por dos
compartimientos separados por una reja: el inferior se llena de agua y en el superior se coloca
el material a esterilizar.

Auxina: Las auxinas son un grupo de sustancias que funcionan como reguladoras muy activas
del crecimiento vegetal, son consideradas hormonas vegetales (fitohormonas) y lo mas cumn
es que provoquen el alargamiento de las clulas. Se sintetizan en las zonas en crecimiento
activo y se desplazan desde all hacia otras zonas de la planta, principalmente hacia la base,
de manera que de ellas hay una variacin en la concentracin de mayor a menor desde el
pice de las ramas, o las frutas en desarrollo a las races.
Biotecnologa: La biotecnologa se refiere a toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas
biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productos o
procesos para usos especficos
Citocinina: Su nombre proviene del trmino citokinesis que se refiere al proceso de divisin
celular, el cual podra ser considerado como el segundo proceso madre de todos los procesos
fisiolgicos en los vegetales, ya que a este proceso le antecede en importancia la
diferenciacin celular, la cual se encarga de dar origen a la formacin de cada uno de los
rganos de cualquier vegetal.
Cdigo gentico: indica que aminocido corresponde a cada triplete o codn del ARN
mensajero. Est organizado en tripletes o codones: cada aminocido est determinado por tres
nucletidos. Teniendo en cuenta que existen cuatro ribonucletidos diferentes (U, C, A y G).
Codn: Un codn es un triplete de nucletidos. Es la unidad bsica de informacin en el
proceso de traduccin. Cada codn codifica un aminocido y esta correspondencia es la base
del cdigo gentico que permite traducir la secuencia de ARN a la secuencia de aminocidos
que constituye la protena.
Dogma central de la biologa molecular: es un trmino que ilustra los mecanismos de
transmisin y expresin de la herencia gentica tras el descubrimiento de la codificacin de
sta en la doble hlice del ADN. Propone que existe una unidireccionalidad en la expresin de
la informacin contenida en los genes de una clula, es decir, que el ADN es transcrito a ARN
mensajero y que ste es traducido a protena, elemento que finalmente realiza la accin celular
Enzimas de restriccin: tambin conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los
enlaces fosfodiester del material gentico a partir de una secuencia que reconocen
Etileno: es una hormona de plantas que difiere de las dems hormonas en que es un gas.
promueve la maduracin y senescencia de los frutos.
El etileno tambin controla otras muchas funciones de las plantas, tales como: Abscisin de
hojas, frutos, ptalos de flores, Cada de hojas, Germinacin de los bulbos de
patata Germinacin de semillas. Formacin de flores en algunas especies.
Explante: Un explante es una clula, tejido u rgano de una planta que se usa para iniciar
cultivos in vitro. Los explantes se retira de las partes de las plantas en crecimiento activo que
no han pasado por ningn tipo de " estrs " como secos, temperaturas demasiado altas o
bajas, falta de minerales y al ataque de plagas o enfermedades
Giberelina: es una fitohormona. Se producen en la zona apical, frutos y semillas. Sus
funciones son: Interrumpir el periodo de latencia de las semillas, hacindolas germinar. Inducir
la brotacin de yemas. Promover el desarrollo de los frutos (floracin).crecimiento longitudinal
del tallo
Kilobase (Kb): 1000 nucletidos o nucletidos pares - una unidad de simple o de doble
hebra de cido nucleico. medicin de la longitud
Micropropagacin: es tcnica de cultivo de tejidos vegetales en la que se toma un explante de
la planta, se lo desinfecta, se lo asla en un recipiente estril y se le propician artificialmente
condiciones que permitan que las clulas expresen su totipotencialidad.

Medio MS: Base destinada a la Preparacin de los Medios utilizados para el Cultivo de
vitroplantas.
Plsmido: Los plsmidos son molculas circulares de ADN que se replican de manera
independiente al cromosoma de la clula hospedera. De manera natural se encuentran en las
bacterias en tamaos que van desde 5,000 hasta 400,000 pb.
Tcnica de recombinacin del ADN: Conjunto de tcnicas de manipulacin gentica que
emplea la recombinacin in vitro asociada a la insercin, rplica y expresin del AADN
recombinado dentro de clulas vivas.
Traduccin gentica: es el segundo proceso de la sntesis proteica (parte del proceso general
de la expresin gnica. Es el proceso que convierte una secuencia de ARN en una cadena de
aminocidos para formar una protena. Es necesario que la traduccin venga precedida de un
proceso de transcripcin. El proceso de traduccin tiene cuatro fases: activacin, iniciacin,
elongacin y terminacin (entre todos describen el crecimiento de la cadena de aminocidos, o
polipptido, que es el producto de la traduccin).
Transcripcin gentica: La transcripcin consiste en la copia de 1 cadena de DNA para dar
una cadena de RNA, gracias a la complementariedad de bases. La cadena que se copia se
conoce como cadena molde o cadena transcrita
2.1 MEDIOS DE CULTIVO
Cultivar a un microorganismo es proporcionarle las condiciones adecuadas para su crecimiento
y multiplicacin.
Medio de cultivo: Es una solucin lquida o gelatinosa que contiene los nutrientes necesarios
para el crecimiento de los microorganismos. Los nutrientes que requieren los microorganismos
son: agua, carbohidratos, nitrgeno, fsforo, azufre, calcio, cobre, etc. Tambin es necesario
brindarle las condiciones ambientales adecuadas de luz, temperatura, oxigenacin, humedad,
etc.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.

2.1.1.1 REA DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIN

rea de preparacin:
Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer tambin un
espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plstico, y los reactivos qumicos. Este
ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparacin de los medios y para colocar
balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitacin, y otros elementos; tambin debe
incluir vitrinas, estanteras y espacio para el equipo de refrigeracin, y para la incubadora o la
cmara de crecimiento (o para ambas).
rea de esterilizacin:
El rea de esterilizacin, puede estar constituida por dos reas conectadas entre s, o por un
solo ambiente, y puede estar localizada dentro del rea general de preparacin.
El rea de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fra y
una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada ; para
el efecto se debe utilizar un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de
agua colocado entre el destilador y el lavadero. Esta rea debe disponer de un espacio para
almacenar agua destildada en botellas de plstico; tambin debe proveer basureros adecuados
para el material vegetal, inorgnico y de vidrio que se deseche.
el rea de esterilizacin debe de tener espacio para el autoclave vertical u horizontal, el cual
puede ser pequeo (olla de presin) o grande (de carga frontal y de enfriamiento lento
y rpido), segn sea el volumen del material que se procese. Esta rea tambin puede incluir
espacio para estufas, secadoras, y un lavadero con agua caliente y fra.
Esterilizacin es la cmara de autoclave.

2.1.1.2. REA DE ALMACENAMIENTO

Almacenamiento del material estril:
Una vez que un material est estril puede mantener esta condicin si est protegido en la
forma apropiada. Es decir, la duracin de la esterilidad de un material no est relacionada
directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su exposicin al medio
ambiente. Los materiales estriles pierden su esterilidad:
Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante
su transporte o almacenamiento.
Al humedecerse el material de empaque.
Es importante no manipular los materiales estriles con las manos hmedas, ni colocarlos sobr
e superficies mojadas. Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de
precauciones, tales como:
Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales estriles.
Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos.
Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento.

La temperatura ideal debe estar por debajo de 26C y la humedad relativa entre 30 y 60%.
Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y hmedos, pueden producir co
ndensacin de humedad sobre el material de empaque.
Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.
Dejar que los materiales que salen del horno o la autoclave alcancen la temperatura ambiente
antes de ser almacenados; de esta forma se evita la condensacin dentro del empaque.
Almacenamiento de los medios de cultivo:
Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las
condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15
y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca
de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se
deben descartar cuando se hidraten o decoloren.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y
8C, a menos que el medio requiera alguna condicin diferente. Se deben mantener en
recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin. Cuando se usa tapn de algodn se
debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).
2.1.1.3 REA DE SIEMBRA ASPTICA:
Asepsia: es la ausencia de microorganismos, un estado libre de grmenes. Conjunto de
procedimientos que impiden la llegada de microorganismos a un medio, por ejemplo: tcnicas
de aislamiento, etc.
rea de transferencia o rea Asptica:
En esta rea del laboratorio se realiza el trabajo de escisin, inoculacin y transferencia de los
explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo el ms alto nivel de limpieza
ambiental, se recombina la instalacin de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado
de baja presin, o la construccin de cuartos de transferencia. Sin embargo, ciertas
operaciones de inoculacin como la escisin y el cultivo de pices y meristemos en tubo de
ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un lugar del
laboratorio libre de corrientes de aire y polvo.
Los gabinetes de flujo laminar deben ubicarse, en lo posible, en un lugar alejado de las puertas
y con un mnimo de corriente de aire, con el fin de prolongar la vida til de los filtros.
2.1.1.4 REA DE INCUBACIN
Los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o cmaras de crecimiento. El
rea de incubacin debe tener una temperatura de (20-28 C), iluminacin variable 1000 a
5000 lux y humedad relativa (70-80 %). En el cuarto de incubacin se instalan estanteras
metlicas o de madera para colocar los cultivos.
Esta estantera tiene medidas variables y puede tener de ancho 0,30 m y 1 m, de largo de
acuerdo con el tamao del cuarto y la altura de 1.80 a 2.20 m. esta rea debe incluir, adems,
un espacio para cultivos en agitacin y para cultivos estticos en oscuridad. Es necesario
propiciar una buena distribucin del aire en este cuarto para evitar zonas de recalentamiento
por efecto de las luces.

La regulacin de la temperatura se puede lograr por medio de aparatos de aire acondicionado

de pared o de un sistema central. en cualquier caso, es necesario tomar precauciones para
evitar el calentamiento excesivo, instalando alarmas y controles para cortar
la iluminacin cuando falle el aire acondicionado.

2.3.7.4. MANEJO DEL MATERIAL TRASPLANTADO

Manejo de las plantas despus del transplante inicial con la utilizacin de mtodos, como el de
Sistema de Inmersin Temporal, ahora es posible producir un nmero muy grande de plantas,
en perodos cortos de tiempo, por lo que existe la necesidad de generar metodologas de
manejo que permitan recuperar y mantener las plantas en buenas condiciones hasta que son
llevadas al campo.
Esta fase empieza a partir del momento en que las plantas, debidamente acondicionadas, son
colocadas en la casa de malla. A partir de all, los pasos sugeridos son los siguientes:
a. Al octavo da de tener las plantas en la casa de malla se retira el amarre de la bolsa plstica,
permitiendo a las plntulas que se vayan adaptando al micro ambiente de las instalaciones.
b. Riego: Si las condiciones son normales y no hay marchites fisiolgica, se hace el segundo
riego de mantenimiento a los 10 12 das despus del transplante. Este segundo riego (10
cm3 por planta) va acompaado con una mezcla de fertilizante rico en fsforo para continuar
estimulando el desarrollo de las races. Dependiendo de las condiciones micro-climticas que
se tienen en la casa de malla y del estado de turgencia de las plntulas, se puede programar
uno o dos riegos diariamente.
c. Riego automtico en casa de malla: Cuando el nmero de plantas sobrepasa las 1.500, se
justifica el riego por microaspersin, que debe estar controlado por un reloj y una vlvula
solenoide. Cuando se utiliza este sistema de riego se deben realizar inspecciones rigurosas
para detectar cualquier problema fitopatolgico.
d. Fertilizacin: Cada ocho das se realiza la fertilizacin con un abono rico en fsforo,
alternndolo con un fertilizante completo que contenga los elementos mayores y menores. Si

se presentan sntomas puntuales de la deficiencia de un elemento se puede realizar una

fertilizacin foliar con fertilizantes simples o completos.
e. Segundo transplante: Cuando las plntulas tengan entre 45 y 60 das del primer
transplante es necesario realizar un nuevo transplante a bolsas plsticas con una capacidad de
500 gramos de suelo, en el que se puede adicionar micorrizas, si se considera necesario,
segn los anlisis del suelo en el que las plantas van a ser sembradas definitivamente.
f. Transplante al sitio definitivo: Entre los 2 y 3 meses de permanecer en la casa de malla,
las plantas estn listas para ser llevadas al sitio definitivo. Durante este perodo es importante
estar atento a deficiencias nutricionales o problemas de plagas y enfermedades.
2.1.2. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
Algunos de los instrumentos ms utilizados en los laboratorios, son elaborados de vidrio
resistente a altas temperaturas, por su alto contenido de dixido de silicio, bajo lcali, xido
brico y vestigios de otros xidos, lo que condiciona su escaso coeficiente de dilatacin,
teniendo una gran aplicacin en la fabricacin de materiales de laboratorio, uno de los ms
conocidos es .el vidrio PYREX. As como los elaborados de distintos metales pesados como
platino,' mercurio, aluminio, cobre que les otorgan caractersticas como buenos conductores del
calor o porque al medio ambiente son muy manejables sin alterar su composicin.
Para el desarrollo de la investigacin y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se
requieren de materiales que permitan la preparacin de frmulas nutrimentales con el objetivo
de cultivar tejidos, rganos y clulas vegetales in vitro. Es muy importante que los materiales y
equipos de uso comn en el laboratorio se identifiquen por su nombre correcto y uso especifico
que tiene cada uno, pero ms importante es saber manejarlo correctamente en el momento
oportuno, teniendo en cuenta los cuidados y normas especiales para el uso de aquellos que as
lo requieran. Los instrumentos y tiles de laboratorio estn constituidos de materiales diversos.
2.1.2.2. EQUIPO DE LABORATORIO
Cmara de flujo laminar

Este equipo, tambin conocido como vitrina estril, es una base para trabajo con material
susceptible de ser contaminado por el aire ambiental o bien de contaminar a este ltimo.
Refrigeradores y congeladores
Su funcin consiste en mantener, en un ambiente controlado espacio refrigerado, diversos
fluidos y sustancias, para que los mismos se conserven en buenas condiciones mientras ms
baja sea la temperatura, menor actividad qumica y biolgica.
Agitador magntico

Es un equipo electrnico que consta de un motor que gira en un rango de rpm (numero de giros
que puede dar en un minuto sobre su eje), usualmente se encuentran agitadores con rangos de
entre 100 a 1200 rpm, aunque existen de mayor numero de revoluciones.
Autoclave

Es un recipiente en el que se consigue exponer el material al esterilizar a temperaturas

superiores a la ebullicin del agua, gracias a aumentar la presin.
Potencimetro

Es un instrumento que se basa en este mtodo para determinar el voltaje entre dos terminales.

Balanza analtica

Es un instrumento delicado que se debe manejar con cuidado. Se debe consultar al instructor
sobre los detalles para pesar con el modelo particular de balanza que se tenga.
2.1.3. GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

GENERALIDADES:
crecimiento de microorganismos en sustancias alimenticias artificiales es una de las
tcnicas ms importantes usadas en el laboratorio.
Permite reconocer las caractersticas culturales de las bacterias.
A partir de estas se puede obtener cultivos puros

Los medios de cultivo constituyen un elemento fundamental para el cultivo in vitro de clulas,
tejidos, protoplastos, anteras y para lograr el desarrollo de embriones y lograr la
micropropagacin, etc. Los medios de cultivo tienen una serie de componentes generales y
especficos cuya presencia y concentracin estar en dependencia del objetivo que se persiga
en su utilizacin. As, los medios de cultivo pueden ser lquidos o tener un soporte slido, tienen
sustancias minerales, vitaminas, aminocidos, azcares, fitohormonas, etc.
Un medio de cultivo se puede determinar, como solucin o formulacin qumicamente definida,
donde un explante encuentra las condiciones adecuadas para desarrollar su potencial
intrnseco. Las clulas vegetales requieren gran variedad de nutrimentos orgnicos e
inorgnicos, para desarrollarse, ambos nutrimentos se requieren en dos niveles: uno macro y
otro micro. El primer objetivo en la preparacin de un medio de cultivo es suministrar los
nutrimentos minerales en concentraciones adecuadas. Se debe incluir macro elementos (C, H,
O, P, K, N, S, Ca Y Mg) y los microelementos (B, Zn, Mn, Cu, Mo, Fe, Cl).
2.1.3.1. DEFINICION DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO DE CULTIVO
Conjunto de nutrientes lquidos o gelatinosos que contiene sustancias esenciales para el
crecimiento de las clulas o tejidos vegetales, en este medio se crean condiciones adecuadas
de desarrollo y reproduccin de manera artificial. Para su ptimo crecimiento es necesario dar
condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo en medios artificiales. Estas son:
temperatura, pH, humedad, presin de oxgeno, grado de acidez o alcalinidad del medio los
nutrientes esenciales para su desarrollo son los nutrimentos minerales en concentraciones
adecuadas. Se debe incluir macro elementos (C, H, O, P, K, N, S, Ca Y Mg) y los
microelementos (B, Zn, Mn, Cu, Mo, Fe, Cl).

2.1.3.2. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo se definen principalmente por sus cualidades qumicas, esto es, su
composicin; tambin deben definirse por sus cualidades fsicas, tales como estado, salinidad,
etc.
La mayora de los medios que se utilizan tienen el nombre dado por quien los formul; Otros
surgen de modificaciones sobre los medios genricos, que son los ms conocidos. Entre los
primeros podemos citar:
1. Knudson (1946)
2. MS (Murashige y Skoog, 1962)
3. White (1963)
4. B5 (Gamborg, 1970-1976)
5. WPM (Lloyd y McCown 1980)
6. KM8p (Kao y Michayluk 1982)
Knudson (1946)
El primer medio conocido es el adecuado para de orqudeas. Bastante pobre en sales
Macronutrientes
(NH4)2SO4
0.5 g/l
MgSO4
0.122 g/l
Ca(NO3)2
0.694 g/l
KH2PO4
0.250 g/l
Micronutrientes
KI
0.83 mg/l
H3BO3
0.056 mg/l
MnSO4.H2O
5.68 mg/l
MoO3
0.016 mg/l
CuSO4.5H2O
0.062 mg/l
FeSO4.7H2O
25.0 mg/l
MS (Murashige y Skoog, 1962), MS, MS
Es el medio ms conocido; se elabor tomando el cultivo in vitro de tabaco como modelo y
siguiendo un procedimiento cuantitativo se determinaron las concentraciones ms adecuadas
de todos los nutrientes. Es apto para la mayora de las especies, por lo que es de amplia
utilizacin, excepto para las ms sensibles a la salinidad ya que se caracteriza por tener una
elevada concentracin salina. En esos casos puede recurrirse a otros medios o simplemente
utilizarlo diluido (1/2 MS, 1/4 MS).
Macronutrientes
NH4NO3
KNO3
MgSO4.7H2O
CaCl2.aq
KH2PO4
Micronutrientes
KI
H3BO3
MnSO4.4H2O

1.65 g/l
1.9 g/l
0.37 g/l
0.33 g/l
0.17 g/l
0.83 mg/l
6.2 mg/l
22.3 mg/l

ZnSO4.7H20
Na2MoO4.2H2O
CuSO4.5H2O
CoCl2.6H2O
Na2.EDTA
FeSO4.7H2O

8.6 mg/l
0.25 mg/l
0.025 mg/l
0.025 mg/l
37.3 mg/l
27.8 mg/l

White (1963)
Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por lo tanto de uso
complementario al MS. Se elabor para cultivo de races de tomate.
Macronutrientes
Ca(NO3)24H2O
0.3 g/l
KNO3
0.08 g/l
MgSO4.7H2O
0.72 g/l
Na2SO4
0.2 g/l
NaH2PO4.H2O
0.019g/l
Micronutrientes
KCl
65 mg/l
KI
0.75 mg/l
H3BO3
1.3 mg/l
MnSO4.7H2O
7 mg/l
ZnSO4.7H20
3 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0.25 mg/l
CuSO4.5H2O
0.025 mg/l
CoCl2.6H2O
0.025 mg/l
Na2.EDTA
37.3 mg/l
FeSO4.7H2O
27.8 mg/l
B5 (Gamborg, 1970-1976)
Gamborg trabaj activamente en la elaboracin de medios, a los que dio diferentes nmeros.
EL B5 fue formulado para cultivo de callo de soja.
Macro
(NH4)2SO4
0.134 g/l
KNO3
2.528 g/l
MgSO4.7H2O
0.246 g/l
CaCl2.aq
0.15 g/l
KH2PO4
0.15 g/l
Micro
KI
0.75 mg/l
H3BO3
3.0 mg/l
MnSO4.H2O
10 mg/l
ZnSO4.7H20
2.0 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0.25 mg/l
CuSO4.5H2O
0.025 mg/l
CoCl2.6H2O
0.025 mg/l
Na2.EDTA
37.3 mg/l
FeSO4.7H2O
27.8 mg/l
WPM (Lloyd y McCown 1980)
Se elabor para el cultivo de tallos de plantas leosas y arbustivas, tipos de plantas para las
que est especialmente adaptado
KM8p (Kao y Michayluk 1982)

Kao y Michayluk abordaron la dificultad de lograr la viabilidad los protoplastos cultivados in

vitro, hasta entonces muy limitada, desde el punto de vista de la optimizacin del medio, y
formularon varios; el ms exitoso fue el KM8p. Su caracterstica principal y distintiva de los
medios hasta entonces formulados es la gran diversidad de nutrientes que contiene, muchos de
ellos no esenciales para el desarrollo de las plantas, pero que si han resultado limitantes en el
cultivo de sus protoplastos.
2.1.4. COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

2.1.4.1. COMPUESTOS INORGANICOS

SALES INORGNICAS
Macronutrientes
Los elementos minerales son muy importantes para la vida de las plantas.
Nitrgeno (N): forma parte de aminocidos, vitaminas, protenas y cidos nucleico.
Magnesio (Mg): es parte de la molcula de clorofila y de los ribosomas.
Calcio (Ca): Es constituyente de la pared celular. Interviene en respuesta de crecimiento.
Fosforo (P): Forma parte de las molculas que almacenan y transfieren la energa qumica de
los cidos nucleicos, de este depende la energa celular.
Potasio (K): Desempea un papel importante en la regulacin osmtica y en la actividad
enzimtica.
Azufre (S): Necesario para sintetizar algunos aminocidos.
Sodio (Na): Es necesario en el cultivo in vitro de halfilas y en plantas cuyos productos
fotosintticos son C4 y plantas con metabolismo acido. (Garca, 2000).
Micronutrientes
Estos micronutrientes son importantes en las clulas vegetales, ya que al adicionarles ciertas
cantidades excesivamente pequeas permite que las sales madres sean ms eficaz para el
medio de cultivo.
Hierro (Fe): forma el ncleo del citocromo y parte de la ferrodoxina.
Molibdato (Mo): fundamental para la actividad de la nitroreductasa
Manganeso (Mn): induce a la sntesis de clorofila, se requiere para la formacin del O2 en la
fotosntesis.
Boro (B): Necesario para el sostenimiento de la actividad meristemtica, involucrado en la
sntesis de bases nitrogenadas como el uracilo.
Cobre (Cu): permite la oxidacin respiratoria final, est ligado al proceso de lignificacin.
Zinc (Zn): requerido para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenlicos.
Cobalto (Co): componente de la vitamina B12
Cloro (Cl): fundamental en reacciones que llevan a la evolucin del O2 en la fotosntesis.
(Garca, 2000).

2.1.4.2. COMPUESTOS ORGANICOS

COMPUESTOS ORGANICOS
Hidratos de Carbono:
Monosacridos: glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa, xilosa
Disacridos: sacarosa, maltosa, celobiosa, trehalosa, lactosa
Trisacridos: rafinosa
Polisacridos: almidn, celulosa De entre ellos el habitualmente utilizado en los medios de
cultivo es la sacarosa.
Reguladores de crecimiento:
Auxinas
Son utilizadas principalmente para la diferenciacin de races y la induccin de callo. Las ms
utilizadas son:
IBA: (cido indol-3-butrico) = diferenciacin de races
ANA: (cido naftalenactico) = diferenciacin de races
IAA: (cido indolactico) = Prolongacin de explantes
2,4-D: (cido diclorofenoxiactico) = induccin de callos.
Citoquininas
Promueve la divisin celular y la induccin de yemas adventicias en callos y rganos.
Brotacin.
Las Citoquininas ms usadas son:
BAP: (bencilamino purina)
Kinetina
2-ip (isopentenil-adenina).
(Generalmente son diluidas con cido clorhdrico o hidrxido de sodio).
Giberelinas
Su funcin principal es alargar las regiones subapicales del explante. La giberelina con mayor
uso es: El GA3: pero se debe tener en cuenta que es muy sensible al calor (pierde el 90% de
su actividad despus del autoclavado)
Comparado con las Auxinas y Citoquininas, las giberelinas se utilizan raramente. La mayora de
los explantes sintetizan cantidades suficientes de este grupo de hormonas.
Acido abscsico
El cido abscsico (ABA) en la mayor parte de los casos produce un efecto negativo en los
cultivos in vitro, pero en determinados casos promueve la maduracin de embriones, y en
cultivos de clulas en suspensin facilita la sincronizacin de la divisin celular.
Entre ellos es frecuente la adicin de auxinas y citoquininas, en diferentes proporciones en
funcin principalmente del tipo de diferenciacin a inducir y del tipo de especie a cultivar. El uso
de otros reguladores es mucho ms ocasional.
Otros compuestos orgnicos:
Aminocidos
Poliaminas Su utilizacin es diversa: para aportar una fuente suplementaria de nitrgeno en
forma amina, producir procesos morfognicos, etc. Suplementos de composicin indefinida:
Extractos de levadura, malta, carne, vegetales (patata, maz, races y rizomas)

 Jugos de frutas u hortalizas (naranja, banano, pia, tomate, patata, leche de coco)
Casena hidrolizada Su uso es desaconsejable por no poder darse una composicin precisa
del extracto aadido, pueden resultar tiles slo en casos concretos

2.1.4.3. MATERIALES INERTES GELIFICANTES

Materiales inertes
Se usan como soporte: agar, agarosa, otros polisacridos, lana de vidrio, papel de filtro, arena.
El agar es un polisacrido natural no ramificado y de alto peso molecular (3.000 a 160.000),
extrado de algas rojas, Rhodofceas, principalmente del gnero Gelidium. Est formado por
galactosidos que forman la Agarosa, y de un polisacrido sulfatado, la Agaropectina. Adems,
contiene muy pequeas cantidades de cationes como impurezas (Na, K, Ca, Mg, etc.). Su
composicin vara ligeramente en funcin de la especie de que se extrae, su procedencia,
poca de cosecha, madurez del alga, etc. Los procesos de obtencin y purificacin para
producir los distintos tipos de agar afectan principalmente a su contenido en impurezas.
Gelificantes:
El gelificante suele ser un slido que al aadirse a un medio de cultivo se disuelve por
calentamiento fuerte (cercano a los 100 C) y hace que el medio adquiera la consistencia de gel
al enfriarse a temperaturas menores. Uno de los mejores agentes gelificantes de que se
dispone para realizar cultivos in vitro de tejidos vegetales es el agar, tambin conocido como
agar-agar. Los gelificantes deben cumplir con una serie de requisitos: no ser asimilado por el
explanto, lo que hara que al consumirse el medio retornase a su estadio lquido, no interferir en
la absorcin de los nutrientes del medio de cultivo, y permanecer estable durante el tiempo de
cultivo.
La principal caracterstica que hace del agar un gelificante es su total disolucin en agua al ser
calentado a 85-100 C, y su gelificacin alrededor de los 35 C. Es termoreversible, es decir, se
puede volver a disolver y a gelificar repetidas veces mediante variaciones en la temperatura, y
es autoclavable. Su gelificacin depende del pH del medio de cultivo, siendo ptima para pH
5.4 - 5.7. Los medios de cultivo para tejidos vegetales suelen ajustarse a pH = 5.7 antes de
aadir el agar, por lo que melifican bien; tras la gelificacin el agar absorbe una cantidad de
agua de hasta 200-300 veces su peso, y forma un gel muy translcido. La preparacin de los
medios de cultivo para vegetales incluye generalmente un aporte de agar del 0.8%.
Entre los compuestos alternativos al agar para utilizarse como gelificantes en el cultivo in
vitro de tejidos vegetales tenemos:
Alginatos. Excelentes para cultivo de clulas en suspensin y de protoplastos.
Agarosa. Es uno de los polmeros del agar, obtenindose a partir de l. Se utiliza ms en
electroforesis de protenas o cidos nucleicos que en cultivo in vitro.
Fitagel. Conocido tambin con el nombre gelrita, marca registrada de Merck; es de amplio uso.
Ficoll. Es un derivado de polisacridos que produce medios de cultivo de tipo coloidal.
Encuentra una aplicacin importante en el cultivo de anteras.
El fitagel es un polisacrido aninico obtenido por fermentacin bacteriana. El gel que forma se
caracteriza principalmente por:
Gran transparencia, que facilita el seguimiento del cultivo.
El medio nutritivo se gelifica con un aporte de fitagel de tan slo el 0.2%
Precisa de cationes divalentes para su gelificacin, principalmente Mg o el Ca.
Se disuelve y gelifica en respuestas a cambios de temperaturas, como el agar, si bien no es
termoreversible.
Los explantos cultivados en medios con fitalgel absorben los nutrientes con mucha facilidad, lo
que permite un crecimiento mas rpido, sin embargo la velocidad de absorcin puede ser
excesiva, no pudiendo incorporarse a sus estructuras y compuestos sino que quedaran en
solucin dentro del explante, causando el problema conocido tpicamente como hiperhidricidad,
frecuente en cultivos de tipo leoso.

Su coste es mucho menor

2.1.4.4. COMPLEJOS ORGANICOS

Compuestos orgnicos:
Aminocidos: Los aminocidos son usados como constituyentes de compuestos de
composicin qumica indefinida o bien por adicin directa. De esta manera, se encuentran en
casena hidrolizada, peptona, triptona, lactoalbmina hidrolizada, extracto de malta, agua de
coco, casamina, etc. Los aminocidos que se emplean directa y ms comnmente son Lglicina, L-glutamina, L-asparagina, L-arginina, L-prolina, cido glutmico. L-hidroxiprolina, Lalanina, L-lisina, L-leucina, L-serina y L-cisteina. Nitsch y Nitsch (1957) sealan que las formas
L de los aminocidos son ms adecuadas para el cultivo de tejidos que las formas -D ya que
estas son txicas.
Poliaminas Su utilizacin es diversa: para aportar una fuente suplementaria de nitrgeno en
forma amina, producir procesos morfognicos, etc. Suplementos de composicin indefinida:
Extractos de levadura, malta, carne, vegetales (patata, maz, races y rizomas)
Jugos de frutas u hortalizas (naranja, banano, pia, tomate, patata, leche de coco)
Casena hidrolizada Su uso es desaconsejable por no poder darse una composicin precisa
del extracto aadido, pueden resultar tiles slo en casos concretos.
Compuestos especficos:
Controladores del potencial osmtico: polietilen-glicol, manitol Se puede precisar su aporte a
los medios en condiciones concretas.
Adsorbentes: carbn activo
Antioxidantes: cido ctrico, cido ascrbico

2.1.5. PREPARACION Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK

Se denomina solucin madre o stock a composiciones concentradas de nutrientes las cuales
estn formuladas por sales minerales que se emplean en un medio particular. Debido al
elevado nmero de compuestos que incluye y a que algunos de ellos se emplean a muy baja
concentracin, resulta ms prctico preparar soluciones madre o "stocks" concentrados. Esto
hace ms rpida la futura preparacin de medios y minimiza los errores, ya que La composicin
de una solucin se debe medir en trminos de volumen y masa, por lo tanto es indispensable
conocer la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen o masa de disolvente, es decir su
concentracin.
La preparacin de medios de cultivo es sencilla pero incluye la manipulacin de mltiples
sustancias. Esta preparacin puede simplificarse mediante el uso de:
Packs listos para usar, disponibles para medios frecuentemente utilizados. Habitualmente
constan de medio base, sin reguladores.
Elaboracin de soluciones stock mas concentradas, agrupando los compuestos en varias
soluciones stock, por ejemplo:
Stock 1: Macros (x10)
Stock 2: Sales de Calcio (x 10)
Stock 3: Micronutrientes (x 100)
Stock 4: Solucin de hierro
Stock 5: Vitaminas (x 100)
Stock 6: Reguladores (cada uno individualmente)(x 200)

Estas soluciones stock se conservan en nevera (stock 1, 2, 3 y 4) o congelador (stock 5 y 6),

segn los compuestos que contengan, durante meses. Algunas soluciones deben conservarse
en oscuridad.
Algunos aspectos relevantes al preparar el medio o las soluciones stock:
La cantidad de un compuesto a aadir, en peso, es funcin de su grado de hidratacin. Lo
relevante es mantener la molaridad del nutriente; a igual peso del compuesto, cuanto mayor
grado de hidratacin menor molaridad del nutriente.
La concentracin de una solucin stock est limitada por la solubilidad de sus compuestos y por
las interrelaciones entre ellos. La disolucin de los compuestos no debe dar lugar a reacciones
entre ellos que causen algn tipo de precipitacin o que disminuyan su capacidad de
incorporacin al explanto.
Algunos compuestos, por ejemplo muchos reguladores de crecimiento, son poco hidrosolubles.
Para preparar sus soluciones stock se disuelven en una pequea cantidad de soluciones
cidas o bsicas (OHNa 1N, HCl 1N), solventes orgnicos (ej. DMSO), o etanol, teniendo
siempre presente el potencial efecto (toxicidad, efecto sobre el pH, etc.) de dichos solventes.
Los compuestos termolbiles deben ser incorporados mediante filtracin al medio ya
autoclavado y a temperaturas cercas a la temperatura ambiente pare evitar su degradacin.

Componentes de soluciones madres o stock que en conjunto con otros elementos (sacarosa,
phytagel y hormonas de crecimiento) conforman un medio de cultivo MS.

Ejemplo De los Clculos de una Solucin Stock.

Preparar 200 ml de solucin de Fosfatos, Boratos y Molibdatos a una
concentracin de 100x.

Fosfato Monopotsico. KH2PO4

La cantidad utilizada en g/L de este componente es 0.170, esta se multiplica

por la concentracin que es 100x da como resultado 17 g / L. Despus se
realizan clculos mediante una regla de tres para determinar cuantos gramos
utilizaran para un volumen de 200 mL, se lleva acabo el siguiente
procedimiento:
17 g

1000 mL

200 mL
(200 mL)(17 g)

3400 g/mL
=

1000

= 3.4 g
1000 mL

cido Brico. H3BO3

6.2 g

1000 mL

200 mL
(200 mL)(6.2 g)

1200 g/mL
=

1000 mL

= 1.24 g
1000 mL

Molibdato De Sodio Dihidratado. Na2MoO4.2H2O

0.025 g

1000 mL

200 mL

(200 mL)(0.025 g)

5 g/mL

=
1000 mL

= 0.005 g
1000 mL

Despus de que se tienen los clculos, en el laboratorio, estos se pesan en la

balanza analtica , se disuelven de uno en uno en agua destilada en un matraz
de Erlenmeyer a un volumen de 100mL, despus se afora en una probeta
graduada a un volumen de 200mL, se vierte en una botella color mbar y se
guarda en refrigeracin.

2.1.6. PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparacin de medios de cultivo, conllevan una metodologa exacta y precisa con las
soluciones sean liquidas o solidas (en polvo), con soluciones salinas y/o de nutrientes que
completan el medio de cultivo para establecer el explante vegetativo de cualquier especie de
plntula. Muchas de las preparaciones llevan nutrientes en poca cantidad y unas llevan ms de
lo requerido, esto se debe a la posibilidad de que al momento de propagacin sea ms fcil y
adaptable al medio del sustrato o si no es viable para ello. Pues lo diferentes tipos de sales
liquidas que se elaboran antes para concluir con la superficie nutritiva, son contrastes que
pueden tener tanto el explante vegetativo y la capacidad de nutrir el medio.

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en
condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos, (Pedrique de
Alucio, 1992).
En consecuencia, la nutricin orgnica de las plantas es un tema muy amplio que se extiende
desde la nutricin de bacterias y hongos, los variados requerimientos nutricionales de partes
aisladas de plantas, los requerimientos especiales de embriones aislados, los tejidos
cultivados, las clulas y protoplastos hasta el tema tan discutido de las plantas superiores
obtienen un beneficio especial de las complejas sustancias orgnicas que se encuentran
principalmente en el estircol natural y en las coberturas protectoras. Posiblemente la
formacin del medio para el cultivo de tejidos es ms un arte que una disciplina por derecho
pblico; la experiencia es el mejor maestro para este tipo de trabajo, y este es el mejor consejo
u orientacin que se le puede dar a un principiante.

Se debera trabajar con materiales que estn definidos con precisin desde el punto de vista
taxonmico, gentico y del desarrollo; existen muchas evidencias que sugieren que la variacin
en la respuesta al cultivo de tejidos segn el genotipo de la forma como se haga el cultivo,
(Krikorian).
Ejemplo: Preparar 500mL De Un Medio MS (1x), partiendo de soluciones concentradas de
sales y orgnicos a 100x, aadiendo 30g / L de sacarosa y 2.8g / L de Phytagel.

Formula para utilizar ciertos ml de la solucin de 50x y verterlo para hacer 500 ml.

V1
C1
V2
C2
Phytagel

Datos
500 ml
1x

50x
2.8 g/L

Sacarosa

30 g/L

Sustitucin
V2: V1 C1/C2; V2: 500 ml x 1x / 50x=
10 ml de solucin stock

2.8 g/L x 500 ml / 1000 ml= 1.4 g/500 ml

30 g/L x 500 ml / 1000 ml= 15 g/500 ml

Despus de obtenido los clculos de las concentraciones, se toman estos pasos: en un

vaso de precipitado se colocan 100mL de agua, colocarle la cantidad de las 6 soluciones y
sacarosa (azcar), se afora a 500mL en la probeta, despus se agregan las hormonas A.N.A. y
B.A.P., se mide el pH que quede entre 5.6 y 5.8 y por ltimo se agrega el Phytagel poco a poco,
se calienta a 40 c , ya que empiece a hervir (formarse burbujas) se toma el tiempo de 1 a 2
minutos, por ltimo se deja enfriar para despus servirlos en los frascos de 20 ml.

2.2. ESTERILIZACION
Esterilizacin
Es una serie de mtodos fsicos-qumicos, que sirven para eliminar los microorganismos y las
esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivo.
Desinfeccin
Es cuando se remueven los m.o. de un material inerte, por ejemplo un bistur.
Desinfestacion
Es remover superficialmente los m.o. con mtodos suaves para no daarlo; se usa hipoclorito
y otros como Hg Cl2, NaClO y Tween (tratamiento comercial).
Otro concepto tenemos que la esterilizacin es un proceso a travs del que se puede lograr la
destruccin total de los m.o. viables presentes en un determinado material. Este procedimiento
es de gran utilidad dentro del campo farmacutico, ya que existen muchos procesos que
requieren la utilizacin de materiales estriles.
Mtodos:
Qumicos: Con xido de etileno
Aldehdos
Gas-plasma de Perxido de Hidrogeno

Fsicos: Calor Radiaciones

Filtracin
Agentes esterilizantes y desinfectantes

2.2.1. GENERALIDADES
La esterilizacin es un mtodo de control del crecimiento microbiano que involucra la
eliminacin de todas las formas de vida microscpicas, incluidos virus y esporas, la
temperatura utilizada para la destruccin de los mismos, es de 100 C en adelante. Es un
trmino absoluto que implica la prdida de la viabilidad mediante la destruccin de todos
los microorganismos contenidos en un objeto, rea especfica o sustancia, acondicionando de
tal modo la posterior propagacin o contaminacin a otros objetos o al medio ambiente.
Los agentes que matan microbios son denominados microbicidas (sida = matar) o ms
comnmente denominados germicidas. Si el agente especficamente destruye bacterias, es
llamado bactericida; si mata hongos es denominado fungicida. Como sea despus de exponer
el objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, ste otra vez se habr contaminado con
microorganismos.

2.2.2. DEFINICION
La esterilizacin es un mtodo de control del crecimiento microbiano que involucra la
eliminacin de todas las formas de vida microscpicas, incluidos virus y esporas, la
temperatura utilizada para la destruccin de los mismos, es de 100 C en adelante. Es un
trmino absoluto que implica la prdida de la viabilidad mediante la destruccin de todos
los microorganismos contenidos en un objeto, rea especfica o sustancia, acondicionando de
tal modo la posterior propagacin o contaminacin a otros objetos o al medio ambiente.

2.2.3. TIPOS DE ESTERILIZACION

ESTERILIZACION. Los mtodos utilizados corrientemente en los laboratorios microbiolgicos
son:
Calor al rojo (flameado).
Calor seco (aire caliente).
Vapor a presin (esterilizacin a autoclave).
Vapor fluente (tindalizacin).
Filtracin.
La incineracin es tambin un mtodo de esterilizacin, pero se aplica fuera del laboratorio
para la eliminacin final de los desechos producidos en l y se considera por separado.
CALOR AL ROJO
Los instrumentos tales como las asas y alambres de siembra y varillas secas se esterilizan
calentndolas en la llama de un mechero bunsen hasta que se ponen al rojo. Los
microincineradores se recomiendan para esterilizar asas de inoculacin contaminadas con
material muy infeccioso (espulos tuberculosos) para evitar el riesgo de chisporrotear partculas
contaminadas sobre las zonas de alrededor.
CALOR SECO
Se aplica en un horno calentado elctricamente que se controla mediante termostatos y que
est provisto de un gran ventilador circulante que asegura la uniformidad de la temperatura en
todas las partes del contenido. Los equipos modernos disponen de controles electrnicos que

pueden llevar la temperatura al nivel requerido, mantenerla en ese punto durante un tiempo
establecido previamente y desconectar seguidamente la corriente. En algunos modelos se
incorpora una cerradura solenoide para impedir que la estufa sea abierta antes de que se
complete el ciclo. Este dispositivo salvaguarda y protege al personal de quemaduras
accidentales.
El material que puede esterilizarse por este mtodo incluye placas de petri, matraces y pipetas
de vidrio y objetos de metal. Pueden adquiriese de diversos proveedores cajas y cilindros
metlicos que almacenan convenientemente el material de vidrio durante la esterilizacin y lo
conservan estril hasta su utilizacin.
CONTROL DE LOS ESTERILIZADORES DE AIRE CALIENTE
Los ensayos para los hornos de funcionamiento elctrico provistos de ventilador se describen
en la Norma Britnica 34212.
El equipo de esterilizacin por aire caliente, debe calibrarse con termopares cuando el aparato
se instala y comprobarse con termopares posteriormente cuando se considere necesario.
El control de rutina ordinario puede efectuarse sencillamente con la ayuda de tubos de Browne.
Los tubos de Browne de Tipo 3 (punto verde) se utilizan para estufas provistas de ventilador.
VAPOR A PRESION
Se realiza Mediante la esterilizacin en autoclave. Las bacterias se matan ms fcilmente por
el calor hmedo (vapor saturado) que por el calor seco. El vapor mata las bacterias por
desnaturalizacin de sus protenas. Una condicin de seguridad convenida para la
esterilizacin es utilizar vapor a 121C durante 15 minutos. Esta temperatura es adecuada para
medios de cultivo, soluciones acuosas, tratamiento de cultivos y muestras desechadas, etc.
El aire tiene una influencia importante en la eficacia de la esterilizacin al vapor de agua,
porque su presencia modifica la relacin presin/temperatura. Por ejemplo: la temperatura del
vapor saturado a 1,054 kg/cm es 121C, siempre que se haya extrado todo el aire de la vasija,
Si slo se ha eliminado la mitad del aire, la temperatura de la mezcla aire-vapor que resulta es
de solamente 112C a la misma presin. Adems, la existencia de bolsas de aire impedir la
penetracin del vapor.
Debe eliminarse primero todo el aire que rodea y penetra en la carga a antes de que pueda
comenzar la esterilizacin por vapor.
OLLA A PRESION
Se utilizan todava en muchas partes del mundo. El tipo ms comn es un aparato para agua
hirviendo a presin. Tiene una cmara vertical de metal provista de una tapa metlica fuerte
que se aprieta y cierra hermticamente mediante un aro de goma. Se disponen en la tapa una
espita para la salida del aire y del vapor, un indicador de presin y una vlvula de seguridad. El
agua del fondo de autoclave se calienta mediante mecheros de gas exteriores, un calentador
elctrico de inmersin o un serpentn de vapor.
AUTOCLAVES CON ELIMINACION DEL AIRE POR DESPLAZAMIENTO DE LA GRAVEDAD
Estas autoclaves estn por lo general dispuestos horizontalmente y son de forma rectangular,
permitiendo que la cmara se cargue ms fcilmente. Puede utilizarse un sistema de bandejas
y carretilla.
La camisa que rodea a autoclave est compuesta de una pared externa que encierra un
espacio estrecho alrededor de la cmara, que se llena con vapor a presin para mantener la
pared de la cmara templada. El vapor penetra en la camisa desde la fuente principal que se
halla a alta presin, a travs de una vlvula que reduce la presin hasta el nivel de
funcionamiento. La presin de funcionamiento se mide en un indicador de presin
independiente fijado a la camisa. Esta camisa tiene un drenaje independiente para eliminar el
aire y la condensacin.

El vapor penetra en la cmara de la misma fuente que suministra el vapor a la camisa. Se

introduce de forma tal que es desviado hacia arriba y llena la cmara desde la parte superior
hacia la inferior, impulsando as al aire y al condensado a fluir en el fondo de la cmara por el
desplazamiento de la gravedad. El desage est provisto de filtros para impedir que se obture
por residuos. El desage lleva generalmente un termmetro para registrar la temperatura del
vapor que fluye. La temperatura registrada por el termmetro del desage es generalmente
inferior a la de la cmara. La diferencia debe determinarse mediante ensayos con termopares.
Tambin cuenta con una vlvula sensible al vapor.
TYNDALLIZACION
Este proceso, designado as despus de que el cientfico Tyndall utilizara un vaporizador de
Koch (o de Arnold), que es una caja metlica en el fondo de la cual el agua hierve mediante un
mechero de gas, una resistencia elctrica o un serpentn de vapor. El material que va a tratarse
permanece en una bandeja perforada, inmediatamente por encima del nivel del agua. La tapa
es cnica, de manera que el agua de condensacin resbala por los laterales en vez de gotear
sobre el contenido. Un pequeo orificio en la parte superior de la tapa permite que salgan el
aire y el vapor. Se utiliza este mtodo para esterilizar medios de cultivo que puede alterarse por
exposicin a temperaturas ms elevadas, por ejemplo medios que contienen carbohidratos
fcilmente hidrolizables o gelatina. Estos medios se vaporizan durante 30-45 minutos al da
durante tres das consecutivos. La primera vez se matan las bacterias vegetativas; cualquier
esporo que sobreviva germinar en el medio nutritivo durante la noche, dando lugar a formas
vegetativas que sern muertas durante la segunda y tercera vaporizaciones.
FILTRACION
Las bacterias pueden eliminarse de los lquidos hacindolos pasar a travs de filtros con poros
muy pequeos que impiden el paso de las bacterias pero, en general, no de los mycoplasmas
ni virus. Se emplea este mtodo para esterilizar el suero para su uso en el laboratorio, las
soluciones de antibiticos y los medios de cultivo especiales que se alteran por el calor. Se
utiliza tambin para separar los productos solubles del crecimiento bacteriano (toxinas) de los
medios de cultivo lquidos.
TIPOS DE FILTROS
Los siguientes tipos de filtros tienen un inters histrico principalmente:
Bujas de barro de loza tales como los tipos de Berkefeld y Mandier, que estn hechas de
Kieseighur y el filtro de Chamberland de porcelana no vidriada.
Filtros de asbesto (filtros Seitz).
Filtros de vidrio incrustado, que se construyen con vidrio finamente pulverizado, fundido lo
suficiente para hacer que los grnulos de vidrio se adhieran entre s.
FILTROS DE MEMBRANA
Estos filtros se fabrican de steres de celulosa (acetato de celulosa, nitrato de celulosa,
colodin, etc.). Tienen muchas ventajas sobre los primeros tipos de filtros bacteriolgicos, ya
que son mucho menos absorbentes y tienen una velocidad de filtracin elevada. Se fabrican
con una gran variedad de tamao de poro y algunas membranas pueden emplearse para
separar partculas de virus, mediante el uso de diferentes gradaciones de tamao de poro. Los
filtros bacterianos tienen un tamao de poro menor de 0,75 umas. Las membranas pueden
esterilizarse a autoclave.
DESINFECCION
Pueden utilizarse una gran variedad de sustancias qumicas y todas ellas reciben el nombre
comn de desinfectantes o biocidas. El primero de estos trminos es el que se va a usar en
este libro. Algunos de ellos son reactivos ordinarios, otros son formulaciones especiales,
registradas con nombres comerciales. Los microbilogos y gerentes de laboratorio se ven con
frecuencia presionados por los vendedores para que adquieran sus productos, para los que
hacen extravagantes propagandas. Generalmente hay diferencias marcadas entre la actividad

de algunos desinfectantes cuando se ensayan en condiciones ptimas por la tcnica de RidealWalker u otras menos acreditadas y cuando se utilizan en la prctica. Los efectos del tiempo,
temperatura, pH y la naturaleza qumica y fsica del artculo que se va a desinfectar y la materia
orgnica presente, no son a menudo totalmente consideradas.

2.2.4. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE

ESTERILIZACION
Factores que Intervienen en el Proceso de Esterilizacin
La eficacia de un proceso de esterilizacin depende de cmo se realice el proceso en s y de
mltiples factores relacionados con el objeto: estructura fsica, nivel de contaminacin inicial, de
limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilizacin, tipo de envoltorio, etc. Todas las fases
de un proceso de esterilizacin (limpieza, preparacin del equipo, esterilizacin, almacenaje y
transporte) deben validarse y controlarse.

Factores relacionados con el objeto

Los niveles de contaminacin del objeto: presencia de materia orgnica y de
Microrganismos Pueden alterar y condicionar el proceso de esterilizacin y derivar al fracaso
del mismo. La presencia de protenas protege a los microorganismos frente a la accin de los
agentes esterilizantes, especficamente los qumicos. Con el fin de eliminar la materia orgnica
y reducir la carga microbiana (y garantizar con ello la eficacia del proceso de esterilizacin), el
material debe descontaminarse previamente mediante una limpieza exhaustiva. Algunos
autores demuestran que despus de una limpieza minuciosa de material de difcil acceso
contaminado artificialmente (fibroscopios, agujas espinales, catteres...) se logra una reduccin
microbiana de entre un 99.90% y un 99.99%.

Configuracin fsica del material:

Los avances cientficos en el diagnstico y tratamiento de las enfermedades han desarrollado
una gran diversidad de material crtico con distinta forma, tamao, complejidad, fragilidad y
sensibilidad. En funcin de su estructura y configuracin fsica se elegir un determinado
procedimiento de esterilizacin. En el Real Decreto 414/1996 del 1 de Marzo, transposicin de
la Directiva 1993/42/CEE, se regulan y clasifican los productos sanitarios; en l se especifica la
responsabilidad del fabricante de describir las condiciones requeridas para reprocesar el
material, sin modificar su funcionalidad y caractersticas. El profesional sanitario tiene la
responsabilidad de aplicar el proceso de esterilizacin ms adecuado y demostrar que puede
reproducirlo exactamente. El proceso de esterilizacin supone un reto importante para el
material con luces o conductos largos o con espacios muertos. Para estos instrumentos ser
necesaria la aplicacin de prcticas especficas.
Limpieza del material previa a la esterilizacin:
El proceso de limpieza se define como la aplicacin de un procedimiento fsico-qumico
encaminado a eliminar la suciedad y otros materiales ajenos al objeto. La limpieza previa de un
objeto es una prctica indispensable para garantizar la efectividad de un proceso de
desinfeccin o esterilizacin. El agua y los detergentes usados en la limpieza deben reunir unas
caractersticas determinadas.
Agua:
Es importante verificar la calidad del agua para conseguir la mxima eficacia del detergente. Un
agua dura puede disminuir su efectividad. Para evitar la corrosin del instrumental quirrgico se
recomienda la utilizacin de agua desmineralizada durante el proceso de limpieza o, como
mnimo, en el ltimo aclarado. Nunca debe utilizarse suero fisiolgico para limpiar y/o aclarar el
instrumental porque puede producir corrosin. Es tambin importante controlar la temperatura
del agua, que no ha de ser excesivamente elevada (entre 20C y 45C); temperaturas altas
favorecen la coagulacin de la albmina y dificultan su eliminacin.

 Detergente:
Los detergentes neutros (pH 7) estn indicados para la limpieza de instrumental quirrgico
delicado, pero son menos eficaces para la eliminacin de sustancias orgnicas. Algunos
sistemas automatizados de lavado de instrumental utilizan detergentes ligeramente alcalinos
(pH de 8 a 11) que se neutralizan posteriormente en el aclarado. Se ha demostrado que los
detergentes enzimticos son ms efectivos que los detergentes alcalinos para la limpieza del
material de difcil acceso. Su eficacia est relacionada con el hecho de contener
endopeptidasas, enzimas que hidrolizan los enlaces de la molcula proteica y facilitan as la
eliminacin de contaminantes de base proteica como sangre y secreciones. Cuando se utilice
un detergente en polvo hay que tener la precaucin de disolverlo previamente, ya que podra
obstruir canales o iniciar un proceso de corrosin si alguna partcula quedase incrustada en
alguna ranura del instrumental. Deben evitarse los detergentes espumantes porque dificultan el
contacto del detergente con el objeto. Los detergentes deben diluirse correctamente segn las
indicaciones de cada fabricante.

2.2.5. ESTERILIZACION CON CALOR HUMEDO

Calor hmedo
Destruye a los microorganismos por coagulacin de las protenas. La presencia
de agua facilita el proceso de destruccin de los microorganismos.
Vapor a presin (autoclave):
El calor en forma de vapor saturado a presin proporciona temperaturas
mayores que la de ebullicin. La esterilizacin en autoclave emplea vapor
saturado a 15 lbs. de presin cuya temperatura es de 121C, por 15 minutos
contados a partir del momento en que el material alcance los 121C.
USOS: Esterilizacin de material contaminado, medios de cultivo y lquidos
termoestables.
Limitaciones: No es efectivo en medios impermeables al agua, ni en materiales
sensibles al calor o a la humedad.
Existen otros mtodos que utilizan el calor hmedo, que aunque no permiten la
eliminacin total de los microorganismos viables, se usan para controlar los
microorganismos presentes en un material o una preparacin.
Entre ellos estn:
Tindalizacin: Es un mtodo de esterilizacin fraccionada, consiste en calentar
el material a la temperatura seleccionada (entre 60 y 100C) por perodos
aproximados de 30 minutos a 1 hora, por 3 das consecutivos con perodos de
incubacin intermedios, las formas vegetativas se destruyen por el
calentamiento y las esporas germinan durante el perodo de incubacin
intermedio y son eliminadas en el siguiente calentamiento.
USO: Esterilizacin de materiales lbiles a ms de 100C pero estables a
temperaturas entre 60 y 100C.
Limitaciones: Proceso muy largo (3 das). Puede que no se logre la
esterilizacin.
Agua hirviente: Consiste en poner el contacto el material con agua hirviendo
por un periodo no menor a 10 minutos. Se usa para la destruccin de
microorganismos patgenos no formadores de esporas en ropas, platos, etc.
Tambin se puede emplear en el control de microorganismos presentes en el
agua de consumo.
Pasteurizacin: utilizado en la eliminacin de microorganismos patgenos en
productos lcteos, vinos, cerveza y jugos.

2.2.6. ESTERILIZACION DE MATERIAL DE CRISTALERIA Y

OTROS MATERIALES

MATERIAL DE CRISTALERA:
Los materiales de cristalera para esterilizacin se lavan con agua y jabn y
despus se secan con papel secante.
El material de cristalera que se va esterilizar debe tener una preparacin previa
evitar que se vuelvan a contaminar con posterioridad a su esterilizacin y
mantenerlas en esas condiciones hasta su utilizacin.
Vasos de precipitado: se rellenan de algodn o gasa y despus se envuelven en
papel estraza y se aseguran con cinta adhesiva.
Se colocan los materiales asegurados con cuidado en autoclave por 20 minutos a
una presin de 15 PSI.
Las pipetas: Se taponean de tal manera que no dificulte la succin, pero al mismo
tiempo impida el paso hacia la boca del material que est pipeteando.
Placas de Petry: Despus de ensambladas (tapa y caja) podrn ser colocadas
dentro de un cilndrico de metal inoxidable con tapa, fabricado especficamente
para ese uso, o en su defecto, las placas sern empaquetadas con papel de
estraza, individualmente, en parejas o en grupos de no ms de 5 placas.
Tubos de ensayos: Se taponean con algodn y se envuelven con papel de estraza
en grupos de 5 a 10 tubos.
Otros
Autoclave: se realiza la esterilizacin por el vapor de agua a presin. El modelo
ms usado es el de Chamberland. Esteriliza a 120 a una atmsfera de presin
(estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

2.2.7. ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO

El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es la autoclave (que utiliza vapor de
agua a presin como agente esterilizante).
Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como
grados de temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el tamao del autoclave y el flujo
del vapor, la densidad y el tamao de la carga en la cmara aumentan la tasa se muerte de los
microorganismos, en una temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o ms.

ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

1. Las cajas petri y pipetas envueltas en una autoclave a 120 o a 15 libras de
presin durante 20 min.
2. Los medios de cultivo se esterilizan de la misma manera en autoclave.
3. Verificar las instrucciones de uso del equipo
4.Revisar que el agua coincida con la marca del tubo indicador delautoclave.
5. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.
6.Acomodar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarlo
adentro
7.Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posicinencontrada.
8. Esperar que salga el vapor de agua por el orificio de purgado, despus
cerrar este orificio
9. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121oc o 15 lb. Depresin
revisando continuamente la escala del barmetro.

10. Se mantiene a esa temperatura y presin durante 15 min. Controlando la

perilla de temperatura.
11. Apagar la autoclave y dejar que baje la presin al valor de 0.
12. Con los guantes de asbesto se abri cuidadosamente la puerta, de
adelante hacia atrs para evitar quemaduras por la salida de vapor.
13. Retirar la canasta de la autoclave y sacar el material y medios de cultivos

2.3. ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE TEJIDOS

La biotecnologa vegetal hace posible que los proyectos agropecuarios tengan ms realce y
despunte a la hora de ejecutarlos, ahora vamos a entender sobre el establecimiento del cultivo
de tejidos vegetales in vitro.
El termino cultivo de tejidos es muy amplio y tiene numerosos objetivos, dependiendo de la
orientacin que se quiera dar al laboratorio. La tcnica de cultivo de tejidos in vitro es muy
heterognea mediante las cuales un explante, que no es ms que la parte separada de un
vegetal, por ejemplo un trozo de hoja, tejido, etc., se cultiva aspticamente en un medio de
composicin qumica definida, para luego incubarla en a condiciones ambientales controladas.
La separacin del explante y las operaciones relacionadas con su incubacin in vitro,
depender en gran medida del tipo de explante y del sistema de cultivo in vitro que se emplee,
basndose desde luego en los objetivos que se persigan. Para el establecimiento de cultivo de
tejidos, se deben analizar aspectos importantes tales como: el explante, la sepsia, los medios
de cultivo y las condiciones ambientales de incubacin.
EL EXPLANTE
Durante el proceso de establecimiento de cultivo de tejidos, la seleccin del explante apropiado
constituye el primer paso a tomar. Esta eleccin se basa en el objetivo perseguido y la especie
vegetal a usar.
El explante es la parte de la planta a partir del cual se inicia el cultivo.
Dependiendo de la especie y si las condiciones ambientales que se proporcionan al explante
son adecuados uno de ellos podra proporcionar cienos de plantas. El tamao del explante
vara desde los 0.1 mm hasta piezas de tallo de 5 cm o ms. Los explantes pueden ser
meristemos, puntas de brotes, tallos, anteras, flores, hojas, embriones, semillas, races y
yemas.
Si en el laboratorio se planifica obtener plantas provenientes de callos, los explantes obtenidos
anteriormente son muy tiles, ya que cualquier explante con clulas nucleares son muy tiles
para obtener callos.
Existentes especies que no responden adecuadamente a la formacin de callos, en estos
casos habr que buscar las alternativas de rganos aptos para que funcione el sistema. En
algunas dicotiledneas por ejemplo, se puede usar semillas germinadas que estn en el pleno
crecimiento. Afortunadamente, una gran mayora de especies vegetales responden al modelo
establecido en tabaco en su caracterstica de permitir el uso de gran variedad de explantes.
Estos ejemplos muestran que cada especie tiene una respuesta diferente al cultivo de tejidos,
lo que est relacionado al tipo de explante. En cuanto a la especie, se debe tomar en cuenta la
variacin gentica, pues el genotipo de la planta dentro de una especie es determinante para el
xito del proceso. Se ha observado que bajo las mismas condiciones ambientales y con el
mismo explante, la respuesta de distintas variedades es diferente.
Si se encuentra estos problemas de genotipo, pequeos cambios de la concentracin del
medio de cultivo o reguladores de crecimiento, puede ser suficiente para solucionar el
problema. Las respuestas de la los explantes pueden variar significativamente con el estado de
desarrollo y edad de los mismos. Si se trabaja con especies leosas, es importante usar
explantes provenientes de plantas jvenes u otras partes de las mismas en pleno desarrollo. En

algunas especies, como el man o la arveja la regeneracin de las plantas a partir de hojas est
limitada al uso de plantas muy jvenes.
Con relacin al tamao del explante se puede mencionar que cuanto mas grande sea hay
mayores posibilidades de proliferacin de callos, aunque ello permita una alta heterogeneidad
ola contaminacin con microrganismos, existentes un tamao mnimo y mximo del explante
(0.1 mm 5 cm), tamaos por debajo de lo mnimo, no produce proliferacin de callos u otras
respuestas que posibiliten la formacin de una nueva planta o clon.

2.3.1. ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

ELECCIN de la planta y/o tejido donante de explantos.
1. ESTABLECIMIENTO, que consiste en la desinfeccin de los explantes
(generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio
artificial de modo de inducir callo, brote, raz o embrin somtico segn se
desee.
2. MULTIPLICACIN: para generar una masa vegetal suficiente para la
regeneracin del nmero de plantas necesarias.
3. ENRAIZAMIENTO: en la que se busca la formacin de races con el fin de
convertir los brotes o embriones somticos en plntulas completas.
4. RUSTICACIN: que es la aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las
condiciones ambientales ex vitro (suelo o algn sustrato inerte).

2.3.1.1. ESTABLECIMIENTO ASEPTICO

El establecimiento asptico de tejidos vegetales, tiene como propsito determinado:
Limpieza de virus y otros patgenos.
Multiplicacin clonal masiva.
Resistencia a plagas y enfermedades.
Resistencia a la toxicidad y otras condiciones ambientales adversas.
Intercambio y la conservacin de germoplasma.
Mayor produccin por hectrea.

2.3.1.2. MULTIPLICACION
Multiplicacin: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la
regeneracin del nmero de plantas necesarias.
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes
(de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema
que se desarrollar luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Peridicamente
estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras
en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cmara
de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De
esta forma aumenta el nmero de plantas en cada repique o divisin de las plantas.
El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie vegetal y de las condiciones del
medio de cultivo. El nmero de plantas que se obtiene por la va de la micropropagacin
permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan
el crecimiento hayan sido optimizados.
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes
(de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema
que se desarrollar luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Peridicamente
estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras

en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cmara

de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De
esta forma aumenta el nmero de plantas en cada repique o divisin de las plantas.
El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie vegetal y de las condiciones del
medio de cultivo. El nmero de plantas que se obtiene por la va de la micropropagacin
permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan
el crecimiento hayan sido optimizados.

2.3.1.3. ENRAIZAMIENTO
Enraizamiento:
Es el proceso de induccin de la formacin de races con el fin de convertir alos brotes o
embriones somticos en plntulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en
condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la
etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que slo contenga auxinas.
Esta operacin se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso
los brotes se sumergen en una solucin concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato
limpio, no necesariamente estril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita.
Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien
desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosntesis para obtener la energa
necesaria para desarrollarse y formar las races.

ELECCIN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamao
aproximado de 2 centmetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicacin se
transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del
tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus
races en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto, el proceso
de multiplicacin y enraizamiento transcurren en forma simultnea.
2.3.1.4. ADAPTACION
Adaptacin:
es el paso de aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente
usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algn sustrato inerte.
El enraizamiento ex vitro permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatacin se
logren simultneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantos,
asegurando as una conexin vascular, continua entre el vstago y la raz.

ACLIMATACIN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recin enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que
el xito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatacin. En esta etapa las plantas
sufrirn cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a vivir en
condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados
de los frascos, estn poco adaptados a crecer en un invernculo, ya que estos explantes han
enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente
tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiracin y prdida de agua en la
planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y
por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecacin del explante. Por otra parte, crecer en
ambientes tan hmedos tambin suele implicar la falta de una cutcula con cera bien
desarrollada, que representa la barrera fsica para evitar la prdida de agua a lo largo de toda
la superficie de la planta.

2.3.2. SELECCION DE PLANTAS MADRE

Las plantas madres son aquellas de las cuales se obtienen material vegetativo para ser
empleado en la siembra Pueden ser plantas en produccin de pimienta en parcelas de
agricultores o plantas preparadas exclusivamente para producir dicho material.
Para que una planta sea seleccionada como planta madre, segn Andjar y Moya (2009) debe
reunir las siguientes condiciones:
Tener un buen desarrollo.
Poseer una forma columnar o recta.
Debe ser una planta altamente productiva.
Ser tolerante a enfermedades.
Estar sana.
No tener plantas enfermas a su alrededor

2.3.2.1. GENOTIPO
Es uno de los factores ms influyentes en la regeneracin in vitro ya que, existen grandes
diferencias en la divisin celular y la capacidad regenerativa en plantas provenientes de una
misma especie, como lo observa SWARTZ (1991), quien considera que la respuesta
morfogentica de los brotes regenerados, est fuertemente influenciada por el genotipo, ya que
algunos explantes provenientes de diferentes individuos parentales presentaban una variacin
en su desarrollo con las mismas concentraciones hormonales.

2.3.2.2. FITOSANIDAD
Es muy comn la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas
libres de virus. El explante ideal para ello es el meristema (dependiendo de la
especie, de 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y de un par de
primordios foliares. La planta que se va a utilizar para la propagacin in vitro deben
de encontrarse libres de plagas virus o enfermedades para as obtener plantas
sanas. adems de que se deben buscar plantas que se encuentren en estado
vegetativo .
Para evitar y/o minimizar las contaminaciones de los cultivos con microorganismos
es necesario:

Conocer el material vegetal con que se trabaja y los posibles

contaminantes especficos.
Realizar una adecuada preparacin de la planta dadora de explantes,
cultivndola preferentemente en invernaderos tratadas con productos qumicos
que eliminen patgenos y eventuales microorganismos endfitos.
Proceder a la desinfeccin superficial de los explantes mediante el uso de
compuestos qumicos con el objeto de eliminar los microorganismos con el menor
dao posible para el explante. Si bien no es posible recomendar un procedimiento
general, se puede sealar que el procedimiento ms popularizado consiste en una
doble desinfeccin mediante la inmersin de los explantes en etanol (70%v/v)
durante 20-60 segundos seguido de hipoclorito de sodio 1 -3%, contenido en el
agua de lavandina comercial, durante 3 a 30 minutos, dependiendo de la
naturaleza del explante.
La edad es un factor importante ya que los tejidos juveniles poseen un alto grado
de actividad meristemtico y tienden a tener ms plasticidad in vitro que los

adultos, como es el caso de la respuesta de cotiledones, hipoctilos y hojas

aisladas de material juvenil que son usadas para micropropagacin. Los tejidos
juveniles presentan una mayor capacidad morfogentica, la cual se manifiesta en
respuesta de crecimiento, proliferacin y enraizamiento, a diferencia de un tejido
maduro el cual es ms difcil de des diferenciar e inducir a la produccin de races
y brotes.
La edad de la planta y el grado de diferenciacin del tejido, muchas veces son
estn interrelacionados, y pueden producir efectos interactivos cundo se cultiva in
vitro.

2.3.2.4. CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LA PLANTA

Los cultivos de tejidos vegetales deben mantenerse en condiciones
ambientales semejantes a las naturales ms favorables. La luz, la temperatura
y la humedad relativa son los principales factores del ambiente que inciden
sobre los cultivos (Vidalie, 1986). El comportamiento de muchos cultivos
depende de la calidad, intensidad y fotoperiodo de la luz que reciben, dado que
varias enzimas involucradas en el desarrollo y en el metabolismo secundario
son influenciadas por la luz. La mayora de los cultivos desarrollan a una
intensidad luminosa entre 5 a 25 W/m2 (1000 a 5000 lux). Si bien la calidad de
la luz puede determinar diferentes respuestas morfognicas, en general se
utiliza luz blanca, pobre en longitudes de onda larga. El fotoperiodo
habitualmente utilizado es de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, aunque
algunos cultivos requieren oscuridad (Marn, 1993).
La temperatura de las cmaras de cultivo se regula en general entre 22 y 28C,
permitiendo as el desarrollo tanto de especies de climas templados como de
plantas tropicales. Es de destacar que durante el perodo iluminado, la
temperatura en el interior de los frascos de cultivo es 1-2C superior a la de la
cmara, debido al efecto invernadero; se crea as un termoperodo suave
(Marn, 1993). La velocidad de sntesis y de degradacin de distintos
compuestos y por ende el nivel de produccin y acumulacin de metabolitos
tambin es influenciado por la 4.- Cultivo in vitro
38 temperatura. As,
Nicotiana tabacum acumula entre un 100 a 200 % ms nicotina a 27C que a
21C o a 31C (Mantell & Smith, 1983). En cuanto a la humedad relativa, sta
se mantiene en alrededor del 70 % en las condiciones en las que se realizan
habitualmente los cultivos, aunque vara con la temperatura de la cmara y el
tipo y cierre de los recipientes. El porcentaje de humedad relativa no es
reportado en la mayora de los trabajos sobre cultivo in vitro de vegetales
(George, 1987a).

2.3.2.5. EDAD DEL ORGANO O TEJIDO VEGETAL

Edad del rgano o de la planta que ha sido extrada: es la edad biolgica de la planta,
es el tiempo que transcurri desde que la planta comenz como retoo o como embrin.

Edad fisiolgica o ontogentica o fase de crecimiento: incluye los conceptos de

juvenilidad y adulto.

El grado de diferenciacin: con este concepto, las partes ms jvenes de la planta son
clulas meristematicas no diferenciadas. Tericamente se dice que algunas plantas poseen las
clulas meristematicas siempre en estado juvenil y que podran vivir para

siempre.
Periodo de cultivo: es el tiempo desde que recin se instala el cultivo.

2.3.3. EXPLANTE
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, clulas sueltas,
protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse
en los procesos de micropropagacin depende de la especie con la que se est trabajando y de
los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares
son genticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir mltiples clones
de una forma o variedad con caractersticas especiales que se desea mantener en el cultivo.
Otros explantes como las yemas adventicias son ms bien genticamente inestables y
producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es til para la
produccin de plntulas con una determinada caracterstica de cultivo, pero si lo es para el
fitomejoramiento, ya que mediante esta variacin seminatural, es posible obtener nuevas
lneas de cultivo.

2.3.3.1. TIPOS DE EXPLANTE

Tipos de cultivos de tejidos.
Se podra hablar de tres tipos de cultivos:

 Cultivo de rganos. Implica que la arquitectura caracterstica del tejido in vivo se mantiene al
menos en parte. Para ello el rgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y
al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general
esfrica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello
una buena rplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagacin pues el
crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos
celulares embrionarios. La imposibilidad de propagar obliga a partir en cada nuevo experimento
de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad.
Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de rganos que se adhieren a una superficie y
en la que proliferan las clulas de la periferia del explante.
Cultivo celular. Supone una disgregacin celular ya sea por medios enzimticos o mecnicos.
La suspensin celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensin en el
medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagacin, aumentando notablemente la
masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como caracterstica negativa se pierde
la heterogeneidad celular de partida, la poblacin se hace uniforme y homognea al predominar
en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento

2.3.3.2. POSICION DEL EXPLANTE EN LA PLANTA

En algunas plantas cualquier segmento de un rgano cualquiera tienen aproximadamente la
misma capacidad regenerativa. Si existen diferencias, pueden ser explicadas generalmente por
el hecho de que en la hoja (o tallo), hay tejidos de diferentes edades. Por otro lado, tambin se
han encontrado grandes diferencias, segn las zonas, en capacidad de regeneracin de
algunos rganos.

2.3.3.3. TAMAO DEL EXPLANTE

Tamao:
En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la
proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de
explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con
microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del
explante, que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil
lograr el establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del
empleo de medios ms complejos o de los denominados medios acondicionados.

2.3.4. SIEMBRA DEL EXPLANTE

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar
la proliferacin de contaminantes biolgicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en
el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontrbel 2001) y
compiten con el mismo deteriorndolo y hacindolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).
Los explantes desinfectados son trasladados a una cmara de flujo laminar (con aire filtrado,
libre de microorganismos) donde se realizar la transferencia a un medio de cultivo apropiado
(Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante
est en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cmara de crecimiento con
condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.
Una vez que los explantes luego de algunas semanas en la cmara de crecimiento han
desarrollado algunas races y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este
es uno de los pasos ms difciles de la tcnica, ya que los explantesin vitro se encuentran en
condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrfica (del medio de
cultivo) y el estrs de adaptacin a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996,

Fossard 1999). Un porcentaje de las plntulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero,

pero la parte que si sobrevive crece ya en condiciones normales y al cabo de una semana
est lista para ser trasladada al campo de cultivo.

2.3.4.1. DESINFECCION DEL EXPLANTE

DESINFECCION
Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
CRITERIOS PARA LA DESINFECCION DE LOS EXPLANTES
Lavado con agua corriente durante 20-30min
Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.
Solucin de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser
reemplazado por el uso de soluciones diluidas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y
0,05%. soluciones diluidas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%.
Enjuagues con abundante H2O estril (4 5 veces).
En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difcil de eliminar.

2.3.4.2. DISECCION DEL EXPLANTE

DISECCION DEL EXPLANTE

2.3.4.3. SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SOLIDOS Y LIQUIDOS

Medios de cultivo: Slido y Lquido
Una forma muy til de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el
uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya sabemos se
considera el padre de la microbiologa), quien se dio cuenta que los microorganismos podan
crecer en soluciones que tuvieran azcar y una fuente de nitrgeno.
De ese tiempo hasta ac, ha pasado mucha agua debajo del puente y actualmente existen
medios muy especializados para microorganismos muy exigentes. La forma ms sencilla de
clasificar los medios de cultivo es por su consistenciaentonces aparecen los medios de
cultivo slidos y los medios de cultivo lquidos o tambin llamados caldos. En ambos medios
debe haber una buena cantidad de nutrientes que faciliten el crecimiento bacteriano y entonces
cual es la diferencia? pues la diferencia radica en la presencia de una sustancia que se llama
Agar o Agar-Agar y que es la encargada de darle la solidez y consistencia al medio. Esta
sustancia proviene, principalmente, de un alga llamada Gelidium, aunque muchos otros

gneros pueden servir como fuente de este polisacrido (es decir, un azcar grande formado
por la unin de azcares pequeos). Y como se obtiene del alga?. Se toman sus semillas, se
lavan, se secan, se realizan procesos de extraccin, filtracin, purificacin y desecacin para
que queden hojuelas o polvo y luego si adicionarla al medio de cultivo.
Fue, Robert Koch, mdico alemn dedicado al estudio de los microorganismos y considerado
uno de los autores de la teora microbiana, quien empez a cultivar y aislar microorganismos.
Koch, buscando mejorar la tcnica utilizada hasta ese momento, decidi solidificar los medios
de cultivo aadindoles gelatina. Sin embargo, y a sugerencia de una ayudante, introdujo el
agar.
2.3.5. CONDICIONES DE INCUBACION
Condiciones de incubacin Iluminacin:

Composicin espectral
Irradiancia
Fotoperiodo
Temperatura Humedad
Disponibilidad de agua
Ventilacin Otros
Distintos recipientes de cultivo y sistemas de ventilacin
Cultivo en biorreactores
Condiciones de incubacin Cultivo en biorreactores
Condiciones de incubacin Cultivos vitropnicos
Condiciones de incubacin Cultivo en bolsas plsticas

Podemos definir el fotoperiodo como el conjunto de los procesos mediante los cuales muchos
organismos y vegetales regulan sus funciones biolgicas como puede ser el caso del
crecimiento o la reproduccin, utilizando como indicador la alternancia da-noche de los
diversos das del ao, donde encontramos das de larga duracin y das de menor duracin
dependiendo de la estacin del ao y por lo tanto del ciclo del sol.

La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: El fotoperiodo: Algunos fenmenos
propios del desarrollo de las plantas (germinacin, floracin, tuberizacin, etc.) pueden ser
activados por el nmero de horas diarias de luz que recibe la planta.
De forma anloga, el nmero de horas de luz que recibe el explante cultivado in vitro puede
afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo ser tambin el mejor
fotoperiodo in vitro.

2.3.5.2. INTENSIDAD LUMINICA

la opcin ms econmica es el empleo de la luz natural, disminuyendo su irradiancia (20-50%)
mediante el agregado de mallas de sombreado (saram). No obstante, en aquellas latitudes
donde el nivel medio de luz natural es bajo y los das son cortos durante una parte considerable
del ao, la luz artificial puede ser aplicada como complemento de la luz natural. Las lmparas
tubulares fluorescentes del tipo luz da son empleadas en horticultura para prolongar el
fotoperiodo. Asimismo, las lmparas tubulares de sodio alta presin presentan una distribucin
espectral de la energa adecuada para estimular fotosntesis y se emplean para tal fin en una
amplia variedad de cultivos. La luz suministrada a los cultivos debe ser evaluada en cuanto a la
calidad, intensidad y perodo de suministro. La respuesta morfognica de un explante puede
variar segn si se le proporciona luz o no. Para estimular la formacin de callo, es comn que
se prefiera la oscuridad. El suministro de luz favorece la diferenciacin de rganos.

2.3.5.3. TEMPERATURA
La temperatura de incubacin de los cultivos es un factor importante a tener en cuenta. Si bien
en condiciones naturales las plantas experimentan diferencias trmicas durante el da y la
noche, las temperaturas in vitro se mantienen casi estables. Es importante sealar que cuanto
ms se asemejen las condiciones in vitro a las ptimas de crecimiento de la especie estudiada,
mayor ser la respuesta obtenida. En cultivos de hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos
a diferentes temperaturas se observ que la regeneracin mayor de brotes se produca a 12 C
mientras que por encima de los 30 C, prcticamente no se observ diferenciacin.

2.3.5.4. HUMEDAD RELATIVA

La humedad relativa (HR) como medida de la cantidad de vapor de agua contenida en la
atmsfera gaseosa, es otro de los parmetros fsicos a tener en cuenta. La HR depender del
sello o cobertura del envase empleado. Si este cierre es hermtico, la humedad interior ser del
100 %. Si existe la posibilidad de un intercambio gaseoso, la humedad interna puede
descender a niveles cercanos al 50 %. Este importante descenso del contenido de HR puede
promover una prdida veloz de agua del medio de cultivo, variando la concentracin de sus
compuestos hasta llegar a niveles txicos.
2.3.6. CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE
Los cambios fisiolgicos dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y
se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo;
estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en
las condiciones originales, algunos de los cambios que sufren las plantas al ser sometidas a
diferentes condiciones son:
La cutcula es ms delgada
Como tienen mucha humedad relativa las races son ms delgadas, pocas races y no
son funcionales.
Estomas atrofiadas, no son funcionales al 100%.
Cutcula ms delgada y con aberturas
Con menos luz y azcar en las plantas se realiza menos fotosntesis y en gran
porcentaje son hetertrofas y en poco porcentaje son auttrofas.
Parnquima desorganizado, no estn unidas, es decir, es ineficiente.

2.3.6.1. FORMACION DE CALLO

La composicin salina ms empleada para inducir la formacin de callo, la organognesis
directa o indirecta en la mayora de las especies vegetales, es la de Murashige & Skoog (1962)
(MS). Sin embargo, existen otras formulaciones diseadas para inducir determinados patrones
morfognicas. Existe, adems, una estrecha relacin entre la composicin hormonal del
explante y la concentracin de reguladores del crecimiento agregada al medio de cultivo.

2.3.6.2. CRECIMIENTO DE YEMAS ADVENTICIAS

La iniciacin directa principia con clulas de parnquima que estn situadas ya sea en la
epidermis o justo abajo de la superficie del tallo; algunas de esas clulas se vuelve
meristemoides las cuales aparentemente se originan de clulas individuales, sin embargo, la
respuesta de los explantes depende de la concentracin de hormonas El desarrollo indirecto de
brotes adventicios implica, primero la iniciacin de callo basal de los brotes separados en
cultivos, Los brotes se originan en la periferia del callo e inicialmente no estn conectados al
tejido vascular del explante, de manera similar, en plantas intactas, si se aplica citoquinina en
bloques de agar cilndrico pueden originarse de brotes del callo formado en el pice de
epicotilos decapitados.
Iniciacin de los brotes

Se pueden iniciar nuevos pices de ramas o brotes ya sea:

Directamente del explante

Indirectamente del callo que se forma en la superficie cortada del explante.

Los dos factores ms importantes que afectan la iniciacin de brotes adventicios son:
La relacin del explante

El rgimen de hormonas que se suministran a las plantas.

2.3.6.3. ENRAIZAMIENTO
El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso
se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de
crecimiento o que slo contenga auxinas. Esta operacin se realiza en condiciones de
esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solucin
concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estril, que
puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el
enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las
plantas deben realizar la fotosntesis para obtener la energa necesaria para desarrollarse y
formar las races.
La induccin de estas races se produce modificando ligeramente las caractersticas del medio
de cultivo adecundolas para la generacin de races.

2.3.6.4. PREADAPTACION Y TRASPLANTE

Pre-adaptacin de plntulas:
En algunas ocasiones, el nmero de plantas recibidas de una sola vez fue muy alto y la
capacidad disponible de mano de obra no permiti una manipulacin rpida del material,
debiendo permanecer varios das en las cajas. En estas condiciones se observ una tasa de
mortalidad alta. Cuando esto sucede, se recomienda guardar los frascos en un lugar fresco y
con luz adecuada, durante 1 2 das. En este perodo se retira la cinta plstica que rodea la
tapa de los frascos para aclimatar la plntula a las condiciones del lugar. Se aconseja que todo
el proceso del transplante se inicie a partir de las 4:00 p.m., todos los das, con el fin de evitar
la deshidratacin de las plntulas, especialmente si el trabajo se realiza en una casa de malla.
Substrato para el transplante:
Los mejores resultados que se obtuvieron en el proyecto, en cuanto al sustrato a usar para el
endurecimiento, fueron con la mezcla de 1 parte de suelo molido o zarandeado (capa arable no
arcillosa) y tres partes de arena (arena gruesa lavada)
2.3.7. TRASPLANTE AL SUSTRATO
Consiste en realizar el trasplante del medio de cultivo a un sustrato para su maduracin. Si el
sistema radical fue diferenciado in vitro las plantas no se pueden trasplantar directamente a las
condiciones de invernadero sin una paulatina adaptacin a las condiciones de suelo. A este
periodo de adaptacin se le ha denominado periodo de endurecimiento.
Con especies leosas, anuales y suculentas, las plantas obtenidas in vitro se deben lavar
cuidadosamente para eliminar todos los residuos de agar, que puedan ser una fuente de
contaminacin. Posteriormente, se trasplantan a recipientes con suelo estril y se cubren con
bolsas de polietileno, que van perforando gradualmente hasta que queden eliminadas
completamente en un periodo de 15 a 20; esto se hace con el objetivo de adaptar
paulatinamente las plantas a las condiciones de invernadero. Durante esta fase de
endurecimiento las plantas se riegan preferentemente con medio de cultivo diluido al 50% y
posteriormente se sustituye esta frmula de riego por soluciones nutritivas menos complejas

2.3.7.1. TIPOS DE SUSTRATO

Un aspecto importante a tener en cuenta lo constituye la eleccin del substrato, siendo el
adecuado aquel que permita el normal crecimiento y desarrollo de las races. Se puede
emplear: arena, perlita, turba, vermiculita, o mezclas de ellos, teniendo la precaucin de realizar
una esterilizacin previa. Es conveniente el agregado de fertilizantes, sea a travs del substrato
(fertilizantes de liberacin controlada) o bien mediante el sistema de riego (fertilizantes
solubles); emplendose proporciones ricas en fsforo (N-P-K: 9-45-15) y potasio (N-P-K: 4-2535) que favorecern el desarrollo radicular y la rustificacin de las plantas.

2.3.7.2. DESINFECCION O ESTERILIZACION DEL SUSTRATO

Tcnicas fsicas: Estas tcnicas estn basadas en la utilizacin del calor como esterilizante, en
sus diferentes formas de aplicacin, como son la desinfeccin por calor y la solarizacin.
Desinfeccin del suelo con productos qumicos: Esta tcnica est basada en el empleo de los
distintos productos qumicos y mediante los efectos de los mismos lograr la desinfeccin del
suelo.
Desinfeccin con vapor de agua: Es un mtodo de desinfeccin del suelo en el que se emplea
el vapor de agua como desinfectante de todos los parsitos existentes en el suelo. Dicho vapor
se obtiene de una caldera mvil generalmente a 80 - 100C que mediante una serie de tuberas
y tubos es conducida al suelo donde va desinfectndolo poco a poco a una profundidad
variable (5 - 15 cm) segn el sistema utilizado, y con una duracin media del tratamiento
comprendida entre 5 y 20 minutos
Pero el efecto de este vapor tambin puede ser negativo ya que si se aplica a una profundidad
demasiado elevada puede destruir las bacterias nitrificantes del suelo.
La efectividad del sistema es mucho mayor en suelos secos que hmedos por lo que ser
aconsejable que evitar aplicar riegos antes de efectuar el tratamiento.
La desinfeccin con vapor de agua es un mtodo con una efectividad alta y su principal
inconveniente es su alto costo.
Las desinfeccin por vapor de agua presenta ventajas e inconvenientes, como son:
Cuando se emplea este mtodo, las bacterias amonificantes suelen ser destruidas por lo que
se suele producir una elevacin en el contenido en amoniaco del suelo, por lo que pueden
producirse fitotoxicidades por una excesiva acumulacin amoniacal.
De lo contrario cuando se realiza la desinfeccin con calor determinados elementos minerales
pasan a formas mas asimilables por la planta, lo que en terrenos muy ricos pueden llegar a
ocasionar riegos de salinidad.

2.3.7.3. TRASPLANTE Y ADAPTACION BAJO CONDICIONES DE

INVERNADERO
Antes de transplantar, se elimina completamente el medio de cultivo de las races, para ello se
colocarn las plntulas en un recipiente con agua limpia y el medio se eliminar de las races
manualmente sin daar a las plntulas. Con la finalidad de evitar contaminacin por
enfermedades fungosas, la plntula se sumerge durante cinco minutos en un recipiente que
contenga una solucin preparada con fungicida. Para el trasplante se utiliza un sustrato el cual
se esteriliza.
La eficiencia del proceso de adaptacin depende, entre otros factores, de la eleccin del
sustrato y de la obtencin de una relacin adecuada entre los componentes de la mezcla, que
asegure una buena supervivencia en el transplante. Dicho sustrato deber permitir la formacin
de un pan de tierra con una buena estructura. Se trata de materiales slidos y porosos, de
origen natural o sinttico, que solos o en mezclas, permiten un crecimiento adecuado de las
plantas en condiciones controladas (Abad,1989).

2.3.7.4. MANEJO DEL MATERIAL TRASPLANTADO

Manejo de las plantas despus del transplante inicial
Con la utilizacin de mtodos, como el de Sistema de Inmersin Temporal, ahora es posible
producir un nmero muy grande de plantas, en perodos cortos de tiempo, por lo que existe la

necesidad de generar metodologas de manejo que permitan recuperar y mantener las plantas
en buenas condiciones hasta que son llevadas al campo.
Esta fase empieza a partir del momento en que las plantas, debidamente acondicionadas, son
colocadas en la casa de malla. A partir de all, los pasos sugeridos son los siguientes:
a. Al octavo da de tener las plantas en la casa de malla se retira el amarre de la bolsa plstica,
permitiendo a las plntulas que se vayan adaptando al micro ambiente de las instalaciones.
b. Riego: Si las condiciones son normales y no hay marchites fisiolgica, se hace el segundo
riego de mantenimiento a los 10 12 das despus del transplante. Este segundo riego (10
cm3 por planta) va acompaado con una mezcla de fertilizante rico en fsforo para continuar
estimulando el desarrollo de las races. Dependiendo de las condiciones micro-climticas que
se tienen en la casa de malla y del estado de turgencia de las plntulas, se puede programar
uno o dos riegos diariamente.
c. Riego automtico en casa de malla: Cuando el nmero de plantas sobrepasa las 1.500, se
justifica el riego por microaspersin, que debe estar controlado por un reloj y una vlvula
solenoide. Cuando se utiliza este sistema de riego se deben realizar inspecciones rigurosas
para detectar cualquier problema fitopatolgico.
d. Fertilizacin: Cada ocho das se realiza la fertilizacin con un abono rico en fsforo,
alternndolo con un fertilizante completo que contenga los elementos mayores y menores. Si
se presentan sntomas puntuales de la deficiencia de un elemento se puede realizar una
fertilizacin foliar con fertilizantes simples o completos.
e. Segundo transplante: Cuando las plntulas tengan entre 45 y 60 das del primer transplante
es necesario realizar un nuevo transplante a bolsas plsticas con una capacidad de 500
gramos de suelo, en el que se puede adicionar micorrizas, si se considera necesario, segn los
anlisis del suelo en el que las plantas van a ser sembradas definitivamente.
f. Transplante al sitio definitivo: Entre los 2 y 3 meses de permanecer en la casa de malla, las
plantas estn listas para ser llevadas al sitio definitivo. Durante este perodo es importante estar
atento a deficiencias nutricionales o problemas de plagas y enfermedades.
3.5.2.3. CRYOCONSERVACION DEL GERMOPLASMA
La cryoconservacin de plantas es un proceso consistente en la preparacin, mantenimiento y
preservacin a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra
bajas de 196 C, obtenidas mediante nitrgeno lquido (NL). Este mtodo de conservacin de
material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservacin de
recursos filogenticos: es un mtodo rpido, sencillo, no altera la estabilidad gentica del
material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento
de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano
de obra y evitar los riesgos fitopatolgicos y fisiolgicos que habitualmente aparecen en el
mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que sealar el importante ahorro
de espacio que supone mantener una coleccin de especies hortcolas o leosas en pocos
metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.
La cryoconservacin, que describimos a continuacin, puede ser aplicada ventajosamente a la
conservacin de especies y variedades vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las
colecciones y bancos de germoplasma clsicos (bancos de semillas, colecciones en campo).}
Existen dos mtodos de congelacin. Podemos hablar de un mtodo de congelacin lento, y un
mtodo de congelacin rpido.
1. El mtodo de congelacin lento, tambin llamado mtodo convencional de
precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470].
2. En el mtodo de congelacin rpido o simple, el material vegetal se congela
inicialmente a 40 C, para pasarlo posteriormente al NL.

3.1. GENERALIDADES
El trmino genrico cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes tcnicas de cultivo de
material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (clulas desprovistas de su pared
celular), clulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas y otras tcnicas de
cultivo, es posible obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo asptico (estril) en

condiciones ambientales controladas. Tambin se lo conoce como cultivo in vitro de plantas

por realizarse en recipientes de vidrio (hoy tambin de otros materiales).
Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902,
pero recin en 1922 se logr el primer experimento exitoso: la germinacin in vitro de semillas
de orqudeas. Luego de la germinacin, las plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de
cultivo en condiciones aspticas, y as se mantuvieron protegidas del ataque de patgenos
(hongos, virus y bacterias).

Cultivo in vitro de pices meristemticos

Introduccin
La regeneracin de plantas sanas partiendo del cultivo in vitro de pices
meristemticos de ciertos vegetales leosos exige la bsqueda de tcnicas
complejas y su empleo acertado. Esas tcnicas deben permitir al explante
sortear frecuentes dificultades como la oxidacin, la heterogeneidad de
respuestas, la reversin al estado juvenil, la presencia de inhibidores de
enraizamiento y, sobre todo, la sobrevivencia al trasplante en condiciones
auttrofas.
Buscando una mejor respuesta del pice meristemtico de algunos ctricos,
Murashige et al. (1972) y Navarro et al. (1975). Plantearon la posibilidad del
microinjerto in vitro de pices sobre plntulas provenientes de semillas,
logrando as el desarrollo de plantas libres de numerosos virus (Navarro y
Surez, 1977; Roistacher, 1977).El microinjerto in vitro fue aplicado ms tarde
al manzano (Alskief y Villemur, 1978), al damasco (Martnez et al., 1979) y a las
vides (Engel- brecht y Schwerdtfeger, 1979) en las que se obtuvieron
ejemplares libres de virus.
Introduciendo algunas modificaciones a las tcnicas disponibles, fue posible
regenerar plantas de duraznero libres de virus como Sharka o Plum Pox y
algunas cepas del Necrotic Ringspot Virus (NRSV), cuando se microinjertaron
in vitro pices del cultivar GF 305 (Mosella, 1979). Por otra parte, Navarro et
al. (1982) informaron acerca de la eliminacin de virus como el Prunus Dwarf
Virus (PDV) y el Chlorotic Leaf Spot Virus (CLSV) empleando el microinjerto de
distintas variedades de duraznero.
Otra tcnica, denominada microinjerto in vivo de pices meristemticos
pretratados in vitro, fue propuesta por Mosella et al. (l980b) e ilustrada por
Jonard et al. (1983). Con esta tcnica se obtuvieron tambin plantas sanas de
Prunus persica (L.) Batsch y con menos complicaciones que con la tcnica
original in vitro. En 1983, Ascui aplic estos nuevos procedimientos a diversos
ctricos y obtuvo resultados promisorios que esperan los indizajes virolgicos
correspondientes.
Procedimiento:
Micro injerto in vitro
1. Preparacin de portainjerto. Se describe la obtencin de plntulas de dos
especies que se usarn como porta injertos.

Dureznero. Las semillas desprovistas del endocarpio se esterilizan con alcohol

de 950 durante 2 min y luego se tratan con hipoclorito de calcio (9%-12% ) mas
0.1% 190 de Tween-20 durante 30 a 60 min. Luego se enjuagan tres o ms
veces con agua destilada estril.
Las semillas se siembran as aspticamente en 40 ml de medio nutritivo
gelificado (Knop-Heller)' contenidos en tubos de vidrio de 170 x 30 mm que se
tapan con algodn hidrfobo y papel de aluminio. El medio de cultivos contiene
agar (8-9 g/ litro), sacarosa (40-60 g/litro), y su pH se regula entre 5.5 y 5.6. En
todos estos ensayos los medios fueron esterilizados en autoclave a 105 C dos
veces: la primera durante 15 min, y 24 horas despus durante 5 min.
La estratificacin durante un lapso de 60 a 90 das a 4 C en la oscuridad
favorece la ruptura de la dormancia de prunus persica cv. GF 305. Luego de
este plazo, y en un tiempo de 4 a 9 das a 27 C en la oscuridad, se obtienen
las plntulas que servirn de portainjerto.
Ctricos.

Semillas del citrange Troyer, cuyas cubiertas seminales han sido

removidas, se esterilizan superficialmente con NaOCl(0.5%) al que se aaden
algunas gotas de Tween-20 como agente humectante. Luego se enjuagan tres
o ms veces con agua destilada estril. Se siembran las semillas as tratadas
en 40 ml de medio nutritivo (Murashige et al., 1962) gelificado (l %), con 20 g/
litro de sacarosa, a un pH de 5.6, en tubos de vidrio de 170 x 30 mm y se
colocan a 24 C en la oscuridad; se logra as la germinacin y el crecimiento
de las plntulas unos 15 das despus. En un lapso de 3 a 4 semanas, el
epictilo mide ms o menos 6 cm de longitud y las plantas estn ya listas para
el microinjerto.
2. Obtencin del pice meristemtico. El pice meristemtico mide de 0.2 a
0.4 mm en ctricos [(Citriis sinensis (L.) Osbeck cv. Thomson y Citrus limon (L.)
Burm. f. cvs. Gnova, Eureka y Lisboa)] y de 0.6 a l mm en el duraznero (p.
persica cv. GF 305); comprende el meristema propiamente dicho y uno o dos
primordios foliares. El meristema se obtiene de los brotes terminales de plantas
mantenidas en el invernadero o de plantas cultivadas de 2 a 3 afios en el
campo, si se trata de ctricos. Los brotes se esterilizan superficialmente con
etanol 80% ( v/ v) durante 2 a 3 min y luego durante 10 a 15 min con hipoclorito
de calcio (6%-9%) que contenga 0.1% de Tween-20. Luego los brotes se lavan
con agua destilada estril tres o ms veces. La operacin se realiza con la
ayuda d un binocular de 20 aumentos en una cmara de flujo laminar.
3. Microinjerto. Los portainjertos desarrollados en condiciones estriles se
extraen del tubo de germinacin en la cmara de flujo; se les secciona el
epictilo a 2 cm del cuello, y se eliminan los cotiledones lo mismo que las
yemas laterales si se trata de ctricos. La operacin se realiza sobre una caja
Petri estril.
El pice injerto se coloca sobre la superficie decapitada y en contacto con la
zona vascular, en el duraznero. En los ctricos, en cambio, se hace una
escisin en la corteza del epictilo en forma de t invertida.

La plntula injertada se coloca en un redondel de papel filtro perforado en su

centro que le servir de soporte en el tubo de vidrio, de manera que el sistema
radical quede en contacto con un medio nutritivo lquido. Para los durazneros,
este medio contiene macroelementos de Knop, microelementos de Heller, y
vitaminas de Miller junto con 60 g/ litro dc sacarosa, a un pH de 5.6. En
los ctricos se utiliza cl medio clsico de Murashige et al. (1962), al cual se
adicionan tiamina-HCl (0.2 mg/ litro), piridoxina-HCl (1.0 mg/ litro), cido
nicotlnico (1.0 mg/ litro), mio-inositol (100 mg/ litro),y sacarosa (75 g/ litro); pH
-5.6.
4. Incubacin. Los microinjertos se incuban en una cmara de ambiente
controlado a 24+- 2c , con una intensidad lumnica que varia de 600 lux
(durazneros) a 1400-1600 lux (ctricos), y con 16 horas de luz por da. El
perodo de incubacin es de 20 a 60 das en durazneros y de 30 a
40 das en ctricos, momento en que las plantas se trasplantan a macetas.
5. Trasplante a macetas. Logrado el desarrollo del injerto, las plntulas se
extraen de los tubos y sus races se lavan profundamente con agua a fin de
eliminar los restos del medio de cultivo. Luego se llevan a maletas que
contienen un sustrato arena/ turba (50%-50%) para los ctricos y turba, tierra de
hoja y arena (en ciertas proporciones) para los durazneros. Estas mezclas se
esterilizan previamente en autoclave a 130c durante 30 min, o directamente
mediante la aplicacin de vapor durante una hora.
Las plntulas se cubren en las macetas con una bolsa de polietileno o con un
frasco de vidrio para reducir los efectos de la deshidratacin. Las plantas se
colocan ms tarde en zonas sombreadas del invernadero, donde se adaptan a
las condiciones normales del cultivo porque se abren paulatinamente las bolsas
y aumenta gradualmente la intensidad lumnica. Posteriormente se realizan los
indizajes virolgicos.

Cultivo directo de pices

Tanto en Citrus limn cv. Gnova como en Prunus persica cv. GF 305, se logr
la regeneracin de plantas bien enraizadas partiendo del cultivo directo dc
pices in vitro. En el duraznero, los pices, despus de 20 a 30 das de cultivo
in vitro sobre medios que favorecen su elongacin, fueron especialmente
repicados a medios gelificados (0.8:%) a los que se adicionaron auxinas (ANA
o AIA, 0.5 mg/ litro) y compuestos fenlicos como la rutina o la quercetina(10-
M); de esos pices, 249, produjeron primordios radiculares en la oscuridad a
24 C, en un lapso de 2 a 3 semanas. Un nuevo cambio a un medio gelificado
simple y sin hormonas (Knop m8s 10 g/ litro de sacarosa) y a un rgimen de
6000 lux estimul la elongacin radicular y el desarrollo de la parte area de las
plantas y determin porcentajes de plantas libres. de virus similares a los
obtenidos con las tcnicas anteriores.

El trasplante a macetas contina como la limitante de este tipo de regeneracin

pues el xito de esta operacin no supera el 20%. En el limonero, por su parte,
un l0% de los pices cultivados sobre el medio de elongacin y repicados al
medio MI116 gelificado que contenga 2 mg/ litro de ANA y 259, de carbn
activado emitieron races.
Las tcnicas resumidas en la Figura 23.5 permiten regenerar plantas
de difcil respuesta al cultivo in vitro partiendo de pices meristemticos cuya
longitud no sea superior a 1 mm; brindan adems la posibilidad de obtener
material vegetal libre de ciertos virus que afectan las plantas madre de frutales
como el duraznero, sin recurrir a tratamientos termoteraputicos. Estos
protocolos son aplicables tambin a especies de ctricos como el limonero y el
naranjo, y se consideran una importante herramienta para resolver problemas
de limpieza de virus en otras especies leosas frutales o forestales; se pueden
aplicar adems a pices de origen diverso como los de plantas infectadas por
patgenos sistmicos, los de callos organognicos, los dc embriones
somticos, los de embriones inmaduros, y otros.

Refuerzos como la termoterapia la quimioterapia, o ambas, podran utilizarse

incluso durante los perodos de cultivo in vitro o de pretratamiento de los
pices; stos podrn cultivarse luego directamente o microinjertarse in vitro o in
vivo, aumentando as las posibilidades de eliminacin de patgenos sistmicos.
El porcentaje de plantas libres de virus, regeneradas mediante algunos de
estos mtodos, podra aumentar considerablemente si se cuenta adems con
tcnicas de propagacin masiva o de micropropagacin para multiplicar las
plantas (o la planta) obtenidas de los pices (Figura 23.6) mediante
microestacas, por ejemplo (Mosella et al., l980).

3.2. MICROPROPAGACION
Micropropagacin de plantas.
Es el conjunto de tcnicas y mtodos de cultivo de tejidos utilizados para multiplicar plantas
asexualmente en forma rpida, eficiente y en grandes cantidades.
Se utiliza para multiplicar o propagar plantas nuevas, tales como aquellas creadas por la
Ingeniera Gentica, Mutagnesis o mejoramiento gentico. Se utiliza tambin la
micropropagacin para obtener plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener
grandes cantidades de plantas que no se propagan eficientemente.

3.2.1. DESCRIPCIN E IMPORTANCIA

Descripcin:
La micropropagacin consiste en la propagacin de un genotipo a gran escala a travs del
empleo de tcnicas de Cultivo de Tejidos. Es una herramienta muy til en los programas de
mejoramiento, ya que tiene el potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala
comercial, a partir de un genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada.
Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas vegetales; esto es
la capacidad de regenerar una planta completa cuando estn sujetas a los estmulos
adecuados. As, las clulas somticas de cualquier tejido podran formar tallos, races o
embriones somticos de acuerdo con la competencia que posean y al estmulo que reciban.
Esta regeneracin ocurre en fases consecutivas:
Fase de desdiferenciacin, donde las clulas se vuelven competentes para responder ante
cualquier estmulo organognico o embriognico.
Fase de induccin, donde las clulas se determinan para formar un rgano o embrin.
Fase de realizacin, donde se forma el rgano o embrin propiamente dicho.
Estas fases estn directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo
cual la optimizacin de los protocolos de regeneracin debe realizarse teniendo en cuenta los
requerimientos intrnsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo. As, en general, puede
decirse que el proceso de desdiferenciacin generalmente es promovido por una Auxina, la
fase de induccin por un balance hormonal especfico del rgano o embrin a formarse y la
fase de realizacin, por una disminucin de la concentracin hormonal en el medio de cultivo.
Importancia:
La propagacin de plantas in vitro o micropropagacin, es una tcnica muy utilizada en cultivos
de importancia econmica. Los cultivos son realizados por personal especializado, con agentes
especficos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente gelificante, agua, etc.)
y en condiciones ambientales controladas (temperatura, humedad y luz).
Los pasos son:
Eleccin de la planta original donante de explantos.
Obtencin y desinfeccin de los explantos.
Adaptacin de explantos al medio de cultivo.
Formacin de races con el fin de convertir los brotes en plntulas completas
Aclimatacin de las plntulas obtenidas in vitro a las condiciones medioambientales ex
vitro (en suelo, por ejemplo).
Las ventajas de este mtodo es que permite obtener muchos individuos iguales en una
pequea superficie, controlar las condiciones ambientales, estudiar diversos procesos de las
plantas y evita el riesgo de que proliferen agentes patgenos (se realiza en medios
esterilizados). Constituye uno de los mtodos que mayores logros ha aportado al desarrollo de
la agricultura. Se aplica en la produccin masiva de especies hortcolas, aromticas,
medicinales, frutcolas, ornamentales y forestales.

3.3.2. CULTIVO DE MERISTEMOS APICALES

Cultivo de meristemas
En la yema apical se encuentra un grupo de clulas que conforman el meristema apical (con un
tamao entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar todos
los tejidos de la planta y regenerar plantas completas (figura 7).

El cultivo de meristemos tiene numerosas aplicaciones. Una de las ms importantes, es la

obtencin de plantas libres de virus, ya que esta pequea zona de tejido generalmente no est
afectada por estos patgenos vegetales. Otra aplicacin es la multiplicacin vegetal de enorme
potencial: a partir de una yema apical, se pueden obtener 4 millones de claveles en un ao.
La tcnica permite multiplicar especies de plantas con reproduccin lenta o dificultosa (como
las orqudeas), o acelerar la produccin de plantas bianuales.

3.3.3. CULTIVO DE APICES MERISTEMATICOS

La regeneracin de plantas sanas partiendo de cultivos in vitro de pices meristemtico de
ciertos vegetales exige la bsqueda de tcnicas complejas y su empleo acertado. Estas
tcnicas permiten al explante sortear frecuentes dificultades como la oxidacin, la
heterogeneidad de respuestas, la reversin al estado juvenil, la presencia de inhibidores de
enraizamiento y sobre todo la sobrevivencia al trasplante en condiciones auttrofas. Buscando
la mejor respuesta del pice meristemtico de algunos, plantas Murashige et al. (1972) y
Navarro et al. (1975) plantearon la posibilidad del microinjerto in vitro de pices sobre plntulas
provenientes de semillas, logrando as el desarrollo de plantas libres de numerosos virus. Una
tcnica denominada microinjerto in vivo de pices meristemtico pre tratados in vitro, fue
propuesta por Mosella et al. (1980), con esta tcnica se lograron obtener plantas sanas de
Prunus prsica L. Batsch y son menos complicaciones que con la tcnica original in vitro. En
1983, Ascui aplico estos nuevos procedimientos a diversos ctricos y obtuvo resultados
promisorios que esperan los indizajes virolgicos correspondientes.
Los meristemas apicales o primarios son los responsables de la formacin del cuerpo primario
de la planta. Se encuentran en los pices de races y tallos, principales y laterales. En el tallo,
el meristema apical o cono vegetativo est protegido por los primordios foliares que lo
envuelven formando las yemas. El meristema primario de raz presenta una particularidad: est
protegido por la caliptra contra los daos mecnicos causados por el suelo. Por presentar
este tejido, el meristema del pice radical suele llamarse subapical. Adems, las
races laterales son endgenas y se originan en zonas ya diferenciadas. Protegido por los
primordios foliares que lo envuelven formando las yemas.

3.3.4. CULTIVO DE EMBRIONES

El cultivo de embriones se ha usado para diferentes propsitos, como los de estudiar los
requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo, rescatar embriones hibrido que se
hayan derivado de cruzamientos interespecficas, producir monoploides y superar la latencia de
las semillas. Igualmente, el cultivo de vulos intactos se ha empleado para el rescate de
embriones (mediante la polinizacin y fertilizacin in vitro) y para inducir embriognesis
somtica a partir de nucelas de algunas especies de plantas. El desarrollo de los embriones
vegetales se caracteriza por 2 estados distintos: el estado temprano que es heterotrfico y el
estado tardo que es autotrfico. Los embriones globulares heterotrficos se desarrollan a
expensas del endospermo y poseen una baja capacidad de ciertos nutrimentos como
hormonas, aminocidos, carbohidratos, vitaminas, purinas y pirimidinas que se encuentran en

el saco embrionario. Con la formacin de los cotiledones, el embrin pasa a ser auttrofo y se
pueden aislar de los vulos y cultivarse in vitro en un medio relativamente simple, que contenga
pequeas cantidades de unos pocos nutrimentos. Diversos estudios con cruzamientos
interespecficas demostraron la importancia del normal desarrollo del endosperma en el
desarrollo del embrin.
Hanning (1940) fue el primero en demostrar que es posible remover de los vulos de la plantas
los embriones de cigotos maduros, y cultivarlos en un medio estril que contenga los
nutrimentos esenciales; en este medio los embriones se pueden desarrollar normalmente y
germinar. Laibach (1925; 1929) obtuvo cultivos relativamente exitosos de embriones hbridos
maduros procedentes del cruzamiento incompatible de Linum perenne x L. austriacum y de
ellos recupero plantas normales. El cultivo de embriones ha sido efectivo en el mejoramiento de
la cebada al permitir rescatar los embriones que resultan de la hibridacin entre Hordeum
vulgare y H. bulbosum; el hibrido es resistente a las bajas temperaturas in vernales a al mildeo.
Mediante la aplicacin de esta tcnica se han logrado algunos cruzamientos intergenricos.
Otra aplicacin del cultivo de embriones es el rescate de material de propagacin en los
frutales cuyas semillas son generalmente de baja viabilidad; tambin ha servido para obtener
hbridos en especies como peras y albaricoques en las cuales se presenta aborto de los
embriones. El cultivo de embriones ha ayudado al mejoramiento gentico de especies de
arbreas porque acorta el periodo siembra-floracin; embriones cultivados in vitro no necesitan
un periodo de latencia anterior a la germinacin. Asimismo, ha sido efectivo para acortar el ciclo
de mejoramiento de Iris spp., porque acorta el periodo de latencia de las semillas que oscilan
entre unos pocos meses y varios aos; esta latencia se debe a algunos inhibidores del
crecimiento del embrin presente en el endospermo y en la cubierta de la semilla. Por medio
del cultivo de embriones es posible acortar la latencia y producir plntulas para el trasplante a
las 2 o 3 semanas.
Raghavan(1976), en una revisin de los avances realizados en el cultivo de embriones de
varias especies econmicamente importantes, seala entre ellos los siguientes: la hibridacin
entre algodn americano tetraploide y algodn asitico diploide (Joshi et at., 1966);
la obtencin de hibridos del cruzamiento incompatible entre Lycopersicon esculentum y L.
peruvia- num (Smith, 1944; Choudhury, 1955; Alexander, 1956); y la trasferencia, en el tomate,
de resistencia al mosaico y al virus del marchitamiento asi como a varias enfermedades
producidas por hongos y por el nematodo de la raz.
El cultivo de embriones ha sido efectivo en el mejoramiento de la cebada, al permitir rescatar
los embriones que resultan de la hibridacin entre Hordeum vulgare y H. bulbosum-, el hibrido
es resistente a las bajas temperaturas invernales y al mildeo (Konzak et a1., 1951). Mediante
la aplicacin de esta tcnica se han logrado algunos cruzamientos intergenricos; por
ejemplo, Cooper et at. (1944) cruzaron Hordeum jubatum con Secale cereals, un cruzamiento
en el cual el desarrollo embrionario in vitro termina de 6 a 13 das despus de la fertilizacin.
3.3.5. MICROINJERTO
Es una tcnica utilizada actualmente en ensayos de revigorizacin, orientados principalmente a
la clonacin de materiales adultos seleccionados libres de contaminacin el material vegetal
adulto es propagado vegetativamente in vitro, cultivado e un medio MS con reguladores de
crecimiento.
pasos para la obtencin del microinjerto:

Preparacin del patrn

Preparacin del injerto
Realizacin del microinjerto
Mantenimiento de la planta
Trasplante

3.3.6. FACTORES QUE AYUDAN A INCREMENTAR LA

POSIBILIDAD DE OBTENER PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS
Recuperacin de plantas libres de patgenos.

Muchos cultivos comerciales vegetales, particularmente los que son propagados

vegetativamente, contiene virus sistemticos, los cuales afectan su funcionamiento o abaten su
rendimiento. Por tanto, antes de librarse comercialmente es deseable producir plantas libres de
virus, que pueden ser clonalmente multiplicadas.
En muchas especies lo anterior puede lograrse con tratamientos con calor de varios rganos in
vitro, o de plantas compuestas, as como con la aplicacin de productos qumicos (Hollings,
1965). Sin embargo, ciertos virus han resistido todas las pruebas de erradicacin por estos
medios y se hacen necesarias otros mtodos.
Actualmente la alternativa de ms xito es el cultivo de meristemos apicales, frecuentemente
combinado con quimioterapia o con tratamientos de calor. Cuando estos mtodos son usados,
las plantas no solo son liberadas del virus, sino tambin de hongos y otros patgenos.

3.3.7. APLICACION AGRONOMICA

Aplicaciones de la tcnica:

Se ha demostrado que la microinjertacin es la forma ms eficaz de obtener

propagacin de plantas libre de patgenos.

Este mtodo resulta ser muy til en las investigaciones con Fito mejoramiento y
el intercambio internacional de germoplasma.

Gracias a esta tcnica a sido posible separar e identificar los patgenos y sus razas
que se encuentran en una misma planta

3.5. CONSERVACION IN-VITRO

Esta actividad facilita principalmente la conservacin de los genes (en genotecas) y de los
genotipos. Las genotecas pueden formarse dejando el DNA desnudo en los plsmidos o
incorporndolo a ciertas bacterias. Los genotipos se conservarn mediante el cultivo de pices,
de nudos o de cualquier otro explante regenerativo.
La conservacin in vitro tiene que considerarse como parte de la estrategia general de
conservacin de una especie vegetal; es ms bien un auxiliar valioso y un suplemento de la
conservacin de los recursos genticos. Solo ocasionalmente, el almacenamiento in vitro sera
la nica estrategia para conservar una especie dada. Para algunos frutales tropicales como el
cacao (Theobroma), la estrategia principal de conservacin estara probablemente en los
bancos genticos in vitro que se utilizan las tcnicas in vitro para evaluar la variabilidad
gentica de la especie, y para la coleccin e intercambio de esta. Los cultivos de races y
tubrculos, como papa, yuca y batata (Ipomoea), se almacenaran como semillas durante
cortos periodos, de modo que, para ellos, los mtodos in vitro serian complementarios para la
conservacin de genotipos especficos y para el traslado internacional de clones. Para otros
cultivos de tubrculos y races tropicales y para especies de frutales como Mula sp., que rara
vez producen semilla y son prcticamente estriles, el almacenamiento in vitro y los
bancos genticos ex situ en el campo estaran probablemente a la par. Por ltimo, en las
especies tropicales de semilla recalcitrante, la coleccin y el intercambio de materiales in vitro
tendrn una funcin bsica.
3.5.1. ASPECTOS IMPORTANTES EN LA CONSERVACION IN-VITRO
Es grande el rango de especies vegetales cultivadas cuya conservacin es accesible a las
tcnicas
in vitro. La conservacin de los recursos filogenticos mediante los mtodos del cultivo in vitro
se logra haciendo como es en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir totalmente el
crecimiento de las clulas y de los tejidos; el objetivo es aumentar al mximo el perodo de
trasferencia del cultivo o entenderlo indefinidamente. No obstante, debe realizarse; como se
indic anterior- mente, una evaluacin cientfica cuidadosa dc las ventajas y desventajas de
una estrategia in vitro de la conservacin de recursos genticos para cada caso especfico.
ASPECTOS IMPORTANTES:

1.
2.
3.
4.

REGENERACION
VARIABILIDAD
ESTABILIDAD GENETICA
ESTRATEGIAS

3.5.1.1. REGENERACION
La regeneracin de plantas enteras basadas en los sistemas de cultivo de clulas es, a
menudo el paso que limita la aplicacin de tcnicas de cultivo in vitro a especies vegetales que
no se pueden propagar mediante meristemos preformados. A pesar de la capacidad que tienen
para iniciar callo diversos tejidos y rganos de muchas especies cultivadas, la regeneracin
reproducible de plantas enteras sigue siendo problemtica. La regeneracin adventicia
mediante la embriognesis somtica es muy deseable, ya que el proceso ofrece altas tasas de
multiplicacin y produce propngulos que poseen ejes de raz y de yema. Los embriones
somticos pueden desarrollarse de clulas nicas y se pueden recuperar plantas con genotipos
ms estables. (Evans et al., 1981)

3.5.1.2. VIABILIDAD
La evaluacin de la viabilidad de los cultivos in vitro se debe realizar sistemticamente. En
condiciones de crecimiento lento, en que el perodo de trasferencia se extiende durante meses
o aos, la frecuencia de evaluacin de los cultivos aumenta en comparacin con la evaluacin
que se hara al material conservado bajo nitrgeno lquido, por ejemplo. Las caractersticas
ms importantes que se evalan en el almacenamiento de crecimiento lento de cultivos
derivados del pice de yemas son: contaminacin, senescencia de la hoja (la razn hojas
verdes/ hojas muertas), nmero de brotes verdes (para micropropagacin adicional), nmero
de nudos viables (verdes) en relacin con la longitud del tallo (verde), presencia o ausencia de
races, y ocurrencia de callo.

3.5.1.4. ESTRATEGIAS
Es grande el rango de especies vegetales cultivadas cuya conservacin es accesible a las
tcnicas in vitro. La conservacin de los recursos fitogenticos mediante los mtodos del cultivo
in vitro se logra haciendo cambios en el ambiente de cultivo para desacelerar o suprimir
totalmente el crecimiento de las clulas y de los tejidos; el objetivo es aumentar al mximo el
perodo de trasferencia del cultivo o entenderlo indefinidamente. No obstante, debe realizarse;
como se indic anterior- mente, una evaluacin cientfica cuidadosa de las ventajas y
desventajas de una estrategia in vitro de la conservacin de recursos genticos para cada caso
especfico.
Se han propuesto dos tipos de conservacin in vitro de los bancos genticos (Withers y
Williams,1985):
a) el banco gentico in vitro activo (IVAG, en ingls) donde los cultivos se mantienen en
crecimiento lento.
b) el banco gentico in vitro bsico (IVBG, en ingls) donde los cultivos son crioconservados. El
IVAG se est desarrollando, en alto grado, para las especies yuca, papa, batata, banano y caa
de azcar, y constituye una coleccin de trabajo; su contraparte estara representada por la
coleccin de campo y por la coleccin de semilla sexual almacenada a corto plazo. El IVBG
constituye una coleccin bsica, es decir, conservada en plazos largos y no activa o de trabajo
ya que la criopreservacin no se ha desarrollado an plenamente en ningn cultivo; este banco
permite un mantenimiento total de la estabilidad genotpica del germoplasma, y su contraparte
estara representada por la coleccin de semilla sexual mantenida bajo almacenamiento a largo
plazo.

3.5.2. METODOS DE CONSERVACION

Hay dos sistemas bsicos de conservacin del germoplasma in vitro son:
A) mediante la limitacin del crecimiento hasta tasas mnimas.
B) mediante la supresin total del crecimiento y del metabolismo celular.

3.5.2.1. FACTORES QUE LIMITAN EL CRECIMIENTO

La tasa de crecimiento de los cultivos in vitro puede controlarse empleando, principalmente, los
siguientes factores: temperatura, nutrimentos inorgnicos y orgnicos, reguladores de
crecimiento, y concentracin osmtica del medio.
Otros factores, como el tamao de los tubos de ensayo o de los frascos, la calidad y
concentracin del agente gelificante, la adicin de carbn activado al medio, la limitacin de la
oxigenacin, la intensidad de la luz y del fotoperiodo, entre otros, son tambin importantes en el
control del crecimiento.
Temperatura:
La reduccin de la temperatura ha sido el recurso ms comnmente utilizado para disminuir el
crecimiento de los cultivos. La mayora de los cultivos in vitro son mantenidos a temperaturas
entre 20 0C y 30 C; a temperaturas ms bajas la tasa de crecimiento disminuye, pero esta
reduccin depende de la especie en cuestin (Withers, 1980).
Concentracin de nutrimentos:
La relacin entre la concentracin de carbohidratos y los componentes nitrogenados del medio
nutritivo puede tener efectos sobre las tasas de crecimiento y la morfognesis en los cultivos in
vitro (Staritsky, 1980). La sacarosa tiene, igualmente, un efecto en la viabilidad de los cultivos:
concentraciones muy tas o.muy bajas de ese azcar resultan nocivas para la conservacin de
los tejidos in vitro.
Concentracin de los reguladores del crecimiento:
Los niveles de citoquininas y de inhibidores del crecimiento, como el cido abscesico,
interaccionan con la concentracin de sacarosa y con la temperatura de conservacin y afectan
as la viabilidad de los cultivos in vitro (Roca, 1985).
Entre los reguladores del crecimiento empleados por. los investigadores figuran el acido
abcisilico (ABA), el cloruro de fosfonio o clorfoniom (Phosphon-D), la hidrazida maleica o
daminazida (B995), el cicocel o 2-cloroetl-cloruro de trimetil (CCC); el cido N-dimetil succnico
y el ancimidol (Nam et ., 1979); y el cido acctil salicflico, ASA(Lpez, 1985).
Concentracin osmtica:
La limitacin del crecimiento por causa de la concentracin osmtica se debe, posiblemente, a
la reduccin de la absorcin de agua y de nutrimentos del medio. Puesto que es altamente
metabolizable, la sacarosa acta osmticamente en concentraciones altas. Otros agentes
osmticos difciles de metabolizar, como el manitol y el sorbitol, son posiblemente ms
efectivos que la sacarosa en la limitacin del crecimiento de los cultivos, pero se debe tener en
cuenta que estas sustancias interaccionan con el contenido de sacarosa. y con la temperatura
de conservacin.

3.5.2.2. SUPRESION DEL CRECIMIENTO

Como se discuti antes, siempre existe un riesgo, mayor o menor, de inestabilidad citogentica
cuando se conserva el germoplasma mediante el cultivo de tejidos in vitro a largo plazo. Este
riesgo se puede minimizar utilizando tejidos organizados (meristemas, yemas y cultivos
derivados) y reduciendo la tasa de crecimiento mediante la .temperatura baja.
Conforme se reduce. la temperatura de un tejido, el metabolismo celular disminuye hasta llegar
a un estado de suspensin animada cuando la temperatura alcanza niveles inferiores a -150 0
C; a esta temperatura, los procesos biolgicos han cesado y las posibles causas de
inestabilidad se habrn, por tanto, minimizado o eliminado. Este tema se trata con mayor
detalle en el Captulo 13 de esta obra.
3.5.2.3. CRYOCONSERVACION DEL GERMOPLASMA
La crioconservacin de plantas es un proceso consistente en la preparacin, mantenimiento y
preservacin a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra
bajas de 196 C, obtenidas mediante nitrgeno lquido (NL). Este mtodo de conservacin de
material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservacin de
recursos filogenticos: es un mtodo rpido, sencillo, no altera la estabilidad gentica del
material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento

de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano
de obra y evitar los riesgos fitopatolgicos y fisiolgicos que habitualmente aparecen en el
mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que sealar el importante ahorro
de espacio que supone mantener una coleccin de especies hortcolas o leosas en pocos
metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.
La crioconservacin, que describimos a continuacin, puede ser aplicada ventajosamente a la
conservacin de especies y variedades vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las
colecciones y bancos de germoplasma clsicos (bancos de semillas, colecciones en campo).}
Existen dos mtodos de congelacin. Podemos hablar de un mtodo de congelacin lento, y un
mtodo de congelacin rpido.
1. El mtodo de congelacin lento, tambin llamado mtodo convencional de
precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470].
2. En el mtodo de congelacin rpido o simple, el material vegetal se congela
inicialmente a 40 C, para pasarlo posteriormente al NL.

5.1.1. SOUTHERN Y 5.1.2. NORTHERN

La hibridacin Southern blot (SB)
Necesita de la extraccin del ADN de la muestra con fenol/cloroformo y de la eliminacin de
ARN y protenas de la misma por digestin enzimtica. Con la aplicacin de endonucleasas de
restriccin-la enzima Pst I es la ms utilizada, pues corta los genomas en fragmentos de
diferentes tamaos ofreciendo un patrn caracterstico en el gel de agarosa-el ADN se rompe,
realizndose una separacin electrofortica de los fragmentos en gel de agarosa los cuales
pueden ser visualizados con bromuro de etidio. El ADN se desnaturaliza y se transfiere a una
membrana realizndose una hibridacin. El SB es el mtodo de referencia actual de. La
especificidad de esta tcnica es superior a cualquier otra debido a la purificacin extra del ADN
por electroforesis. Adems es el nico mtodo que permite conocer si el genoma viral est en
situacin episomal o integrado en el ADN celular. Las desventajas fundamentales del SB son su
gran complejidad tcnica, duracin de la misma y la necesidad de utilizar tejidos no fijados,
puesto que existen protocolos para material fijado, su sensibilidad se reduce muy
notablemente.

UNIDAD 4: ADN RECOMBINANTE

La hibridacin Northern
se utiliza para la detccin de RNA. El ARN celular se extrae y se separa por medio de un gel
desnaturalizante que contiene formaldehido. Seguidamente se hibridan con sondas ARN
antisense o ADN.
Northertn Blot: pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis y Gelfand, 1990). En sntesis,
la tcnica consiste en extraer el RNA de las clulas pertinentes y su posterior separacin por
tamao mediante electroforesis en gel. Las molculas de RNA son transferidas y unidas al filtro,
al igual que en el Southern blot. Despus de la hibridacin con una sonda marcada (y posterior
a la deteccin segn el mtodo de marcaje utilizado), las bandas en el que indican la ubicacin
de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de
tamao adecuado, se puede conocer el tamao de los RNA que se han identificado. As, la
tcnica permite conocer el tamao preciso de un RNA, luego del empalme transcripcional.
Adems, sirve para identificar diferentes tipos de RNA codificados por un mismo gen y para
determinar la cantidad y el tejido especfico (o tipo de clulas) en que se encuentra un RNA
especfico. As, ser posible determinar los niveles de actividad gnica, por ejemplo durante el
desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un perodo definido dela vida, o

despus de haber sido sometido a los organismos a diferentes estmulos fisiolgicos (Russel,
1998).
Es una tcnica muy similar al Southern Blot que permite la identificacin de secuencias
especficas de RNA. La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentacin y se somete a
electroforesis en geles de agarosa, donde las molculas de RNA se separan desde mayor a
menor tamao. Una vez terminada la electroforesis, y sin teir el gel, los fragmentos se
traspasan a un filtro de nitrocelulosa a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una
sonda marcada, especfica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una
secuencia de cido nucleico, por ejemplo DNA, que reconocer a la secuencia de RNA
inmovilizada en el filtro, a travs del reconocimiento de secuencias complementarias de cidos
nucleicos.
En todos los sistemas de hibridacin descritos anteriormente el cido nucleico diana est
localizado en un soporte slido, bien una membrana o una biopsia o extendido citolgico, en los
procedimientos que seguidamente describiremos el cido nucleico se encuentra disuelto en un
lquido.

Detalle de la tcnica de Southern

Esta tcnica fue descrita por el Dr. Southern en 1975 y constituye el mtodo ms utilizado para
analizar la estructura del ADN cortado por enzimas de restriccin. Para la realizacin de esta
tcnica se debe extraer ADN genmico, se pueden extraer de 200 a 300 nanogramos de ADN
con lo que se pueden realizar de 20 a 30 "digestiones" con enzimas de restriccin.

Despus de dicha digestin, el aproximadamente milln de fragmentos de ADN obtenidos, se

separan entre s, segn su tamao, en un gel de agarosa, sometido a un campo de corriente
continua en una cubeta de electroforesis. El ADN posee una carga elctrica negativa por lo que
se desplaza hacia el polo positivo. Los fragmentos ms pequeos se desplazan a mayor
velocidad que los ms grandes (Fig.)

Figura 2.13. Representacin esquemtica de la tcnica de Southern Blotting para el estudio de

las secuencias especficas en el ADN genmico.

Con el electroforesis convencional se separan fragmentos entre 100 y 30.000 pares de bases.
Cuando se marca con un colorante fluorescente (bromuro de etidio), el ADN separado de esta
forma, aparece como una mancha homognea de material fluorescente debido a que existen
demasiados fragmentos de ADN como para que puedan diferenciarse entre s.
La tcnica de Southern Blotting permite identificar uno o dos fragmentos de ADN de inters en
el aparentemente uniforme coleccin de milln de fragmentos cortados con la enzima de
restriccin. El siguiente paso consiste en la desnaturalizacin de los fragmentos de cadena
doble para obtener fragmentos de cadena nica. Esto se logra con un bufer de Ph bsico.

La molcula de cadena nica es transferida desde el gel a una membrana de niln o a papel de
nitrocelulosa, ayudado por capilaridad.
La identificacin de uno o ms fragmentos de inters se logra con una sonda especfica
marcada con radioactividad o colorimetra. La sonda marcada se incuba con el filtro de niln o
nitrocelulosa en una solucin que favorece la formacin de ADN de doble cadena. Despus de
lavar el filtro, para retirar la sonda que no se uni a su cadena complementaria, el filtro se
expone a un film de Rx durante 24 a 48 horas, para observar la posicin de uno o ms
fragmentos a los que la sonda ha hibridizado, lo que se observa como una banda negra
despus del revelado. (Fig. )

4.1. TRASFORMACION DE ORGANISMOS

La tecnologa del DNA recombnate es una tcnica que ha permitido introducir material gentico
forneo en un individuo, y hacer que ste organismo incorpore dicho material a su genoma y lo
exprese como si fuera suyo. Esta tecnologa desarroll a partir del descubrimiento de las
enzimas de y su accin sobre los cidos nucleicos.
La recombinacin gentica es un proceso biolgico que se produce normalmente en todos los
organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma (patrimonio gentico del que est
dotado un organismo) y se verifica normalmente con la rotura y la reunin del ADN. Hoy es
posible crear molculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homologa
y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de
restriccin y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier
organismo e inserirla en el ADN de otro. Las formas vivas que han sufrido tal transformacin y
que contienen un ADN extrao son llamadas transgnicas. Es quizs necesario abrir un
parntesis para aclarar el hecho de que la clonacin. de la oveja Dolly no se ha obtenido con
tcnicas de ingeniera gentica. Dolly es solamente un gemelo idntico, como los que se
observan en la naturaleza, aunque estos ltimos son "ms" idnticos en cuanto que comparten

tambin el material gentico contenido en las mitocondrias. Las tcnicas de clonacin que
permiten obtener gemelos idnticos consisten en sustituir el ncleo de la clula madre por un
ncleo de un donante del cual se quiere hacer una copia.
La clula obtenida de este modo dar origen a un embrin cuyas mitocondrias contendrn el
ADN de la clula madre y no el contenido en las mitocondrias del organismo del cual se ha
querido hacer la copia. En caso de gemelos idnticos obtenidos naturalmente, los dos
individuos comparten todo el patrimonio gentico incluido el mitocondrial. Cerrado este
parntesis necesario para subrayar la diferencia entre ingeniera gentica y clonacin, en la
que no se manipula el ADN y no se interviene en el orden gentico de los organismos,
pasamos a describir los vectores moleculares necesarios para las operaciones de ingeniera
gentica.