SEPARACIN DE CLULAS

Muchos de los avances en biologa celular y molecular son el resultado de estudios

llevados a cabo en clulas especializadas. Como los tejidos y rganos que componen
un ser vivo estn formados por mltiples tipos celulares, una de las primeras tareas a las
que se enfrenta el investigador consiste en aislar una poblacin pura de un
determinado tipo de clulas. Adems, tras la separacin, se tendrn que utilizar otro
tipo de tcnicas para contar el nmero de clulas obtenidas y para determinar su
viabilidad, es decir, para comprobar que siguen vivas.
Las diversas tcnicas de separacin se basan en las diferencias existentes entre los
distintos tipos celulares como, por ejemplo:

el tamao y la densidad de las clulas

la afinidad de anticuerpos hacia determinados eptopos de la superficie celular
la dispersin de luz
la emisin de fluorescencia

Con frecuencia, para conseguir una separacin eficaz es necesario utilizar dos o ms
mtodos.

SEDIMENTACIN ISOPCNICA
Esta tcnica permite separar clulas en funcin de su densidad. Este mtodo es ideal
para separar clulas cuyas densidades difieren en ms de 0,02 g/ml. Para ello se utilizan
centrifugadoras convencionales y se aplican campos gravitatorios de baja intensidad
(pocas g). La separacin se consigue haciendo sedimentar las clulas en un gradiente
de densidad, es decir, en un medio cuya densidad aumenta con la profundidad del tubo.
Se distinguen dos tipos de gradiente de densidad:

Gradiente discontinuo: se genera superponiendo capas de densidad decreciente

Gradiente continuo: se genera con un formador de gradientes o, en algunos
casos, se generan ellos solos al centrifugarlos a velocidades elevadas

Gradiente discontinuo

Gradiente continuo
(con formador de gradientes)

Gradiente continuo
(autogenerado)

El medio con el que se forma el gradiente de densidad debe ser muy soluble en agua
para poder abarcar un amplio rango de densidades. Adems, debe ser inerte, no debe
ser txico, no debe ser viscoso a concentraciones elevadas y no debe ejercer mucha
presin osmtica en disolucin. Ejemplos de este tipo de medios son la sacarosa, el
cloruro de cesio, metrizamida y polmeros de elevado peso molecular como los
dextranos, el Ficoll o el Percoll, etc.
En un gradiente de densidad, las clulas sedimentan hasta alcanzar aquella posicin en
la que su densidad iguala a la del medio.

Una vez separadas, hay que extraer las clulas del gradiente de densidad. Una forma
de hacerlo es introducir un medio de flotacin (muy denso) directamente en el fondo del
tubo para que vaya desplazando el gradiente y las clulas hacia arriba. Las clulas son
canalizadas hacia el tubo de salida y se recogen en una placa con mltiples pocillos que
ya tienen medio de cultivo. Las clulas diluidas ya separadas se cultivan hasta alcanzar
el nmero deseado para realizar los experimentos planeados.

ELUTRIACIN CENTRFUGA
Este mtodo separa las clulas en funcin de su tamao. El elutriador consiste en una
centrifugadora adaptada para utilizar un rotor especialmente diseado para la separacin
de clulas.
El proceso comienza cuando las clulas, que estn suspendidas en el medio de cultivo,
son bombeadas hasta la cmara de separacin, localizada en el interior del rotor,
mientras ste est girando. El diseo de la cmara tambin ayuda a la separacin
porque, al ser ms estrecha en el extremo ms alejado del eje del rotor, el flujo del
medio es ms rpido en esa zona y genera una fuerza centrpeta ms intensa. Una vez en
el interior de la cmara, se establece un equilibrio de fuerzas. Por un lado, la fuerza
centrfuga tiende a empujar las clulas hacia las paredes del rotor. Por otro lado, el
bombeo de medio de cultivo a travs de la cmara establece una fuerza centrpeta de
intensidad variable que contrarresta la velocidad de sedimentacin de las clulas.
Si la poblacin celular fuese uniforme se alcanzara una situacin de equilibrio en la
que las clulas permaneceran en una posicin fija. Como hay varios tipos celulares con
distinto tamao y densidad, las clulas tienden a sedimentar a distintas velocidades, y
cada tipo de clula alcanza su equilibrio en distintas posiciones de la cmara.

La cmara de sedimentacin est iluminada por una luz estroboscpica y se puede

observar directamente a travs de un visor. Cuando las clulas alcanzan el equilibrio
se incrementa la velocidad del flujo y las clulas son empujadas hacia el exterior,
donde se recogen en tubos apropiados.

El equilibrio se alcanza en pocos minutos y la separacin se puede llevar a cabo en unos

30 minutos. En cada separacin se pueden llegar a obtener hasta 108 clulas. Las clulas
se pueden cultivar inmediatamente despus de su separacin, hasta alcanzar la
concentracin deseada.
Dos inconvenientes de esta tcnica son que (1) el aparato es bastante caro y (2) se
necesita adquirir mucha experiencia antes de llegar a conseguir separaciones eficaces.

SEPARACIN INMUNOMAGNTICA
Estas tcnicas se basan en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas esferas
formadas por un material superparamagntico (es decir, que slo son magnticas en
presencia de un campo magntico) recubierto de un polmero. Los anticuerpos se
unen de manera especfica a un antgeno presente en la superficie de un tipo celular
concreto y, mediante un simple imn, se pueden separar las clulas que se han unido a
los anticuerpos de las dems. Existen en el mercado dos sistemas de separacin de
clulas basados en el uso de esferas superparamagnticas unidas a anticuerpos:
Dynabeads y MACS.
1.- Dynabeads (Invitrogen)
Son unas esferas de poliestireno cuyo interior contiene hierro, lo que le confiere
propiedades superparamagnticas. Su tamao es uniforme, con un dimetro de 4,5
micras (comparable al tamao de una clula). Sobre su superficie se pueden unir
covalentemente diversos ligandos biorreactivos: anticuerpos primarios, anticuerpos
secundarios, estreptavidina, oligonucletidos, etc. Veamos, a modo de ejemplo, cmo se
realiza la separacin de tipos celulares con Dynabeads unidas a un anticuerpo
(primario o secundario). La separacin se realiza en tres pasos:

1.- Unin: una vez aadidas a la muestra, los anticuerpos de las Dynabeads se
unen directamente a aquellas clulas que expresan sobre su superficie el
antgeno correspondiente (si las Dynabeads estn unidas a un anticuerpo
primario) o a anticuerpos previamente unidos al antgeno (si las Dynabeads
estn unidas a un anticuerpo secundario).

2.- Aplicacin del campo magntico: mediante un imn, se separan las

Dynabeads (junto con las clulas que llevan unidas) del resto del material
presente en la muestra. Se retira todo el material no seleccionado y se hace un
par de lavados con medio libre de clulas.

3.- Separacin: se retira el imn y se resuspenden las Dynabeads (junto con las
clulas seleccionadas) en un medio libre de clulas. Para separar las Dynabeads
de las clulas se pueden utilizar enzimas proteolticas o un compuesto
comercial denominado DETACHaBEAD, que contiene anticuerpos solubles
que compiten con los anticuerpos de las Dynabeads a la hora de unirse al
antgeno. En algunos casos es posible seguir trabajando con las clulas
seleccionadas sin tener que separarlas de las Dynabeads.

La seleccin celular puede ser:

Positiva: cuando las Dynabeads se unen a las clulas que nos interesa
seleccionar.

Negativa. cuando las Dynabeads se unen a las clulas que no interesan. Este
tipo de seleccin es el que hay que utilizar cuando es importante que las clulas
seleccionadas estn intactas.

En algunos casos, la separacin celular se hace en varias etapas en las que se combinan
selecciones negativas y selecciones positivas.
2. Microesferas MACS (Magnetic-activated cell sorting) (Miltenyi Biotec)
Son partculas superparamagnticas formadas por xido de hierro y polisacridos
(dextranos). Son muy pequeas, con un dimetro aproximado de 50 nm (~ 100 veces
menor que el de las Dynabeads), y se encuentran unidas a anticuerpos especficos. Al
ser tan pequeas, no alteran ni la estructura, ni la funcin, ni la actividad de las clulas.
No son txicas y son biodegradables. Aunque se las denomina microesferas, en
realidad se trata de nanopartculas, de modo que sera ms correcto decir que son
nanoesferas.
La separacin se lleva a cabo haciendo pasar la muestra a travs de una columna que
contiene una matriz de esferas ferromagnticas recubiertas de un material inerte que no
daa las clulas. Cuando se coloca la columna sobre un imn, las esferas crean un
campo magntico de gran intensidad que atrae fuertemente las microesferas MACS
y las clulas unidas a ellas, mientras que las clulas que no se han unido a las
microesferas MACS fluyen libremente a travs de la columna. Se necesita un campo
magntico muy intenso porque las microesferas son muy pequeas y las clulas estn
mnimamente marcadas.
La separacin se realiza en tres pasos:

1.- Unin: una vez aadidas a la muestra, los anticuerpos (u otros ligandos) de
las microesferas MACS se unen directamente a aquellas clulas que expresan
sobre su superficie el antgeno correspondiente.

2.- Se hace pasar la muestra a travs de una columna MACS colocada

sobre un imn: las microesferas MACS y las clulas unidas a ellas quedan
retenidas en el interior de la columna, mientras que las clulas que no se han
unido a las microesferas MACS fluyen libremente. Se hace un par de lavados
con medio libre de clulas para arrastrar todo el material que no se ha quedado
retenido en la columna.

3.- Elucin: al retirar la columna MACS del soporte magntico el campo

magntico desaparece y las clulas seleccionadas se pueden eluir fcilmente con
la ayuda de un mbolo. Las clulas estn listas para ser cultivadas y/o
analizadas, ya que no es necesario separar las microesferas.

La seleccin de las clulas puede ser positiva (si las microesferas MACS se unen
directamente a las clulas que se quieren seleccionar) o negativa (si las microesferas
MACS se unen a las clulas que no interesan). Para seleccionar algunos tipos de clula
se pueden utilizar estrategias que combinen selecciones positivas y negativas.

CITOMETRA DE FLUJO
La citometra de flujo permite analizar, de forma simultnea, diversos parmetros de
cada una de las clulas presentes en una poblacin celular heterognea. Adems de
contar las clulas, esta tcnica obtiene informacin relacionada con el tamao y la
complejidad interna de cada clula. Utilizando anticuerpos marcados
fluorescentemente tambin es posible determinar el grado de expresin de
determinadas protenas localizadas sobre la superficie celular.
El citmetro de flujo hace pasar las clulas, de una en una, a travs de un rayo lser.
La luz que emerge de cada clula cuando el lser incide sobre ella es captada por
distintos detectores y analizada. Cada detector ofrece un tipo de informacin distinto.

Los datos recogidos se analizan estadsticamente mediante el software del aparato,

que elabora un informe detallado sobre las caractersticas de las clulas como, por
ejemplo, su tamao, su complejidad interna o su fenotipo.
Cada detector ofrece un tipo de informacin distinto sobre la clula:

Hay un detector frontal que recoge la luz difractada a ngulos bajos. Esta seal
da informacin sobre el tamao de la clula.

Hay un detector lateral (perpendicular al lser incidente) que recoge la luz

difractada a 90. Esta seal da informacin sobre la complejidad interna de la
clula.

Hay detectores laterales adicionales que recogen la fluorescencia emitida por

la clula a 90 despus de haberla marcado con anticuerpos fluorescentes. Esta
seal da informacin sobre la presencia o no de determinadas molculas en la
superficie celular (el fenotipo).

COMPONENTES DEL CITMETRO DE FLUJO

La figura inferior muestra, de manera esquemtica, los principales componentes de un
citmetro de flujo:

El sistema de fluidos se encarga

de llevar la muestra hasta el punto
de interrogacin (el punto donde
las clulas atraviesan el lser).
Tambin se encarga de eliminar
los desechos.

El lser, es la fuente luminosa.

Al incidir sobre las clulas, la luz
se difracta. A determinadas
longitudes de onda tambin es
capaz de excitar los fluorforos
presentes en las clulas.

El punto de interrogacin es el
corazn del sistema. Aqu es
donde la muestra atraviesa el
lser para que el sistema ptico
recoja las seales de difraccin y
de fluorescencia.

El sistema ptico recoge la luz

difractada y/o la luz emitida por
fluorescencia para dirigirla hacia
los detectores.

Los detectores reciben la luz y

la cuantifican.

Los circuitos electrnicos envan

las seales de los detectores al
computador, que las convierte
en informacin digital para llevar
a cabo los anlisis necesarios.

ENFOQUE HIDRODINMICO
Para recoger datos de forma precisa es fundamental que las clulas (o partculas) pasen
de una en una a travs del lser. En la mayora de los citmetros esto se consigue
haciendo que el tubo por donde circulan las clulas (y que en la figura inferior aparece
representado en un color ms claro) desemboque en el interior de otro tubo por el que
circula un fluido envolvente a mayor velocidad. Este fluido envolvente es una
disolucin salina que rodea a la muestra (en la figura aparece representado de color ms
oscuro). Durante este proceso, el flujo que arrastra la muestra se va comprimiendo hasta
alcanzar un espesor aproximadamente igual al dimetro de una clula. De este modo, las
clulas llegan al punto de interrogacin de una en una. Este fenmeno se denomina
enfoque hidrodinmico. Los aparatos ms modernos utilizan, adems, un enfoque
acstico que permite alinear las clulas utilizando una velocidad de flujo mayor.

Cada clula llega por separado al punto de interrogacin y a medida que atraviesa el
lser se recoge informacin sobre sus caractersticas. As se analizan todas y cada una
de las clulas presentes en la muestra. El citmetro de flujo es capaz de analizar miles
de clulas por segundo.

DETECCIN DE LA DISPERSIN FRONTAL

La luz que incide sobre la clula en el punto de interrogacin se difracta y sale reflejada
en todos los ngulos. La difraccin frontal, tambin llamada difraccin de luz a bajo
ngulo, es la cantidad de luz que sale dispersada hacia adelante cuando el lser incide
sobre la clula. La cantidad de luz dispersada hacia adelante es aproximadamente
proporcional al tamao de la clula.

La luz se cuantifica por medio de un detector que convierte la intensidad en voltaje.

En la mayora de los citmetros hay una barra por delante del detector de dispersin
frontal. Esta barra se llama barra oscurecedora y evita que la intensa luz del lser incida
directamente sobre el detector cuando no ha encontrado ningn obstculo en su camino
(figuras inferiores izquierda y central). Cuando el lser se encuentra con una clula, la
luz se dispersa alrededor de la barra oscurecedora y es recogida por el detector (figura
inferior derecha).

La luz dispersada que incide sobre el detector se convierte en un pulso de voltaje.

Si la clula es pequea, la dispersin frontal es reducida y si la clula es grande, la

dispersin frontal es elevada. Por tanto, la magnitud del pulso de voltaje es
proporcional al tamao de la clula.

Si hacemos un histograma con estos datos, las clulas ms pequeas aparecen en la

parte izquierda del histograma y las clulas ms grandes en la parte derecha. Un
histograma de la dispersin frontal es un grfico que representa la distribucin de
tamaos de los distintos tipos de clulas presentes en la muestra. Hay que tener en
cuenta que se trata de una grfica unidimensional.

UMBRAL DE DETECCIN
Un aspecto importante que hay que considerar a la hora de estimar el tamao de las
clulas presentes en una muestra es que hay que fijar un umbral de deteccin. Como
la muestra contiene gran cantidad de restos celulares y de otras partculas pequeas, su
seal ser muy grande y no permitir ver con detalle los componentes de mayor tamao.
Por eso, se fija un umbral y las partculas con un tamao inferior son ignoradas
(aunque tambin atraviesan el lser). Slo se tienen en cuenta las partculas con un
tamao que supere el umbral.
Los restos celulares y otras partculas
pequeas generan una seal muy grande

Solo se analizan las partculas con un

tamao superior al umbral de deteccin

DETECCIN DE LA DISPERSIN LATERAL

La luz que incide sobre la clula en el punto de interrogacin se difracta y sale reflejada
en todos los ngulos. La luz que se dispersa a ngulos mayores, por ejemplo, hacia
los costados, se denomina dispersin lateral. La dispersin lateral se debe a la
granularidad y a la complejidad estructural del interior de la clula.

Esta luz dispersada lateralmente se enfoca mediante un sistema de lentes y se recoge

mediante un detector distinto, que generalmente est orientado perpendicularmente (a
90) a la trayectoria del lser incidente. Las seales recogidas por el detector de
dispersin lateral tambin se pueden representar por medio de histogramas
unidimensionales.

GRFICOS BIDIMENSIONALES
Los histogramas unidimensionales que hemos visto hasta ahora no muestran
necesariamente la complejidad de la poblacin celular. Por ejemplo, lo que en el
histograma de difraccin frontal parece ser una nica poblacin son en realidad
mltiples poblaciones, tal y como nos indica el histograma unidimensional obtenido a
partir de los datos de difraccin lateral.
Difraccin frontal
(sin corregir)

Difraccin lateral

Difraccin frontal
(corregida)

Para poder distinguir las diversas poblaciones celulares se tienen que representar los
datos utilizando dos dimensiones. En el eje x (abscisas) se representan los datos de la
difraccin frontal y en el eje y (ordenadas) se representan los datos de la difraccin
lateral. As se obtiene el denominado grfico bidimensional de puntos o grfico de
difraccin.
Difraccin frontal

Difraccin lateral

Grfico de difraccin (2D)

Se puede observar que los picos que aparecen

en los histogramas unidimensionales de
difraccin frontal y de difraccin lateral se
correlacionan con las regiones de puntos
coloreados que aparecen en el grfico
bidimensional.

Veamos los resultados que se obtienen a partir una muestra de sangre. El grfico de
difraccin bidimensional (que recoge los datos de difraccin frontal y de difraccin
lateral) muestra tres tipos celulares: (1) los linfocitos (que son clulas pequeas con
poca complejidad interna), (2) los monocitos (clulas de tamao medio y con algo ms
de complejidad interna) y (3) neutrfilos y otros granulocitos (clulas grandes con una
enorme complejidad interna). El verdadero potencial de la tcnica de citometra de flujo
reside en la capacidad de realizar este anlisis de mltiples parmetros.
Grfico bidimensional obtenido a partir de
una muestra de sangre

Distintas poblaciones celulares presentes

en la muestra estudiada

TCNICAS FLUORESCENTES EN CITOMETRA DE FLUJO

Una de las formas ms frecuentes de estudiar las caractersticas celulares mediante
citometra de flujo implica el uso de molculas fluorescentes como, por ejemplo,
anticuerpos marcados con fluorforos. Cuando se aaden anticuerpos marcados a una
muestra que contiene diversos tipos de clulas, los anticuerpos se unen de manera
especfica a aquellas clulas que presentan en superficie (o en su interior) el antgeno
correspondiente. En una poblacin de clulas marcadas, algunas brillarn ms que
otras, segn cmo se hayan marcado.

Cuando la luz de un lser con la longitud de onda adecuada (luz de excitacin) incide
sobre el fluorforo, ste emite una seal fluorescente (luz de emisin) que tiene una
longitud de onda caracterstica para cada fluorforo. Esta seal es detectada por el
citmetro de flujo.

Luz incidente

Excitacin

Emisin (fluorescencia)

Cmo se recoge la seal de fluorescencia? Por regla general, los datos de fluorescencia
se recogen del mismo modo que los datos de dispersin lateral. La luz fluorescente
emitida por las clulas marcadas sigue el mismo recorrido que la luz dispersada
lateralmente y mediante una serie de filtros y espejos es dirigida hacia los detectores
adecuados, que estn colocados perpendicularmente a la trayectoria del lser y que
slo miden la luz de una determinada longitud de onda (la caracterstica para cada
fluorforo).

Cuando una clula atraviesa la trayectoria del lser se genera una seal de
fluorescencia. La luz fluorescente se dirige hacia el detector apropiado, donde es
convertida en un pulso de voltaje proporcional a la cantidad de fluorescencia
emitida.

Se registra la totalidad de los pulsos de voltaje y se

representan grficamente mediante un histograma
unidimensional. En la figura de la derecha se
observan dos poblaciones celulares. Cada una de
ellas ha resultado marcada de distinto modo
mediante los anticuerpos fluorescentes: en una
poblacin el marcaje es intenso y en la otra no.

TCNICAS FLUORESCENTES QUE UTILIZAN DOS COLORES

Para hacer un experimento con dos colores debemos asegurarnos de que los dos
fluorforos sean compatibles. Por ejemplo, el Alexa-Fluor-488 y la ficoeritrina (RPE) suelen usarse juntos con mucha frecuencia porque ambos se excitan con luz de
una misma longitud de onda (488 nm). Sin embargo, la fluorescencia que emiten
tienen longitudes de onda distintas (Alexa-Fluor-488 emite luz verde de 520 nm y la
R-PE emite luz naranja de 580 nm) y, por tanto, se pueden detectar por separado,
cada una con un detector distinto. En resumen, los dos se excitan con el mismo tipo de
luz, pero despus se recoge la emisin a dos longitudes de onda distintas, una para cada
fluorforo.

Los dos fluorforos se excitan con luz de

una misma longitud de onda (488 nm)

Los dos fluorforso emiten luz con

longitudes de onda distintas

Si se analizan los datos de un experimento en el que se ha utilizado esta pareja de

fluorforos, el histograma bidimensional puede presentar cuatro poblaciones celulares
distintas. Si dividimos el histograma en cuadrantes, (1) las clulas que slo estn
marcadas en verde darn una seal de fluorescencia localizada en el cuadrante inferior
derecho, (2) las clulas que slo estn marcadas en naranja darn una seal de
fluorescencia localizada en el cuadrante superior izquierdo, (3) las clulas que no estn
marcadas ni en verde ni en naranja darn una seal de fluorescencia localizada en el
cuadrante inferior izquierdo, (4) las clulas que estn marcadas en verde y en
naranja darn una seal de fluorescencia localizada en el cuadrante superior derecho.

Toda esta informacin est basada en un vdeo que se puede encontrar en YouTube
(est en ingls):
http://www.youtube.com/watch?v=sfWWxFBltpQ

CLASIFICADOR DE CLULAS ACTIVADO POR FLUORESCENCIA (FACS)

Algunos citmetros de flujo (no todos) poseen una funcin denominada "clasificacin
de clulas activada por fluorescencia", o FACS, (fluorescence-activated cell sorting).
Esta tcnica est basada en la deflexin electrosttica de gotas cargadas (es el mismo
principio que hace funcionar a las impresoras de chorro de tinta) y permite clasificar y
separar las clulas en funcin del tipo de marcaje fluorescente que presenten. En
esencia, el mtodo FACS es muy similar a la citometra de flujo, pero posee tres
caractersticas diferenciales:

1.- La boquilla vibradora: La boquilla por donde sale el fluido que arrastra la
muestra est acoplada a un cristal piezoelctrico que la hace vibrar con una
frecuencia y amplitud determinada. Esta vibracin interrumpe el flujo continuo
de la muestra y hace que se formen gotas de un tamao prcticamente
constante y con una distancia fija entre gota y gota. Una vez formada, la gota
puede tener una sola clula o no tener ninguna.

2.- Un dispositivo que asigna carga: Nada ms salir de la boquilla (antes de

que se formen las gotas), cada clula es analizada. En funcin de la
fluorescencia que presenta se le asigna un tipo de carga (positiva, negativa, o
ninguna). Como cada gota que se forme despus contiene una nica clula,
habr gotas con carga positiva, gotas con carga negativa y gotas sin carga.

3.- Las placas deflectoras: Mientras estn cayendo, las gotas pasan entre dos
placas cargadas que establecen un campo elctrico entre ellas. El voltaje que se
establece entre las placas oscila entre 2 y 6 kV. La trayectoria de cada de las
gotas cargadas se desva hacia la placa que tenga polaridad opuesta, de modo
que cada tipo de gota se recoge en un tubo distinto.
Boquilla vibradora

Asignacin de carga

Deflexin de las gotas

Los primeros aparatos solo podan seleccionar dos poblaciones celulares (positiva y
negativa). Hoy en da, variando la cantidad de carga asignada, es posible seleccionar
cuatro poblaciones celulares distintas (positiva y negativa, ms o menos cargadas).
Las clulas recogidas se vuelven a analizar para comprobar que la seleccin ha sido
correcta y se pueden poner en cultivo para que alcancen la concentracin deseada.