ABSTRACT.- Peres K.C., Trinca V., Oliveira F.P., Oliveira L.J., Bressan F.F., Pimentel J.R.V.,
Meirelles F.V. & Pereira F.T.V. 2015. [Caracterization of caveolin -1 and -2 proteins in
cloned and transgenic placenta of cattle.] Caracterizao das protenas caveolinas -1 e
-2 na placenta de conceptos bovinos clonados transgnicos. Pesquisa Veterinria Brasileira
35(5):477-485. Curso de Zootecnia, Faculdade Estadual Paulista, Rodovia Comandante Joo
Ribeiro de Barros Km 651, Dracena, SP 17900-000, Brazil. E-mail: verechia@gmail.com
The transgenic application of green fluorescent protein (GFP) as fetal cell marker on
cattle cloned placenta could provide an exclusive model for studying the morphologic and
immunologic maternal-fetal interactions, providing information about its mapping, distinguishing the fetal from maternal cells. This model will have direct application, mainly because these animals present problems during its development. With this models support,
we intend to verify the substances transport between mother and fetus during endocytosis,
through the immunolocalization of protein named caveolae. For these, we used 06 cloned
bovine and 30 cattle samples of artificial insemination (AI) with 90 days of pregnancy, which had been their development interrupted by humanitarian slaughter of the recipient and
recovery of the pregnant uterus. We collected the placentome and the chorion. A part of the
samples was cut and fixed, by immersion, on a solution containing 4% of parafomaldehyde
or 10% of formaldehyde on a sodium phosphate buffer (PBS), at 0,1M pH 7.4, Zamboni solution (4% of paraformaldehyde, 15% of picric acid, on sodium phosphate buffer 0,1M pH
7.4), metacarn (60% of metanol, 30% of chloroform, and 10% glacial acetic acid), for morphologic and immunohistochemistry verification for caveolinas proteins -1 and -2 (CAV
-1 and CAV- 2). The caveolins -1 were found in fetal and maternal villi, but its strongest
staining was observed in the endometrial stroma. The caveolins -2 had positive staining
in trophoblast and chorioallantoic membrane, and specifically in giant trophoblastic binucleated cell. Therefore the results were compared between cloned cattle and from AI or
natural mating, for assisting on detection of the reason of many placental alterations, embryonic losses, spontaneous abortion, post-natal mortality and large offspring syndrome
on laboratory-manipulated animals. The result suggests that the proteins caveolins -1 and
-2 (CAV-1 and CAV-2) are part of the caveolae composition and important structures related to the molecule transfer to the fetus, nourish it through endocytosis and pinocytosis.
INDEX TERMS: Caveolin-1 and -2 proteins, caveolae, placentation, immunolocalization, cattle.
RESUMO.- A utilizao da transgenia com a protena fluorescente verde (GFP) como marcador de clulas de origem
fetal nas placentas de clones bovinos servir de modelo
indito para estudo morfofisiolgico e imunolgico da interao materno-fetal, visto que possibilitar o seu mapeamento, diferenciando as clulas fetais das maternas. Tal
3
Department of Animal Sciences, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824, USA.
4
LMMD-Laboratrio de Morfofisiologia Molecular do Desenvolvimento,
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), Universidade
de So Paulo (USP), Av. Duque de Caxias Norte 225, Campus da USP, Pirassununga, SP 13635-900, Brasil.
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INTRODUO
o ndice de colesterol dessas estruturas, e ainda que os colesterois e glicosfingolpidos so os principais componentes das cavolas. Se o colesterol for removido da membrana plasmtica, a cavola desaparece (Rothberg et al. 1992,
Chang et al. 1994, Pelkmans & Helenius 2002).
Segundo Deurs (2003), Thomas & Smart (2008) e Hansen & Nichols (2010) a caveolina-1 expressa dentro da
maioria das clulas que possuem adipcitos, msculo liso,
clulas endoteliais, epiteliais e fibroblastos sendo necessria para a estruturao da cavola. A caveolina-1 e 3 pode
dar forma a cavolas invaginantes, j a caveolina-2 s apresenta forma invaginando quando em presena com a caveolina-1, caso contrrio, o Complexo de Golgi ir degrad-lo.
A caveolina-3 especfica do tecido muscular, encontrada
nos msculos esqueltico, cardaco e liso.
Este trabalho teve como objetivo observar a funo e
marcao das protenas caveolina-1, -2 na placenta de bovinos clonados e transgnicos, que esto envolvidas no transporte de substncias transplacentrias e internalizao celular destas, mediante a tcnica de imuno-histoqumica.
MATERIAL E MTODOS
Para a caracterizao das caveolinas -1 e -2 na placenta de conceptos bovinos clonados transgnicos, que expressam a protena
fluorescente verde, foram utilizados o crio e placentnios, listados no Quadro 1 e tambm os anticorpos primrios e secundrios
listados no Quadro 2.
As amostras de crio e placentnio so provenientes do Projeto Jovem Pesquisador FAPESP, Processo 2005/52676-1, sob responsabilidade da Profa. Adjunta Flvia Thomaz Verechia Pereira,
do Laboratrio de Morfofisiologia da Placenta e Embrio - L@
Quadro 1. Relao de tamanhos dos embries bovinos
clonados transgnicos expressando a protena fluorescente
verde - GFP (cm) e idade fetal (dias). Dracena/SP, 2007
GFP3.*1
GFP3.*2
GFP4
Animal Clonado Transgnico
GFP5
GFP6
GFP7
Animal Clonado Transgnico
GFP8
1,1 cm
34
0,65cm
34
1,0cm
28
Medida CR (cm) 61-75 dias gestao
5,5cm
60
5,5cm
60
5,66
60
Medida CR (cm) 76 90 dias gestao
16,0cm
90
Anticorpo primrio
Caveolina 1
Policlonal Coelho
1:400 SCBT (sc-894)
Caveolina 2
Policlonal Coelho
1:200 SCBT (sc-7942)
Anticorpo Secundrio
anti-camundongo
anti-coelho/anti-ovino
Kit LSAB,
(biotinilado)
Dako (K0690)
(Adaptado de Artoni et al. 2007).
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RESULTADOS
Fig.1. Imuno-histoqumica para a caveolina 1. (A-D) 53 dias de gestao, animal de gestao natural; interdigitaes materno-fetais.
(A-C) Imunomarcao positiva para a caveolina 1 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela) e vilos maternos (*). (D)
Controle negativo sem marcao. Barra= 5m.
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Fig.2. Imuno-histoqumica para a caveolina 1. (A-D) 60 dias de gestao, concepto GFP +; interdigitaes materno-fetais. (A,C) Imunomarcao positiva para a caveolina 1 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela) e vilos maternos (*). (B,D) Controles
negativos sem marcao. Barra= 5m.
Fig.3. Fotomicrografia Imuno-histoqumica para a caveolina 1. (A-D) 60 dias de gestao, concepto GFP + ; interdigitaes materno-fetais. (A,C) Imunomarcao positiva para a caveolina 1 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela) e vilos maternos
(*), clulas trofoblasticas gigantes binucleadas (seta), vasos sanguineos (v). B e D: controles negativos sem marcao. (A) Barra =
20m. (B) Barra = 20m. (C) Barra = 50m. (D) Barra = 100m.
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Fig.4. Imuno-histoqumica para a caveolina 1. (A-D) 90 dias de gestao, concepto GFP +; interdigitaes materno-fetais. (A,C) Imunomarcao positiva para a caveolina 1 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela) e vilos maternos (*) e epitlio uterino
(cabea de seta). (B,D) Controles negativos sem marcao. Barra = 5m.
Fig.5 Imuno-histoqumica para a caveolina 1. (A,B) 90 dias de gestao, concepto GFP +; interdigitaes materno-fetais. (A-C) Imunomarcao positiva para a caveolina 1 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela), vilos maternos (*), clulas trofoblsticas gigantes binucleadas (seta). (D) Controle negativo sem marcao. (A) Barra = 200m. (B) Barra = 100m. (C) Barra = 50m.
(D) Barra = 100m.
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Fig.7. Imuno-histoqumica para a caveolina 2. (A-D) 90 dias de gestao, concepto GFP +; interdigitaes materno-fetais. (A-C) Imunomarcao positiva para a caveolina 2 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela) e vilos maternos (*) (D) Controle
negativo sem marcao. (A) Barra = 100m. (B) Barra = 50m. (C) Barra = 50m. (D) Barra = 20m.
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Fig.8. Imuno-histoqumica para a caveolina 2. (A-D) 90 dias de gestao, concepto GFP; interdigitaes materno-fetais. (A,C) Imunomarcao positiva para a caveolina 2 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela) e vilos maternos (*) e epitlio uterino.
(B,D) Controles negativos sem marcao. Barra = 5m.
Fig.9. Imuno-histoqumica para a caveolina 2. (A-D) 90 dias de gestao, concepto GFP +; interdigitaes materno-fetais. (A-C) Imunomarcao positiva para a caveolina 2 no mesnquima (M), trofoblasto (T), vilos fetais (estrela), vilos maternos (*) clulas trofoblsticas gigantes binucleadas (seta) D: controles negativos sem marcao. (A) Barra = 200m. (B) Barra = 100m. (C) Barra = 50m.
(D) Barra = 200m.
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DISCUSSO
O presente trabalho descreve pela primeira vez a localizao e demonstra a expresso das protenas caveolinas-1
e -2, na placenta de conceptos bovinos clonados transgnicos com idade de 60 e 90 dias de gestao, e conceptos
de IA nos perodos de 30 e 53 dias de gestao, mediante
imuno-histoqumica.
Foi observado que as mesmas clulas presentes na placenta de conceptos bovinos de gestao natural aos 30 e
53 dias de gestao se encontram tambm nas placentas
de conceptos clonados transgnicos de 60 e 90 dias de gestao, concordando com Oliveira et al. (2010), que observou que as estruturas como clulas gigantes binucleadas,
vasos sanguneos presentes no crio e clulas epiteliais,
que formam a placenta de conceptos bovinos providos de
gestao natural no inicio da gestao, esto presentes em
todas as fases at o final desta e que de fato, as caractersticas histolgicas das placentas nas diferentes fases da
gestao so muito semelhantes, fato tambm relatado por
Miglino et al. (2007) comparando a placenta de bovinos
providos de gestaes normais com a de bovinos clonados.
Para uma especificidade maior, a regio da placenta
de bovinos estudada nesse trabalho foram as regies dos
placentnios, caracterizada pela presena de reas especializadas de trocas metablicas, os quase esto separados
por reas intercotiledonrias de crio liso, assim como as
estudadas por Pereira (2000), em bfalas.
Assis Neto et al. (2009), demonstraram o desenvolvimento inicial da placentao bovina (Bos indicus) do ponto
de vista do alantoide e mnio, que compe as membranas
fetais. Essas clulas so sustentadas por uma fina membrana basal e o mesnquima extraembrionrio, mesma regio
que obteve marcao positiva para as protenas caveolinas
-1 e -2, em nas amostras.
O trofoblasto um tecido que em seu desenvolvimento
apresenta-se extremamente vascularizado, corroborando
com nossos resultados em relao presena de grande
quantidade de vasos sanguneos, visualmente observados
no presente trabalho. Hard & Anderson (1982) e Ford et
al. (1984) afirmam que o fluxo uterino sanguneo aumenta acentuadamente a partir dos 20 dias de gestao at o
nascimento, assim os vasos sanguineos presentes so importantes para a vascularizao do sinccio trofoblstico,
por possurem paredes finas no apresentam nenhuma
resistncia ao fluxo sanguneo.
A constituio do trofoblasto caracterizada por uma
nica camada de clulas cuboidais a colunares altas, em
concordncia com trabalhos descritos anteriormente que
relataram tal semelhana entre placentas bovinas (Greenstein et al. 1958, King et al. 1979, King et al. 1980) e placentas bubalinas.(Sharma et al. 1983, Pereira 2000).
Neste trabalho foram observadas clulas trofoblsticas gigantes binucleadas, o mesmo tambm foi descrito
por Bosch (2006), como clulas trofoblsticas arredonPesq. Vet. Bras. 35(5):477-485, maio 2015
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