Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios de Superiores Cuautitlan Campo 1

Seccin de Microbiologa

Laboratorio de Microbiologa Industrial

Reporte de las prcticas #2 y #3 Curva de crecimiento
microbiano y Efecto de diferentes fuentes de Carbono sobre
el crecimiento microbiano

Profesores:

Q.F.B Paredes Jurez Jonathan Pablo

Q.F.B Garca Barrn Alma Susana

Grupo: 2651
Semestre: 2016-II
Carrera: Qumica industrial
Alumnos:

lvarez Rivas Rubn Daro

Bentez Hernndez Jos Antonio
Espinosa Villeda Elsy Valeria
Lpez Martnez Adrian Osvaldo
Lpez Moreno Miguel ngel Ciprss
Prez Prez Daniel Alfredo

Fecha de Entrega: 8 de abril del 2016

Objetivos.

General:
Evaluar el efecto de diferentes fuentes de carbono (Dextrosa, Lactosa,
Manitol, y Melaza) sobre el crecimiento de Escherichia Coli, as como
identificar las fases de crecimiento del microorganismo en un cultivo.
Particulares:
Elaboracin de curvas de crecimiento microbiano para identificar la mejor
fuente de carbono en Escherichia Coli.
Determinacin de parmetros cinticos que permitan evaluar el crecimiento
del microorganismo en diferentes sustratos.
Elaboracin de mtodos indirectos (Biomasa por Turbidez y por peso seco)
para el Anlisis de crecimiento de Escherichia Coli.
Elaboracin de mtodo directo (Cuenta viable por sembrado masivo) para
el Anlisis de crecimiento de Escherichia Coli.

Introduccin.
En microbiologa el crecimiento se define como el incremento de nmero de
clulas; la fisin binaria es el proceso por el cual una clula se divide para formar
dos clulas iguales, hay un intervalo que transcurre en la formacin de dos clulas
a partir de una la cual se llama generacin y el tiempo requerido para esto es el
tiempo de generacin o tiempo de duplicacin.
El hecho de que exista un crecimiento equilibrado simplifica la medicin de
velocidad de crecimiento en un cultivo bacteriano, dado que dicha velocidad en
todos los componentes de una misma poblacin es la misma, el medir cualquier
componente permite la determinacin de la velocidad de crecimiento.
Las bacterias enfrentan constantemente condiciones que limitan o impiden su
crecimiento. Su habilidad para colonizar un ambiente requiere la capacidad para
alternar perodos de rpida divisin celular y de crecimiento nulo. Las
caractersticas de las clulas en estos periodos pueden analizarse en el
laboratorio en condiciones controladas de temperatura, oxigenacin y composicin
del medio de cultivo.
Hay microorganismos que se multiplican por fisin binaria como es el caso de
E.Coli su crecimiento puede ser representado como el logaritmo del nmero de
clulas en funcin del tiempo de incubacin, que grficamente resulta en una
curva de crecimiento bacteriano y presenta 4 fases:
2

Fase de transicin A o lag

Fase logartmica o exponencial (FE)
Fase estacionaria (FS)
Fase de muerte celular

La fase lag representa el tiempo necesario para reiniciar el ciclo celular despus
de un periodo de ayuno nutrimental
Un cultivo bacteriano generalmente se inicia al inocular el medio de cultivo con un
nmero pequeo de bacterias en FS. En los primeros minutos posteriores al inicio
del cultivo, se recupera el nivel normal de tensin helicoidal del DNA e incrementa
la expresin de los genes importantes para el crecimiento. Posteriormente, entre
los 30 y 40 minutos, se reinicia la replicacin del cromosoma y a los 80-120
minutos se presenta la primera divisin de la mayora de las clulas. La FE, o de
crecimiento balanceado, representa el periodo en el que hay suficientes
nutrimentos; las bacterias recuperan el ciclo celular e incrementan su nmero
exponencialmente. La fase de transicin B, o de crecimiento no balanceado, se
inicia cuando disminuyen los nutrientes. En esta transicin cambia la pendiente de
la curva de crecimiento exponencial y disminuye la velocidad de sntesis de
macromolculas. La disminucin de la sntesis de DNA y protenas no es
sincrnica, lo que ocasiona un incremento en la relacin DNA/protena.
Por otra parte, la divisin celular contina a una velocidad similar a la de la FE, lo
que genera clulas de menor tamao. Finalmente, cuando los nutrientes se
agotan, las clulas entran a la FS. El inicio de esta fase se define
operacionalmente como el momento en el que el nmero de clulas en el cultivo
no vara. En estos cultivos la fase exponencial en la bacteria Escherichia coli
representa el periodo de rpida divisin celular o de crecimiento balanceado,
mientras que la FS representa el periodo de crecimiento nulo. Las bacterias que
no esporulan en respuesta al ayuno nutrimental, como es el caso de Escherichia
Coli, presentan cambios morfolgicos y fisiolgicos importantes al ingresar a la FS.
Estos cambios no representan un estadio final con suspensin total del
metabolismo, como en la esporulacin, sino un estadio dinmico en el que se
mantiene un metabolismo basal aun despus de semanas en ayuno. Esta
condicin se logra mediante la expresin oportuna de genes que se organizan en
redes de regulacin. La respuesta gentica al estrs nutrimental vara en relacin
al tiempo que tienen las clulas en FS, la oxigenacin, el pH, la temperatura y el
primer nutriente que se agota (fuente de carbono, nitrgeno o fosfato), entre otros
factores.
En la fase de muerte celular ya no es posible la divisin celular, por lo tanto, las
clulas mueren y la poblacin decrece.

La curva de crecimiento se inicia al diluir el cultivo de una noche en medio nuevo.

1) Fase de transicin A o fase lag; 2) Fase logartmica o exponencial; 3) y 4)
3

Fase estacionaria. En estos cultivos la fase exponencial representa el periodo de

crecimiento rpido o balanceado y la fase estacionaria el periodo de crecimiento
nulo.
Hay distintos mtodos que permiten conocer el crecimiento de los
microorganismos, directos (recuentos en placa, filtracin a travs de membrana,
nmero ms probable y recuento directo en microscopio) e indirectos
(Turbidimetra, actividad metablica y peso seco).
Para esta prctica se llev a cabo el estudio de cmo se ve afectado el
crecimiento microbiano por efecto de un sustrato. Dicho efecto puede ser descrito
por la ecuacin cintica de Monod, dicha ecuacin establece la cintica para la
degradacin de sustrato y a su vez puede ejercer relacin con el rendimiento de
utilizacin del sustrato.Una vez conocidos los parmetros cinticos ayudar a
determinar cul ser la mejor fuente de carbono para utilizar con la bacteria E.Coli.
Esta es una imagen de una curva de crecimiento microbiano en un medio que
contiene Escherichia Coli.

Materiales y Reactivos.
Tabla 1.0 Materiales, Equipo, Reactivos y/o Soluciones

Metodologa

Efecto de diferentes fuentes de

carbono sobre el crecimiento
microbiano.
ACTIVACION
DE LA CEPA.

Tomar dos muestras de E.

Coli e inocular en un tubo
con 10mL de BHI

Incubar a 37C
durante 24 horas
preinoculo
Tomar 5mL del
medio e inocular
en 50mL del medio
de cultivo en un
matraz Erlenmeyer

Incubar a 37C
durante 12 horas

1. MMM
1%
2. MMM
1%
3. MMM
1%
4. MMM
1%

+ lactosa

Sembrar con pipeta

estril en un matraz
Erlenmeyer del
medio

+ glucosa

Rotular los matraces

+ melaza

Dejar en
agitacin a
150rpm y a
36C durante
12 horas

+ sorbitol

Llenar 2/3 de
una celda y el
resto
congelarlo.

Tomar 20mLdel
medio y colocarlo en
un frasco mbar
(ser utilizado como
blanco).

Antes de inocular
Aadir 10mLdel
preinoculo en cada
uno de los matraces

Preparar la solucin de
sustrato.
a) 2mL de H2O
b) 1.8ml de H2O
0.2ml de
sustrato.
c) 1.6ml de H2O
c 0.4ml de
sustrato.
d) 1.4ml de H2O
0.6ml de
sustrato.
e) 1.2ml de H2O
0.8ml de
sustrato.
f) 1.0ml de
sustrato.

y
Rotular seis tubos.
y
Agregar

Solucin de sustrato
y H2O a cada tubo.
Adicionar
0.5ml de Fenol al 5%

Agitar y enfriar en
un bao de hielo.

Adicionar a cada
tubo 2.5ml de H2SO4

Reposar a
temperatura
ambiente.

10 minutos.

Reposar en bao de
agua a 30C

Leer absorbancias a
490nm
7

Resultados
Tabla 1. Resultados de colonias presentes en Agar EMB de melaza a diferentes
tiempos con Asa Bacteriolgica de 10 L (sembrado masivo)
8

Tiempo
(minuto
s)
30

Diluci Asa(
n
L)

Conteo
caractersticas

1/1000

10

8 rosas y 1 verde

60

1/1000

10

3 grandes rosas

90

1/1000
0

10

5 grandes, 8 medianas,
6 chicas

120

1/1000
0

10

Incontables
coloracin
fluorescente

150

1/1000
0

10

19 medianas Todas de
coloracin rosada y 5
de ellas tiene el centro
un poco morado

y Imagen

de
verde

180

1/1000
00

10

46 medianas, 6 rosas
40 moradas

210

1/1000
00

10

14 medianas, 55 chicas
y todas poseen una
coloracin morada

Tabla 2. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli

en melaza presentes en Agar EMB a diferentes tiempos con Asa Bacteriolgica de
10 L (sembrado masivo) y Absorbancia de 490 nm

Melaza 1%
Tiempo
(minutos
)
30
60

Transmitan Absorbancia
cia
(490 nm)

Dilucin
en tubo

UFC/mL

ln(UFC/
mL)

135.9
154.3

-2.1332
-2.1883

10-3
10-4

13.7101
14.9141

90

150.9

-2.1787

10-4

120

141.1

-2.1495

10-4

150

139.4

-2.1442

10-4

180

133.0

-2.1235

10-5

210

133.6

-2.1258

10-5

900,000
3,000,00
0
8,000,00
0
14,000,0
00
19,000,0
00
460,000,
000
690,000,
000

Nota:
Para
pasar
-log(transmitancia)

de

transmitancia

absorbancia

15.759
16,589
16.7599
19.9467
20.3522

es

el

Tabla 3. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli

en glucosa Trabajado a diferentes tiempos, diluciones y absorbancia a 490 nm
10

Glucosa 1%
Tiempo
Transmitan Absorbanci
(minutos) cia
a (490 nm)
30
1
0

Dilucin
en tubo
10-3

60

0.9397

0,027

10-4

90

.8810

0,055

10-4

120

.9057

0,043

10-4

150

0.8994

0,046

10-4

180

0.9120

0,04

10-5

210

0.9549

0,02

10-5

240

0.9549

0,02

10-5

270

0.9549

0.02

10-5

UFC/mL
27000000
0
75000000
0
12000000
00
13500000
000
31200000
000
78000000
000
71100000
000
37500000
000
60000000
0

ln(UFC/mL
)
19.41393
252
20.43558
376
20.90558
739
23.32595
55
24.16368
39
25.07997
466
24.98735
31
24.34760
677
24.84986
568

Tabla 4. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli

en lactosa Trabajado a diferentes tiempos, diluciones y absorbancia a 490 nm
Lactosa 1%
Tiempo
(minutos
)
30

Transmitan Absorbancia
cia
(490 nm)

Dilucin
en tubo

UFC/mL

ln(UFC/mL
)

10-3

382.5

60

10-4

247.5

90

10-4

2060

120

10-4

0.056

150

10-4

900.026

180

10-5

2543

5.946728
653
5.511410
582
7.630461
262
2.882403
588
6.802423
652
7.841099
765
11

210

10-5

240

10-5

123009
400
612504
85

18.62777
133
17.93048
233

Tabla 5. Resultados para la curva de crecimiento microbiano de Escherichia Coli

en manitol Trabajado a diferentes tiempos, diluciones y absorbancia a 490 nm
Manitol 1%
Tiempo
(minutos
)
30

Transmitan Absorbancia
cia
(490 nm)

Dilucin
en tubo

UFC/mL

ln(UFC/m
L)

10-3

1.009x10
20
1.4665x1
020
4.2766x1
020
3.3876x1
022
2.7491x1
023
3.1622x1
022
6.2058x1
024
9.6449x1
025

20,0048
008
20,1663
963
20,6311
505
22,5299
139
23,4392
842
22,5200
128
24,7928
053
25,9843
485

60

10-4

90

10-4

120

10-4

150

10-4

180

10-5

210

10-5

240

10-5

Tabla 6. Relaciones de tiempo de duplicacin experimental de Escherichia Coli

para cada sustrato
Sustrato

Tiempo de duplicacin

glucosa
Lactosa
Melaza

1x10-9
3.828x104
0.05517

109
2612.2
18.125

Nmero de Generaciones
28.9678
36.97
28.58

12

Grfico 1. Curvas de crecimiento microbiana logartmica de Escherichia Coli a

diferentes sustratos a diferentes intervalos de tiempo tomando como un mximo
240 minutos

Crecimiento logartmico microbiano de E.Coli

30
25

f(x)
f(x) =
= 0.03x
0.04x +
+ 19.89
16.34
R
=
0.85
R = 0.91

20

melaza ln
Linear (melaza ln)
dextrosa ln
Linear (dextrosa ln)

15

f(x) = 0.06x + 1.77

R = 0.45

ln
10

Linear (dextrosa ln)

lactosa ln
Linear (lactosa ln)
Linear (lactosa ln)

Manitol
Linear (Manitol)

20 40 60 80 100120140160180200220240

-5

Tiempo (minutos)

Grfico 2. Curvas de crecimiento microbiano Algebraico de Escherichia Coli a

diferentes sustratos en diferentes intervalos de tiempo tomando como un mximo
de 240 minutos

13

f(x) = NaN x^NaN

R = NaN

Tiempo vs UFC/mL

160000000000
140000000000
120000000000

melazaq

100000000000

Power (melazaq)

80000000000
UFC/mL

60000000000

lactosa

40000000000

Manitol

20000000000
0
0

20 60 100 140 180 220 260 300

40 80 120 160 200 240 280

TIiempo (minutos)

Grfico 3. Valores medidos de Absorbancia en funcin del tiempo de incubacin

para la cepa de Escherichia Coli en los distintos sustratos trabajados.

Grfico 4. Valores medidos de UFC/ml en funcin del tiempo de incubacin para

la cepa de Escherichia Coli en medio Melaza 1%

14

Anlisis de resultados
Se analizaron 4 diversas fuentes de carbono en forma de sustrato que son:
Dextrosa, Lactosa, Manitol, y Melaza para evaluar el crecimiento microbiano de
Escherichia Coli y as llevar un seguimiento de las fases de crecimiento de dicha
bacteria por el mtodo de turbidimetra y espectrofotometra molecular cuyos
resultados de Absorbancia y UFC/ml estn representadas en la parte de
resultados de la Tabla 2 a la Tabla 5.
Tericamente Escherichia Coli puede reproducirse cada 20 minutos e incluso en
solo 7 hrs una clula bacteriana puede dar origen a ms de 2,000,000 millones de
clulas nuevas
Cabe mencionar que los sustratos inicialmente planeados para servir como
sustrato del crecimiento de Escherichia Coli:
1. Dextrosa
2. Lactosa
3. Melaza
4. Manitol
Por otra parte al momento de medir la Absorbancia y Transmitancia para poder
cuantificar el crecimiento microbiano de Escherichia Coli se tuvieron problemas
con el equipo (espectrofotmetro) y con las celdas que no eran las ideales para la
lectura aparte de que ya estaban muy daadas y no dejaban absorber el haz de
luz que en ellas se incida
Cabe destacar una de las caractersticas principales de cada sustrato por ejemplo
se tiene que la glucosa es un monosacrido que tiene disponibles los carbonos
15

para ser aprovechados por Escherichia Coli por otro lado tenemos a la lactosa
que es un disacrido (glucosa + galactosa) ya este tiene dos fuentes de carbono
provenientes de diferente monosacrido por lo que se le hace ms difcil a
Escherichia Coli la obtencin del carbono aunque la fuente sea basta y siguiendo
esta lgica llegamos al sustrato melaza que es el sustrato que nosotros
manejamos siendo un polisacrido la fuente de carbono es basta pero de difcil
acceso para Escherichia Coli por cuestiones de la energa que tiene que emplear
para la sustraccin del mismo
En cuanto a la cuestin del crecimiento microbiano de los tres sustratos utilizados
para el crecimiento de Escherichia Coli donde su crecimiento es apreciable en el
Grfico 2 donde se observa el crecimiento de la bacteria antes mencionada en
funcin del tiempo
El mejor sustrato para el crecimiento de Escherichia Coli como era de esperarse
fue glucosa por su baja complejidad molecular y fcil sustraccin de la fuente de
carbono en dicho grfico es apreciable algunas de las etapas del crecimiento
microbiano de una bacteria como los son:
1. Adaptacin
2. crecimiento
3. estacionaria
4. muerte
En la grfica no es apreciable la fase de adaptacin debido a que antes de
comenzar con el estudio espectrofotomtrico se dej que Escherichia Coli se
adaptar en cada sustrato para que posteriormente fuera menos tardada la
medicin de lecturas
Las lecturas de espectrofotometra se llevaron a cabo durante un periodo de
aproximadamente 4 horas (240 minutos) en el que el comportamiento de la
bacteria fue diferente para cada caso:
1. Glucosa se logra apreciar un grfico prcticamente completo con fase de
crecimiento bien definida con una fase estacionaria con duracin baja y una
fase de muerte confirmando nuevamente la facilidad para la obtencin de
carbono y la baja energa requerida por Escherichia Coli. (Grfico 2)
2. Para el caso de lactosa y melaza nicamente se logra observar la fase de
crecimiento logartmico debido al difcil acceso para la obtencin del
carbono y aunque la lactosa es un disacrido y la melaza un polisacrido
no quiere decir que cada uno de los monosacaridos presentes en ella estn
disponibles para que Escherichia Coli pueda tomarlos y reproducirse ya
que se trata de un sacrido muy procesado por lo que le fuerza a
Escherichia Coli a utilizar mas energa para poder obtener este
macronutriente y por consecuencia le lleva ms tiempo alcanzar cada una
de las fases de crecimiento en ambos sustratos. (Grfico 2)
3. De manera similar se comporto el manitol ya que es un polisacrido y
necesita mucha energa para poder observar claramente todas las fases de
16

crecimiento de E.Coli por ende en la parte de resultados del Grfico 2 solo

es posible apreciar la parte de adaptacin y logartmica.
En cuanto a la tabla de resultados 6 se tienen los datos de , tiempo de
duplicacin y el nmero de generaciones, estos resultados fueron calculados y
proporcionados por cada equipo de laboratorio que realizo dicha experimentacin
con el sustrato asignado. Estos resultados nos indicaran (tericamente) que a
mayor menor ser el tiempo de duplicacin, lo que resultara a un nmero de
generaciones mayor.
Esto puede confirmarse en la parte de resultados en el Grafico 2 ya que se reporta
un mayor nmero de generaciones para la Glucosa y Lactosa con valores de 28.9
y 36.9 respectivamente.
Para el caso de la melaza tambin se encuentra concordancia en cuanto al
nmero de generaciones y la representacin grfica ya que aunque la diferencia
no es mucha si cuenta con un nmero de generaciones menor en comparacin a
los dems sustratos trabajados, y as su comportamiento ser una curva menos
elevada que indica una menor cantidad de UFC/ml.
Existen microorganismos que estando en la etapa de crecimiento aumentan
considerablemente en cantidad y se agrupan en colonias que son grupos de
clulas suficientemente grandes para ser observadas (UFC) sin ayuda de un
microscopio, como se puede observar en la parte de resultados en la Tabla 1. hay
que tomar en cuenta que para que se de dicho crecimiento microbiano es
necesario cumplir requerimientos nutricionales como son tener un control en la
temperatura, pH, presin osmtica y fuente de carbono.

Conclusiones:

A un menor tiempo de duplicacin de microorganismos en cada sustrato ,

se tendr una velocidad de crecimiento mayor.
El mejor sustrato en el que se puede desarrollar E.Coli es en la glucosa.
dada su baja complejidad de enlaces
Entre menor sea el tiempo de duplicacin del microorganismo, en el
sustrato mayor ser el nmero de generaciones.
entre menor sea la complejidad del sustrato menor energa requerida E.Coli
para poder reproducirse
la incubacin de E.coli se llev a cabo en una incubadora a 37C para su
ptimo desarrollo y crecimiento
E.Coli es el microorganismo procariota estudiado con mayor profundidad
debido a su rpida multiplicidad, bajo tamao y gran manejabilidad
La fase de crecimiento o fase exponencial del microorganismo en nuestro
sustrato (melaza) se dio en un tiempo periodo de 3 horas y media a cuatro.

17