CLONAJE MOLECULAR

El proceso de clonacin consiste en la obtencin de un clon, entendido como un conjunto de elementos

genticamente idnticos entre s, y a su precursor. Su inters radica en su carcter biotecnolgico como
proceso de multiplicacin de molculas de ADN, ARN, clulas, tejidos u organismos complejos, mediante
mecanismos de manipulacin gentica.3
En particular la clonacin de molculas, sean stas genes o fragmentos de ADN o ARN, puede dividirse segn
el proceso experimental en celular y acelular.3

Clonacin Celular
El mtodo clsico de clonacin de cidos nucleicos es el que aprovecha la capacidad de las clulas para
replicar el ADN, relativo a la tecnologa del ADN recombinante. Para ello, el fragmento de ADN o ADNc a
clonar (inserto) se une a otro ADN (vector de clonacin) y la molcula de ADN recombinante formada se
incorpora a la clula anfitriona en cultivo donde tiene lugar la amplificacin por replicacin. Este proceso se
conoce como transfeccin de genes y sus objetivos centrales son la amplificacin y la expresin de los
productos gnicos.
La amplificacin permite el estudio de la secuencia y la estructura de cidos nucleicos, as como la deteccin
de mutaciones asociadas a enfermedad. Por su parte, la expresin de los productos gnicos permite el
estudio de los procesos de transcripcin, traduccin y regulacin. La produccin de protenas o ARN para su
estudio y aplicacin en el diagnstico, la teraputica, as como la ingeniera de protenas con manipulacin de
sus propiedades para uso en la industria, son utilidades prcticas de la evaluacin de los productos de
expresin gnica.3
Los genes tienden a estar desmetilados en los tejidos donde se expresan y metilados donde no se expresan,
especialmente en regiones de ADN llamadas "islotes Cpg". Multiples factores ambientales pueden modificar
este proceso y constituyen elementos reguladores de la expresin gentica (Regulacin Epigentica).
Para su evaluacin en los productos gnicos, encontramos tcnicas avanzadas para la deteccin de
metilaciones en los genes, como el MALDITOF MS (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight
mass spectrometry), la HPLC (High-performance liquid chromatography) y la MSP-R CP (Methylation-Specific
PCR).Esta ltima metodologa precisa de un tratamiento especial de la muestra con bisulfito sdico para
diferenciar las bases metiladas de las no metiladas. La Nested-MSP (MN-MSP) aparece como mtodo
alternativo a laMSP en aquellos casos en que se analicen muestras con baja cantidad o calidad de ADN
inicial, como puede ocurrir con las conservadas en parafina. 4

Clonacin Acelular
Cuando la clonacin no requiere la intervencin de clula alguna e implica la clonacin in vitro de molculas
de cidos nucleicos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa, estamos refirindonos a la clonacin
acelular.5, 6
La PCR es el ejemplo clsico de los ensayos de amplificacin de cidos nucleicos, considerada hoy como una
herramienta imprescindible en el laboratorio de biologa molecular e ingeniera gentica.
Esta tcnica est basada en el uso de cebadores y una enzima, ADN polimerasa termoestable (Taq
polimerasa), que permite amplificar el segmento sealado por los cebadores (oligonucletidos). Es un
proceso cclico de aproximadamente unas 40 repeticiones de tres pasos que suceden a diferentes
temperaturas: desnaturalizacin, alineamiento o fijacin de los cebadores y extensin. Esta progresin es
controlada en el tiempo y por los cambios de temperatura. 5, 6

Se han desarrollado variantes de la PCR que amplan su versatilidad dentro de las que se encuentran: PCR
mltiple, RT-PCR, PCR anidada, PCR de extensin solapada (mutagnesis), PCR in situ, PCR hot start,
amplificacin mediante activacin progresiva de la polimerasa, amplificacin con rampa decreciente de
temperaturas, amplificacin asimtrica, amplificacin cuantitativa (PCR en tiempo real), amplificacin en
chips.
La Taq polimerasa usa ADN como molde; cuando se parte del aislamiento de ARN se requiere de un paso
previo denominado reverso transcripcin (RT) conducido por enzimas. Hoy existen sistemas capaces de
realizar ambas funciones, tanto la RT como la polimerizacin del ADN, y entonces el proceso se denomina
RT-PCR. Despus de la amplificacin el producto de la PCR puede ser detectado por medios, como la
electroforesis en gel de agarosa o la electroforesis capilar.
Entre las ventajas actuales de la PCR se encuentran un menor tiempo de obtencin de resultados y una
mayor sensibilidad. Entre las desventajas resalta que es un proceder costoso, laborioso y requiere personal
altamente entrenado para su ejecucin.5, 6
Esta tcnica se ha utilizado en la evaluacin cualitativa de mediadores de la respuesta inmune en sistemas
de deteccin/no deteccin. Este mtodo es eficiente evaluando el polimorfismo gentico de mediadores
solubles y receptores involucrados en la respuesta inmunitaria. Su uso se ampla al rastreo de mutaciones,
tipado de ADN para trasplante, deteccin de microorganismos infecciosos, deteccin de enfermedades
inmunolgicas de origen gentico, entre otras aplicaciones. 3
El principio de la PCR a punto final se ha utilizado en sistemas de semicuantificacin de mediadores del
sistema inmune, como las citocinas, en las que el producto amplificado en diferentes diluciones se
comprueba hasta su no deteccin, y se multiplica por el coeficiente de dilucin. 5
Otro de los mtodos empleados en la evaluacin de mediadores inmunitarios utilizando PCR a punto final, es
la cuantificacin de la densidad de banda resultado de electroforesis segn los niveles de fluorescencia
emitida durante la fase de meseta del proceso de amplificacin, con la limitante de estar evaluando el
producto de una relacin que no es lineal con la concentracin inicial. En todos los casos se establecen genes
que sirven de control interno en la eficiencia de la reaccin. 7
RT-PCR en tiempo real
La RT-PCR ha demostrado ser un mtodo eficiente para la cuantificacin de la expresin de genes. La
tecnologa de la RT-PCR en tiempo real ha sido adaptada para realizar cuantificaciones. Existen dos mtodos
fundamentales para analizar los datos de la PCR en tiempo real: la cuantificacin absoluta y la cuantificacin
relativa. La cuantificacin absoluta determina el aporte del nmero de copias del transcripto de inters,
usualmente relacionando la seal de la PCR con una curva estndar. La cuantificacin relativa describe los
cambios en la expresin del gen diana en comparacin con algn grupo de referencia, tal como un control
sin tratar o una muestras en el tiempo 0 durante el perodo de estudio.8
La cuantificacin absoluta debe ser realizada en situaciones donde es necesaria la determinacin absoluta del
nmero de copias del transcripto. En algunas situaciones, es innecesaria, siendo suficiente el reporte del
cambio relativo en la expresin de un gen. Por ejemplo, determinar que un tratamiento increment la
expresin de un gen X en 2.5 rdenes puede ser ms relevante que determinar que el tratamiento
increment la expresin del gen X de 1 000 copias a 2 500 copias por clula. 9
La cuantificacin de los cambios relativos en la expresin gnica utilizando RT-PCR en tiempo real requiere
de ciertas ecuaciones, asunciones y su prueba para analizar los datos adecuadamente. El mtodo de Livako
2-Ctes el ms utilizado para calcular los cambios en la expresin gnica en este tipo de experimentos. 9
Para aplicar este mtodo es necesaria la seleccin de un control interno y un calibrador. El propsito de un
gen como control interno es normalizar las PCRs para la cantidad de ARN adicionado a las reacciones de
reverso transcripcin. Se ha visto que los genes "housekeeping" (del ingls) estndares son usualmente

suficientes como genes de control interno. Entre los controles internos apropiados para la PCR cuantitativa
en tiempo real se encuentran el GADPH, la -actina, la 2-microglobulina y el ARN ribosomal (ARNr). Estos
genes se expresan en los tejidos con diferente intensidad y esta informacin debe ser aprovechada para
escoger el control interno ms apropiado segn el tejido en estudio. 9
Los instrumentos utilizados para la PCR en tiempo real tienen un sistema de ciclos trmicos y de deteccin
de fluorescencia controlados por un programa informtico, y pueden monitorear la acumulacin de productos
en tiempo real midiendo el incremento en la fluorescencia durante cada ciclo de la reaccin para generar
resultados cuantitativos. En la actualidad existen varios tipos de reactivos para detectar los productos
amplificados con sensibilidad similar. Se clasifican de forma general en dos grupos: las sondas fluorognicas
y las molculas fluorescentes, que se unen al ADN.8
Son posibles los anlisis de elevados rendimientos de expresin de genes mediante la utilizacin de
tecnologas de microarreglos de ADN complementarios. En este caso, la expresin de un gran nmero de
genes puede ser monitoreada de forma simultnea, comparando sus perfiles en diferentes muestras,
combinando tcnicas de hibridacin. Entre las aplicaciones recientes de esta tcnica en el campo de la
inmunologa encontramos el monitoreo de cambios en la expresin causada, por ejemplo, en las citocinas
por la inflamacin aguda o crnica de diferente origen, o la comparacin entre las poblaciones celulares. 1013
Sin embargo, las bajas seales de hibridacin son difciles de interpretar; adems, el costo elevado de los
arreglos limita su uso en los estudios de rutina.

El aporte de la tecnologa a la biologa

A lo largo de la historia, el desarrollo de la tecnologa ha impactado notablemente
en el quehacer cientfico. En el campo de la biologa, especficamente, el
desarrollo disciplinar (conceptual y procedimental) ha ido siempre de la mano del
desarrollo tecnolgico.
En el siglo XVIII, el surgimiento de los microscopios permiti observar cosas y seres totalmente
desconocidos e inexplicables en esa poca. Al aumentar la capacidad de la visin humana
hasta lo inimaginable, surgieron nuevas ideas, como la de que todos los seres vivos estn
compuestos por clulas.
En 1895 se descubri una forma de radiacin electromagntica capaz de atravesar cuerpos
opacos y de impresionar pelculas fotogrficas: los rayos X. Con el desarrollo de esta tcnica
comenz un perodo de avances sin precedentes en la historia de la biologa, disciplina cuyo
avance estaba limitado por las tecnologas existentes en ese momento.
En 1953, gracias a la difraccin de rayos X, se logr uno de los conocimientos cientficos ms
significativos: la estructura de doble hlice del ADN. Este modelo cientfico marc un hito
en la biologa molecular, y tiene profundas consecuencias conceptuales, experimentales y
tecnolgicas. Naci as una nueva tecnologa: la del ADN recombinante, mediante la cual se
puede cortar, duplicar, identificar, secuenciar o manipular secuencias de genes. Esta tecnolog a
ha permitido, por ejemplo, crear organismos genticamente modificados.
Finalmente, gracias a los avances tecnolgicos, se gest y llev a cabo el proyecto ms
controvertido y ambicioso de la biologa actual: el Proyecto Genoma Humano, mediante el
cual se ha logrado leer el mapa gentico humano. La magnitud de este proyecto promete
revolucionar el futuro de una manera tan profunda que algunos han propuesto nombrar este
siglo como el "siglo de la biologa". Si bien los nuevos conocimientos reportan beneficios
directos en numerosas y diversas reas como las de medicina, ecologa o agricultura, sus
consecuencias ticas, sociales, legales impactan a toda la sociedad.
LA PCR Y LA BIOLOGIA MOLECULAR

La biologa molecular en los laboratorios de microbiologa clnica supone un gran apoyo a la hora de obtener
diagnsticos sensibles y especficos en el menor espacio de tiempo posible.
Estos mtodos no sustituyen, sino que complementan los ya usados mtodos microbiolgicos tradicionales,
el anlisis integrado de todos ellos est llevando a resultados ms fiables y eficaces.
De entre todas las tcnicas moleculares utilizadas, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha
adquirido un gran valor diagnstico, permitiendo la deteccin de agentes etiolgicos, y de sus genotipos de
virulencia y resistencia, con gran sensibilidad y rapidez.
La Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR)
La Reaccin en cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en ingls) es una tcnica que se utiliza
comnmente en los laboratorios de investigacin mdicos y biolgicos para amplificar (crear copias mltiples
de) el ADN, sin utilizar un organismo vivo, tal como la E. coli o una levadura. Asimismo, se emplea en una
variedad de tareas, tales como la deteccin de enfermedades hereditarias, la identificacin de huellas
digitales genticas, diagnstico clnico, anlisis forense del ADN, deteccin de patgenos en el hombre,
animales, plantas, y alimentos, e investigacin en biologa molecular (Saunders et al., 2001).
La PCR fue inventada a principios de los 80s por Kary Mullis, al cual le fue otorgado el premio Nobel en
qumica en octubre de 1993 por este logro, siete aos despus de haber publicado sus primeras ideas. La
idea de Mullis fue la de desarrollar un proceso a travs del cual el ADN se pudiera multiplicar artificialmente
a travs de ciclos repetidos duplicados llevados a cabo por una enzima llamada ADN-Polimerasa.
La ADN-Polimerasa se produce naturalmente en los organismos vivos, donde funciona para duplicar el ADN
cuando las clulas se dividen. Trabaja unindose a una sola hebra de ADN y creando una hebra
complementaria.
El proceso original de PCR actualmente ha sido mejorado mediante el uso de la ADN-Polimerasa que procede
de una bacteria termofilica que vive a temperaturas arriba de 110 C (en aguas termales). La ADNPolimerasa o Taq polimerasa tomada de estos organismos es termoestable (estable en las altas
temperaturas).
Actualmente la Taq polimerasa se utiliza frecuentemente en la prctica de PCR. Una desventaja de la Taq es
que incurre a veces en equivocaciones al copiar el ADN, conduciendo a mutaciones (errores) en la secuencia
del ADN (Saunders et al., 2001).
La PCR que ha sido utilizada por varios aos para la deteccin directa de muchos tipos de agentes
infecciosos en muestras clnicas, ha sido adaptada para ser usada como una herramienta de tipificacin. La
ventaja de la PCR es su habilidad para producir literalmente millones de copias de un segmento de ADN
particular con alta fidelidad en un tiempo de 3 a 4 horas (Tenover et al., 1997).
El procedimiento requiere una plantilla de ADN que puede estar presente en la muestra en pequeas
cantidades; dos primers oligonucletidos que flanquean las secuencias de la plantilla de ADN que va a ser
amplificado; y una DNA-polimerasa estable al calentamiento.
Un ensayo tpico de PCR requiere aproximadamente de 3 horas para completar 30 ciclos, donde cada ciclo
consiste de una fase de desnaturalizacin, en donde la doble hebra de ADN es fundida en hebras nicas; una
fase de alineacin, en donde los primers se unen a las secuencias blanco en las hebras separadas; y una
fase de extensin, en donde la sntesis de ADN procede de los primers a partir de cada hebra de la plantilla

de ADN, generando dos nuevas copias de la doble hebra de la plantilla original. Despus de cada 30 ciclos ,
una sola copia inicial de la plantilla de ADN tericamente puede ser amplificado a 1 billn de copias (Tenover
et al., 1997; Saunders et al., 2003).
El uso vlido de esta tcnica es crtico para mantener la calidad de muchas bases de datos de ADN
producidas. Es un hecho establecido que diversos factores pueden influenciar la validez de los resultados
obtenidos por PCR, incluyendo la presencia de componentes inhibitorios, la calidad de la plantilla de DNA, y
la carencia de optimizacin con respecto a componentes de la reaccin y las condiciones de los ciclos
termales.
Todos estos factores pueden comprometer la especificidad y sensibilidad de la reaccin, pudiendo llevar a
resultados falsos-negativos, falsos-positivos, o no reproducibles. Pero menos conocido, sin embargo, es la
variacin de los resultados en la PCR atribuidos debido al subptimo funcionamiento de los termocicladores,
siendo este el aspecto particular de la tcnica que constituye las bases de los estudios interlaboratorios
Utilidad de ensayos de PCR de genes ricketsiales en el diagnstico molecular de rickettsiosis humanas
Resumen
Introduccin Hasta la fecha no se ha evaluado la eficiencia de ensayos de PCR que amplifican ADN de
Rickettsia spp. en muestras clnicas. Nuestro objetivo fue determinar la sensibilidad y la utilidad para la
identificacin de especies de Rickettsia de mtodos de PCR que amplifican los genes ADNr 16S, htrA, gltA,
ompA y ompB para el diagnstico molecular de rickettsiosis.
Mtodos Estudiamos 72 muestras (sangre con EDTA, biopsias de piel y garrapatas) de 52 pacientes con
rickettsiosis en fase aguda y confirmada por PCR. Se realizaron PCR sencillas [ADNr 16S, gltA (extremo 5 ),
y htrA] y secuenciales (anidadas o semianidadas) [ompB, gltA (regin central) y ompA].
Resultados La mayor sensibilidad con PCR sencillas se obtuvo para gltA (extremo5 ). En PCR secuenciales,
los resultados ms sensibles se lograron utilizando ompB (83,3%). La mayor sensibilidad (100%) se obtuvo
tras realizar 3 PCR secuenciales. Segn las caractersticas clnicas, la PCR de ompA fue la ms til para
identificacin de especies de Rickettsia.
Conclusiones Los mtodos de PCR son vlidos para el diagnstico de rickettsiosis en fase aguda. Los 3
ensayos de PCR secuenciales aqu estudiados (ompB, gltA y ompA) son herramientas tiles para el
diagnstico molecular de rickettsiosis. La PCR de ompB es efectiva para un primer cribado y permite detectar
un alto porcentaje de muestras positivas. La PCR del gen ompA es la ms fiable para implicar una especie de
Rickettsia en patologa humana. No obstante, la epidemiologa, los sntomas clnicos y el vector deben ser
valorados para el diagnstico de rickettsiosis
Reaccin en cadena de la polimerasa (PRC) [Polymerase chain reaction (PRC)]
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR es una tcnica de biologa molecular
desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un
fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia
de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su
utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta
probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o
hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin

han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del
equipo necesario para llevarla a cabo.
a. Obtencin de secuencias especficas a partir de ADN clonado Es muy prctico utilizar la PCR para preparar
ADN de un fragmento clonado en un plasmido un fago. Es suficiente provisionarse de los nucletidos
complementarios a las secuencias del vector de un lado y del otro del fragmento a clonar. En el vector pGEM3Z que se presenta a continuacin, debe elejirse como primer sentido el complemento del promotor de T7, y
la secuencia del promotor SP6 como primer antisentido.
b. Analsis de mutacions La PCR puede adaptarse para poner en evidencia y analizar mutaciones que pueden
sucederse en las clulas eucariotas. Estas mutacions pueden ser ocasionadas debidoa errores, ya sea
insertos o elevamiento de insertos, reemplazo de nucletidos por otros (mutaciones puntuales). Estudios
pueden realizarse a partir de material aislado de una sla clula. Substracciones y adiciones pueden ser
determinados mediante la cuantificacin de la talla final del producto amplificado. Si se quiere analizar una
mutacin puntual, se debe realizar un secuencaje del producto PCR, puesto que stas mutaciones no
cambian lel tamao del producto obtenido.
c. adicin de secuencias tiles Se puede tambin aadir secuencias tiles, que contengan por ejemplo uno
ms sitios de restriccin, a las extremidades de los fragmentos amplificados. Ser suficiente de introducir
secuencias suplementarias en el lado 5' de los oligonucletides elejidos para realizar la PCR.
Reaccin en cadena de la polimerasa
Gel de agarosa teido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante el
uso de distintos cebadores, los cuales presentan un bajo nivel de especificidad.
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (polymerase chain
reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis,.1 Su objetivo es
obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora
basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta
mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos
derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, sobre todo en el
mbito de la investigacin forense, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a
cabo dicha tcnica.
Fundamento e importancia[editar]
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN,
para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN
recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan
a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por
Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la dcada de 1980. Inicialmente la tcnica
era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario
agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de
desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN
polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas

para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus
(polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth).
Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer
correccin de errores (Pfu, Vent).
Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite
calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la
reaccin. Muchos termocicladores modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como
enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared
muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el
equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin
de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos carecan de este
sistema y solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la
mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin
mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para
la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos
hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la
deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosa
Reactivos[editar]
Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 L.
Para realizar la tcnica se necesitan:2
Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una
de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de
dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar enfrentados y no a
mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen
los extremos de la secuencia que se desea replicar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio
(MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de
ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis
de ADN. Actan como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms
comn es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman
un ciclo.
Conceptos de la PCR[editar]
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mnima de ADN necesaria para que se produzca la amplificacin, es
decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea
positiva pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtencin de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la
especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen ms de un sitio al que se
pueden unir aparecer ms de un producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos, ya que puede
que una muestra sea negativa pero sea dada como positiva porque se ha amplificado una regin de ADN no
diana o que no se buscaba amplificar.
Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificacin. Este concepto es
de especial importancia en la secuenciacin, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad
permite evitar falsos positivos y/o negativos.
Ciclo de amplificacin[editar]
Esquema general de la PCR.
Grado de amplificacin segn el nmero de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto
especfico, 3: producto inespecfico); B concentracin de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la
concentracin de ADN respecto del tiempo.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura
llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza
con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un
choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso
para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en
cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de
ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los
cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar.
Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar la reaccin de PCR con la llamada "
tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicar calor a la parte de arriba del vial que
contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se
comercializaron y que no incluan este sistema tenan que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El
objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensacin de la muestra,
ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:lquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos
volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este
proceso fsico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.
Inicio[editar]

Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una
polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN
polimerasas que requieran activacin por calor.
Desnaturalizacin[editar]
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales est constituido). Este
paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms
habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la
proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente
empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la
desnaturalizacin.
Alineamiento o unin del cebador[editar]
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia
complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40
segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las
cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a
sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada.
Extensin o elongacin de la cadena[editar]
Acta la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del
cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva
hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3',
uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la
cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la
polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de
extensin depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a
amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar
mil bases en un minuto.
Elongacin final[editar]
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de
PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.
Conservacin[editar]
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a
corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos
de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis,
que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida
y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de
agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y
aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3 El/los tamao/s de los

productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene
fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.
Optimizacin de la PCR[editar]
En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima cantidad de ADN para obtener un
gran nmero de copias. Adems, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones
inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a
analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la
contaminacin con ADN extrao. Ejemplos en los que es especialmente importante evitar la amplificacin
son la deteccin de enfermedades (para no diagnosticar errneamente a los pacientes) o el diagnstico de
identidad y parentesco. Posibles precauciones son:
Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificacin: recogida, envo, custodia y procesado de
muestras.
Limpieza exhaustiva y esterilizacin (leja, etanol, luz UV, psoralenos...) de la superficie de trabajo entre la
realizacin de una PCR y la siguiente.
En laboratorios de diagnstico gentico, se suelen tener reas separadas de trabajo: un laboratorio para la
preparacin de la mezcla madre para la PCR, otro para la adicin del ADN a amplificar, otro donde se
encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.
Cabinas de seguridad biolgica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades.
Proteccin adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio:
guantes, bata, cubrezapatos, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnstico molecular es conveniente
que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.
Controles positivos y negativos.
Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una amplificacin no esperada se podr
comprobar si proviene de uno de los operarios.
Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de productos de PCR y en
evitar la formacin de productos falsos. Algunas consideraciones al disear estos cebadores son:
Se recomienda usar primers de ms de 15 nucletidos (18-30 nn) Normalmente, se suelen disear de 20
nucletidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy especfica, y los que se excedan
en longitud harn que perdamos rendimiento en la reaccin.
Los primers no deben diferir en ms de 3 bases.
La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que
empiecen y terminen con 1 2 bases pricas.
Se requiere una distribucin homognea de los cuatro nucletidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en ms de 5 C.

Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre s, o se formarn
dmeros entre ellos.
Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que ms se ajuste a nuestras
necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma ms
eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden
funcionalidad. Las ms habituales son la taq y la pfu.
Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas. El
termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello,
diversas casas comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados con materiales que hagan ms eficaces
el desarrollo y el transcurso de las etapas, adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio,
su manejo, mantenimiento y ubicacin ser clave.
Aparte de aspectos como la contaminacin y algn fallo en la hibridacin de primers, puede haber otras
complejidades que afecten a la PCR, como son:
Degradacin del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subptimas o
cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de amplificacin o resultados parciales. Un
caso particular es el "allele dropout", o bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser
homocigtico para dicho alelo.
Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso de la PCR. Requerir un
procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio antes de preparar la
mezcla de PCR. Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es necesario
una purificacin previa.
Modificacin del ADN: las sustancias como el formol (empleado en conservacin de tejidos) o la luz
ultravioleta modifican el ADN, alterando as los resultados de la amplificacin.
Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow", que consisten en que la
polimerasa amplifica una repeticin de ms de un microsatlite o repeticin en tndem.
Alelo fuera de patrn: un alelo amplificado puede no coincidir con el patrn de picos de la referencia. Esto es
seal de que algo ha ido mal durante la PCR.
Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma y el resultado sea una combinacin del
patrn de picos que cabe esperar tras la amplificacin de cada una de ellas por separado. Esto y el caso
anterior dificulta la interpretacin de los resultados.
Tipos de PCR[editar]
PCR anidada[editar]
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para
realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada,
es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una
amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y
especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificacin de un amplicn obtenido previamente,
los cebadores slo van a hibridar en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica banda. As,

evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los cebadores. La desventaja de esta tcnica es que no nos
permite cuantificar la muestra.
PCR de extensin solapada (Mutagnesis)[editar] Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos
(clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers) mutagnicos y otros 2. Se amplifica un fragmento
5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutacin. Se usan los productos en otra reaccin
para producir el ADN mutado de longitud completa
PCR in situ[editar] La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones
fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y
luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de
amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin.
PCR mltiple[editar]
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares
de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes,
para amplificar simultneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: informacin sobre varios locus en una
sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de
bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una
cuidadosa optimizacin del proceso.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)[editar]
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una
transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta
forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:
1.er paso: retrotranscripcin a partir del ARN.
2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estndar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)[editar]
Artculo principal: PCR en tiempo real
Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente
en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir
de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature).
Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas
especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al
fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto
para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar
cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas.

Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la
zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta,
presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce
cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3'
exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir
el nivel de amplificacin del gen.
La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo
real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin
en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin
del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de
amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada.
El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y
que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La
mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir,
permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos
reactivos determinados.
Tcnica TaqMan
Variaciones de la PCR bsica[editar]
PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para identificar o utilizar los
polimorfismos de una sola base (SNPs). Utiliza cebadores especficos para las secuencias normal y mutante.
El diseo ms habitual es un anlisis en dos tubos con dos cebadores: uno normal y otro mutante en
reacciones separadas junto con los cebadores control.
PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en
un fondo de oligonucletidos largos con secuencias solapantes cortas.
PCR asimtrica: usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rpidamente
examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.
Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se
emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos
repetidos de hibridacin-elongacin.
PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica durante las etapas iniciales de la PCR:
mientras que la mquina alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95) puede que ocurra la unin
de los cebadores y se produzca amplificacin, ya que en el camino para alcanzar estos 95 se pasa por la
temperatura de anillamiento (que es ms baja).
Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reaccin comience cuando la mquina ya est a 95,
debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos
conseguir mediante varias tcnicas:
- Aadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento

- Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reaccin. La cera se funde al alcanzar los 95
y es entonces cuando los componentes entran en contacto
- Anticuerpos anti-polimerasa que estn bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los 95 estos anticuerpos se
inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar
PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un mtodo de PCR para su uso en huella gentica, que
amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella gentica nica de
longitudes de fragmento amplificadas.
PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es conocida una secuencia interna.
Muy til en la identificacin de secuencias que flanquean insertos genmicos.
PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al ADN de inters y mltiples
cebadores hibridando estos linkers.
PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genmico.
Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA):
permite amplificar varias secuencias objetivo con un nico par de cebadores, evitando as las limitaciones de
resolucin de la PCR multiplex.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. En la tcnica clsica de PCR, se
cuantifica por aproximacin con diluciones y amplificacin de concentraciones conocidas de la secuencia
diana. Tambin se puede cuantificar por mtodo competitivo: se trabaja con concentraciones crecientes
conocidas de un fragmento que puede ser amplificado por los mismos oligos que la muestra de estudio, pero
de menor tamao que sta, de forma que con los resultados obtenidos se puede estimar qu concentracin
del competidor es equivalente a la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificacin en PCR est
optimizada en la tcnica de PCR en tiempo real.
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una secuencia desconocida que
flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta
de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base
desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando
gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de la PCR.
PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede ser usado en clulas vivas.
Ciclo trmico rpido para PCR:4 La amplificacin del DNA puede llevarse a cabo rpidamente, como
completar 30 ciclos en menos de 30 minutos: ciclo trmico rpido. Normalmente se ha considerado que las
etapas de cada ciclo son tres reacciones que ocurren en tres periodos separados y a tres temperaturas
diferentes. Este paradigma del equilibrio secuencial no tiene en cuenta que la temperatura de la muestra no
cambia instantneamente, de hecho, durante una PCR la muestra est la mayora del tiempo en
temperaturas de transicin. El ciclo trmico rpido aprovecha la ventaja de la instantnea desnaturalizacin
e hibridacin, cuyas temperaturas necesitan alcanzarse, pero no mantenerse. Adems, para productos
cortos, la extensin puede llevarse a cabo durante la transicin a la temperatura de extensin, y por lo
tanto, tampoco es necesario mantenerla. Un ciclo rpido podra entonces describirse como 94C, 0 seg;
55C, 0 seg y 72C, 0 seg. Como vemos, este modelo no ayuda, porque nos lleva solo a temperaturas

extremas y no nos da informacin sobre lo que pasa entre ellas. En cambio, en el paradigma cintico para
PCR de ciclo rpido se describe completamente el historial de temperaturas de la muestra. Se considera que
desnaturalizacin, hibridacin y elongacin ocurren en un rango de temperaturas y adems pueden solapar
temporalmente. Hay termocicladores que permiten que un ciclo se complete en 20-60 segundos, por lo que
30 ciclos tardan de 10 a 30 minutos.
Aplicaciones[editar]
La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como herramienta de deteccin y/o
generacin de acervos de fragmentos de ADN de inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo
en s mismo, por ejemplo en diagnstico clnico.
Investigacin[editar]
La PCR convencional, se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio debido a su robustez
y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de
inters.
Clonacin de un segmento de ADN mediante amplificacin con cebadores que contienen una secuencia apta
para la recombinacin dirigida con un plsmido.
Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de secuencias de ADN en vectores, como
pueden ser los plsmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta
secuencia que permite la interaccin posterior con otra complementaria situada en el vector de clonacin a
emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restriccin en dichos cebadores, de modo que, y si sta
no exista previamente en el fragmento y es nica en el vector, pueda efectuarse una ligacin mediante la
ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de restriccin apropiada de ambos elementos. Otro mtodo
asimilable a esta va es el empleo de la recombinacin dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una
secuencia que faculta a una recombinasa la recombinacin dirigida con un vector dado.5
Medicina[editar] En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis
(Coleman y Tsongalis, 2006):
Una de las principales aplicaciones de la PCR es hacer pruebas genticas para detectar mutaciones en el ADN
que provoquen algn tipo de enfermedad.El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el
genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. As, se
pueden hacer anlisis del ADN de los futuros padres para ver si son portadores, o analizar el ADN de sus
hijos por si estn afectados por una enfermedad hereditaria. Para el anlisis prenatal, las muestras de ADN
pueden obtenerse a partir de la amniocentesis, de la muestra de las vellosidades corinicas o incluso a partir
de algunas clulas fetales que circulan por el torrente sanguneo de la madre. El uso de la PCR tambin es
esencial para el diagnstico gentico preimplantacional donde se pueden analizar las clulas del embrin
para buscar posibles mutaciones.
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se
amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas caractersticas de tamao o
temperatura de fusin que permitan identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que
implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin por
VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la
enfermedad.6

La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de
sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones en el donante (como VIH
o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se
pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas
muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se
encuentre el causante.
Tambin se puede usar la PCR como parte de las pruebas realizadas cuando se hace un trasplante de tejidos.
En 2008 se propuso usar esta tcnica para reemplazar las pruebas tradicionales con anticuerpos.7
A veces, mediante la PCR se pueden hacer terapias personalizadas para pacientes con ciertos tipos de cncer
que producen mutaciones en los oncogenes a partir de la deteccin de estas mutaciones.
Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses[editar]
Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la medicina y antropologa forense se han visto
enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el
conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los
materiales biolgicos que ms informacin puede proporcionar es el ADN.
La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos perodos si las
condiciones son propicias.5 En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son
extraordinariamente pequeas o estn deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona
cantidades tiles para posteriores pasos de anlisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material
recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teora basta una
sola molcula para que el proceso pueda tener lugar. Tambin debido a la naturaleza de la tcnica y su
propsito de amplificacin de fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que este ADN pueda ser
empleado como molde para una reaccin de PCR.
En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que an no se han
degradado. Algunos lugares en que el ADN podra preservarse son la brea las cenizas volcnicas, el mbar,
hielos histricos polares o glaciares y ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales de apatita de
restos de esqueleto,8 siendo posible de ese modo caracterizar cadveres, fsiles u otros restos mediante
genotipado por anlisis de microsatlites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo,
como pueden ser los realizados mediante el ADN genmico del hombre de Neanderthal.9 El propsito sera
utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudios filogenticos o etnogrficos o de
poblaciones mediante la comparacin de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separacin
evolutiva de dos especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona o para obtener pruebas a partir
de muestras mnimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos (Butler,
2005).
Agronoma y diversidad Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genticas de individuos
concretos, dentro del marco de la gentica forense, existen mtodos basados en la PCR que permiten
discernir entre grupos infraespecficos de cultivos de inters agronmico; por ejemplo, de cultivares.10 Para
ello, se emplean oligonucletidos de un tamao lo suficientemente pequeo como para que ceben de forma
relativamente inespecfica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrn de bandas discreto e

interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar a los
individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que divergen...
Historia[editar] Electroforesis de protenas SDS-PAGE resolviendo la polimerasa Taq.
En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology describi por primera vez un
mtodo que usaba enzimas para replicar una secuencia pequea de ADN con cebadores in vitro.11 Sin
embargo, este temprano ejemplo del principio bsico de la PCR no recibi mucha atencin, y la invencin de
la reaccin en cadena de la polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a Kary Mullis.12 13 Mullis gan el
Premio Nobel por su trabajo en PCR.
Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa que se use sea capaz de soportar las altas
temperaturas de >90 C necesarias para la separacin de las dos hebras de ADN de la doble hlice tras cada
ciclo de replicacin. Las ADN polimerasas que se utilizaron originariamente para los experimentos in vitro
previos a la PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que los primeros
procedimientos para replicar el ADN eran muy ineficientes, largos y requeran grandes cantidades de ADN
polimerasa.
El descubrimiento en 1968 de la polimerasa Taq, una polimerasa de ADN extrada de la bacteria termfila
Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 C), elimin los grandes
inconvenientes del mtodo de la PCR. Este ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo
activa hasta despus de la desnaturalizacin del ADN, eliminando la necesidad de aadir a la reaccin nueva
polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permiti automatizar el proceso, antes tan tedioso,
acoplndolo al uso del termociclador.
Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba en Emeryville, California (EE UU), para
una de las primeras empresas biotecnolgicas, Cetus Corporation, donde era responsable de sintetizar
cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que concibi la idea para la PCR una noche mientras cruzaba la
Autopista de la Costa Pacfica (EE UU) en su coche.12 Estaba imaginando una nueva forma de analizar
mutaciones en el ADN cuando se percat de que, en lugar de eso, haba inventado un mtodo para
amplificar regiones especficas de ADN mediante ciclos de duplicacin repetidos usando ADN polimerasas.
Mullis atribuye la invencin de esta tcnica a los efectos de la droga psicodlica y alucingena LSD.14
En la revista Scientific American, Mullis resumi el procedimiento: "Comenzando con una nica molcula del
material gentico ADN, la PCR puede generar 100 billones de molculas iguales en una tarde. La reaccin es
fcil de hacer, no requiere ms que un tubo de pruebas, unos pocos reactivos simples y una fuente de
calor."15 Fue premiado con el Premio Nobel de Qumica en 1993 por su invencin, y siete aos despus, l y
sus colegas del Cetus llevaron a la prctica su propuesta. Sin embargo, han aparecido controversias y
diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales y prcticas de otros cientficos al trabajo de Mullis,
y sobre si l fue el inventor nico del principio de la PCR.
Guerras de patentes[editar] La tcnica de la PCR fue patentada por Cetus Corporation, donde Mullis
trabajaba cuando invent la tcnica en 1983. La enzima polimerasa Taq fue tambin cubierta de patentes.
Tuvieron lugar varios pleitos relacionados con la tcnica, incluyendo un pleito fracasado generado por
DuPont. La compaa farmacutica Hoffmann-La Roche adquiri los derechos de las patentes en 1992 y
actualmente mantiene las que an estn protegidas.16 17
Proceso para la realizar la tcnica PCR

La PCR, o Reaccin en Cadena de Polimerasa, es una tcnica biomolecular que nos permite identificar
cualquier dato de nuestro cdigo gentico a travs de la amplificacin selectiva de fragmentos de ADN. Su
importancia para el avance de la tecnologa gentica fue de gran magnitud que le otorg a su creador, Dr
Kary Mullis, el Premio Nobel de Qumica en 1993. Para su realizacin se necesita: la muestra de ADN a
investigar (ADN molde); buffer, cloruro de magnesio, DNTPs, un par de cebadores o primers mnimo, Taq
Polimerasa y agua. Adems todo esto se realizar de un laboratorio, la mezcla dentro en un tubo Eppendorf
y la mquina a utilizarse ser el termociclador. EL proceso de la PCR consiste en tres pasos bsicos, que
describiremos a continuacin.
El primer paso es la desnaturalizacin, que consiste en separar las dos hebras de las cuales est constituido
el ADN molde. Este paso se puede realizar de distintos modos, el ms usado es exponer el ADN a
temperaturas de 95 C, aproximadamente. La temperatura a exponerse depender del largo de las hebras y
del contenido de guanina y citosina, por ser su unin ms fuerte y resistente a la desnaturalizacin. Otros
mtodos que menciona Passarge, raramente usados, son la adicin sales o agentes qumicos. (Passarge,
2010, pg. 62) Como resultado de este paso obtenemos dos hebras de ADN con nucletidos expuestos.
A continuacin tendremos la hibridacin de los primers, que son pequeas secuencias de nucletidos
diseados para buscar un fragamento de ADN especfico. (Dra. Celia E. Coto, 2003) En este caso el primer se
unir al fragmento que queremos identificar o amplificar por complementariedad de bases. Esto se da a una
temperatura de 60 C y durante 30 segundos, aproximadamente. La temperatura y duracin depender del
primer que se est utilizando. As obtenemos el lmite de la regin de la molcula que ser amplificada.
Finalizamos con la polimerizacin de la cadena complementaria del ADN molde partiendo de los primers
como soporte inicial. La Taq Polimerasa ser la encargada de la sntesis de la nueva hebra de ADN
complementario aadiendo DNTPs, que son nucletidos sueltos. (Jean-Pierre Herveg, 2006) La temperatura
para la Taq Polimerasa es de 72 C aproximadamente y el tiempo depender del primer nuevamente.
Podremos obtener cuatro hebras de ADN, dos hebras del ADN molde y otras dos clonadas.
Para ver nuestros resultados se debe realizar un gel de electroforesis y as identificar si lo que buscbamos
se encontraba en el ADN de la muestra y tambin podremos saber en qu proporcin. Lo cmodo de este
mtodo es que se puede obtener la amplificacin o determinacin del fragmento deseado, incluso realizando
20 veces estos simples pasos. Es as que por su alto rango de sensibilidad y por ser tan especfico, se ha
vuelto el mejor mtodo para identificar virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas
o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado.

A. MTODOS DE LA PCR UTILIZADOS EN LOS DIAGNSTICOS MOLECULARES

RUTINARIOS 1. Principios de la tcnica de PCR La reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reaccin de
amplificacin basada en enzimas. El trmino reaccin en cadena se
refiere a varios ciclos de copiado de un tramo especfico de ADN, en este
caso a partir del genoma del agente infeccioso. La regin que hay que
amplificar est definida por dos (o ms) secuencias de nucletidos
cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a la
secuencia diana. Los cebadores, oligonucletidos cortos que son
complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de
ADN para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se
desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la
secuencia diana uniendo los nucletidos libres a los cebadores.

Repitiendo el rgimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la

cantidad de ADN diana copiado que se obtiene aumenta de forma
exponencial, produciendo suficiente para operaciones posteriores, tales
como la deteccin, la clonacin y la secuenciacin. La sensibilidad de
diagnstico de la PCR es muy alta, porque se producen varios millones
de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reaccin
puede ser tambin muy alta, ya que est determinada por las
secuencias especficas de nucletidos de la diana seleccionada, as como
por el diseo del cebador. Los cebadores pueden disearse para detectar
secuencias especficas de nucletidos en los genomas de los agentes
infecciosos diana seleccionados o pueden disearse para ser
complementarios de regiones ms conservadas, permitiendo de este
modo la deteccin de miembros dentro de una familia o gnero del
agente infeccioso. Se ha publicado una sinopsis ms detallada de las
tcnicas moleculares (17). a) Amplificacin del ADN Si el genoma del
agente infeccioso es de ADN, la amplificacin se realiza directamente,
con o sin purificacin previa del ADN diana. En muchos casos el empleo
de ADN extrado y purificado del material que se va a utilizar en la
prueba, dar como resultado un aumento en la sensibilidad analtica y
diagnstica. b) Amplificacin del ARN (PCR de trascripcin inversa) Los
genomas de muchos agentes infecciosos contienen cido ribonucleico
(ARN) que no se puede amplificar directamente mediante la PCR. Para la
amplificacin por PCR se necesita un ADN diana monocatenario, y ste
no est disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por
la adicin de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la
transcriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a ADN complementario
(ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el
ensayo de la PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripcin
inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reaccin de trascripcin inversa se
realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere despus a un
tubo nuevo para la reaccin de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de
polimerasas de ADN termoestables con actividad transcriptasa inversa y
tampones especficos en los cuales las polimerasas RT y ADN estn
activas. Ambas permiten una reaccin RT-PCR que tiene lugar en el
mismo tubo en secuencia directa sin manipulacin adicional y con
menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayora de los casos
ser necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripcin inversa.
c) Deteccin del amplmero por la PCR El producto PCR o amplmero
puede detectarse utilizando varios procedimientos. El ms comn
incluye la deteccin no especfica del producto de la PCR, basada en una
medida amplmera utilizando electroforesis en gel de agarosa y tiendo
el ADN con un tinte intercalado no especfico, como el bromuro de etidio
(ahora es posible reemplazar este ltimo con tintes no cancergenos, por
ejemplo GelRed, o el reconocimiento especfico de la secuencia diana
amplificada utilizando una transferencia de ADN por Southern blot
seguido de hibridacin con sondas de oligonucletidos complementarias
de la secuencia diana. Las sondas de hibridacin pueden ser, enzima,

marcado como quimioluminiscente o radionucletido para permitir la

deteccin de la secuencia diana especfica. Ms adelante se dan algunos
ejemplos de mtodos de la PCR utilizados actualmente. 2. PCR
convencional En la PCR convencional (o simplemente PCR) se utiliza un
par de cebadores oligonucletidos para amplificar una parte pequea del
genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analtica es relativamente
alta con un nmero mnimo de 100 a 1000 copias de ADN diana
detectable. La especificidad analtica puede ser alta, dependiendo de la
seleccin de la diana, del cebador designado, y de la optimizacin de la
prueba. La sensibilidad y especificidad analticas se pueden mejorar
mediante la aplicacin de la PCR anidada (vase ms adelante el punto
3). La especificidad y la sensibilidad se pueden mejorar posteriormente
utilizando el mtodo Captulo 1.1.5. Validacin y control de calidad de
los mtodos de PCR utilizados en el diagnstico de las enfermedades
infecciosas Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 3 Southern
blot seguido de las sondas de hibridacin, pero esto lleva mucho tiempo
y requiere el manejo en el laboratorio de ADN amplificado, y la
interpretacin de los resultados puede ser tcnicamente subjetiva. Esta
deteccin de los mtodos, basada en la complejidad y los gastos, no es
una prctica comn hoy en da en los laboratorios de diagnstico. 3. PCR
anidada En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de
amplificacin con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e
internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una
sensibilidad y especificidad analticas superiores si se comparan con las
pruebas de la PCR convencionales. Sin embargo existe un alto riesgo de
contaminacin cruzada dado que los productos de la primera tanda de
amplificacin se utilizan a menudo como molde inicial para la segunda
tanda, dando como resultado la transferencia de material entre los
diferentes tubos de PCR. La PCR anidada ha sido ampliamente
reemplazada por los protocolos de la PCR en tiempo real, los cuales son
igualmente sensibles, pero tienen un riesgo de contaminacin mucho
menor. La sensibilidad analtica es tpicamente
Ventajas de los ensayos de PCR
Anlisis
de PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) - el mtodo ms moderno y preciso para el
diagnstico de laboratorio de muchas enfermedades.Para el descubrimiento de este mtodo de
estudio de American Scientists Carrie Myullis en 1993 fue galardonado con el Premio
Nobel.Utilizando el anlisis de PCR para la infeccin aplicable para enfermedades bacterianas y
virales para.Al mismo tiempo, el estudio es capaz de diagnosticar la enfermedad en la
enfermedad aguda, crnica y poco conocido.Quin es el diagnstico por PCR, y cuando se
utiliza?
por el mtodo de anlisis de reaccin en cadena de la polimerasa infeccin
PCR es la identificacin de agentes infecciosos mediante la determinacin de su material
gentico (ADN o ARN) en las muestras obtenidas del paciente.

El reactor de investigacin se coloc en una muestra especial de material biolgico (sangre,

secreciones, frotis), que presumiblemente puede ser microorganismos de ADN.El material de la
muestra se aade enzimas especiales.Estas enzimas tien
en la capacidad de unirse al ADN y un microorganismo para sintetizar una copia.ADN sntesis
transcurre la reaccin de una copia de una reaccin en cadena.En su primera etapa de una sola
molcula de ADN formado por dos nuevas molculas.En la segunda etapa de los dos de cuatro
nuevas molculas estn formadas, y as sucesivamente.Despus de mltiples ciclos de reaccin
generada una sola copia de ADN varios cientos o miles de copias.Un gran nmero de copias del
ADN del microorganismo para analizar y comparar fcilmente con la base de datos, que contiene
informacin acerca de la estructura del ADN de varios patgenos.Anlisis
PCR utilizado para el diagnstico de infeccin de muchos patgenos, incluyendo los patgenos de
las infecciones "ocultas" que se caracterizan asintomtica.La mayora de los laboratorios llevan a
cabo investigaciones de este mtodo para las siguientes infecciones:

genital por clamidia y las vas respiratorias;

hepatitis B, C;
micoplasmosis genitales y del tracto respiratorio;Sistema genitourinario
ureaplasmosis;
candidiasis de los genitales;Tricomoniasis
;Tuberculosis
;
mononucleosis infecciosa;
herpes infeccin;
VIH (SIDA);Infeccin
VPH;
helikobakterioz.
Los expertos apuntan a los muchos beneficios del anlisis de PCR.
1. diagnstico directo de la presencia del patgeno.La mayora de los mtodos de diagnstico
convencionales detectan marcadores de protenas, que son productos de microorganismos.Slo
se indica la presencia de infeccin.PCR indica directamente la presencia de un agente infeccioso
en particular en el cuerpo.
2. Un alto nivel de especificidad.El mtodo PCR tiene alta especificidad debido a que el material
en la muestra a identificar fragmento de ADN nica que es caracterstico solamente de un
patgeno especfico.Esto evita que los resultados falsos de las pruebas.
3. La alta sensibilidad del anlisis de PCR.Este mtodo hace posible el estudio de clulas
individuales detectar incluso los virus o bacterias.Determinacin del nmero de patgenos es
particularmente importante en el caso de patgenos oportunistas, que se convierten patolgica
solamente por el aumento de su nmero.
4. La capacidad de diagnosticar los mltiples patgenos en un material de muestra.La similitud
de la composicin qumica de los cidos nucleicos dentro del ADN o ARN de patgenos, para
aplicar este mtodo permite la identificacin de diferentes infecciones.
5. Capacidad para detectar infecciones latentes y crnicas.Adems, el anlisis metodomPTsR
muy eficaz contra microorganismos con alta variabilidad antignica y parsitos intracelulares.
6. Alta velocidad de anlisis por PCR.Anlisis

transcripcin PCR se suele formular las designaciones de "negativo" o "positivo".Anlisis

PCR positiva indica que el material en el estudio de la muestra identific la infeccin rastros.Por
lo tanto, este resultado indica la presencia en el cuerpo de una infeccin particular.Resultado
negativo
PCR significa que en una muestra de estudios de materiales biolgicos no mostr trazas de la
infeccin.Un resultado negativo en la mayora de los casos indica que hay una infeccin en el
cuerpo, que est tratando de encontrar este mtodo de anlisis.Anlisis
PCR para la hepatitis C Anlisis
PCR para la hepatitis C - pruebas de laboratorio de sangre, a travs del cual revela el

material gentico (partcula RNA), hepatitis partcula de virus C de ARN del VHC puede ser
determinada por este mtodo cualitativa y cuantitativamente.Anlisis
cualitativa indica la presencia de virus de la hepatitis C en la sangre de un paciente.Este estudio
se realiz en pacientes cuya sangre encontrado anticuerpos contra la hepatitis C. En el
desciframiento de anlisis de PCR para la hepatitis C se puede especificar: "detectado" o "no
encontrado".Norma se considera la entrada "no encontrado".El resultado es "encontrado" puede
indicar que el virus se multiplica en el cuerpo y en constante infecta las clulas del hgado.El
anlisis cualitativo por este mtodo tiene una cierta sensibilidad (de 10-500 IU / ml).Al llevar a
cabo el diagnstico por PCR en pacientes con baja concentracin de virus (en tratamiento
antiviral) es deseable utilizar un sistema de diagnstico que tiene la sensibilidad no menos de 50
UI / ml.
Anlisis cuantitativo de PCR de VHC (carga viral) - Investigacin de la concentracin de virus en
la sangre.La carga viral se llama el nmero de unidades de la ARN viral que est presente en un
cierto volumen de sangre (normalmente 1 ml, 1 cm3).En la decodificacin de anlisis de PCR es
la cantidad designada en las figuras, las unidades - UI / ml.
Cuanto mayor sea la carga viral en una persona, mayor es el riesgo de transmisin por verticales
o durante las relaciones sexuales.Adems, la alta carga viral obstaculice de forma significativa la
terapia antiviral.
De acuerdo con la explicacin del anlisis de PCR para la hepatitis C se considera que es una
carga muy por encima de 800.000 UI / ml o 800?103. La carga viral mayor que 1?107 - muy
alto.Anlisis
PCR en un clamidia
Chlamydia - es parsitos intracelulares que ocupan una posicin intermedia entre la rickettsia
(bacterias) y los virus.La infeccin afecta a los tejidos de las mucosas del tracto genital, tracto
respiratorio, la conjuntiva.
patgenos urogenitales por clamidia - clamidia Chl.Trachomatis es muy difcil de detectar debido
a su doble naturaleza.El mtodo de anlisis de PCR para la clamidia tiene suficiente sensibilidad
para la deteccin cualitativa de la presencia del patgeno y el diagnstico de la etapa aguda de

la enfermedad.El material para el anlisis de PCR para la clamidia es el residuo de orina, semen,
fluido prosttico y raspados de la uretra y la conjuntiva.
resultado del anlisis de PCR puede ser negativo o positivo.En caso de anlisis negativo en forma
por lo general indica que Chl.Trachomatis no se detecta, no hay infeccin, la fase aguda de la
enfermedad est ausente.Con un resultado positivo del anlisis de los resultados de PCR indicar
en el formulario: Chlamydia, que es causada por Chl.Trachomatis, la fase aguda de la infeccin
primaria o reactivacin de la infeccin.

Qu es la PCR?
La PCR ampla sus dominios
EDUARDO LPEZ COLLAZO
Unidad de Investigacin del Hospital Universitario La Paz, de Madrid
El autor de la tribuna analiza la evolucin que ha sufrido la tcnica diagnstica de reaccin en
cadena de la polimerasa, que naci como una herramienta de biologa molecular y que poco a
poco ha ido ampliando sus indicaciones, siendo clave en la identificacin de virus y retrovirus.
Desde que Kary B. Mullis inventara la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), a principios
de la dcada de 1980, en el horizonte de este campo ha ido apareciendo una gran cantidad de
aplicaciones al diagnstico clnico. Esta tcnica ha tenido tanta influencia en el desarrollo de la
biologa y, por consiguiente, en la medicina, como el descubrimiento de la estructura de doble
hlice del material gentico (ADN). El hecho de poder amplificar mnimas cantidades de ADN
de manera especfica ha propiciado su aplicacin en la deteccin de microorganismos difciles
de cultivar, infecciones virales recientes, polimorfismos que causan enfermedades y
marcadores de cncer, entre otras muchas aplicaciones. Hoy por hoy, la medicina no puede
caminar sin ella.
Explotando la funcin original de las polimerasas -enzimas cuya actividad es copiar
secuencias de ADN, esta tcnica nos permite realizar un fotocopiado molecular de una parte
del material gentico. Por ello, la presencia de nfimas cantidades de una secuencia
especfica, como por ejemplo la secuencia que caracteriza a un virus, se puede amplificar
hasta hacerla visible y, por lo tanto, detectable. En un principio la PCR slo era aplicable a la
deteccin de ADN; sin embargo, utilizando un paso previo y con ayuda de las
retrotranscriptasas, podemos detectar tambin ARN, que es el material gentico presente en
los llamados retrovirus, como el VIH o la hepatitis C. Esta variacin es conocida como RT-PCR
(Retrotranscriptase Polymerase Chain Reaction).
La amplificacin de una porcin del material gentico perteneciente a un microorganismo o a
un virus nos informa solamente de la presencia o no de esta infeccin en el paciente
analizado. Esto ltimo se conoce como PCR cualitativa. Sin embargo, si se monitoriza el

proceso de amplificacin de la secuencia en cuestin a tiempo real, podemos cuantificar la

cantidad de material gentico que est presente en la muestra. La Q-PCR en tiempo real nos
posibilita no slo conocer la presencia de la infeccin sino tambin cuantificar el nmero de
copias existentes, convirtindose en instrumento crucial para la determinacin de la carga
viral. Por otra parte, la posibilidad de poder amplificar varias secuencias especficas de un
mismo espcimen (multi-PCR) nos aporta una informacin completa de la presencia de la
infeccin.
Nuevas indicaciones
Es evidente que esta herramienta, que en principio se entendi como otra ms de la biologa
molecular, tiene un amplio espectro de aplicacin en el diagnstico. En el campo de la
microbiologa, la PCR est llamada a sustituir completamente a gran cantidad de los mtodos
actuales de deteccin de agentes patgenos. No slo gana, por amplia diferencia, en cuanto a
la posibilidad de detectar la presencia de microorganismos difciles de cultivar; tambin facilita
tener resultados fiables en un intervalo de tiempo corto -horas-, mientras que los cultivos
necesitan das.
En la actualidad se han desarrollado ensayos de PCR para la deteccin de Listeria,
Legionella, Borrelia, Leptospira, Chlamydia, Neisseria y Treponema, entre otros.
Los resultados obtenidos por PCR han demostrado correlacionar erfectamente con la
informacin que aportan los cultivos, con la diferencia de que, para estos ltimos, se tuvo que
esperar unos siete das, mientras que los resultados de la PCR se obtuvieron en horas. Cabe
destacar que la sensibilidad de esta tcnica es mil veces mayor que la que tiene un cultivo.
Otras aplicaciones interesantes, y cada vez ms extendidas, son la determinacin de la
resistencia a antibiticos de bacterias aisladas de pacientes y la deteccin de parsitos tales
como Toxoplasma, Trypanosoma y Cryptosporidium.
Cncer y virus
En el diagnstico del cncer la aplicacin de la PCR ha sido esencial para determinar la
presencia de marcadores especficos del desarrollo de esta enfermedad, as como la aparicin
de polimorfismos que inducen eventos oncolgicos. Un ejemplo claro lo constituyen los niveles
de expresin de factores como HER-2 y la topo IIa, genes importantes en el desarrollo del
cncer de mama, fcilmente detectables por PCR en tiempo real. Sus niveles indican una
mala prognosis para el paciente en cuestin. Por otra parte, la localizacin de mutaciones en
genes como el p53 es otra de las aplicaciones de la PCR al diagnstico en el campo de la
oncologa. Sin embargo, una de las reas donde esta tcnica ha tenido mayor impacto es en
la deteccin y cuantificacin de virus y retrovirus. Tres factores han contribuido a ello: son
agentes patgenos con un material gentico muy simple, el aislamiento de su ADN o ARN es
sencillo y, por ltimo, el diagnstico por cultivo es difcil y laborioso.

Una larga lista de ensayos de PCR se ha establecido para detectar virus. En este apartado
merecen una especial mencin los retrovirus que provocan el sida, ya que la PCR ha
contribuido a eliminar el periodo ventana en su deteccin. Los mtodos ms tradicionales,
basados en la aparicin de anticuerpos o la deteccin de protenas del virus (Elisa o Western
Blot), necesitan unos niveles de contaminacin elevados o un perodo de incubacin largo (de
tres a seis meses desde la infeccin).
No obstante, con la PCR se puede reconocer su presencia transcurridas 48-72 horas de la
contaminacin, siendo ms prudente esperar una semana para eliminar posibles falsos
negativos. Por otra parte, la posibilidad que brinda la cuantificacin de las copias existentes
ayuda en el ajuste del tratamiento. La precisin de la PCR logra diferenciar la presencia de
distintos subtipos de un mismo virus cuya apariencia es indistinguible por mtodos ms
clsicos.
Otros campos de aplicacin de esta tcnica son las enfermedades neurodegenerativas y el
diagnstico prenatal. Mientras que en el primer grupo el uso de la PCR se circunscribe a la
deteccin de polimorfismos que sirven para la clasificacin de este tipo de enfermedades, en
el caso del diagnstico prenatal se aplica para identificar posibles fallos genticos en los fetos.
Recientemente se ha abierto una amplia gama de posibilidades para el diagnstico no invasivo
prenatal usando la PCR, debido a que se ha identificado la presencia de ADN fetal en la
circulacin de la madre, posibilitndose la extraccin de material gentico fetal desde el
plasma materno.
La precisin y fiabilidad de esta tcnica ha eliminado el antiguo temor que suscitaba la
aparicin de falsos positivos/negativos. Sus mltiples y muy variadas posibilidades nos hacen
recomendar el estudio de las peculiaridades de cada diagnstico donde se aplica la PCR,
tendiendo otro puente de unin entre la biologa molecular y el diagnstico clnico.