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Cincia Animal, 11(2):101-112, 2001

CRIOPRESERVAO DE OCITOS MAMFEROS: IMPORTNCIA, ESTADO ATUAL,


LIMITAES E PERSPECTIVAS
(Cryopreservation of mammalian oocytes: importance, state-of-art, limitations and perspectives)
Ana Paula Ribeiro RODRIGUES, Christiani Andrade AMORIM, Alline Ferreira BRASIL & Jos
Ricardo de FIGUEIREDO
Laboratrio de Manipulao de Ocitos e Folculos Ovarianos Pr-antrais LAMOFOPA/ Universidade Estadual do Cear

RESUMO
A utilizao de biotecnologias reprodutivas como a fecundao in vitro, a inseminao artificial e a transferncia
de embries associadas tcnicas de criobiologia oferece uma oportunidade para aumentar e apoiar estratgias
para a conservao da biodiversidade. A presente reviso mostra os fundamentos bsicos, importncia, estado
atual e limitaes da criotecnologia para programas de reproduo, bem como os principais resultados da
criopreservao de ocitos oriundos de folculos pr-antrais.
PALAVRAS-CHAVE: criopreservao, crioprotetor, ocitos, tecido ovariano, folculos pr-antrais

ABSTRACT
The use of reproductive biotechnologies such as in vitro fertilization, artificial insemination and embryo transfer
associated with cryobiological techniques offers the opportunity to improve and support strategies for conservation
of biodiversity. The present review shows the fundamental aspects, importance, state-of-art and limitations of the
cryotechnology for assisted reproduction programmes, as well as the main results of the cryopreservation of
oocytes enclosed in preantral follicles.
KEY WORDS: cryopreservation, cryoprotectant, oocytes, ovarian tissue, preantral follicles

INTRODUO
Nas duas ltimas dcadas, estudos relacionados
biotecnologia reprodutiva tm permitido avanos
significativos na rea do conhecimento cientfico,
contribuindo de forma significativa para a conservao
da biodiversidade (HOLT, 1998). Uma prova disso
o atual crescimento da biotcnica de manipulao de
ocitos inclusos em folculos ovarianos pr-antrais
(MOIFOPA), que visa a otimizao do potencial
reprodutivo de animais de alto valor gentico e/ou em
via de extino. Alm das etapas de isolamento e cultivo
folicular in vitro, a biotcnica de MOIFOPA abrange
tambm a criopreservao dos ocitos inclusos nestes
folculos. Associada a outras biotecnologias
reprodutivas, como a fecundao in vitro e a
transferncia de embries, a criopreservao de ocitos
inclusos em folculos pr-antrais pode ser utilizada para

assegurar a fertilidade humana, bem como conservar o


material gentico de animais de alta produo ou
elevado valor zootcnico ou ainda de espcies raras
(RAYOS et al., 1994).
A criotecnologia tem sido bastante utilizada para
a preservao de material gentico como smen,
embries e ocitos oriundos de folculos antrais, visando
a constituio de bancos de germoplasma animal,
assegurando desta forma a preservao das espcies.
Embora inmeros protocolos de criopreservao j
tenham sido desenvolvidos em muitas espcies animais
(camundongos GUNASENA et al., 1997a,b;
COOPER et al., 1998; ratos SUGIMOTO et al.,
1996; humanos HOVATTA, et al., 1996; ovinos
GOSDEN et al., 1994; bovinos PAYNTER et al.,
1999), o sucesso da criotecnologia ainda continua
limitado. Baseado nisso, muitos investigadores tm
trabalhado no sentido de desenvolver um protocolo
101

de congelao ideal que mantenha a viabilidade


oocitria aps a descongelao.
O objetivo do presente trabalho descrever
os fundamentos bsicos, importncia e limitaes da
criotecnologia. Sero abordados tambm os principais
resultados da criopreservao oocitria, com nfase
aos ocitos oriundos de folculos pr-antrais.
Populao e atresia folicular
No ovrio mamfero a populao de ocitos
estabelecida ainda na vida fetal (primatas, ruminantes
BETTERIDGE et al., 1989) ou em um curto perodo
de tempo aps o nascimento (roedores HIRSHFILD,
1991). A grande maioria, 90%, (ERICKSON, 1986)
destes ocitos so extremamente pequenos e imaturos,
ncleo estacionado em prfase I da meiose,
circundados por uma camada de clulas somticas,
precursoras das clulas da granulosa, formando os
folculos primordiais (SHAW et al., 2000), os quais
constituem o pool de reserva, folculos quiescentes ou
em repouso (BECKERS et al., 1996) do ovrio. O
folculo a unidade funcional do ovrio mamfero
(GORE-LANGTON & ARMSTRONG, 1994),
sendo a populao folicular ovariana bastante
heterognea (SAUMANDE, 1981). De acordo com
o grau de evoluo, os folculos podem ser divididos
em: a) folculos pr-antrais ou no cavitrios e b)
folculos antrais ou cavitrios. Os folculos pr-antrais
so assim denominados por no possurem no seu
interior uma cavidade repleta de lquido folicular
denominada antro e, so constitudos pelos primordiais,
primrios e secundrios. J os folculos antrais, ou que
apresentam antro so constitudos pelos folculos
tercirios e de De Graaf (FIGUEIREDO, 1995).
O nmero total de folculos pr-antrais varia
entre espcies, sendo de aproximadamente 1.500 na
camundonga (SHAW et al., 2000); 33.000 na ovelha
(AMORIM et al., 2000); 35.000 na cabra (LUCCI et
al., 1999) e 2.000.000 na mulher (ERICKSON,
1986). Como nenhum novo folculo primordial
formado aps o estabelecimento do seu nmero,
ocorre uma reduo ordenada, geralmente exponencial,
no nmero de folculos pr-antrais ao longo da vida
reprodutiva da fmea (SHAW et al., 2000). Essa
reduo devido a dois fenmenos que ocorrem
naturalmente no ovrio, isto , a ovulao e a atresia
ou morte folicular. Somente uma pequena parte
102

(0,01%) dos folculos chega ao estgio de ovulao


(NUTTINCK et al., 1993), pois a sua grande maioria
(99,9%) torna-se atrsica durante as fases de
crescimento e maturao (CARROLL et al., 1990).
Importncia da criotecnologia
Conforme referido anteriormente e, tendo em
vista essa grande perda folicular e conseqentemente
oocitria que ocorre normalmente in vivo, vrios
pesquisadores tm conduzido seus trabalhos visando
maximizar o potencial fecundante das mais variadas
espcies mamferas. Na medicina humana, a meta
solucionar problemas reprodutivos ligados
infertilidade, enquanto que na medicina veterinria, o
objetivo primordial aumentar a produtividade de
animais de alto valor gentico, ou mesmo a preservao
de espcies raras ameaadas de extino, as quais
podem ser utilizadas para propagar e proteger a
biodiversidade (HOLT, 1998). Para isso, tem-se
lanado mo de biotcnicas cada vez mais inovadoras
como o caso da criotecnologia (CANDY et al., 1997,
NEWTON et al., 1998, VAJTA, 2000). Esta tcnica
permite a conservao da capacidade fecundante tanto
de clulas germinativas masculinas como femininas, alm
de preservar a sobrevivncia e a viabilidade
embrionria por longos perodos atravs da congelao
ou da vitrificao. A criopreservao de importncia
prtica para flexibilizar a utilizao de biotcnicas como
a fecundao in vitro, clonagem, transgnese e a
MOIFOPA para a constituio de bancos de
germoplasma animal (BGA). A constituio de BGAs
de grande importncia, pois possibilita a conservao
e utilizao posterior, medida que houver necessidade,
de milhares de ocitos oriundos de folculos pr-antrais,
obtidos a partir de um nico ovrio pertencente a
animais de alto valor zootcnico e/ou em perigo de
extino. A criotecnologia tambm de fundamental
importncia, uma vez que possvel demonstrar a
susceptibilidade de folculos pr-antrais aos efeitos
txicos de diferentes tipos e concentraes de
crioprotetores, bem como o comportamento desses
folculos frente aos protocolos de criopreservao.
Princpios bsicos da criopreservao
A criopreservao visa reduzir o metabolismo
celular durante a estocagem em baixas temperaturas,
tornando possvel a conservao de clulas e tecidos

por um perodo indeterminado (RALL, 1992).


Entretanto, para que isso seja possvel mesmo aps
longos perodos de conservao, vrios fatores
essenciais para a sobrevivncia celular devem ser
considerados. Dentre esses podem ser citados, o tipo
e concentrao de agentes crioprotetores, a taxa de
reduo da temperatura de resfriamento, a manuteno
da temperatura de estocagem, o procedimento de
descongelao e as tcnicas utilizadas para garantir a
remoo do crioprotetor aps a descongelao
(GORDON, 1994).
Por permitir a reduo do metabolismo celular
medida que a temperatura diminui, a criobiologia
possibilita maiores e melhores condies de
preservao (DE LA VEGA & WILDE, 1991). O
resfriamento progressivo e a conseqente formao de
cristais de gelo podem causar danos irreversveis ou
at mesmo a morte do material biolgico a ser
criopreservado. A criopreservao ocasiona
desnaturao da matria orgnica e perda do material
celular, como os sais, por exemplo. Durante a
descongelao, pode ocorrer perda de material celular
que determina reduo da capacidade funcional ou
morte da clula em casos extremos. Entretanto, esses
efeitos negativos podem ser evitados com a utilizao
de agentes ou substncias crioprotetoras que permitem
preservar clulas vivas, temperaturas extremamente
baixas durante anos (DE LA VEGA & WILDE, 1991).
Agentes Crioprotetores
Os agentes crioprotetores so solventes
orgnicos utilizados sozinhos ou em associao
(GUYADER-JOLY, 1998) e que agem protegendo a
clula durante o perodo de estocagem em baixas
temperaturas. Entretanto, para que a utilizao de um
crioprotetor proporcione resultados satisfatrios
necessrio que o mesmo apresente caractersticas
desejveis, como, alta solubilidade, baixo peso
molecular para que haja uma melhor permeabilidade
celular, no caso de crioprotetores intracelulares, baixa
toxicidade e alta estabilidade s temperaturas elevadas
(DE LA VEGA & WILDE, 1991). Os crioprotetores
so compostos muito hidrfilos e esto divididos em
trs classes: 1) permeveis ou intracelulares
crioprotetores de baixo peso molecular (ex.:
dimetilsulfxido (DMSO), etilenoglicol (ETG),
propanodiol (PROH), glicerol (GLI), metanol e

butanodiol); 2) impermeveis ou extracelulares de baixo


peso molecular (galactose, glicose, sacarose e trealose)
e 3) impermeveis ou extracelulares de elevado peso
molecular (polivinilpirrolidona, polivinil lcool,
hialuronato de sdio, albumina srica bovina e ficoll
70) (GUYADER-JOLI, 1998).
No que se refere ao mecanismo de ao,
acredita-se que os crioprotetores intracelulares ao
penetrarem na clula, interagem com a membrana
celular estabilizando-a e, conseqentemente, evitando
seu rompimento durante a congelao. Podem ainda
atuar como um tampo hiperosmtico, diminuindo os
efeitos de altas concentraes de molculas nas clulas
desidratadas (MASSIP et al., 1987). Os crioprotetores
intracelulares mais comumente utilizados so: DMSO,
PROH, ETG e GLI. O glicerol usado rotineiramente
para a estocagem de smen e tem a vantagem de ser
pouco txico. Entretanto, o mesmo pouco
recomendado para a criopreservao de gametas
femininos devido sua baixa solubilidade, sendo
substitudo pelo DMSO, PROH e o ETG em alguns
protocolos, pois estes crioprotetores possuem alta
solubilidade na gua e penetram rapidamente nas
clulas (OKTAY et al., 1998).
Os crioprotetores no permeveis de baixo e
elevado peso molecular podem ser utilizados
conjuntamente com os crioprotetores intracelulares para
controlar a reidratao celular no momento da
descongelao. Durante a descongelao, a
concentrao salina extracelular diminui medida que
o gelo derrete, portanto a gua tende a penetrar na
clula. Por outro lado, a concentrao do crioprotetor
no meio intracelular maior que no meio extracelular,
portanto, a tendncia do mesmo abandonar a clula.
Esta troca pode ser letal para a clula, pois a sada do
crioprotetor ocorre a uma velocidade muito mais lenta
do que a entrada de gua. A adio de um crioprotetor
de baixo peso molecular como a sacarose, ao meio de
diluio ou remoo do crioprotetor produz reteno
de gua no meio extracelular impedindo que esta
ingresse na clula mais rapidamente que a sada do
crioprotetor, diminuindo assim, os riscos osmticos (DE
LA VEGA & WILDE, 1991). Desta forma, sugere-se
que o efeito benfico da sacarose seja devido ao fato
desta substncia atuar como um tampo osmtico
contra o estresse sofrido pelas clulas durante a adio
e remoo dos agentes crioprotetores permeveis
103

(NEWTON et al., 1998).


Etapas do Processo de Criopreservao
O processo de criopreservao envolve
basicamente as seguintes etapas: 1) perodo de
equilbrio ou exposio aos agentes crioprotetores; 2)
resfriamento com induo da formao de gelo e
congelao; 3) estocagem em nitrognio lquido; 4)
descongelao e 5) remoo do crioprotetor
(FAHNING & GARCIA, 1992). O perodo de
equilbrio uma etapa extremamente importante para
que a clula ou tecido atinja um estado no qual as
concentraes de crioprotetor e gua, extra e
intracelular, tornem-se iguais (GUNASENA et al.,
1997a). Em alguns mtodos de criopreservao esta
fase extremamente curta ou no existe. No tocante
ao resfriamento, se este realizado muito rapidamente,
impede que a gua intracelular saia em quantidades
suficientes, formando assim os cristais de gelo no
interior da clula. Estes cristais de gelo aumentam de
tamanho no momento da descongelao, causando
injrias s estruturas celulares. Do contrrio, se o
resfriamento lento, a desidratao progressiva das
clulas acarreta uma elevao da concentrao de
eletrlitos no meio intracelular, modificando suas
propriedades fsico-qumicas, ocasionando,
conseqentemente, a perda da viabilidade celular. Com
a finalidade de evitar o aumento no nmero de cristais
de gelo, a descongelao dever ocorrer o mais rpido
possvel (BARIL & BREBION, 1993), sendo
normalmente realizada em banho-maria a 37C. Quanto
remoo do crioprotetor, esta pode ser realizada
submetendo-se a clula ou tecido a um (uma etapa) ou
vrios banhos (vrias etapas) sucessivos normalmente
de 5 a 15 minutos, utilizando-se meios na ausncia ou
na presena de crioprotetores. Aps a descongelao
celular, o crioprotetor deve ser retirado devido sua
toxicidade s temperaturas elevadas (NEWTON et al.,
1998). O tipo de crioprotetor utilizado, bem como a
sua concentrao (M = molaridade) pode variar com
a espcie (FAHNING & GARCIA, 1992), com o tipo
de clula e seu estgio de desenvolvimento. A Tab. 1
ilustra os tipos de crioprotetores, suas concentraes
e os mtodos de remoo que tm sido utilizados em
diferentes espcies e material biolgico criopreservado.

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Mtodos de Criopreservao
Na criotecnologia, o objetivo minimizar os
danos causados sobre as clulas durante as fases
envolvidas nos procedimentos de criopreservao.
Recentemente, dois principais mtodos tm sido
utilizados para a criopreservao de ocitos e tecido
ovariano (VAJTA, 2000). Esses mtodos so os
seguintes: congelao convencional ou lenta; e
congelao sem equilbrio ou vitrificao (BAUTISTA
& KANAGAWA, 1998).
A congelao lenta, na qual a reduo da
temperatura ocorre de modo gradual, um mtodo de
criopreservao que tem sido aplicado para a
conservao de embries (SHAW et al., 1995),
ocitos maturos (CARROLL et al., 1993; YOUNIS
et al., 1996) e imaturos (COOPER et al., 1998) e ainda
de tecido ovariano (CANDY et al., 1997) em vrias
espcies. Aps um perodo de equilbrio que pode variar
de 5 a 60 minutos (CANDY et al., 1997), o material
resfriado lentamente a uma velocidade de 2C/min at
- 4 a - 9C, mantendo-se nesta temperatura por um
curto perodo (10 a 15min) para a estabilizao trmica
e realizao do seeding (induo artificial da
cristalizao de gelo), no sentido de evitar o superresfriamento das clulas ou tecido (NIEAMANN,
1991). Em seguida, a amostra continua sendo resfriada
lentamente a uma velocidade de 0,3C/min. Neste
caso, o aumento dos cristais de gelo ocorre
extracelularmente, aumentando a concentrao de
soluto extracelular, causando uma desidratao
osmtica das clulas. Quando nesta fase a velocidade
de resfriamento maior do que 0,3C, alguns autores
denominam o processo de congelao rpida (DE LA
VEJA & WILDE, 1991). Uma vez que a desidratao
celular suficientemente atingida (entre -30 a -80C),
o material pode ser resfriado rapidamente sem
formao letal de gelo intracelular. Aps este
resfriamento rpido o material estocado em nitrognio
lquido. A congelao lenta uma tentativa de manter
o equilbrio entre as vrias fontes de danos, usando
uma baixa concentrao de crioprotetor e controlando
a formao de gelo (VAJTA, 2000).
A vitrificao, ao contrrio da congelao lenta
um mtodo mais radical, pois elimina totalmente a
formao de gelo (VAJTA, 2000), portanto, pode-ser

Tabela 1. Crioprotetores e seus mtodos de remoo em diferentes espcies e tipo de material.


criopreservado.

Crioprotetor
PROH/DMSO
DMSO
DMSO

Concentra
o
(M)

N0 etapas
p/ remoo
do
crioproteto
r

Material
biolgic
o

Animal

1,5

03

Ocito
maturo

Coelha

1,4

01

Ovrio

Camundong
a

1,5

03

Ovrio

Ovelha

1,5

03

Ocito

Vaca

3,5-8,0

03

Embrio

Camundong
a

1,5

03

Ovrio

Sagi

1,8

04

Ocito
imaturo

Vaca

1,5

03

FOPA

1,5

02

Ovrio

1,2

04

Ocito
imaturo

mulher

1,5

03

ovrio

camundonga

DMSO/PROH/GLI
PROH/DMSO
DMSO
ETG
DMSO
DMSO
PROH
DMSO/PROH/ETG/GL
I

Camundong
a
Camundong
a

Referncia
Vincent et
al., 1989
Harp et al.,
1994
Gosden et
al., 1994
Schellande
r et al.,
1994
Nowshari
et al., 1995
Candy et
al., 1995
Otoi et al.,
1995
Cortvrindt
et al., 1996
Cox et al.,
1996
Son et al.,
1996
Candy et
al., 1997

PROH/DMSO = propanodiol/dimetilsulfxido; DMSO = dimetilsulfxido; DMSO/PROH/GLI = dimetilsulfxido/propanodiol/glicerol; ETG =


etilenoglicol; DMSO/PROH/ETG/GLI = dimetilsulfxido/propanodiol/etilenoglicol/glicerol

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definida como um processo fsico pelo qual uma soluo


de crioprotetor altamente concentrada solidifica-se
durante o resfriamento, sem a formao de cristais de
gelo. Para auxiliar no super-resfriamento, uma soluo
de vitrificao, alm de conter um crioprotetor no
permevel, geralmente a sacarose, deve ser composta
pela associao de altas concentraes de pelo menos
dois crioprotetores permeveis. Quando esta soluo
composta por apenas um tipo de crioprotetor
permevel associado ao impermevel, alguns autores
denominam o processo de congelao ultra-rpida
(NIEMANN, 1991). A probabilidade de vitrificao
diretamente proporcional concentrao do
crioprotetor (BAUTISTA & KANAGAWA, 1998).
O slido formado chamado vtreo, retm as
distribuies molecular e inica normais do estado
lquido, evita os efeitos prejudiciais da cristalizao extra
e intracelular (ARAV et al., 1993) e, considerado
como um lquido super-resfriado extremamente
viscoso. Ao contrrio dos procedimentos convencionais
de congelao lenta, a vitrificao no requer controle
da curva de resfriamento e aquecimento em taxas
timas, necessitando apenas ser suficientemente rpida
para prevenir a cristalizao (RALL, 1987). O sucesso
da vitrificao j foi relatado em embries de
camundongos (RALL, 1987), ovinos (SCHIEWE et
al., 1991) e bovinos (MASSIP et al., 1986) e ocitos
de camundongos (NAKAGATA, 1989) e bovinos
(ARAV et al., 1993). Entretanto, a alta concentrao
de agentes crioprotetores requeridos para a soluo
de vitrificao pode ser quimicamente txica e causar
injrias osmticas aos ocitos (ARAV et al., 1993). A
intensidade da toxicidade qumica diretamente
relacionada concentrao, ao tempo e temperatura
de exposio s solues de vitrificao (RALL,
1987).
Estado atual da criopreservao de ocitos
No mbito da reproduo animal programada
em fmeas, tem sido extensivamente realizada a
criopreservao oocitria. Os ocitos criopreservados
podem ser de dois tipos, a saber: ocitos maturos
oriundos de folculos antrais (YOUNIS et al., 1996) e
ocitos imaturos oriundos de folculos pr-antrais in
situ, inclusos no tecido ovariano (OKTAY et al., 1998)
e isolados (JEWGENOW et al., 1998).

106

Criopreservao de ocitos maturos oriundos de


folculos antrais
WHITTINGHAM (1977) demonstrou que
ocitos maturos de camundongos podem ser
criopreservados com sucesso quando resfriados
lentamente em uma soluo de 1,5 M de DMSO.
Alguns anos mais tarde, CARROLL & GOSDEN
(1993) demonstraram que em condies apropriadas
para a congelao e descongelao, ocitos de
camundongos criopreservados so aptos fecundao
e podem desenvolver-se taxas similares aquelas
normalmente obtidas a partir de ocitos frescos. Estudo
realizado em coelhos no qual foi examinado o efeito
do PROH sobre o desenvolvimento e fecundao in
vivo de ocitos congelados, verificou-se que 39% (79/
200) dos ocitos congelados foram fecundados e 9%
(9/105) deram origem a fetos normais, comparado a
81% (38/47) e 32% (12/38), respectivamente para
ocitos no submetidos congelao (VICENT et al.,
1989). Em bovinos foi relatado o nascimento de um
animal normal aps fecundao in vitro de ocitos
previamente congelados e descongelados com
posterior desenvolvimento embrionrio in vitro (FUKU
et al., 1992).
Como pode-se constatar, embora j tenha sido
obtido sucesso com a criopreservao de ocitos
maturos, principalmente em camundongos, o
desenvolvimento de ocitos congelados e
descongelados, fecundados in vitro e o conseqente
desenvolvimento at o nascimento bastante varivel.
O ncleo dos ocitos maturos encontra-se estacionado
na metfase da segunda diviso meitica, condio em
que a clula torna-se uma unidade altamente organizada
j apresentando uma zona pelcida, cromossomos
alinhados ao longo de um delicado fuso de microtbulos
(fuso meitico) e grnulos corticais. A perda de alguma
destas estruturas, as quais so sensveis ao resfriamento
e solues crioprotetoras pode resultar em efeito
deletrio sobre a viabilidade celular ps-descongelao
(NEWTON, 1998).
Vrios estudos tm indicado que anormalidades
severas podem se desenvolver durante diferentes
estgios do processo de criopreservao, inclusive a
lise do ocito (WHITINGHAM, 1977). O fuso
meitico a nica estrutura do citoesqueleto que
transitria e, essencial para a separao dos

cromossomos durante a meiose (HARP et al., 1994).


O resfriamento pode originar anomalias cromossmicas
em ocitos maturos como um dos resultados dos efeitos
sobre o fuso meitico (AMAN & PARKS, 1994).
Durante a congelao e descongelao vrias organelas
celulares sofrem profundas mudanas, podendo ocorrer
tambm rearranjo do citoesqueleto e do fuso meitico;
agrupamento e migrao dos grnulos corticais
perifricos e endurecimento da zona pelcida
(CORTVRINDT et al., 1996). Entretanto, a grande
maioria dos problemas acima citados so observados
com menor freqncia pela criopreservao de ocitos
imaturos (NUGENT et al., 1997).

Criopreservao de ocitos imaturos oriundos de


folculos pr-antrais
Ocitos imaturos apresentam o material
cromossmico (cromatina descondensada) includo no
interior de uma vescula germinativa (NEWTON,
1998). Estes ocitos encontram-se no estgio de
diplteno da prfase I meitica, no possuem fuso
discernvel (HARP et al., 1994) e, alm disso, a
maturao citoplasmtica ainda no se encontra
completa (CORTVRINDT et al., 1996). Os ocitos
inclusos nos folculos pr-antrais, especialmente, os
primordiais so muito menores do que aqueles
totalmente maturos (metfase II), e menos diferenciados,
possuindo poucas organelas com zona pelcida e
grnulos corticais ausentes. Todas essas caractersticas
so potencialmente benficas criopreservao
(OKTAY et al., 1998). Desta forma, um problema
comumente encontrado, como por exemplo, a falha
dos espermatozides em penetrar no ocito em
decorrncia do endurecimento da zona pelcida, o qual
resulta em baixas taxas de fecundao (CARROLL et
al., 1993), poder ser evitado pela criopreservao
de ocitos imaturos (WOOD et al., 1992). CANDY
et al. (1994) demonstraram pela primeira vez, o
nascimento de camundongos aps a fecundao e
maturao in vitro e, transferncia embrionria a partir
de ocitos imaturos congelados e descongelados.
Outras experincias realizadas mostraram que ocitos
imaturos de humanos so aptos maturao meitica,
fecundao e desenvolvimento aps a criopreservao
(SON et al., 1996).

Criopreservao de folculos pr-antrais presentes


no tecido ovariano
O sucesso da criopreservao de tecido
ovariano tem sido amplamente demonstrado. Na
medicina humana (NEWTON et al., 1996; 1998) e
em animais de laboratrio (COX et al., 1996;
GUANASENA et al., 1997a,b), os pesquisadores tm
concentrado seus esforos para a criopreservao de
folculos pr-antrais in situ. Estes estudos tm
demonstrado por anlise histolgica, que folculos prantrais presentes no tecido ovariano aps a congelao
e descongelao apresentam-se morfologicamente
normais (HOVATTA et al., 1996). Desta forma, o
tecido ovariano congelado, contendo os folculos prantrais, pode ser utilizado posteriormente, para
transplantes. Em camundongos, o auto-transplante de
tecido ovariano congelado e descongelado em animais
com falha ovariana mostrou a restaurao da funo
endcrina (HARP et al., 1994), eliminando portanto,
o requerimento da terapia de reposio hormonal. Alm
disso, se o enxerto recolocado em stios ortotpicos,
a fertilidade pode ser restaurada. Camundongas
ovariectomizadas auto-transplantadas com tecido
ovariano fresco ou congelado e descongelado,
apresentaram ciclos estrais regulares ps-transplante
em 80 e 75% dos animais, respectivamente (HARP et
al., 1994). Tecido ovariano criopreservado de sagis
tambm tem sido transplantado sob a cpsula renal de
camundongas imunodeficientes. Nos enxertos
recuperados 21 a 32 dias depois, observou-se folculos
em todos os estgios da foliculognese (CANDY et
al., 1995). Resultados similares tambm foram obtidos
por HOVATTA et al. (1996) em humanos, utilizandose o DMSO e o PROH como crioprotetores. COX et
al. (1996) demonstraram que ovrios fetais congelados
e descongelados quando transplantados recuperaram
a fertilidade de camundongas, mostrando que 73 a 86%
dos animais gestaram. O transplante para um ambiente
diferente in vivo pode ser uma alternativa para a
constituio de bancos de tecido ovariano congelado
(NEWTON, 1998). Fragmentos de ovrio ovino
(GOSDEN et al., 1994) e primata no humano
(CANDY et al., 1995) enxertados sob a cpsula renal
de camundongos imunodeficientes, demonstrou
revascularizao e crescimento folicular. Ademais,
folculos presentes no tecido ovariano humano

107

cresceram at o estgio antral (mais de 5 mm de


dimetro) aps seis semanas de estimulao exgena
com FSH (OKTAY et al., 1998). Embora at o
momento no tenha sido demonstrado que o tecido
ovariano criopreservado possa restaurar a fertilidade
em humanos, o nascimento de animais viveis tem sido
obtido a partir de enxerto de tecido ovariano congelado
e descongelado em camundongos (CARROLL &
GOSDEN, 1993). Em animais domsticos como os
ovinos, a viabilidade folicular tambm j foi
demonstrada atravs da anlise histolgica de tecido
ovariano congelado e descongelado (SALLE et al.,
1998). BAIRD et al. (1999) realizaram autotransplante de tecido ovariano em ovelhas ps
descongelao e observaram um aumento nos nveis
de progesterona quatro semanas aps o enxerto.
Porm, nesta espcie os resultados mais encorajadores
foram reportados por GOSDEN et al. (1994), os quais
obtiveram o nascimento aps o transplante de tecido
ovariano congelado e descongelado. Em bovinos,
PAYNTER et al. (1999) demonstraram que o nmero
mdio de folculos pr-antrais presentes em fragmentos
de tecido ovariano cultivados por 48 horas aps
congelao/descongelao, foi semelhante ao
observado em fragmentos ovarianos no congelados.
Criopreservao de folculos pr-antrais isolados
Embora, excelentes resultados referentes
congelao de tecido ovariano j tenham sido obtidos
em vrias espcies, a formao de gelo intracelular
(FGI) ainda pode representar, em alguns casos, um
entrave para o sucesso da criotecnologia. Em tecido, a
FGI tem mostrado ser muito mais prevalente e pode
ocorrer a uma taxa significativamente maior do que pode
ser atingida nas clulas em suspenso (ACKER &
McGANN, 1998). A criopreservao de tecido
substancialmente diferente da criopreservao de
clulas em suspenso, como os folculos pr-antrais
isolados por exemplo. Em um tecido organizado, a
difuso de gua e crioprotetores no facilitada. Vrios
tipos celulares em um tecido desempenha uma
contribuio para a funo do mesmo. Portanto, a
sobrevivncia de cada tipo celular ps-descongelao
extremamente importante (HARP et al., 1994). O
tecido do estroma ovariano muito rico em clulas, as
quais esto juntamente posicionadas. Portanto, a
formao de gelo no espao intercelular pode danificar
108

facilmente as clulas e quebrar a comunicao


intercelular necessria para a integridade do tecido
(SUGIMOTO et al., 1996). Uma alternativa possvel
de ser realizada no sentido de reduzir as injrias
causadas pela FGI seria a congelao de folculos prantrais isolados.
Em camundongos, a anlise ultra-estrutural
revelou que folculos pr-antrais isolados
mecanicamente, apresentaram altas taxas de
sobrevivncias aps os procedimentos de congelao
e descongelao. Estes folculos foram ainda cultivados
in vitro e responderam gonadotrofina corinica
humana. Aps a maturao mostraram-se aptos
fecundao e ao desenvolvimento embrionrio at o
estgio de blastocisto (CORTVRINDT et al., 1996).
Ainda em camundongos, outros estudos resultaram em
maiores sucessos, obtendo-se nascimentos a partir de
folculos pr-antrais isolados congeladosdescongelados, desenvolvidos e fecundados in vitro
(CARROLL et al., 1990; CARROLL & GOSDEN,
1993). Em felinos, JEWGENOW & GRITZ (1995),
utilizando um procedimento de congelao lenta, e o
DMSO como crioprotetor, relataram que cerca de 12%
dos folculos pr-antrais felinos que foram congelados,
encontravam-se intactos aps a descongelao.
Posteriormente, nesta mesma espcie JEWGENOW
et al. (1998) testaram diferentes crioprotetores
(DMSO, PROH, ETG e GLI) tambm para a
congelao lenta de folculos pr-antrais e observaram
que somente quando o GLI foi empregado, houve uma
diminuio no nmero de folculos com ocito e clulas
da granulosa intactos quando comparado com folculos
no congelados (controle). A percentagem de folculos
viveis utilizando os demais crioprotetores foi similar
ao controle.
Limitaes da criopreservao de ocitos
Embora a utilizao da criotecnologia j tenha
permitido grandes avanos para a biologia reprodutiva
em vrias espcies, o processo de criopreservao de
ocitos apresenta algumas limitaes, as quais podem
ser enumeradas: 1) a susceptibilidade aos danos txicos
e osmticos que os ocitos podem sofrer durante todas
as fases (perodo de equilibrio; resfriamento; estocagem
devido a problemas tcnicos, como aquecimento
acidental; descongelao aquecimento e remoo do
crioprotetor) do processo de criopreservao; 2)

exigncias de habilidade especial, utilizao de


equipamentos caros e sofisticados e longa durao do
procedimento, no caso da escolha pelo mtodo
tradicional (congelao lenta) de criopreservao; 3)
Exposio solues contendo altas concentraes de
crioprotetores quando da utilizao dos mtodos de
congelao ultra-rpida ou vitrificao; 4) No
padronizao de um mtodo de criopreservao ideal,
que permita a viabilidade de um grande nmero de ocitos
aps a descongelao.
CONSIDERAES FINAIS E
PERSPECTIVAS
Conforme mostrado anteriormente, a aplicao
da criopreservao na biotecnologia reprodutiva poder
permitir a criao de BGAs no qual os gametas femininos
(ocitos maturos e imaturos), e tecido ovariano de vrias
espcies animais podero ser preservados
indefinidamente visando a conservao e manuteno
da biodiversidade. No que se refere especificamente aos
ocitos imaturos oriundos de folculos pr-antrais, os
quais so mais resistentes aos procedimentos de
congelao e descongelao, a criopreservao aplicada
biotcnica de MOIFOPA, no somente ser capaz de
preservar o material gentico de fmeas mamferas, como
tambm poder ser aplicvel para a preservao da
funo endcrina de vrias espcies. Se os programas
de reproduo assistida especificamente, de animais em
extino, mantidos em cativeiro falham, as amostras de
ocitos inclusos em folculos pr-antrais crioestocados
podero ser descongeladas, para posterior utilizao no
futuro em protocolos de crescimento de folculos prantrais in vitro at a maturao, seguida de fecundao
dos ocitos e transferncia dos embries obtidos.
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Recebido para publicao em 30.10.2000

Aceito em 5.09.2001

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