Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
ISSN 2415-251X
Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
EDITOR DE LA REVISTA
Licda Maria Remey Gordillo
Coordinadora General Area de Microbiologia y Hospital Roosevelt
Dr. Carlos Meja Villatoro
Jefe de la Clnica de Enfermedades Infecciosas
Hospital Roosevelt
CONTRIBUCIONES
Autores:
Licda Maria Remey Gordillo
Licda. Julia Mirelia Cali Arriaga
Licda. Jackelyn Paola Tol Urizar
Licda. Alejandra Castillo
Licda. Veronica Itzep
Licda. Rosa Alvarez
Licda. Diana Baldizn
Licda. Margarita Boloix
Sr. Hctor Cat
Licda. Lis Jerez
Licda. Ana Luca Lemus
DIAGRAMACIN Y DISEO
Mellross Elswith Salazar Alvarez
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Editorial
La Microbiologa Clnica tiene como objetivo principal establecer el agente causal de las infecciones que afectan al hombre. El Diagnstico debe ser certero y oportuno, capaz de dirigir un
tratamiento adecuado que conlleve a la recuperacin del paciente. El logro del diagnstico se
basa en la estandarizacin adecuada de los procedimientos y el conocimiento y uso adecuado
de diferentes tecnologas dirigidas al tipo de microorganismo sospechoso.
En respuesta a las diversas necesidades se tom la iniciativa de actualizar a los profesionales de
diversas reas de la salud, mediante la informacin de temas bsicos a travs de un Diplomado
de Microbiologa Clnica en el cual se incluyeron temas de resistencia antimicrobiana, biologa
molecular, diagnstico y tratamiento de hongos sistmicos y tuberculosis con la participacin de
conferencistas expertos en los temas.
Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron:
1. Conferencias tericas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y especficos sobre diagnstico, procedimientos estndar, tratamiento de infecciones causadas por
microorganismos bacterianos.
2. Investigacin sobre un tema especfico sobre resistencia antimicrobiana.
3. Elaboracin y presentacin de un manual de procedimientos estndar acorde a las necesidades, capacidades y disponibilidad de recursos para el diagnstico bacteriano microbiolgico.
El Diplomado se desarroll en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y
Maestra de la Unidad de Enfermedades Infecciosas que funciona en Hospital Roosevelt desde
el ao 2004 y que es avalado por las autoridades docentes y administrativas del hospital Roosevelt y de la Facultad de Medicina de la Universidad Francisco Marroqun. Tuvo una duracin de
6 meses.
Los principales objetivos especficos que se deseaba alcanzar fueron:
1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y mdicos de instituciones clnicas
pblicas y privadas sobre los principios y la prctica del diagnstico de microorganismos bacterianos, pruebas y tratamiento antimicrobiano.
2. Conocer y aplicar los reportes de susceptibilidad correctos para guiar el tratamiento del paciente, logrando que los laboratorios radicados en distintos hospitales y a nivel comunitario sigan
con exactitud los mismos procedimientos de pruebas y de control de calidad.
3. Conocer y aplicar el manejo de bases de datos que permitan tener informacin que pueda
ser utilizada por especialistas en enfermedades infecciosas, epidemilogos y otros funcionarios
responsables de la salud para establecer patrones de resistencia a agentes antimicrobianos,
promoviendo el tratamiento ptimo e implementando medidas para limitar la difusin de organismos resistentes en los hospitales y la comunidad.
Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran Mdicos y 38 Qumicos Bilogos, 20 eran estudiantes con pensum cerrado de la carrera de Qumica
Biolgica y 4 tcnicos de laboratorio clnico. Se retiraron 9 personas, quedando 58.
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Dentro de la poblacin de profesionales Qumicos Bilogos se tuvo la participacin de profesionales que provenan de Quetzaltenango, Solol, Chimaltenango, Antigua Guatemala, Amatitln,
Mazatenango. El 21% de toda la poblacin estaba trabajando en hospitales en la iniciativa privada.
De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que
represent un 90% del total de asistentes, 6 no aprobaron, 10.3% y 9 se retiraron. El puntaje
ms alto fue de 89 puntos y el ms bajo de 61 puntos, con una media de 76 puntos. nicamente
7 profesionales obtuvieron puntajes por encima de los 80 puntos. El porcentaje de asistencia
fue del 86% en los 10 mdulos. El porcentaje de puntualidad fue del 48%.
El mdulo que present mayor dificultad fue el de Resistencia Antimicrobiana, lo que se reflej
en los puntajes obtenidos durante el segundo examen parcial que evalu este mdulo, nicamente el 50% de la poblacin aprob. Debido a la dificultad se tom la decisin para el II Diplomado ampliar el mdulo y reforzar los temas sobre resistencia.
En general se puede concluir con los resultados obtenidos que los temas tratados fueron correctamente orientados y asimilados por los participantes. Y la elaboracin de manuales contribuy
a una mejor estandarizacin microbiolgica en los lugares de trabajo de donde provenan los
profesionales que elaboraron los trabajos.
Los profesionales participantes completaron la asistencia a X mdulos con diferentes temas microbiolgicos y desarrollaron trabajos de investigacin. La siguiente edicin presenta los trabajos ms importantes referentes a la informacin que proveen. Son el reflejo del esfuerzo de sus
realizadores para proporcionar informacin estandarizada de procedimientos diarios que son
bsicos en el trabajo diario en Microbiologa. Representan un importante aporte en los temas
desarrollados y son herramientas fundamentales para los laboratorios que trabajan Microbiologa.
Licda. Maria Remei Gordillo
Dr. Carlos Mejia Villatoro
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-1-1-1-1-1-1-
-1-1-
Introduccin
Generalidades
-2-2-3-3-3-3-4-4-4-4-4-4-4-4-5-5-
-6-6-6-6-7-7-8-8-8-8-10-10-11-11-11-11-12-12-
Referencias
-16-16-
Manual de Microbiologia
Introduccin
Generalidades
Normas Mnimas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiologa
Organizacin de rea de Trabajo
Generalidades de la Estructura Bacteriana
Bacterias Gram positivo
Bacterias Gram negativo
-13-13-13-13-13-13-14-14-14-14-
-16-16-17-17-17-17-16-16-16-17-18-18-18-18-19-19-
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Tinciones Bsicas
Tincin de Gram
Principio
Procedimiento de la Tincin de Gram
Tincin Ziehl Neelsen
Principio
Procedimiento de Tincin de Ziehl Neelsen
Tincin de Kinyoun
Principio
Procedimiento de Tincin Kinyoun
Tincin Kinyoun Modificado
Principio
Procedimiento de Tincin Kinyoun Modificado
Observacin en Fresco
Principio
Procedimiento de Observacin en Fresco
Toma de Muestra y Procedimientos
Orocultivo
Propsito e importancia
Recoleccin de la muestra y transporte
Procedimiento
Aislamiento Primario
Identificacin Streptococcus pyogenes
Procedimiento
Cultivo de Garganta Especial
Propsito
Recoleccin de Muestra y Transporte
Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae
Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella
pertussis
Aislamiento primario
Corynebacterium diphteriae
Neisseria meningitidis
Bordetella pertussis
Identificacin de principales Microorganismos
Corynebacterium diphtheriae
Neisseria Meningitidis
Bordetella pertussis
Hemocultivo y Mielocultivo
Propsito
Recoleccin de la muestra y transporte
Toma de muestra
-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-20-20-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-22-22-22-22-22-22-22-22-22-22-23-23-23-23-23-24-24-24-24-24-24-24-24-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-27-27-27-27-27-27-27-27-
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Aislamiento primario
Procedimiento de incubacin
Identificacin de principales microorganismos
Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos estriles
Propsito
Recoleccin de Muestra y Transporte
Aislamiento Primario del Lquido Cefalorraqudeo u otros Lquidos Estriles
Identificacin de principales microorganismos
Coprocultivo
Propsito e Importancia
Salmonella sp
Shigella
Vibrio Cholerae
Recoleccin de Muestra y Transporte
Aislamiento Primario
Procedimiento para aislar Salmonella sp, Shigella sp
Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae
Identificacin de principales Microorganismo
Pruebas Bioqumicas
Identificacin de Salmonella sp
Identificacin de Shigella sp
Identificacin de Vibrio cholerae
Urocultivo
Propsito e importancia
Recoleccin de la Muestra y Transporte
Asilamiento primario
Identificacin de principales microorganismo
Escherichia coli
Klebsiela pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Secreciones Varias
Secreciones de heridas y abscesos
Propsito e importancia
Recoleccin de la muestra y transporte
Toma de muestra de Herida
Toma de muestra de Absceso
Toma de muestra en quemaduras
Toma de muestra de ojo
Toma de muestra de Odo
Aislamiento primario
-27-27-27-28-28-29-29-30-30-31-30-31-31-a la-33-33-3333-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-35-35-36-35-36-37-37-37-38-38-39-39-40-40-41-41-41-41-41-41-42-41-41-42-42-42-43-43-43-44-44-44-44-44-44-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-46-46-
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-46-46-46-47-47-47-47-47-47-47-47-47-47-47-48-48-48-48-48-48-48-48-49-49-49-49-49-49-49-49-50-50-50-50-50-50-50-50-50-50-51-51-51-51-51-51-51-51-52-52-53-53-53-53-53-53-53-53-54-54-54-54-54-54-54-54-55-55-55-55-56-56-56-56-56-56-56-56-56-56-57-a la -59
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Introduccin
Generalidades
Propsito e importancia
Tuberculosis pulmonar y tuberculosis extrapulmonar
Niveles de laboratorio
Nivel i
Nivel ii
Nivel iii
Toma de muestra y procedimientos por tipo de muestra
Muestras de orina
Propsito e importancia
Toma de muestra
Chorro medio u orina al vuelo
Sondas permanentes
Puncin o aspirado suprapbico
Catter
Procesamiento de la muestra
Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina
Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes
Muestras de sangre y mdula sea
Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de
sangre y mdula sea
Toma de muestra de sangre y mdula sea
Precauciones para el uso de los frascos
Tratamiento de la muestra en el laboratorio
Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes
Muestras de lquido cefalorraqudeo, lavados y otros lquidos corporales
Propsito e importancia
Toma de muestra para lquido cefalorraqudeo
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra
Preparacin de la muestra para la elaboracin de frotes
Muestras de heces
Propsito e importancia
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la Muestra de
heces
Preparacin de la muestra de heces para la elaboracin de frotes
Muestras de biopsias y secreciones varias
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra
Preparacin de la muestra para la elaboracin de frotes
muestras de esputo
toma de muestra.
-60-60-60-60-61-61-61-61-61-62-62-62-62-62-62-62-62-62-63-63-63-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-65-65-65-66-66-66-67-67-67-67-67-67-67-68-68-68-68-68-68-68-68-68-68-69-68-69-69-69-69-69-70-70-70-70-70-70-70-71-71-71-
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Normas de Publicacin
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MANUAL DE TINCIONES
EN MICROBIOLOGA CLNICA
Julia Mirelia Cali Arriaga
Jackelyn Paola Tol Urizar
I. INTRODUCCIN
El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiologa,
con el fin de conocer todas las tcnicas de tinciones que sirven de base en las identificaciones
bacterianas, a la vez se hace mencin de las normas de bioseguridad tiles para mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, as como tambin el procedimiento de
elaboracin de frotes y fijacin de los mismos. Adems est elaborado de tal manera que sea aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del Laboratorio en Microbiologa
II. GENERALIDADES
A. Normas mnimas de seguridad
en el laboratorio de microbiologa
1. Entrar al laboratorio en forma ordenada,
dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para
tal fin.
2. Llevar puesta la bata de laboratorio en
todo momento. La misma debe permanecer
completamente cerrada.
3. Limpiar y desinfectar las superficies de
trabajo, antes de comenzar y al finalizar el
trabajo.
4. Lavar las manos con agua y jabn antes
de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre despus
de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.
5. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en
las reas de laboratorio.
6. Evitar llevar al laboratorio, accesorios que
podran ser fuente de contaminacin (por
ejemplo joyas).
7. Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos.
Hablar slo lo indispensable.
8. No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse
cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de
contacto en ningn rea del laboratorio.
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Si el cromforo es un in positivo el colorante es de tipo bsico, pero si la carga es negativa ser de tipo cido. La mayora de las
bacterias son teidas por colorantes bsicos,
que permeas la pared celular y se adhieren
por enlaces inicos dbiles a molculas con
cargas negativas de la clula bacteriana. La
tincin de las bacterias con azul de metileno,
es un ejemplo de tincin simple que facilita la
observacin de forma, tamao y arreglo de
las clulas (Aquiahuatl, Prez, 2004).
1. Preparacin de frote:
a. Muestras slidas
Tomar la muestra con un hisopo, de preferencia que el material no sea algodn, puede ser
dacrn o alginato de calcio.
Rodar el hisopo con la muestra sobre una lmina portaobjetos limpia de manera que se
obtenga una preparacin homognea (mismo grueso aproximado en toda la lmina) de
sta forma los colorantes penetran de manera adecuada en las estructuras presentes en
la muestra.
Dejar secar al aire o secar aplicando calor
suave debajo de la lmina portaobjetos sin
quemar la muestra (Gordillo, 2005).
b. Muestras lquidas
Tomar una pequea porcin del lquido ya
sea con pipeta pasteur estril, asa en argolla
flameada, asa estril descartable. Colocar en
la lmina, NO restregar la muestra.
Dejar secar al aire o secar aplicando calor
suave debajo de la lmina portaobjetos sin
quemar la muestra (Gordillo, 2005).
1) Fijacin del frote
Fijar los frotes de cultivos lquidos con dos
gotas de metanos o etanol absoluto y dejar
secar al aire (hacer esto en zonas alejadas
del mechero).
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Este es un colorante catinico y se combina fuertemente con los componentes celulares cargados negativamente, con los cidos
nuclicos y los polisacridos cidos (Koneman, Allen, Janda, Procop, Schreckenberger,
Woods, 2008).
b. Materiales y Reactivos
Azul de metileno
Alcohol etlico 95%
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua desmineralizada
Cronmetro
c. Procedimiento
Extender la muestra en un portaobjetos
limpio y fijar la muestra.
Cubrir la extensin con azul de metileno
de Loeffler durante 1-2 minutos
Retirar exceso de colorante y lavar con
abundante agua desmineralizada.
Dejar secar a temperatura ambiente.
d. Resultados
A. Tinciones simples
Son aquellas en donde se utiliza un solo colorante, es simple y fcil su realizacin.
1. Tincin de Azul de Metileno de
Loeffler
a. Principio
Es una tincin simple utilizada para una gran
variedad de microorganismos, sin embargo
su uso es especfico para detectar bacterias
en frotes de lquido cefalorraqudeo en casos
de sospecha de meningitis bacteriana.
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d. Resultados
a. Principio
La tincin de Azul de lactofenol se emplea
para observar hongos. Es una tincin simple
(un slo colorante) y como tal est basada en
la afinidad del colorante por componentes de
las clulas, en este caso por las estructuras
fngicas.El azul de lactofenol tiene tres caractersticas que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo
moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. Figura 3. Estructuras fngicas de coloracin azul.
El fenol destruye la flora acompaante (algunas veces en los cultivos, juntos a los hongos
pueden crecer colonias de bacterias). El cido lctico conserva las estructuras fngicas al
crear, por decirlo de algn modo, una pelcula
que las protege provocado por un cambio de
gradiente osmtico entre el interior y el exterior
de dicha estructura. El azul de algodn tiene la
capacidad de adherirse a las hifas y conidios
de los hongos microscpicos (Garca, Beltran,
Guzmn, Len, Arredondo y Fonseca. 2001).
b. Materiales y Reactivos
Solucin de azul de lactofenol
Cultivo a evaluar
Asas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio
Aceite de inmersin
Mechero
Agua salina fisiolgica
c. Procedimiento
Colocar una gota de agua salina fisiolgica
sobre el portaobjetos.
Con el asa picar el cultivo y expandir por
encima de la gota de agua salina fisiolgica,
hasta que no se seque.
Despus seca la muestra, tomar una gota
de azul de lactofenol y se aade sobre la
muestra.
c. Procedimiento
Se cubre la muestra con el cubreobjetos
Se cubrir la lmina
Observar en el microscopio.
naranja de acridina
Procurar que no queden burbujas de aire
Lavar con agua de
en la preparacin, ya que sino lo que se ob Dejar secar al aire
servara mayoritariamente sern las burbuobservacin
jas.
con la solucin de
por dos minutos.
chorro abundante.
para su posterior
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d. Resultados
Las lminas deben enfocarse utilizando un microscopio de epifluorescencia, utilizando filtro
azul o amarillo estndar.
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d. Resultados
B. Tinciones diferenciales
Son aquellas donde se utilizan dos o ms colorantes y en contaste permite la diferenciacin
del microorganismo o la visualizacin de la estructura deseada.
1. Tincin de Gram
a. Principio
De gran importancia en Microbiologa porque
permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (gram positivo y gram negativo), segn
se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared
celular de ambos grupos: las bacterias gram
positivo tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias
gram negativo tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica
externa. Tras la tincin con el primer colorante
(Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol
que arrastrar al colorante slo en las bacterias gram negativo, mientras que en las bacterias gram positivo el colorante queda retenido
y permanecern azules. Las gram negativo se
teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, de
color rosado al microscopio (Lpez-Jcome y
otros, 2014).
b. Materiales y Reactivos
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Asa de Siembra en argolla
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas
Palillos
Microscopio
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua destilada
Solucin de cristal Violeta
Lugol
Safranina
Etanol 95%
Cronmetro
c. Procedimiento
Cubrir el frote con Cristal Violeta durante 3
min.
Retirar el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el
portaobjetos, para no desprender la muestra.
Cubrir ahora con Lugol durante 1 min., realizar otro lavado suave. Todas las clulas se
teirn de violeta.
Agregar unas gotas de etanol 95%, deslizndolo por el portaobjetos, hasta que las
gotas que salen no tengan casi color. Las clulas gram- pierden el colorante violeta y quedarn incoloras. Las gram + seguiran violeta.
Aadir una el colorante safranina (colorante
de contraste) por 2 min.
Lavar el colorante con agua. Este colorante slo entrar en las bacterias gram , que
quedarn rojas. Las gram + seguirn violetas.
Secar las preparaciones sobre papel de filtro.
Observarlas al microscopio utilizando el objetivo de inmersin
d. Resultados
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2. Tincin de Wright
a. Principio
c. Procedimiento
Colocar el frote secado al aire sobre una
rejilla o cubeta de tincin con el frote hacia
arriba
Cubrir completamente el portaobjetos con el
colorante de Wright gota a gota.
Dejarlo que permanezca en el frote aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los gl-
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3. Tincin de Giemsa
a. Principio
d. Resultados
Los ncleos celulares se tornan violeta inEs la segunda coloracin en uso, luego de la
tenso.
tincin de Wright, y en importancia de las mez Es frecuente encontrar en el mtodo de
clas de Romanowsky. Es quizs la mejor moGiemsa que la granulacin eosinfila no
dificacin de este tipo de coloraciones para
presenta la tonalidad rojo-anaranjada cadescubrir parsitos en la sangre, como en el
racterstica sino que presenta una tonalidad
caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanopardo rojizo. Esta dificultad puede prevenirsomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de
se aadiendo una gota de fucsina fenicada
Giemsa tambin da excelentes resultados para
por cada 10ml de alcohol metlico utilizado.
la tincin rutinaria de frotes sanguneos. Cuan Las granulaciones neutrfilas (lila) y los
do se va a teir con este colorante, debe fijarse
hemates (rojo plido) se tien mal; sin
primero la muestra con metanol absoluto por un
embargo, esta coloracin permite diferentiempo mnimo de tres minutos (cuando la preciar algunas formas de metamielocitos que
paracin no incluye metanol). El colorante en
pueden ser confundidos con los monocitos,
solucin nunca se utiliza de manera directa, por
pues el protoplasma de los monocitos quelo que se debe diluir con la solucin amortiguada de color azulado y el de los metamielocidora en una proporcin de 1:10 1:20 y el tiemtos de color rosa.
po de coloracin podr ser de 10 20 minutos,
El citoplasma de los linfocitos presenta
respectivamente (Ortega, Garibaldi. 2009).
una tonalidad azul definida y sus ncleos
violetas de intensidad variable.
b. Materiales y Reactivos
Los grnulos basfilos y las plaquetas se
Colorante de Giemsa (constituido por una
tien de color azul, no obstante stas ltimezcla de azul de metileno, eosina y varios
mas presentan corpsculos violetas interazures en dilucin acuosa).
nos.
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
Portaobjetos
Muestra biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua desmineralizada
Cronmetro
c. Procedimiento
Sumergir el frote verticalmente en una solucin de Giemsa preparada temporalmente a
partir de 1 volumen de la solucin colorante
ms 9 volmenes de solucin tampn (pBs,
pH 6.8) o bien en agua desmineralizada.
Esperar durante 10-20 minutos.
Lavar el frote con abundante agua, directamente del chorro.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una
gasa o algodn humedecido en alcohol para
4. Tincin de Ziehl-Neelsen
a. Principio
La tincin de Ziehl-Neelsen (Z-N) fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de
manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clnicas de
pacientes. Esta tcnica es capaz de diferenciar
los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
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a. Principio
Esta tincin es til para visualizar quistes de
protozoos intestinales que tienen la propiedad
de ser cido-alcohol resistente (AAR). Cryptos- d. Resultados
poridium, Cyclospora e Isospora suelen producir diarrea persistente, sobre todo en pacientes
inmunocomprometidos o con infeccin por el
VIH.
La tcnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza
la penetracin de la fucsina fenicada en la pared celular mediante la accin combinada del
fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la
capa de cidos miclicos. Con el lavado con
agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero el colorante fucsina queda dentro del
parsito y este se destaca en contraste al fondo
azul (EHAS, 2012).
b. Materiales y Reactivos
Carbol fucsina (fucsina fenicada)
Azul de metileno
Alcohol-cido
Mechero
Portaobjetos
Cubetas para tincin
Pizetas con agua destilada
Toalla de papel
Guantes
Microscopio
Libreta
Cronmetro
c. Procedimiento
En una lmina portaobjetos hacer un extendido delgado de la muestra de heces, dejar
secar a temperatura ambiente y fijar la muestra con calor pasando dos o tres veces por
mechero.
Cubrir la lmina con colorante carbol fucsina
y aplicar calor hasta la emisin de vapores
y mantener por 5 minutos, evitando la ebullicin del colorante.
Lavar el exceso con agua del chorro.
Decolorar con alcohol-cido durante 20-30
segundos.
Lavar con abundante agua del chorro.
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Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua desmineralizada
Cronmetro
b. Materiales y Reactivos
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
Portaobjetos
c. Procedimiento
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
Fijar la muestra en una lmina portaobjetos.
biolgica
Cubrir la lmina con colorante verde de
Microscopio
malaquita y aplicar calor hasta la emisin de
Aceite de inmersin
vapores y mantener por 5 minutos.
Soporte de Tinciones
Lavar el exceso con agua del chorro.
Goteros
Cubrir con la lmina con colorante safrani Agua desmineralizada
na por 1 minuto.
Cronmetro
Lavar el exceso de colorante con abundan cido peridico
te agua del chorro.
Reactivo de Schiff
Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio.
c. Procedimiento
Cubrir el material fijado en la lmina con
d. Resultados
acido peryodico al 0,5% durante 5 minutos.
Lavar con agua destilada.
Agregar el reactivo de Schiff. 20 minutos.
Lavar con agua del chorro.
Dejar secar al aire para su posterior observacin
d. Resultados
C. Tinciones Especiales
Se basan en el hecho que distintas estructuras
celulares tienen distinta composicin qumica,
de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes.
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Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta
1. Tinta China
a. Principio
Fue desarrollada originalmente para micros- c. Procedimiento
copia de luz con el fin de rodear y delinear las
En una lmina portaobjetos colocar una
bacterias no teidas u otros materiales biolgigota de la tinta china.
cos. Utilizamos diferentes mtodos para evaluar
Esterilizar el asa y tomar una muestra de
estructuras individuales, tan pequeas como las
cultivo del hongo o en el caso de la muestra
vesculas sinpticas e incluso de gran tamao,
de LCR colocar con una pipeta una gota socomo los microorganismos unicelulares. Este
bre la tinta.
mtodo es muy til, aunque est limitado por la
Con el cubreobjetos mezclar la tinta con la
presencia de un fondo oscuro que no permitir
muestra
la correcta identificacin de forma ntida y deta Colocar el cubreobjetos sobre la preparallada de los componentes de dichas estructuras.
cin
Observar la placa en el microscopio a 40x
En microbiologa, la tincin de Tinta China proy 10x
porciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorga- d. Resultados
nismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresin, siendo la tcnica ms utilizada para poner de manifiesto su cpsula. Este
hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la
primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemacin y puede
ser visualizada por medio de la tinta china. El
principio es simple, ya que slo se requiere depositar una gota de la muestra clnica sobre un
portaobjetos, posteriormente se coloca el coloFigura 15. Se observa levaduras capsuladas de C.
rante y se observa al microscopio sin necesidad
neoformans 40X.
de fijacin, algunas estructuras difundirn el colorante y otras no, lo que permitir un contraste
Tincin de Auramina-Rodamina
de las estructuras observadas. Se han utilizado 2.
diferentes colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tie el fondo de la a. Principio
muestra de un color oscuro y la cpsula del C. Los cidos miclicos de las paredes celulares
neoformans permanece sin teir. La principal de las micobacterias poseen afinidad para los
dificultad con la tincin negativa es que los mi- fluorocromos auramina y rodamina. Estos colocroorganismos tienden a contraerse durante el rantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
periodo de secado; para evitarlo, se ha optado color amarillo o naranja brillante contra un fondo
por usar la tincin negativa hmeda, en la cual verdoso. El permanganato de potasio, empleado
los organismos se suspenden en una pelcula como contraste, evita la fluorescencia inespecde tinta china o mancha oscura y el contorno de fica. Todos los microorganismos cido-alcohol
la cpsula puede ser observado sin el peligro de resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto
contraccin (Lpez-Jcome y otros, 2014).
importante de la coloracin rodamina-auramiria
es que luego los frote pueden ser reteidos con
b. Materiales y Reactivos
la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun direc Asa
tamente sobre la tincin con el fluorocromo, si
Tinta China
se elimina antes el aceite de inmersin.
Mechero
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d. Resultados
Las fibras elsticas y colgeno se observan con
fluorescencia amarillo verdosa, estas se pueden confundir con hongos y levaduras, se diferencian en la fluorescencia.
4. Tincin de Gomori-Grocott
a. Principio
Es una coloracin especial para hongos, la coloracin est basada en la presencia de cido
crmico, los grupos hidroxilo de los polisacridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehdos y estos a su vez reducen el
complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloracin caf o negra. Utiliza un buffer
(bisulfito de sodio) y tambin un colorante de
contraste (cloruro de oro) y uno de fondo (verde
brillante) (Pontn, Llovo, 2007).
b. Materiales y Reactivos
cido crmico
Bisulfito de sodio
Metenamina.-nitrato de plata
Cloruro de oro
Verde brillante
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua desmineralizada
Cronmetro
c. Procedimiento
Cubrir la muestra fijada en el portaobjetos
con la solucin de cido crmico al 10% durante 10 minutos.
Lavar con abundante agua desmineralizada.
Cubrir con la solucin de metabisulfato sdico 1% durante 1 minuto.
Lavar con abundante agua desmineralizada.
Introducir la lmina en un recipiente con la
solucin de metenamina-nitrato de plata, dicha solucin debi ser previamente calentada
en bao de mara a 800C por 6 minutos, Una
vez introducida la lmina se debe mantener
las condiciones durante 5 minutos ms hasta
observar el cambio de color en solucin de
marrn a negro.
Lavar con abundante agua desmineralizada.
Cubrir el portaobjetos con la solucin de cloruro de oro 1% de 2 a 5 segundos y lavar con
agua desmineralizada.
Cubrir el portaobjetos con la solucin verde
brillante 0.2% en cido actico glacial durante
1 minuto.
Lavar con abundante agua desmineralizada
y dejar secar a temperatura ambiente.
d. Resultados
IV. Referencias
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prcticas de laboratorio de microbiologa general. Departamento de Biotecnologa. Universidad Autnoma Metropolitana, Iztapalapa, Mxico. pp. 20-24.
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C. Enlace Hispano Americano de Salud EHAS(2012) Procesamiento de Muestras para Diagnstico de Parsitos Intestinales. Espaa. pp.
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D. Flores., E. Albarado., L. Thomas., D. Lobo.,
A. (2008) Comparacin de la tincin fluorescencia modificada y gram, en muestras urogenitales y perianales de pacientes asistidos en el
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E. Garca., P. Beltran., C. Guzmn., A. Len., P.
Arredondo., M. Fonseca., X. (2001) Diagnstico
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Laboratorio de Microbiologa. Unidad Docente
Asociada Laboratorios Clnicos. Unidad Docente Asociada Otorrinolaringologa. Santiago, Chile. Rev. chil. infectol. Vol.18 (4). Pp. 18
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Muestra. Hospital Roosevelt, rea de Microbiologa. 2. Edicin. Guatemala. pp. 5.
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CATEDRA DE BIOTECNOLOGIA. Pp. 12
J. Ortigoza., S. Cruz., M. (s.f.) Manual de procedimientos para el laboratorio de la E. E. Parasitologa General UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS REGION
VERACRUZ. pp. 37.
K. Organizacin Mundial de la Salud OMS(2005). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Ginebra. pp. 13-15.
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M. Pontn., J. Llovo., J. (2007) Diagnstico Microscpico de las Micosis. Asociacin Espaola
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MANUAL DE MICROBIOLOGIA
Alejandra Castillo
Veronica Itzep
1 Introduccin
Las enfermedades infecciosas constituyen un
problema de salud pblica cada vez en aumento generando costos altos para su tratamiento,
esto se ha debido al uso indiscriminado de antibiticos generando la desimanacin de bacterias multiresistente en el mbito hospitalario
o comunitario, dificultando el adecuado tratamiento.
Los pacientes hospitalizados como no hospitalizados presentan una variedad de sintomatologas, poniendo en evidencia el tipo de enfermedad pero en otros casos dificulta al mdico
poder diagnosticar, por lo recurren al laboratorio
de microbiologa para poder obtener diagnsticos certeros y poder tratar al paciente efectivamente.
El objetivo del presente manual es poder utilizarlo como una gua de procesos facilitando el
diagnostico de algunas enfermedades infecciosas frecuentes, describiendo los procedimientos
de aislamiento como las tcnicas presuntivas y
confirmatorias de identificacin.
tes.
- El personal de laboratorio debe utilizar equipo de proteccin apropiados (lentes, mascarilla)
para evitar en lo posible aerosoles o salpicaduras de las muestras. Las muestra que se deben
centrifugar debe ser tapadas previamente, al
destapar algn tubo usar gasas para evitar los
aerosoles.
- Desinfectar las mesas de trabajo antes y despus del manejo de material infeccioso, con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio.
- Recipientes adecuados para desechos de materiales como placas, tubos, muestras clnicas.
Pg. 17
Pg. 18
funcin dar color a todas las clulas. El segundo reactivo el lugol, actuando como mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared celular de la bacteria. El
tercer reactivo el decolorante Alcohol-acetona,
donde los organismos Gram positivo no se decoloran y los Gram negativo si lo hacen. Y el
cuarto reactivo el colorante de contraste Safranina, poniendo de manifiesto las bacterias
Gram negativas.
2.4.1.2 Procedimiento de la Tincin de
Gram
a. Preparacin del Frote
- Tomar la muestra con un hisopo de dacron o
alginato de calcio.
- Rodar el hisopo sobre un portaobjeto
- En caso de muestras liquidas tomar una porcin con un asa en argolla flameada y fra, colocarlo en un portaobjeto.
- Dejar secar al aire o acelerar el secado acercando el portaobjeto al mechero, pero con precaucin porque el calor puede degradar o deformarse las bacterias.
b. Preparacin de la tincin
- En una bandeja con dos varillas colocar el frote
en forma horizontal
- Colocar el Cristal Violeta suficiente cantidad,
dejar actuar durante 1 minuto
- Lavar suavemente con agua
- Colocar el mordiente Yodo, dejar actuar por 1
minuto
- Lavar suavemente con agua
- Decolorar con Alcohol-Acetona, agregando
gota o gota hasta que salga casi claro o ligeramente azul
- Lavar con agua
- Agregar safranina como contraste, dejar actuar
por 1 minuto
- Lavar con agua
- Dejar secar la muestra
- Examinar al microscopio con objetivo 100X de
inmersin de aceite. Gram Positivo se tien de
morado y Gram negativo de rosado. (fig. 3)
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b. Incubar por 18 a 24 hrs a 35-36 C introducirlo en una jarra con veladora con el objetivo de
crear un ambiente de C02
c.Buscar colonias de pequeas de 1 a 1.5 mm
de dimetro rodeada de un halo de hemolisis
completa sospechosas con beta-hemolisis sospechosas de S. pyogenes
3.1.4 Identificacin Streptococcus
pyogenes
Es el principal microorganismo patgeno humano que produce infeccin local o sistmica
y trastornos inmunitarios postestreptoccicos.
Puede causar Faringitis, Erisipe, Celulitis, Gangrena estreptoccica, Fiebre puerperal, Piodermia estreptoccica, Sndrome de Choque Toxico, fiebre reumtica y glomerulonefritis.
La prueba de catalasa es negativa, susceptible
al Taxo A (bacitracina 0.04 U) formando un halo
de inhibicin, resistente al Taxo SXT, la identificacin de pirrolidonilarilamidasa (PYR) y la deteccin del Antgeno A de Lancefield. (fig. 9)
3.1.4.1 Procedimiento
a. Despus de la incubacin de 16 a 24 horas
del asilamiento primario, proceder a buscar colonias sospechosas de beta hemolisis.
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b. Trasladar una o varias colonias a un agar sangre carnero al 5% en el centro y proceder a realizar
un estriado en forma de tapete
c. Con una pinza flameada y fra colocar un disco de Taxo A (bacitracina 0.04 U)en el centro
d. Incubar por 16 a 24 horas en ambiente de CO2
e. Examinar la caja para observacin de un halo de inhibicin alrededor del Taxo A. La presencia
del halo indica que se aislo S. pyogenes (fig. 10)
f. Proceder a realizar la prueba de susceptibilidad y pruebas serologas de aglutinacin para confirmacin del grupo
Pg. 23
Pg. 24
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Colonias de B. pertussis
Figura No. 14
3.3
Hemocultivo y Mielocultivo
3.3.1 Propsito
El hemocultivo sirve para detectar las bacterias que se estn reproduciendo en la sangre,
lo que provoca septicemia. El mielocultivo es
el cultivo de mdula sea y sirve para detectar
bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi.
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente
estril, por lo tanto, la presencia de microorganismo o sus productos constituyen un problema para todos los rganos y sistemas que son
irrigados por el mismo. La deteccin e identificacin de los diversos microbianos, es de vital
importancia desde el punto de vista clnico para
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiolgico.
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Subcultivo
a. Los subcultivos deben realizarse en cabina o
cerca de un mechero de bunsen
b. Realizar los subcultivos ciegos dentro de las
12 a 24 horas de incubacin
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c.Antes de realizar el subcultivo, desinfectar la superficie de la tapa del frasco con alcohol al 70%
d. Con una jeringa estril, extraer a travs del tapn de la muestras
e. Inocular una gota de muestra del hemocultivo en un extremo de la superficie de las placas de
Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate y Agar Manitol sal.
f. Tambin colocar una gota sobe un portaobjeto para la tincin de Gram
g. Proceder a realizar la dispersin para obtener colonias aislada
h. Incubar las placas de Agar sangre carnero 5% y Agar Chocolate a 35-36C por 24 horas en
ambiente de CO2; las placas de MacConkey y Manitol Sal incuabar en ambiente aerobiosis.
i. Observar el gram si se observa morfologa bacteriana informar al medico
j. Si no hay crecimiento a las 24 horas, seguir incubando hasta por 48 horas.
k. Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento de sulbcultivo al 5to y 7 mo dia.
l. Streptococcus pneumoniae tiene tendencia a autolisis, deben ser subcultivado a las 12-17 horas
de incubacin, repetir a las 48 horas y 7mo da de incubacin sin presentar cambio de coloracin
o turbidez.(Tabla No. 2)
Tabla No. 2 Alteracin del hemocultivo y posible bacteria
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Staphylococcus aureus
-
Streptococcus pyogenes
-
Pseudomonas aeruginosa
-
Haemophilus influenzae
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Interpretacin
Tincin del Gram del sedimento del LCR:
f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero - Observar diplococos Gram Negativo, forma de
al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 rion, en parejas como grano de caf, compatiy Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente bles con N.meningitidis.
aerobiosis, a 36C, revisar a las 24 horas.
- Cocobacilos Gram Negativo pleomrficos, con
g.Si el laboratorio cuente con pruebas para de- escasa formas bacilares, compatible con H. inteccin de antgenos, realice estas pruebas con fluenzae
una pequea cantidad del LCR o del sobrena- - Cocos Gram Positivo, lanceolado, ovalado, disdante del LCR.
puestos en parejas o cadena cortas, la capsula
h.Si no se observa crecimiento deben ser rein- se insina como un halo claro alrededor de las
cubados los medios por 72 horas antes de des- bacterias, compatible con S. pneumoniae.
cartados.
- Bacilos Gram Negativo, compatible con Entei.Si presenta desarrollo de microorganismos so- robacterias o Pseudomonas sp.
bre los medios de cultivo slidos realizar colora- - Levaduras redondas con gemacin, Gram pocin Gram, de acuerdo a lo observado proceder sitivo, se insina cpsula hacer tinta china, para
a montar las pruebas de identificacin y antibio- verificar la presencia de C. neoformans
Tincin de Ziehl Neelsen
grama.
Reportar al mdico inmediatamente lo observa- - Si se observan bacilos alcohol cido resistente
cortos, morfologa compatible con M. tuberculodo en la tincin de Gram, ZN o Tinta China.
sis o otras micobacterias.
Segunda Porcin
Al observar crecimiento a las 24 o 48 horas y
a. Proceder a realizar el examen macroscpico observar crecimiento en distintos medios como
(color, aspecto, volumen ) y citolgico del Lqui- gua (Tabla No. 4)
do estril
b. El examen citolgico de la segunda porcin Tabla No. 4
se analizara
- Recuento de glbulos rojos
- Recuento de glbulos blanco
- Formula diferencial
c Es este tubo tambin puede realizarse pruebas de latex para identificacin de Criptococcus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemolitico.
Tercera Porcin
Proceder a realizar el examen qumico con eva- Realizar Frote gram de las colonias para confirmar morfoluacin de glucosa y protenas.
loga y proceder a identificacin (tabla No. 5)
3.4.4 Identificacin de principales miTabla No. 5
croorganismos
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3.5 Coprocultivo
3.5.1 Propsito e Importancia
Mtodo utilizado para identificar diferentes microorganismos causantes de enfermedades
gastrointestinales, provocando diarreas, vmitos, fiebre y dolores estomacales.
Los principales enteroptogenos estn: Salmonella sp, Shigella sp y Vibrio cholerae.
Pg. 33
3.5.3.2
Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae
a. Procesar la muestra lo ms pronto posible o muestra
proveniente en medio de transporte de Cary Blair
b.Con un hisopo estril o asa en argolla tomar muestras
de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre.
c.Tomar un hisopo o asa de muestra y colocarlo en Agua
Peptonada Alcalina por 6 a 8 hr a 35-36 C para enriquecimiento de Vibrio cholerae
d.Sulcultivar en medio TCBS (tiosulfato, citrato sales biliares y sacarosa y Agar Sangre
e. Con un asa en argolla flameada y fra proceder a estriar.
Incubar por 24 hrs a 35-36C
f.Revisar la presencia de colonias circulares de borde entero de color amarillo (sacarosa positivo) en medio TCBS y
en agar Sangre colonias hemolticas. (Figura 18)
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- Proceder a picar una vez el medio por el centro al fondo del tubo
- Sin sacar el asa recta del tubo estriar el sland
del medio
- Incubar a 36 C por 18 / 24 hrs
- Leer la reaccin
B. LIA Agar Lisina Hierro
Mide la capacidad del microorganismo para
descarboxilar un aminocido (lisina o arginina)
para forma una amina con la consiguiente alcalinidad, ponindose de manifiesto por el viraje
del indicador prpura de bromocresol. El medio
es de color prpura intenso pH 6.
Procedimiento
- Con un asa recta no flameada del proceso
del TSI,
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
- Proceder a picar el medio tres veces hasta el
fondo y estriar el sland
- Incubar a 36C por 18 a 24 hrs
- Leer la reaccin
3.5.4 Identificacin de principales Microorganismo
Pg. 35
C.Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de
carbono es una prueba til en la identificacin
de enterobacterias, se detecta mediante el
crecimiento y alcalinizacin del medio a pH 7.6,
el aumento de pH se visualiza con el indicador
Azul de Bromotimol que vira el medio de color
verde a azul oscuro.
Procedimiento
- Con un asa flameada y fra tomar una colonia
aislada
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
- Proceda a estriar el sland
- Incubar a 36 C por 18-24 horas
- Interpretar
Interpretacin
Positivo: Crecimiento y viraje azul
Negativo: Sin viraje el medio (verde)
D. UREA
La triptena y la glucosa aportan los nutrientes
para el desarrollo del microorganismo, el rojo
de fenol es el indicador del pH y el cloruro de
sodio mantiene el balance osmtico. Las bacterias que hidrolizan la urea por medio de la
enzima ureasa liberan amoniaco y dixido de
carbono, esto alcaliniza el medio virando el rojo
de fenol de amarillo al Rosado Intenso, esta
prueba puede realizarse en medio liquido o
slido. El medio es de color amarillo.
Procedimiento
- De un cultivo puro tomar una colonia con una
asa flameada y fra
- Desenrosque el medio y flamee la boca del
tubo
- Estriar la superficie del sland
- Incubar por 18 a 24 hrs a 36C
- Leer reaccin
Interpretacin
Positivo: Rosado intenso
Negativo: Sin viraje el medio (Amarillo)
E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina)
Utilizado para la identificacin de enterobacterias sobre la base de:
1. Movilidad:
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- Mezcle la suspensin y el antisuero completamente y a modo de mecedora mueva el portaobjeto repetidamente para observar aglutinacin
bajo luz brillante y sobre un fondo negro. Si la
reaccin es positiva en 30 seg a 1 min aparecer
una precipitacin.
- Si presenta aglutinacin en el control se trata
de una cepa rugosa, y no puede ser serotipificado.
3.5.4.3 Identificacin de Shigella sp
a. Reaccin bioqumica
b. Tincin de Gram
Salmonella typhi
c. Serolgica
Los cultivos de TSI sospechosa de S. typhi deben analizarse serolgicamente con antisueros
de Salmonella Vi y O del grupo D. El antgeno
Vi es capsular puede enmascarar la reaccin
del grupo somtico O, por lo que aislamientos
de Salmonella typhi sern normalmente positivos tanto Vi como para el antisuero D.
Procedimiento
- En un portaobjeto lmpido colocar tres pequeas gotas de solucin salina
- Tomar una porcin del crecimiento de la superficie de TSI y suspender cada gota de solucin
salina, mezclar
- Aadir una pequeas gota de antisuero O del
grupo D a una suspensin y una pequea gota
del antisuero Vi a una segunda. La tercera suspensin ser control
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b. Tincin de Gram
c. Serologa
b. Tincin de Gram
S. dysenteriae es las mas comn en desintera, los aislamientos con reacciones tpicas en la pruebas bioqumicas
deben estudiarse primero con el antisuero monovalente A1, despus con el antisuero polivalente B y por ultimo el antisuero polivalente D.
Procedimiento
- En un portaobjeto dividirlo y en cada seccin
colocar una gota de solucin salina
- Tomar muestra de las colonias sospechosas
del TSI u otro medio no selectivo
- Emulsifique el crecimiento en cada gota de
solucin salina, mezcle completamente las suspensin para hacerla moderadamente lechosa
- Aadir una gota pequea de antisuero y una
se usara como control
- Mezclar bien la suspensin y el antisuero para
observar autoaglutinacin.
- Observar el portaobjeto bajo una luz brillante
y sobre un fondo negro. Reaccin positiva dentro de 30 seg a 1 min.
- Si observar una el control que es la colonia
con solucin salina, se debe observar una mezcla homognea, si hay presencia de aglutinacin no sirve para serotipificado.
c. Prueba de Cuerda
La prueba se utiliza para distinguir cepas de
V. cholerae de Aeromonas. El desoxicolato de
sodio lisas las bacterias, la solucin perder la
turbidez y el ADN se desprender de las clulas
causando la viscosidad.
Procedimiento
- En un portaobjeto colocar una gota de desoxicolato sdico al 0.5 %
- Tomar una colonia a analizar previamente incubada en Agar Infusin de Corazn por 18 a
24 hrs
- Interpretar
Interpretacin
Positivo: Vibrio cholerae; otros vibrios darn positivo o positivo dbil
Negativo: Aeromonas
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3.6 Urocultivo
3.6.1 Propsito e importancia
El urocultivo es utilizado para la identificacin
de microorganismos causantes de infecciones
urinarias asintomticas o sintomticas que van
precedidos de leucocitosos y bacteriuria. Bajo
condiciones normales no hay bacterias en el
tracto urinario. El microorganismo principales
de infeccin urinaria son bacilos gram negativo y con mayor frecuencia es la Escherichia
coli, seguido de Klebsiella sp, Enterobacter sp.,
Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, de menor importancia estn los cocos gram positivos
como Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus y hongos.
Cultivos de orinas con presencia de 2 a ms microorganismos es indicio de una mala limpieza
por lo tanto es una contaminacin.
El criterio de Kass, es til para interpretar del
crecimiento del bacteriano y ser considerada
una verdadera infeccin urinaria, siendo este
criterio de igual o mayor a 100,000 UFC/ML
(UFC/ml Unidad formadora de colonias por mililitro).
3.6.2 Recoleccin
Transporte
de
la
nios.
Llevar la muestra inmediatamente al laboratorio, no pasando ms de una hora despus de la
recoleccin.
Mujeres:
a. Realizar la limpieza en el rea genital, separando los labios mayores, con gasas estril con
jabn antisptico limpiar y con otra gasa estril
con agua quitar el jabn
b. Dejar secar
c. Proceder a recolectar la muestra en un frasco
estril boca ancha, descartando la primera porcin de la orina en el sanitario y luego recolectar
la otra porcin a medio chorro
d. Trasladarla inmediatamente al laboratorio.
Hombres:
a. Realizar la limpieza en la punta del pene con
gasa estril con antisptico, luego con otra gasa
con agua estril quitar el jabn.
b. Dejar secar.
c. Proceder a la recoleccin de la muestra en
frasco estril boca ancha, descartando la primera porcin de la orina en el sanitario y recolectarla otra porcin a medio chorro.
d. Trasladar inmediatamente al laboratorio.
Muestra
y 2. Puncin Supra-pbica
Esta por ser una tcnica delicada debe ser tomada por un mdico pediatra. Es la obtencin de la
De preferencia que el paciente no este con te- muestra por jeringa estril. Esto solo se hace en
rapia antibitica previa a la recoleccin de la casos de que los cultivos aerobios dan negativos
muestra, la muestra adecuada es la primera de y con sintomatologa, malformacin de la uretra
la maana, de no ser posible por lo menos pa- o sospecha de infeccin por un anaerobio.
sar dos horas sin orinar para recolectar la muestra. Al momento de tener la muestra enviarla lo
ms antes posible al laboratorio no mayor de 2
horas. Recolectar en frasco estril previa limpieza adecuada.
Existen varios procesos de recoleccin de la
muestra:
1. Chorro medio
Nios: Realizar la limpieza en el rea con agua
y jabn, secar, colocar la bolsita de recoleccin
de orina peditrica adecuadamente (varones
que el pene quede introducido en el agujero
de la bolsita y mujercitas que el agujero quede
en el centro donde saldr la orina). No dejar la
bolsita por ms de una horas colocada en los
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3. Sondas permanentes
Este procedimiento se utiliza en aquellos enfermos con sonda permanente en los que no es
posible retirar o reemplazar la sonda.
Se desinfecta la parte externa de la sonda en la
zona proximal con alcohol yodado y se punza
la sonda con aguja y jeringa estril. Se vuelca
el contenido en forma asptica en un frasco estril.
Criterio de Kass
- Recuentos inferiores a 10,000 UFC/ml, con
hallazgos de cultivos polimicrobianos indican
que hubo una posible contaminacin.
- Recuentos de 10,000 a 100,000 UFC/ml, posible bacteriuria
- Recuentos igual o mayor a 100,000 UFC/ml
3.6.3 Asilamiento primario
- Proceder a sembrar la orina con un asa cali- en pacientes asintomticos tienen una probabibrada; se utiliza medios de cultivo de Agar San- lidad del 80% de presentar bacteriuria significagre Carnero al 5% permitiendo el crecimiento tiva, probabilidad que aumenta hasta el 96% en
de todo tipo de bacterias, Agar MacConkey paciente sintomtico.
permitiendo el crecimiento de bacterias Gram - Muestras obtenidas por Puncin Suprapbica
negativo. Tambin puede usarse Chromocult o cualquier recuento de colonia es significativo.
CLED este inhibe el swarming de Proteus sp
- Con un asa calibrada de 0.001 ml flameada 3.6.4 Identificacin de principales miy fra proceder a tomar la muestra de orina pre- croorganismo
viamente agitada y abierta cerca del mechero
- Realizar un lnea con el asa calibrada en el 3.6.4.1Escherichia coli
centro de la placa de Agar Sangre y otra lnea Reaccin bioqumica
con el asa flameada y fra en la placa de MacConkey de igual manera
- Con un asa no calibrada realizar las estras en
forma de zigzag.
- Incubar el Agar Sangre en jarra con candela
ambiente de CO2 y el Agar MacConkey en aerobiosis a 35-36 C por 18 a 24 hrs.
- Interpretacin, si no hay crecimiento en un
cultivo por 48 horas reportar Negativo a las 48
horas de Incubacin, si hay presencia de crecimiento contar el nmero de colonias presentes
y multiplicar por 1000 si se usa asa calibrada
de 0.001 y multiplicas por 100 si se us asa
calibrada de 0.01 ml realizar la identificacin de
la bacteria por medio de reacciones qumicas.
Tener en cuenta el criterio de Kass.
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3.7.1.4
Identificacin de principales microorganismos
3.7.1.4.1 Esquema de identificacin de Cocos Gram positivo
Tabla No. 7 Identificacin de Staphylococcus aureus y coagulasa negativa
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Tabla No. 8
Identificacin de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y alfa hemolisis
Tabla No. 9
Identificacin de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y beta hemolticos
Tabla No. 10
Identificacin de Cocos Gram positivo, catalasa negativa y gamma hemolisis
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Mujeres adultas
- Colocar a la paciente en una camilla en posicin ginecolgica, introducir el especulo hasta
3.7.2 Secrecin Vaginal
visualizar el cuello
3.7.2.1 Propsito
- Introducir el hisopo tomar una muestra e introducirlo en un medio de transporte Stuart o Amies
La mucosa genital es una regin vulnerable a la o Amies con carbn
infeccin producida tanto por microorganismos - Proceder a tomar dos muestras con hisopo,
constitutivos de la microbiota habitual como por uno para hacer el extendido para la tincin y otro
los adquiridos de forma exgena a travs del colocarlo en solucin salina estril para observacontacto sexual, estn normalmente coloniza- cin en fresco
das por diferentes microorganismos que inclu- - Las muestras en medio de transporte deben
yen estafilococos coagulasa negativo, corine- ser enviada inmediatamente al laboratorio, si no
bacterias, estreptococos, bacterias anaerobias es posible mantenerlo a temperatura ambiente y
y con menor frecuencia levaduras. En edad re- no exceder de 18 horas.
productiva destaca la presencia de Lactobaci- En mujeres embarazadas, en busca de Strepllus acidophilus, ejerciendo un control biolgico tococcus agalactiae (beta-hemolitico del grupo
y un mecanismo de defensa para el epitelio va- B) se recomienda la toma de muestra introduginal. Las infecciones del tracto genital femeni- ciendo el hisopo por el canal vaginal sin colocar
no pueden ser de origen endgeno, causadas especulo.
principalmente por Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae o Candida sp.
3.7.2.2 Recoleccin de la muestra y
transporte
Condiciones previas a la obtencin de la muestra, no estar en tratamiento de antibitico, no
realizarse ducha vaginales ni relaciones sexuales 24 horas antes de la toma de muestra. Y no
baarse el da de la recoleccin de la misma.
Tabla No. 13
En Nias
En nias NO utilizar especulo.
- Colocar a la nias en posicin ginecolgica
- Realizar una previa limpieza para evitar contaminacin con flora colonizante
- Utilizar hisopos finos estriles (Dacron) humedecido con solucin salina y proceder a tomar la
muestra desde los labios menores, introducirlo
en medio de transporte Stuart o Amies o Amies
con carbn
- Utilizar otro hisopo para el extendido
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Tabla No. 14
3.7.2.3 Aislamiento Primario
- Proceder a realizar el inoculo en medios
de cultivo como Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey, Thayer Martin, Manitol Sal, rotando el hisopo sobre la superficie.
- Con asa en argolla flameada y fra proceder a dispersar la muestra en cuatro cuadrantes a modo de tener colonias aisladas.
- Incubar las placas de Agar Sangre, Chocolate y Thayer Martin a 3536C en medio de CO2 por 24 horas Diagrama de identificacin de N. gono- Las placas de MacConkey y Manitol Sal incubar- rrhoeae
la a 35-#6C en ambiente aerobiosis por 24 horas
- Concluida las 24 horas observar crecimiento
de
colonias
sospechosas,
3.7.2.4 Identificacin de principales
microorganismo
Examen en Fresco: Informar la presencia
de clulas descamativas, leucocitos y bacterias, presencia o ausencia de levaduras
y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis.
Gram: Identificar clulas clave, que son clulas descamativas recubiertas por cocobacilos gram variable, Lactobacilos, presencia de polimorfonucleares, levaduras.
Giemsa: Observar cuerpos de inclusin
sugestivas de C. trachomatis. La tcnica citolgica tiene baja sensibilidad, pudiendo confirmar por medio de tcnicas inmunolgicas o ampliacin de cidos nucledos.
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Tabla No. 15
Tabla No. 16
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4 Anexos
4.1 Prueba de Catalasa
til para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayora de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas
que contiene citocromo, excepto Streptococcus
sp.
Material
- Portaobjeto
- H2O2 al 30%
Procedimiento
- En un portaobjeto colocar una gota de H2O2
al 30%
- Tomar con una asa una colonia pura de 18-24
horas y extender la colonia sobre el agua oxigenada suave
Positivo: formacin de burbujas
Negativo: no se observan burbujas
- Descartar el portaobjeto en recipiente con
desinfectante
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Procedimiento
- Una colonia aislada, sembrar en estra en la
zona del pico de flauta.
- Incubar a 35-36C durante 24-48 horas
Interpretacin
La aparicin de un color castao oscuro o negro en el medio indica hidrlisis de la esculina. Si no hay cambio se considera negativa la
prueba
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5 Bibliografa
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http://es.scribd.com/
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1. INTRODUCCION
En la ltima dcada, la tuberculosis (TB) ha resurgido como una de las mayores causas de muerte
ya que anualmente se registran cerca de 3 millones; en 1995 caus ms de 75,000 muertes en
Latino Amrica y el Caribe, lo cual significa que cerca de 1,100 personas enfermaron y ms de
200 murieron por TB cada da. Se estima que existen 8.8 millones de nuevos casos cada ao
que corresponden a 52,000 muertes por semana o ms de 7,000 cada da, lo que se traduce en
ms de 1,000 nuevos casos cada hora, cada da. Estas tasas de muerte reflejan solo parcialmente la tendencia global de la TB, ya que ms del 80% de los pacientes se encuentran en la edad
econmicamente activa (15 49 aos). Se estima que en el ao 2000, 2 mil millones de personas
se encuentran infectadas con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium, 3 millones de
personas mueren anualmente por complicaciones de tuberculosis en todo el mundo. Se calcula
que hay 8 millones de nuevos casos cada ao, el 95% de los cuales aparecen en pases en vas
de desarrollo. En los pases industrializados, el 80 % de los casos aparecen en personas mayores
de 50 aos; en los pases en vas de desarrollo el 80% se produce entre los 15 y los 50 aos. Se
estima que 3 millones de personas que padecen tuberculosis tambin tienen VIH/SIDA.
Existen factores predisponentes en los pases en vas de desarrollo como:
Inmigracin de personas de zonas de alta endemicidad.
Condiciones socioeconmicas bajas en ciudades con alta poblacin.
Aumento de personas infectadas con VIH/SIDA.
Durante las primeras dcadas del siglo XX, se dio una disminucin progresiva de la incidencia de
la tuberculosis, y alcanz su menor nivel a comienzos de la dcada de 1980. Muchos microbilogos pensaron que la tuberculosis estaba por ser vencida, dado que la enfermedad alcanz la
lnea basal de cero en muchas partes del mundo a fines de la dcada de los 70s. Pero sucedi
todo lo contrario.
Actualmente las tasas de morbilidad y mortalidad han aumentado, con el aparecimiento de cepas
resistentes de Mycobacterium a mltiples drogas y por el VIH/SIDA.
Para Guatemala la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) report una tasa de incidencia de 80
por cada 100,000 habitantes en el ao 2000.
La epidemia del Sndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el descenso de los estndares socioeconmicos, entre otros, contribuyen al resurgimiento de
la enfermedad en pases industrializados. Aunque en la mayora
de los pases en desarrollo, la TB ha sido siempre endmica, su
severidad se ha incrementado debido a la pandemia del Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH) y a los niveles de pobreza imperantes. La situacin de la TB a nivel mundial se ha agravado con
el aparecimiento de cepas multirresistentes a las drogas antituberculosas, que incrementan las tasas de mortalidad y representan
un serio problema para el control de esta enfermedad, por ello la
realizacin de una susceptibilidad antibitica con un perfil delimitado de antibiticos es de gran ayuda para poder evitar y/o disminuir
la multirresistencia y poder brindar tratamientos efectivos.
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4.1. Nivel I
las biopsias del tejido pueden rendir resultados
positivos en comparacin a los fluidos en donde
el nmero de los bacilos se ve disminuido por la
dilucin. El diagnstico de la TB extrapulmonar
es difcil a menudo por su localizacin en sitios
del organismo de acceso complicado, adems
el carcter serio de esta forma de tuberculosis
se debe frecuentemente a su diagnstico tardo.
Previo a la
pandemia del
VIH, aproximadamente
el 15% de
los
nuevos
casos de TB
eran
extrapulmonares.
Estos casos
son de difcil
diagnstico, dado que son menos comunes a
los mdicos y porque los sitios de infeccin son
menos accesibles y visibles. La TB extrapulmonar ms frecuente son la linftica, pleural, genitourinaria, miliar, sea, menngea y peritoneal.
Los pacientes con TB pulmonar activa son altamente infecciosos para otros pacientes y para
el personal de cuidados de salud, como ya se
ha mencionado en la parte de introduccin del
presente trabajo. Este tipo de transmisin se
asocia a desarrollo rpido de la enfermedad en
unas cuatro semanas, con mal pronstico. De
igual manera este tipo de transmisin contribuye en los casos de alta resistencia.
.
El aumento de casos de Tb extrapulmonar, crea
la necesidad de un mejor diagnstico y nuevas
tcnicas para el aislamiento y susceptibilidad
micobacteriana, estableciendo como punto crtico el menor tiempo posible para el aislamiento
y la informacin sobre la drogo resistencia de
las micobacterias.
4.NIVELES DE LABORATORIO
Los niveles de laboratorio en micobacteriologa
han sido adoptados por la Sociedad Torcica
Americana (American Thoracic Society), la cual
ha establecido tres niveles de la siguiente manera:
Realiza lo siguiente:
a. Recoleccin de muestras clnicas adecuadas
(incluyendo esputo inducido por aerosol).
b. Transporte y envo de muestras a un laboratorio de nivel superior para el aislamiento e identificacin.
c. Puede preparar y examinar frotes para el
diagnstico presuntivo y/o como monitoreo del
progreso de los pacientes diagnosticados que
estn siendo tratados con medicamentos.
4.2. Nivel II
Adems de todas las funciones del laboratorio
Nivel I, realiza lo siguiente:
a. Procesa muestras para su cultivo en medios a
base de huevo y medios a base de agar y huevo.
b. Identificacin de Mycobacterium tuberculosis
c. Puede realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana con drogas antituberculosas primarias
d. Retiene cultivos de micobacterias para test
adicionales o repeticin de pruebas (se recomiendan 6 meses de retencin)
4.3. Nivel III
Adems de las funciones de los laboratorios I y
II, realiza lo siguiente:
a) Identificacin de todas las especies micobacterianas de muestras clnicas
b) Puede realizar estudios de susceptibilidad
antimicrobiana de micobacterias
c) Puede dirigir investigaciones y brindar entrenamiento.
5. TOMA DE MUESTRA Y PROCEDIMIENTOS POR TIPO DE MUESTRA
TOMA DE MUESTRA
Actualmente se realiza la implementacin de
tcnicas que producen resultados exactos y precisos en menor tiempo. El motivo principal es el
mejoramiento de la calidad del servicio que se le
presta al paciente y al sistema hospitalario.
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Para lograr esto es necesario que todo el personal mdico y de enfermera encargado de
la obtencin y extraccin de muestras conozca
los procedimientos estandarizados para tales
propsitos, a manera de evitar falsos resultados.
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Mujer:
Limpiar la vulva con bastante agua y jabn,
teniendo cuidado de quitar bien el jabn.
Secar el rea.
Separando los labios, colectar la orina a la mitad de la miccin en un recipiente estril tratando de no topar la boca del frasco con los labios.
Llevar la orina al laboratorio.
5.1.2.4. Catter
Nios:
En los nios pequeos para evitar al mximo
la contaminacin es necesario limpiar la regin
genital con agua y con jabn y/o con solucin
salina.
Colocar la bolsa estril sobre la regin.
En el momento de obtener la muestra, retirar
cuidadosamente la bolsa, de manera que la orina no se escurra.
Cerrar la bolsa y llevar inmediatamente al laboratorio.
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Botellas de tapn negro para aislamiento de micobacterias tanto de sangre como de MO. Las
botellas BacT/ALERT MB en combinacin con
el Lquido de enriquecimiento y el suplemento
de antibiticos son un medio de cultivo selecRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
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Secreciones
0.5 ml como mnimo
En recipiente estril, de preferencia en jeringas (si se va a coleccionar la muestra por medio
de una puncin es mejor si se cuenta con las de
tipo tuberculina)
El rea de toma de muestra debe estar bien
limpia
Si son hisopos deben transportarse en Stuart
o Amies
5.5.2. Preparacin de la muestra para
la elaboracin de frotes
Biopsias de tejido
Colocarla en una caja de petri estril de vidrio
preferentemente
Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, solucin salina o agua destilada estril
Triturar con bistur la biopsia en partes pequeas a manera de formar una mezcla homognea
Transferir la solucin a un tubo
Agitar por 5min aproximadamente en vortex
Centrifugar la solucin por 15min a 3000rpm
Descartar el sobrenadante
Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar
el frote
Hacer la tincin
Biopsias de Hueso
Colocarla en una caja de petri estril de vidrio
preferentemente
Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, solucin salina o agua destilada estril
Triturar con bistur a manera de formar partculas lo ms pequeas posibles.
Hacer por lo menos tres improntas frotando
una laminilla contra otra a manera de obtener
un frote en cada uno de los extremos y uno en el
centro de la lmina portaobjetos
Hacer la tincin
5.6. MUESTRAS DE ESPUTO
La muestra de esputo es de utilidad para investigar la causa de infecciones respiratorias inferiores (bronquitis, neumona) y en la investigacion.
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TABLA No. 3
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trocelulosa capturan este complejo inmunolgico que se hace visible gracias a la presencia
del marcador de oro coloidal.
Un resultado positivo (una banda visible de color prpura/gris) indica que el antgeno LAM de
las micobacterias est presente en la muestra
en el lmite de deteccin de la prueba o por encima de l.
Fuente: Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social
Un resultado negativo (sin banda visible de code Guatemala.
lor purpura/gris) indica que este no est presen (mayor) (menor)
NOTA: De 1-4 BAAR en toda la lmina Repetir muestra te o que se encuentra por debajo del lmite de
Si la cantidad de BAAR en la nueva muestra sigue sien- deteccin. Con el fin de garantizar la validez del
do la misma el resultado es POSITIVO (+)
ensayo se ha incorporado una banda de control
de procedimiento en el dispositivo del ensayo.
7. PRUEBAS DE TAMIZAJE
Materiales
Las pruebas de tamizaje son pruebas que ayu- Tarjetas de anlisis de la prueba Alere Deterdan a dar un diagnstico presuntivo de infec- mineTM TB LAM Ag 10 tarjetas (10 pruebas por
cin por Mycobacterium tuberculosis. Se ob- tarjeta)
tiene un resultado ms rpido que el cultivo y Recipientes de recoleccin de orina
generalmente ms sensible que las tinciones. Pipetas con precisin de 60 L
Sin embargo, deben ser interpretadas correla- Tips descartables
cionando la clnica del paciente y los datos de Temporizador
la historia clnica del paciente.
Obtencin de la muestra
7.1. PRUEBA DE LAM
Antes de recoger la muestra de orina, se recoPrincipio
mienda limpiar la zona genitourinaria con una
La prueba de antgeno de LAM es un anlisis toalla limpia. Recoja la orina en un recipiente
inmunocromatogrfico diseado para la de- estndar de recoleccin de orina fresca.
teccin cualitativa del antgeno lipoarabinoma- Conservacin de la muestra
nano (LAM) de las micobacterias en orina hu- 1.Si se conservan a temperatura ambiente las
mana. La prueba Alere DetermineTM TB LAM muestras de orina fresca pueden utilizarse a lo
Ag emplea anticuerpos altamente purificados, largo de las 8 horas siguientes a la obtencin.
especficos del principal antgeno polisacrido 2. Si el anlisis se va a realizar a lo largo de los
del gnero Mycobacterium: lipoarabinomanano 3 das posteriores a la obtencin de las muestra
(LAM).
de orina, estas deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8 C. Si el anlisis se va a
Estos anticuerpos se utilizan tanto como traza- realizar ms de 3 das despus, se deben condores de captura como de deteccin. Los an- gelar las muestras a -20 C o menos.
ticuerpos de captura se absorben en la mem- 3. Si las muestras estn congeladas o refrigebrana de nitrocelulosa de las tiras reactivas. El radas, se deben poner a temperatura ambiente
anticuerpo de deteccin se marca con un con- una hora antes de utilizarlas.
jugado de partculas de oro coloidal.
4.Las muestras congeladas pueden contener
agregados. Todas las muestras congeladas se
Una vez que la muestra de orina se haya agre- deben centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos
gado a la seccin de muestra, los anticuerpos a temperatura ambiente. La muestra a utilizar
conjugados con oro coloidal se adhieren al an- se recoge con cuidado del sobrenadante.
tgeno LAM y la muestra los libera de la seccin 5.Evitar ciclos de congelado/descongelado repetidos. No se pueden utilizar las muestras que
de conjugado. A continuacin, los anticuerpos
se hayan congelado y descongelado ms de
anti-LAM inmovilizados en la membrana de nitres veces.
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Procedimiento
1. El nmero deseado de unidades de prueba
de las 10 tarjetas de anlisis pueden extraerse
doblando o rasgando la perforacin.
NOTA:
La extraccin de las unidades de prueba debe iniciarse
en el lateral derecho de la tarjeta de anlisis con el fin
de conservar el nmero de lote que aparece en el lateral
izquierdo de esta.
El anlisis debe iniciarse a lo largo de las 2 horas posteriores a la retirada de la cubierta protectora de aluminio
de cada prueba.
Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay amPara facilitar la lectura e interpretacin de los plifican una parte del gen rpoB que contiene la
resultados cuando stos se observan muy p- regin central de 81 pares de bases. Las sonlidos, se puede utilizar la Tarjeta de Escala de das son capaces de distinguir entre la secuenReferencia (incluida en el kit), la cual se sostie- cia natural conservada y las mutaciones de la
regin central que se asocian a la resistencia a
ne a la par del resultado.
rifampicina.
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Materiales
Cartuchos Xpert MTB/RIF con tubos de reaccin integrados.
Sistema GeneXpert Dx equipado con el software GX4.0.
Recipientes estriles y hermticos, con tapa
para toma de muestra.
Guantes desechables y proteccin ocular
Etiquetas o rotulador permanente
Pipetas de transferencia para el procesamiento de la muestra
Procedimiento
Limpie adecuadamente el rea de trabajo
(pase un algodn con cloro 10% y luego otro
con etanol 70%, secar con algodn)
Remueva un cartucho y un vial del reactivo de
muestra del kit GeneXpe rt MTB/RIF
Agregue 2 volmenes de reactivo de muestra
por una de esputo en el recipiente colector (2:1)
3. Aparecer una pantalla para seleccionar sesin en windows, seleccione cepheid e introduzca la contrasea cphd
4. Al ingresar a windows, el software de genexpert se iniciara automticamente, si no, presione el icono de genexpert dx software en el escritorio.
5. Introducir el usuario y contrasea correspondiente para cada usuario.
6. Al ingresar, aparecer un recuadro preguntando si quiere hacer algn manejo de la base
de datos, presionar no.
7. Luego aparecer un recuadro preguntando si
quiere hacer un backup, presionar no.
8. Al terminar de ingresar los mdulos del genexpert deben aparecer en el lado izquierdo
como disponibles.
9. El equipo est listo para usar.
Pg. 77
1. Despus de terminar de procesar las mues7. Aparecer el recuadro para que introduzca tras, saque los cartuchos de los mdulos.
de nuevo su usuario y contrasea, introdzca- 2. Cierre el software presionando en la x de la
los.
parte suprior derecha.
8. Al darle ok la luz del mdulo seleccionado 3. Aparecer un recuadro preguntando si quiere
para procesar la muestra empezara a parpa- hacer algn manejo de la base de datos, presiodear.
nar no.
9. Introduzca el cartucho en el mdulo y cierre 4. Luego aparecer un recuadro preguntando si
quiere hacer un backup, presionar no.
la compuerta.
10. El equipo iniciara
5. El software se cerrara.
11. a procesar su muestra. El tiempo restante 6. Presione inicio en la barra de inicio de windows.
depender del ensayo a realizar.
7. Presione apagar
Inserto del test MTB/RIF Cepheid
8. Apague el monitor.
Apagado del equipo
Resultados e interpretacin
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Precauciones y limitaciones
Trate todas las muestras biolgicas, incluidos
los cartuchos usados, como posibles agentes
transmisores de infecciones.
Todas las muestras biolgicas debern tratarse
con las medidas de precaucin habituales
Utilice guantes protectores desechables, bata
de laboratorio y proteccin ocular cuando manipule las muestras y los reactivos.
Lvese las manos a fondo tras manipular las
muestras y los reactivos de la prueba.
Siga los procedimientos de seguridad del centro para trabajar con productos qumicos y manipular muestras biolgicas.
Si se va a procesar ms de una muestra a
la vez, abra solo un cartucho, aada la muestra tratada con el reactivo de la muestra (o una
muestra liquida descontaminada) y cierre el cartucho antes de aadir la muestra tratada con el
reactivo de la muestra al siguiente cartucho.
No abra la tapa del cartucho Xpert MTB/RIF
salvo para aadir la muestra tratada.
No use un cartucho que se haya cado o agitado despus de aadir la muestra tratada.
8.1. Muestras
Las muestras para realizarles cultivo de micobacterias estn clasificadas dentro de dos categoras:
De origen pulmonar (esputo, liquido y biopsia
pleural, hisopados larngeos, cepillados y lavados bronquiales).
8. CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN
De origen extrapulmonar (orina, heces, piel,
LOWENSTEIN JENSEN
sangre, mdula sea, tejidos blandos, aspirados
suprapbicos de vejiga, biopsias, lquido cefaloLos procedimientos para obtener el crecimiento
rraqudeo (LCR), lquido pericrdico, lquido pein vitro de las micobacterias son especializados;
ritoneal, secreciones varias, fluidos y muestras
deben seguirse estrictamente las instrucciones
tisulares en general).
para tener xito en su recuperacin. Por lo geneDe estas categoras hay dos niveles:
ral, las muestras para cultivo contienen muchas
bacterias de las microbiotas, especialmente el
Tabla No. 5 Tipos de muestras.
esputo que siempre se contamina con microbiota de la boca. Adems el esputo es una muestra difcil de manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su
cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo
lquido y descontaminarse; es decir darle algn
tratamiento qumico para destruir las bacterias
contaminantes que crecen rpido, pero sin destruir a las micobacterias.
El cultivo se realiza en Lowenstein Jensen que
es un medio muy nutritivo (Huevos enteros frescos, fcula de papa, glicerol, sales de fosfato
y magnesio, L-asparagina, glicerol y verde de
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bovina 0.2%, o caldo lquido para micobacterias (Ej. Middlebrook 7H9 Dubos) al triturador
de tejido. Si la muestra es mucoide puede agregarse N-acetil-L-cistena (NALC)
- Mantener el tubo de lado e insertar el pistilo.
Empujar la muestra al fondo del tubo
- Detener el tubo en la mano, empujar el pistilo
hacia delante y atrs en ngulo 90
- Triturar la muestra hasta lograr una suspensin homognea
- Remover cuidadosamente el pistilo del tubo.
Utilizar un volumen pequeo de medio para enjuagar la punta del pistilo dentro del recipiente
de descarte
- Tapar el tubo con un tapn de rosca estril
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9.47 gr
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Materiales
Verificar la etiqueta y fecha de expiracin.
Reactivo BBL MycoPrep Frmula aproximada (ajustada y/o enriquecida para satisfacer
los criterios de rendimiento) por un litro de agua
- NaOH en granallas
20g
- Citrato trisdico (Na3C6H5O7.2H2O) 14.5g
Cada ampolla de vidrio sellada dentro del frasco contiene un mnimo de 0.370 g de NALC(C5H9NO3S)
Tampn fosfato BBL Mycoprep Frmula aproximada (ajustada y/o enriquecida para satisfacer los criterios de rendimiento) por 500 ml de
agua purificada
-Fosfato disdico (Na2HPO4)
-Fosfato monopotsico (KH2PO4)
2.37g
2.27g
Ph Final de 6.8
Advertencias y precaucin: Para uso de diagnostico in vitro.
Pg. 84
c. En un gabinete de seguridad biolgica, utilice un tubo para centrifuga estril libre de aerosoles de 50 mL y con tapa de rosca, aada cantidades iguales de la muestra y de la solucin
de NALC-NaOH activada (aproximadamente 5
mL de cada uno)
Principio
d. Tape el tubo para centrifuga y mezcle en
un vortex hasta que la muestra se lice. Si la Se tiene un compuesto fluorescente en la parte
muestra es muy viscosa aada ms solucin inferior de los tubos de 16x100 mm de fondo rede NALC-NaOH y vuelva a mezclar.
dondo. El compuesto fluorescente es sensible
a la presencia de oxgeno disuelto en el caldo.
e. Deje reposar la mezcla a temperatura am- Al inicio la gran cantidad de oxgeno disuelto
biente durante 15 minutos y agite suavemente apaga las emisiones procedentes del compuesde vez en cuando. Evite tratar la muestra en to y se puede detectar muy poca fluorescencia.
exceso.
Ms tarde, los microorganismos que respiran
activamente consumen el oxgeno y permiten
f. Aada el tampn de fosfatos ya preparado al que se detecte la fluorescencia.
tubo para centrifuga hasta alcanzar los 40 mL
y mezcle. Centrifugar entre 15 y 20 minutos a Los tubos que se introducen en el instrumento
3,000 gravedades.
BACTEC MGIT son incubados continuamente a
37C y este controla los tubos cada 60 minutos
g. Decante con cuidado todo el fluido sobrenapara detectar un aumento en la fluorescencia.
dante
El anlisis de la fluorescencia, este anlisis se
h. Aada una pequea cantidad de tampn de utiliza para determinar si el instrumento detecta
fosfatos con un pH 6.8 (0.5 a 2 mL) y vuelva a el tubo como positivo con organismos viables.
suspender el sedimento. Utilice la suspensin Cada tubo positivo contiene aproximadamente
para preparar frotis y para los procedimientos 105 a 106 UFC/ml. Los frascos de cultivo que
permanecen negativos durante un mnimo de
micobacteriolgicos.
42 das (hasta 56 das) y que no muestran indicios de ser positivos se retiran del instrumenControl de Calidad del Usuario:
Examine los componentes del equipo de cada to como negativos y se esterilizan antes de ser
lote o envo que se reciba por Deterioro del Pro- desechados.
ducto.
Inocular una caja de agar sangre para bs- El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT
se aade a cada tubo MGIT para proporcionar
queda de bacterias u hongos contaminantes.
Inocular los reactivos del Mycoprep (buffer y substancias esenciales para el crecimiento rpisolucin NaOH-citrato de sodio-NALC en tubo do de micobacterias. El cido oleco es usado
de medio slido y tubo de medio lquido para por las micobacterias y es muy importante en el
verificar esterilidad.
metabolismo micobacteriano. La albmina acta como agente protector al ligar cidos grasos
8.3. Inoculacin de Tubo Bactec MGIT libres que pueden ser txicos para las especies
960 (Indicador de crecimiento de Mi- de Mycobacterium, ayudando a su recuperacobacterias).
cin. La dextrosa es una fuente de energa.
El uso del tubo BBL MGIT indicador de crecimiento enriquecido con el suplemento de creRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
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Despus del ingreso de los tubos, el instrumento automticamente realizara la lectura de los
tubos cada hora durante el tiempo necesario para la interpretacin del procedimiento.
MANTENIMIENTO DIARIO MGIT 960
Verificar luces internas y externas:
Correcto funcionamiento
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Verificar de Temperatura
Correcto funcionamiento
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Resultados
Un resultado positivo para el test de niacina se
evidencia por la aparicin de color amarillo en
el extracto de la muestra y en el control positivo;
la ausencia de color en el control negativo.
Precauciones
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Se considera que los medios de cultivo desarrollados en medios a base de huevo son los que
producen los resultados ms homogneos, se
obtienen resultados satisfactorios con agar de
Middlebrook y Cohn suplementado con cido
asprtico al 0.1 %.
Almacenamiento
Conservar las tiras de 2 a 8 C. No exponer
a humedad y temperaturas elevadas. Proteger
de la luz, las tiras son fotosensibles. La fecha
de vencimiento es vigente para el producto
cuando est envasado en su recipiente intacto
y ha sido conservado segn las instrucciones.
Procedimiento
a. Utilice un cultivo de 3 4 semanas hecho en
medio de Lowenstein-Jensen, medio Petragnani u otro medio de huevo coagulado.
b. Aada 0.5 ml de agua destilada a un tubo
limpio de 20x110mm con tapn de rosca.
c. Utilizando una pipeta estril de 1 mL o una
esptula, saque dos agregados de colonias del
cultivo. Aada las colonias al agua destilada y
disperse las colonias utilizando la pipeta o la esptula. Alternativamente, aada 1.5 ml de solucin salina estril en cada cultivo inclinado y remueva el cultivo para una suspensin espesa.
Transfiera 0.5 ml de esta suspensin de cultivo
a un tubo vaco y estril para analizar.
d. Con las pinzas esterilizadas al fuego, aada
cuidadosamente una tira BBL Taxo para prueba de nitrito al tubo. Oriente la tira para poder
introducir primero la parte inferior de la misma,
sealada con una flecha, en el tubo. Sostenga
el tubo en sentido vertical.
e. Cierre el tubo con el tapn e incbelo a 35 +/2C durante 2 horas. Agite el tubo suavemente
al concluir la primera y la segunda hora de incubacin. No incline el tubo
f. Despus de 2 horas de incubacin, incline el
tubo cuidadosamente de un lado a otro 6 veces
para humedecer la tira entera. Inclnelos tubos
a temperatura ambiente para cubrir la tira con el
lquido. Deje los tubos en esta posicin durante
10 min.
Resultados
El cambio del color de la parte superior de la tira
a azul claro o azul oscuro indica la reduccin
de nitrato. La ausencia de un cambio de color
indica una reaccin negativa.
Control de Calidad
Especificaciones de la identidad, las tiras de papel blancas con flecas negras apuntando hacia
abajo.
Respuesta del cultivo: Prepare tubos con agua
destilada. Inoclelos con los organismos a analizar.
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Limitaciones
La prueba de reduccin de nitrato es valiosa
para l identificacin de M. tuberculosis y otras
micobacterias clnicamente significativas. Sin
embargo, esta prueba es slo una parte de la
batera bioqumica necesaria para la identificacin preliminar de estos organismos.
9.3.
DETECCIN
MPT64
DE
ANTGENO
Principio
Prueba de casete que consta de una almohadilla para la muestra, una almohadilla de conjugado dorado, una membrana de nitrocelulosa
y una almohadilla absorbente. Los anti-MPT64
monoclonal de ratn estn inmovilizados sobre la membrana de nitrocelulosa como material de captura (lnea del test). Tiene aadidos otros anticuerpos los cuales reconocen
otros eptopes del MPT64, conjugados con las
partculas del coloide dorado, fueron usados
para la captura del antgeno y la deteccin en
un ensayo tipo sndwich. El dispositivo de la
prueba rpida SD BIOLINE Ag MPT64 tiene
una letra C (Lnea control) y la letra T (Lnea
de prueba) sobre la superficie del casete.
Ambas lneas, control y test no son visibles
en la ventana de resultado antes de la aplicacin de cualquier muestra. La Lnea Control
es usada como control del procedimiento. La
lnea control debe siempre aparecer si el procedimiento de prueba es realizada adecuadamente y los reactivos de prueba de la lnea
control estn funcionando. Cuando la muestra
es aplicada en el pozo de muestras, esta fluye lateralmente a travs de la membrana, el
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Resultados
La hibridacin incluye los siguientes pasos: desnaturalizacin qumica del producto a amplificar;
hibridacin de amplicones de una sola cadena,
marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adicin de conjugado
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
reaccin de tincin mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa molecular)
Bao de agua
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
ADN polimerasa termoestable con tampn (recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase de
Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Precauciones
Todos los procedimientos se deben realizar en Pinzas
campanas biolgicamente seguras. Use tubos Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 L
de ensayo con tapa para evitar infeccin del Plataforma de agitacin/TwinCubator
usuario cuando requiera de cultivos con mues- Probeta graduada
Puntas de pipeta desechables con filtro
tras.
Reactivos para extraccin de ADN, as como
9.4. IDENTIFICACIN DE ESPECIES equipos necesarios
COMUNES DE MICOBACTERIAS (Ge- Termociclador (rango de calentamiento 3C/
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
noType Mycobacterium CM)
+/0,2C)
Termmetro calibrado
PRINCIPIO
El kit GenoType Mycobacterium CM (Common Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
Mycobacteria) est basado en la tecnologa
DNASTRIP y permite la identificacin de las si- 1. Preparacin de muestra y controles (si apliguientes especies de micobacterias: M. avium can controles)
ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. for- Las muestras para extraccin son a partir de
tuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, en 300 L agua ultrapura libre de DNasa y RNaM. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
ulcerans, M. tuberculosis complex, y M. xenopi. Las muestras tambin pueden extraerse a partir
El procedimiento completo se divide en tres pa- de cultivos positivos en medio lquido, se traslasos: extraccin de ADN procedente de cultivo da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridacin reversa.
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Pg. 94
2) Perfil de amplificacin
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Cuando no aparece patrn de bandas especfico de especie, un patrn que indique la presencia de una bacteria gram-positiva con alto
contenido en G+C puede, en casos raros, estar
originado por una Micobacteria que no puede
ser detectada por este kit. Por favor, tenga en
cuenta que puede identificar especias adicionales de micobacterias con el kit GenoType Mycobacterium AS.
PRECAUCIONES
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cualquier fuente potencial de DNA contaminante. Si
se requiere almacenar durante ms de 4 semanas, almacene a 20C. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote
el PNM. Almacene el resto de los componentes
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus de su fecha de caducidad.
Los especmenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especmenes de pacientes deben ser considerados siempre como
potencialmente infecciosos. Las muestras de
Otras bandas
Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
tabla de interpretacin.
No todas las bandas de una tira han de mostrar
la misma intensidad.
Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
pueden aparecer bandas adicionales.
TABLA DE INTERPRETACIN
pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
cultivos realizados a partir de esas muestras
deben ser etiquetados y manejados siempre
bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
de acuerdo con las guas institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de
seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparacin de la muestra, incluyendo el paso de inactivacin por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II.
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PRINCIPIO
El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal
Species) est basado en la tecnologa DNASTRIP y permite la identificacin de las siguientes
especies de micobacterias:
M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.
LIMITACIONES
celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
Los miembros del M. tuberculosis complex no lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
pueden ser diferenciados.
intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kanAntes de la amplificacin, el DNA ha de ser ais- sasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, y M.
lado de cultivo bacteriano realizado por un m- shimoidei.
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que El procedimiento completo se divide en tres pala muestra de DNA ha sido amplificada eficien- sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo
temente durante la reaccin de amplificacin.
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos
El test slo funciona dentro de los lmites de las necesarios no se suministran), una amplificaregiones genmicas para las que los primers cin mltiplex con primers marcados con biotina
y sondas han sido elegidos. El anlisis de se- (la ADN polimerasa termoestable no se incluye),
cuencias potenciales permanece reservado y una hibridacin reversa.
para la reanudacin de investigaciones.
La hibridacin incluye los siguientes pasos: desLa presencia de mltiples especies de bacte- naturalizacin qumica del producto a amplificar;
rias en la muestra a analizar puede dificultar la hibridacin de amplicones de una sola cadena,
interpretacin de resultados.
marcados con biotina, a sondas unidas a memComo cualquier sistema de deteccin basado brana; lavado astringente; adicin de conjugado
en la hibridacin, este sistema contempla la po- de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
sibilidad de que variaciones de las secuencias reaccin de tincin mediada por AP. Una plantien las regiones genmicas que fueron elegidas lla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
para los primers y sondas, y la deteccin de re- esquema de bandas obtenido.
giones para las cuales el kit no fue diseado,
pueden conducir a resultados falsos. Debido a MATERIALES
la gran variabilidad existente en los genomas Agua destilada (para uso en biologa molecubacterianos es posible que ciertos sub-tipos lar)
puedan no ser detectados. El test refleja los co- Bao de agua
nocimientos de Hain Lifescience.
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
La utilizacin de este ensayo est limitada a Bao de ultrasonidos
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Centrfuga de mesa
Cronmetro
ADN polimerasa termoestable con tampn
(recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase
de Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Pinzas
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
Plataforma de agitacin/TwinCubator
Probeta graduada
Puntas de pipeta desechables con filtro
Reactivos para extraccin de ADN, as como
equipos necesarios
Termociclador (rango de calentamiento 3C/
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
+/0,2C)
Termmetro calibrado
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Las muestras para extraccin son a partir de
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
Las muestras tambin pueden extraerse a partir
de cultivos positivos en medio lquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
DNasa y RNasa.
PROCEDIMIENTO
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, MBCheck). Este test no puede usarse para detectar
micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de
ADN amplificado. Es crucial el calentamiento
de las muestras a 95C durante, al menos, 20
minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de ADN que produzca ADN de
bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce ADN adecuado para
amplificacin:
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio slido, recoja las colonias de bacterias con
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35 L de PNM suministrado
5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contiene 15 mM de MgCl2) no suministrado
2 L25 mM de solucin MgCl2 no suministrado
0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado
3 L de agua (para uso en biologa molecular)
no suministrado
5 L de solucin de DNA (aada el DNA en
una zona distinta)
La concentracin final de MgCL2 en la mezcla
de amplificacin ser de 2,5 mM.
Determine el nmero de muestras a amplificar
(nmero de muestras a analizar ms las muestras de control). Por ejemplo, un control de contaminacin contiene 5 L de agua en lugar de
solucin de ADN. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solucin de
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
mezcla madre en volmenes de 45 L en tubos
preparados de PCR.
2) Perfil de amplificacin *)
HIBRIDACIN
Preparacin
Precaliente en bao de agua con agitacin o
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin tolerada en la temperatura idnea es de +/1C.
Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745C antes de usar.
Los reactivos han de estar libres de precipitado
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepcin del CON-C y
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
con sus tampones respectivos (CON-C con
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
concentrado a 1 mlL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si
se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz.
1. Dispense 20 L de la Solucin de Desnaturalizacin (DEN, azul) en una esquina de cada
uno de los pocillos usados.
2. Aada a la solucin 20 L de muestra amplificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos
usando pinzas e identifquelas marcando bajo
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solucin tenga un color homogneo.
Tenga la precaucin de no derramar solucin
en los pocillos cercanos.
4. Ponga una tira en cada pocillo.
Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solucin y el lado con la sonda
hacia arriba (identificable por el marcador coloreado prximo al extremo inferior). Usando
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersin. Limpie cuidadosamente las pinzas despus de cada uso
para evitar contaminacin. Ello, es tambin de
aplicacin en los pasos siguientes.
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Cuando utilice bacterias crecidas en medio lquido, la contaminacin bacteriana puede posiblemente generar el mismo patrn de bandas.
Este resultado, por tanto, es vlido nicamente
cuando el DNA fue aislado del crecimiento bacteriano en medio slido (colonias individuales/
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Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad:
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y
piel.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfxido y es irritante.
LIMITACIONES
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un mtodo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que
la muestra de ADN ha sido amplificada eficientemente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de
las regiones genmicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El anlisis de
secuencias potenciales permanece reservado
para la reanudacin de investigaciones.
La presencia de mltiples especies de bacterias en la muestra a analizar puede dificultar la
interpretacin de resultados.
Como cualquier sistema de deteccin basado
en la hibridacin, este sistema con- templa la
posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genmicas que fueron
elegidas para los primers y sondas, y la deteccin de regiones para las cuales el kit no fue
diseado, pueden conducir a resultados falsos.
Debido a la gran variabilidad existente en los
genomas bacterianos es posible que ciertos
subtipos puedan no ser detectados. El test refleja los conocimientos de Hain Life- science.
La utilizacin de este ensayo est limitada a
personas cualificadas, bien entrenadas en el
procedimiento de utilizacin del ensayo y familiarizadas con mtodos de biologa molecular.
La evaluacin de este sistema de anlisis fue
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
caractersticas de rendimiento de este ensayo
no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de
otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.
9.6. IDENTIFICACIN DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
(GenoType MTBC)
PRINCIPIO
El kit GenoType MTBC est basado en la tecnologa DNASTRIP que permite en base a los
polimorfismos genticos, por los que la ADN
girasa B diferencia genticamete de especies/
cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium
tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis
BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae,
M. microti, y M. tuberculosis/M. canettii.
El procedimiento completo se divide en tres pasos: extraccin de ADN procedente de cultivo
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos
necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos:
desnaturalizacin qumica del producto a amplificar; hibridacin de amplicones de una sola
cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
a membrana; lavado astringente; adicin de
conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
(AP), y una reaccin de tincin mediada por AP.
Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y
rpida del esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa molecular)
Bao de agua
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
ADN polimerasa termoestable con tampn
(recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase
de Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Pinzas
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
Plataforma de agitacin/TwinCubator
Probeta graduada
Puntas de pipeta desechables con filtro
Reactivos para extraccin de DNA, as como
equipos necesarios
Termociclador (rango de calentamiento 3C/
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
+/0,2C)
Termmetro calibrado
Tubos para PCR, libres de DNasa y
RNasa
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PREPARACIN DE LA MUESTRA
Las muestras para extraccin son a partir de
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
Las muestras tambin pueden extraerse a partir
de cultivos positivos en medio lquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
DNasa y RNasa.
dad y utilice directamente 5 L del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solucin de
ADN haya de almacenarse por perodos prolongados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
un tubo nuevo.
AMPLIFICACIN
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en
una habitacin libre de ADN. La muestra debe
aadirse en un rea separada.
Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
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HIBRIDACIN
Preparacin
Precaliente en bao de agua con agitacin o
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin tolerada en la temperatura idnea es de +/1C.
Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745C antes de usar.
Los reactivos han de estar libres de precipitado
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepcin del CON-C y
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
con sus tampones respectivos (CON-C con
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas
si se almacena a temperatura ambiente y se
protege de la luz.
1. Dispense 20 L de la Solucin de Desnaturalizacin (DEN, azul) en una esquina de cada
uno de los pocillos usados.
2. Aada a la solucin 20 L de muestra amplificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifquelas marcando
bajo el marcador coloreado con un lpiz. Lleve
siempre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solucin tenga un color homogneo.
Tenga la precaucin de no derramar solucin
en los pocillos cercanos.
4. Ponga una tira en cada pocillo.
Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solucin y el lado con la sonda
hacia arriba (identificable por el marcador coloreado prximo al extremo inferior). Usando
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersin. Limpie cuidadosamente las pinzas despus de cada uso
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Tiempos prolongados de incubacin del sustrato pueden conducir a una tincin incrementada
del fondo y podra dificultar la interpretacin de
los resultados.
12. Detenga la reaccin aclarando brevemente
por dos veces con agua destilada.
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bandeja y squelas entre dos capas de papel absorbente.
RESULTADOS E INTERPRETACIN
Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la
luz. Con cada kit se proporciona un formulario
de evaluacin. Cuando se utilice este formulario
de evaluacin, pegue las tiras reveladas en los
campos marcados, alineando las bandas CC
y UC con las respectivas lneas del formulario.
Anote el nmero de las bandas positivas en la
penltima columna y determine la especie con
la ayuda de la tabla de interpretacin y registre
el nombre de las especies identificadas en la
ltima columna. La plantilla suministrada tambin sirve como ayuda para evaluacin y ha de
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reaccin
(ver esquema).
PRECAUCIONES
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cualquier fuente potencial de ADN contaminante. Si
se requiere almacenar durante ms de 4 semanas, almacene a 20C. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote
el PNM. Almacene el resto de los componentes
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
de su fecha de caducidad.
Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
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Los especmenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especmenes de pacientes deben ser considerados siempre como
potencialmente infecciosos. Las muestras de
pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
cultivos realizados a partir de esas muestras
deben ser etiquetados y manejados siempre
bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
de acuerdo con las guas institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de
seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparacin de la muestra, incluyendo el paso de inactivacin por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivacin
por calor las muestras deben ser centrifugadas
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
el rotor con contenedor de aerosoles solamente
en la cabina de seguridad. Despus de la inactivacin por calor se puede utilizar un rotor
standard para centrifugar las muestras fuera de
la cabina de seguridad.
Observe las precauciones normales para preparar la amplificacin. Es esencial que todos los
materiales y reactivos usados para extraccin
de ADN y amplificacin estn libres de DNasas.
Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad:
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y
piel.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfxido y es irritante.
LIMITACIONES
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un mtodo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que
la muestra de ADN ha sido amplificada eficientemente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de
las regiones genmicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El anlisis de
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de cultivos positivos en medio lquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
DNasa y RNasa.
PROCEDIMIENTO
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, MBCheck). Este test no puede usarse para detectar
micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de
ADN amplificado. Es crucial el calentamiento
de las muestras a 95C durante, al menos, 20
minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de ADN que produzca ADN de
bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce ADN adecuado para
amplificacin:
Cuando use crecimiento bacteriano en medio
slido, recoja las colonias de bacterias con un
asa de inoculacin y suspndalas en aproximadamente 300 l de agua (grado Biologa Molecular).
1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio lquido, aplique directamente 1
ml. Concentre las bacterias mediante centrifugacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
en un rotor con contenedor de aerosoles y en
una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
y resuspenda las bacterias en 100-300 L de
agua (ver ms arriba) con un vrtex.
2. Incube las bacterias procedentes del apartado 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao
de agua.
3 Incube durante 15 min en un bao de ultrasonidos.
4 Centrifugue durante 5 min a mxima velocidad y utilice directamente 5 l del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solucin de
ADN haya de almacenarse por perodos prolongados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
un tubo nuevo.
AMPLIFICACIN
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en
una habitacin libre de ADN. La muestra debe
aadirse en un rea separada.
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2) Perfil de amplificacin *)
Mezcle por tubo:
35 L de PNM suministrado
5 L 10x de tampn para incubacin de polimerasa no suministrado.
x L de solucin MgCl 1) no suministrado
1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable (consulte el manual) no suministrado
y L de agua para obtener un volumen de 45
l (sin considerar el volumen de enzima) no
suministrado.
Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de
ADN) para obtener un volumen final de 50 L
(sin considerar el volumen de enzima).
1) Dependiendo del sistema enzima/tampn
usado, la concentracin ptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
algunos tampones para incubacin ya contienen MgCl .
Los productos para amplificacin pueden almacenarse entre20CY 8 C
La evaluacin del rendimiento del ensayo Ge- Para comprobar la reaccin de amplificacin,
noType Mycobacterium AS fue realiza- da uti- aplique directamente 5 l de cada muestra a un
lizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qia- gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn
gen. Las cantidades necesarias por muestra de carga. Los amplicones tienen una longitud
cuando utilice esta enzima son las siguientes:
aproximada de 230 pb (Control de Gnero) y
200 pb (Control Universal/amplicon espe35 L de PNM suministrado
cie-especfico).
5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contiene 15 mM de MgCl2) no suministrado
HIBRIDACIN
2 L25 mM de solucin MgCl2 no suminis- Preparacin
trado
Precaliente en bao de agua con agitacin o
0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to3 L de agua (para uso en biologa molecular) lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
no suministrado
Precaliente las soluciones HYB y STR a 375 L de solucin de DNA (aada el DNA en 45C antes de usar.
una zona distinta)
Los reactivos han de estar libres de precipitado
La concentracin final de MgCL2 en la mezcla (tenga en cuenta, no obstante que la solucin
de amplificacin ser de 2,5 mM.
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
Caliente a temperatura ambiente los restanDetermine el nmero de muestras a amplificar tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
(nmero de muestras a analizar ms las mues- el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
tras de control). Por ejemplo, un control de con- Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
taminacin contiene 5 L de agua en lugar de Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
solucin de ADN. Prepare una mezcla que con- con sus tampones respectivos (CON-C con
tenga todos los reactivos excepto la solucin de CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperamezcla madre en volmenes de 45 L en tubos tura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
preparados de PCR.
concentrado a 1 mlL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso.
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Pg. 111
Cuando utilice bacterias crecidas en medio lquido, la contaminacin bacteriana puede posiblemente generar el mismo patrn de bandas.
Este resultado, por tanto, es vlido nicamente
cuando el DNA fue aislado del crecimiento bacteriano en medio slido (colonias individuales/
idntica morfologa de colonias).
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Pg. 112
de acuerdo con las guas institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de
seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparacin de la muestra, incluyendo el paso de inactivacin por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivacin
por calor las muestras deben ser centrifugadas
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
el rotor con contenedor de aerosoles solamente
en la cabina de seguridad. Despus de la inactivacin por calor se puede utilizar un rotor
standard para centrifugar las muestras fuera de
la cabina de seguridad.
Observe las precauciones normales para preparar la amplificacin. Es esencial que todos los
materiales y reactivos usados para extraccin
de DNA y amplificacin estn libres de DNasas.
Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad:
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfxido y es irritante.
LIMITACIONES
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un mtodo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que
la muestra de ADN ha sido amplificada eficientemente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de las
regiones genmicas para las que los primers
y sondas han sido elegidos. El anlisis de secuencias potenciales permanece reservado
para la reanudacin de investigaciones.
La presencia de mltiples especies de bacterias
en la muestra a analizar puede dificultar la interpretacin de resultados.
Como cualquier sistema de deteccin basado
en la hibridacin, este sistema con- templa la
posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genmicas que fueron elegidas para los primers y sondas, y la deteccin
de regiones para las cuales el kit no fue diseado, pueden conducir a resultados falsos.
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MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa moleDebido a la gran variabilidad existente en los cular)
genomas bacterianos es posible que ciertos Bao de agua
subtipos puedan no ser detectados. El test re- Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
fleja los conocimientos de Hain Life- science.
La utilizacin de este ensayo est limitada a Centrfuga de mesa
personas cualificadas, bien entrenadas en el Cronmetro
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami- ADN polimerasa termoestable con tampn
(recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase
liarizadas con mtodos de biologa molecular.
La evaluacin de este sistema de anlisis fue de Qiagen)
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime- Guantes desechables
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las Papel absorbente
caractersticas de rendimiento de este ensayo Pinzas
no han sido validadas para todas las polime- Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
rasas disponibles comercialmente, el usuario Plataforma de agitacin/TwinCubator
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de Probeta graduada
otras polimerasas distintas de las arriba men- Puntas de pipeta desechables con filtro
Reactivos para extraccin de DNA, as como
cionadas.
equipos necesarios
9.6. IDENTIFICACIN DEL COMPLE- Termociclador (rango de calentamiento 3C/
JO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
+/0,2C)
(GenoType MTBC)
Termmetro calibrado
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
PRINCIPIO
El kit GenoType MTBC est basado en la tecnologa DNASTRIP que permite en base a los PREPARACIN DE LA MUESTRA
polimorfismos genticos, por los que la ADN Las muestras para extraccin son a partir de
girasa B diferencia genticamete de especies/ colonias aisladas de cultivo slido, suspendicepas pertenecientes al grupo Mycobacterium das en 300 l agua ultrapura libre de DNasa
tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y
BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, RNsa.
Las muestras tambin pueden extraerse a parM. microti, y M. tuberculosis/M. canettii.
El procedimiento completo se divide en tres pa- tir de cultivos positivos en medio lquido, se
sos: extraccin de ADN procedente de cultivo traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR,
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos libre de DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con bioti- PROCEDIMIENTO
na (la ADN polimerasa termoestable no se inEXTRACCIN DE ADN
cluye), y una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos: Puede usarse un crecimiento bacteriano en
desnaturalizacin qumica del producto a am- placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Miplificar; hibridacin de amplicones de una sola ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
cadena, marcados con biotina, a sondas uni- MB-Check). Este test no puede usarse para dedas a membrana; lavado astringente; adicin tectar micobacterias directamente de muestras
de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidi- de pacientes. La zona de trabajo ha de estar
na (AP), y una reaccin de tincin mediada por libre de ADN amplificado. Es crucial el calenAP. Una plantilla asegura la interpretacin sen- tamiento de las muestras a 95C durante, al
cilla y rpida del esquema de bandas obtenido. menos, 20 minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas.
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solucin de ADN. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solucin de
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
preparados de PCR.
2) Perfil de amplificacin *)
HIBRIDACIN
Preparacin
Precaliente en bao de agua con agitacin o
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin toAMPLIFICACIN
lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en Precaliente las soluciones HYB y STR a 37una habitacin libre de ADN. La muestra debe 45C antes de usar.
aadirse en un rea separada.
Los reactivos han de estar libres de precipitado
Mezcle por tubo:
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin
35 L de AM B suministrado
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
10 L de AM A- suministrado
Caliente a temperatura ambiente los restanAada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
ADN) para obtener un volumen final de 50 L el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
(sin considerar el volumen de enzima).
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
Determine el nmero de muestras a amplificar con sus tampones respectivos (CON-C con
(nmero de muestras a analizar ms las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperataminacin contiene 5 L de agua en lugar de tura ambiente.
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ltima columna. La plantilla suministrada tambin sirve como ayuda para evaluacin y ha de
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reaccin TABLA DE INTERPRETACIN
(ver esquema).
PRECAUCIONES
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El tratamiento y preparacin de la muestra, incluyendo el paso de inactivacin por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivacin
por calor las muestras deben ser centrifugadas
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
el rotor con contenedor de aerosoles solamente
en la cabina de seguridad. Despus de la inactivacin por calor se puede utilizar un rotor
standard para centrifugar las muestras fuera de
la cabina de seguridad.
Observe las precauciones normales para preparar la amplificacin. Es esencial que todos los
materiales y reactivos usados para extraccin
de ADN y amplificacin estn libres de DNasas.
Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad:
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfxido y es irritante.
La tuberculosis (Tb) es una enfermedad reemergente causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis y que infecta a un tercio
de la poblacin mundial. Dentro de los principales objetivos en el desarrollo de procedimientos para realizar susceptibilidad antibitica es
poder identificar la presencia de cepas resistenLIMITACIONES
tes y multiresistentes.
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser ais- Para el tratamiento se utilizan varios medicalado de cultivo bacteriano realizado por un m- mentos para evitar la aparicin de resistencias
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que por mutaciones naturales en las micobacterias.
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- Las drogas de primera lnea son rifampicina
(RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y
temente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de las etambutol (EMB); todas tienen cierto grado de
regiones genmicas para las que los primers toxicidad pero son relativamente seguras y cauy sondas han sido elegidos. El anlisis de se- san pocos efectos secundarios.
cuencias potenciales permanece reservado Los test de susceptibilidad desempean un papel muy importante en epidemiologa, debido a
para la reanudacin de investigaciones.
La presencia de mltiples especies de bacte- que detectan la aparicin de resistencia provorias en la muestra a analizar puede dificultar la cada por fallas en la administracin o en la supervisin de un tratamiento adecuado. Tambin
interpretacin de resultados.
Como cualquier sistema de deteccin basado es importante porque los resultados pueden ser
en la hibridacin, este sistema con- templa la utilizados como una gua para iniciar la terapia,
posibilidad de que variaciones de las secuen- para confirmar la resistencia antibitica en un
cias en las regiones genmicas que fueron paciente que demuestra respuesta insatisfactoelegidas para los primers y sondas, y la detec- ria al tratamiento y para la evaluar la tendencia
cin de regiones para las cuales el kit no fue de resistencia primaria y adquirida dentro de
diseado, pueden conducir a resultados falsos. una comunidad.
Debido a la gran variabilidad existente en los En Guatemala las pruebas de susceptibilidad a
genomas bacterianos es posible que ciertos frmacos no se llevan a cabo rutinariamente,
subtipos puedan no ser detectados. El test re- lo cual hace surgir la posibilidad de esquemas
inadecuados de tratamiento para pacientes
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EN TUBO
11. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
derretido dentro de los balones como sigue:
- Agregar 225ml de agar a 6 balones de 500ml
(PARA ANTIBIOTICOS)
- Agregar 250ml de agar a 1 baln de 1 litro
(PARA CONTROL DE CRECIMIENTO)
- Agregar un magneto a cada baln
Cubrir los balones con tapaderas plsticas de
tapn de rosca, tapones de esponja, o papel
aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121C
AGREGAR 25 mL de OADC (ESTO ES PARA
20 TUBOS MXIMO 25 TUBOS EXACTOS)
C. Etiquetado de las cajas.
1. Preparar 70 cajas cuadriplate en dos columnas de 35 cajas cada una.
2. Etiquetar todas las cajas de una columna con
el nmero 1.
3. Etiquetar todas las cajas de la segunda columna con el nmero 2.
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antimicrobianos.
NOTA:
- Contar un acumulo como un solo organismo.
- Utilizar objetivo de aceite de inmersin (para
conteo de organismos teidos con carbolfucshina)
- Utilizar objetivo seco fuerte (para conteo de
organismos teidos con fluorocromo)
D. Preparacin de cajas.
1. Permitir que los antimicrobianos se descongelen a temperatura ambiente, y usarlos lo ms
rpido posible. Nunca permitir que se recongelen.
2. Retirar un frasco de 200ml de enriquecedor
OADC del refrigerador, y atemperar.
3. Retirar un frasco de tapn de rosca de 500ml
conteniendo 180ml de agar Middlebrook 7H10
y agitar en un plato de agitacin para homogenizar el medio (sin calor)
4. Agregarle 20ml de enriquecedor OADC cuando el agar tenga una temperatura de 56C y homogenizar (no aplicar calor)
5. Agregar la cantidad apropiada de antimicrobiano para obtener una concentracin final de
0.2m de INH y continuar la agitacin por 1 a 2
min (ver tabla No. 9)
6. Utilizando una pipeta estril o un dispensador, dispensar 5ml de agar con INH en el cuadrante II de las 35 cajas etiquetadas con 1 (ver
tabla No. 9)
7. Repetir los pasos del 1 al 6 para los otros
antimicrobianos y dispensarlos dentro de los
cuadrantes de las cajas 1 y 2 (ver tabla No. 9)
Tabla No 9. Preparacin de cajas con
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Ejemplos de reportes.
1.5. La presencia de microcolonias sugiere que el aislamiento puede ser resistente al antibitico
pero que tiene algn efecto en el organismo y puede ser efectivo en combinacin con otras drogas.
1.6. Interpretar un resultado como resistente cuando la proporcin del crecimiento en el medio
conteniendo antibitico es 1% del crecimiento en el medio libre de antibitico.
1.7. Ejemplos:
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MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa molecular)
Bao de agua
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
10.2.2. MTODO DE PCR: IDENTIFI- DNA polimerasa termoestable con tampn (reCACIN DEL COMPLEJO MYCOBAC- comendacin: HotStarTaq DNA Polymerase de
TERIUM TUBERCULOSIS (GenoType Qiagen)
Guantes desechables
MTBDRplus)
Papel absorbente
PRINCIPIO
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Pinzas
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
Plataforma de agitacin/TwinCubator
Probeta graduada
Puntas de pipeta desechables con filtro
Reactivos para extraccin de DNA, as como
equipos necesarios
Termociclador (rango de calentamiento 3C/
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
+/0,2C)
Termmetro calibrado
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Las muestras para extraccin son a partir de
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
Las muestras tambin pueden extraerse a partir
de cultivos positivos en medio lquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
DNasa y RNasa.
PROCEDIMIENTO
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
MB-Check). Este test no puede usarse para
detectar micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de DNA amplificado. Es crucial el calentamiento de las muestras a 95C durante,
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar
bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de DNA que
produzca DNA de bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce
DNA adecuado para amplificacin:
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio slido, recoja bacterias con un asa de inoculacin y suspndalas en aproximadamente
300 l de agua (grado Biologa Molecular).
1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio lquido, aplique directamente 1
ml. Concentre las bacterias mediante centrifugacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
en un rotor con contenedor de aerosoles y en
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bilidad.
Como en cualquier anlisis basado en DNA,
No utilice los reactivos despus de su fecha de este test slamente analiza la secuencia de
caducidad.
cidos nuclicos y no la de aminocidos. Es
Los especmenes de los pacientes y los culti- posible, por tanto, que mutaciones que no cauvos realizados a partir de especmenes de pa- san un cambio de aminocido (mutaciones sicientes deben ser considerados siempre como lenciosas) podran producir la ausencia de una
potencialmente infecciosos. Las muestras de de las sondas wild type.
pacientes de riesgo (infectados por microorga- Los datos ms recientes indican que a pesar de
nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi- aparezca una mutacin L533P en la respectiva
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cepa, esta puede todava ser sensible a RMP.
cultivos realizados a partir de esas muestras Por tanto, si la banda WT8 est ausente y la
deben ser etiquetados y manejados siempre sonda de la mutacin rpoB MUT3 no se tie,
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, deben ser considera- dos los resultados de la
de acuerdo con las guas institucionales. Ob- resistencia fenotpica.
serve todas las normas medioambientales y de En los ltimos aos han sido publicadas mutaseguridad, tanto federales, estatales como lo- ciones adicionales dentro de las testadas en la
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. regin del gen rpoB causantes de la resistenEl tratamiento y preparacin de la muestra, in- cia a rifampicina. Ya que estas mutaciones son
cluyendo el paso de inactivacin por calor, de- muy raras, estas no fueron accesibles para la
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- validacin de este sistema y fueron solamente
ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin detectadas in silico. Sin embargo, una detecpor calor las muestras deben ser centrifugadas cin in silico no excluye la posibilidad de que
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir alguna de las mutaciones no pueda ser detecel rotor con contenedor de aerosoles solamen- tada in vitro.
te en la cabina de seguridad. Despus de la El GenoType MTBDRplus solamente detecta
inactivacin por calor se puede utilizar un rotor aquellas resistencias del M. tuberculosis comstandard para centrifugar las muestras fuera de plex que tienen sus orgenes en la regiones de
la cabina de seguridad.
rpoB, katG e inhA examinadas aqu. ResistenObserve las precauciones normales para pre- cias que tienen sus orgenes en mutaciones en
parar la amplificacin. Es esencial que todos los otros genes o regiones de genes, as como,
materiales y reactivos usados para extraccin otras resistencias o mecanismos de resistencia
de DNA y amplificacin estn libres de DNasas. rifampicina e isoniazida no sern detectados
por este test.
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- El usuario debe tener o adquirir informacin somar las siguientes medidas especiales de se- bre el patrn de distribucin de las mutaciones
guridad:
locales de los genes investigados con este test.
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) con- La presencia de mltiples especies de bactetiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y rias en la muestra a analizar puede dificultar la
piel.
interpretacin de resultados.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- Tericamente, puede existir resistencia a pesar
metil Sulfxido y es irritante.
de que aparezca un modelo wild type. Si, en
un ensayo, la muestra contiene una cepa que
LIMITACIONES
ha desarrollado una he- teroresistencia y la reLa declaracin dada en este manual con res- sistencia se debida a una mutacin no cubierta
pecto a la capacidad del mtodo, se refiere a por las sondas, aparecer el patrn de bandas
muestras de cultivos y muestras clnicas pul- de wild type. Del mismo modo, si la muestra
monares baciloscopia positivas. Los datos dis- contie nen ms de una cepa del complejo M.
ponibles sobre muestras clnicas extrapulmo- tuberculosis (debido a un cultivo mixto o una
nares baciloscopia positivas no son suficientes contaminacin) y una de ellas alberga una mupara trazar una conclusin acerca de su aplica- tacin que no est cubierta por las sondas
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Procedimiento
Preparacin antifimicos: Reconstituir cada frasco de liofilizado del kit SIRE con 4 ml de agua
estril destilada/desionizada para preparar soluciones de reserva de estreptomicina de 83
ug/ml, de isoniazida de 8.3 ug/ml, rifampicina
de 83 ug/ml y de etambutol de 415 ug/ml
Preparacin del inculo: Todos las preparaciones deben realizarse a partir de cultivos puros
de M. tuberculosis. Deben estar previamente
identificadas y aseguras que es de cultivo puro.
El inoculo puede prepararse a partir de un medio slido de un tubo BATEC MGIT 7 ml positivo, adems los que crecen en medios lquidos
y slidos se pueden utilizar para preparar un
tubo MGITi de siembra que sirve para preparar
el inculo.
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Advertencias y Precauciones
Toda muestra para anlisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
precauciones estndar y las normas operativas
de seguridad.
El trabajo con cultivos de M. tuberculosis requiere prcticas, equipo de contencin e instaLos antifmicos se reconstituyen con 4 ml de laciones de nivel des eguridad biolgica (BSL)3.
agua estril/desionizada para lograr la concen- Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
tracin adecuada
en busca de indicios de contaminacin o dao.
4. Preparacin de inculo del tubo de Control de Desecharse los que no parezcan aptos. No deCrecimiento: Con una pipeta, transferir aspti- ben usarse tubos con daos.
camente 0.1 mL de la suspensin de microor- En caso que se rompa un tubo:
ganismos (Preparacin de inculo) a 10 ml de 1. Cierre los cajones del instrumento
solucin salina estril para preparar la suspen- 2. Apagar el instrumento.
sin 1:100 de control de crecimiento. Mezclar 3. Desalojar la zona inmediatamente
bien la suspensin de control de crecimiento. 4. Consultar las normar de manejo de manipuInocular 0.5 mL de la suspensin 1:100 de con- lacin de lquidos y materias contaminadas as
trol de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la como aerosol de micobacterias descritas.
etiqueta CC
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para anlisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
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11. BIBLIOGRAFA
A.D.A.M. Inc. www.adam.com
ngeby, Kristian. (2004). Diagnosis and drug susceptibility testing where resources are scarce. by Karolinska
University Press. Sweden
www.microbiologiaclinica.com
www.biomeriux.com
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2. Primera pagina
La primera pgina del trabajo incluir obligatoriamente los siguientes puntos:
- Ttulo del trabajo conciso, completo y explicativo sobre el asunto al que se refiere.
- Nombre completo de los autores, sin abreviaciones. Los autores debern indicar la forma en
que deseen ser citados.
- Ttulo acadmico completo de los autores, con el nombre y la direccin de la institucin de trabajo a la que estn afiliados.
- Especificacin de la unidad o departamento de la institucin donde el trabajo fue realizado.
- Nombre, direccin, e-mail y nmero de telfono/fax del autor designado para recibir la correspondencia.
3. Resumen:
El resumen debe presentar los siguientes puntos:
Ser enviado en el idioma original (espaol o ingls). En los casos de artculos en ingls, se deben
enviar el resumen en espaol e ingls.
Extensin mxima de 300 palabras para los artculos originales y revisiones, y de 250 palabras
para las notas previas y relatos de casos.
Ser informativos y no indicativos, explicando de forma clara los objetivos, mtodos, resultados y
conclusiones derivadas del estudio.
En los descriptores deben incluirse por lo menos 3 y hasta un mximo de 10 palabras-clave,
en el idioma original y en ingls, empleadas en el DeCS Descriptores en Ciencias de la Salud,
publicacin de la BIREME (Centro Latino-Americano y del Caribe de informacin en ciencias de
la Salud), disponible en http://decs.bvs.br o en el ndex Medicus (Medical Subject Headings),
disponible en http://www.ncbi.nlm.gov/entrez/meshbrower.cgi
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Figuras: Deben de ser numeradas conforme orden de aparecimiento en el texto, en nmeros arbigos. Todas las explicaciones deben de ser presentadas en las leyendas. Los grficos y figuras
deben de ser enviados en power point. En el caso de figuras y fotografas, se deber colocar
en el dorso una etiqueta adhesiva en la que se indique el nombre del primer autor y una flecha
sealando el margen superior. Las fotografas digitales deben de ser enviadas con buena definicin (mnimo 300DPI). De ser necesario, utilizar siempre imgenes producidas por impresoras
de alta resolucin y en blanco y negro.
6. Referencias bibliogrficas
Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en que fueron mencionadas
en el texto, debiendo ser identificadas en nmeros arbigos colocados como exponentes. Los
nombres de las revistas deben ser abreviados de acuerdo con el ndex Medicus, disponible en:
http://www.ncbi.nlm.gv/jrbrowser.cgi.
Las citas debern comprobarse sobre los artculos originales y se ordenaran segn las normas
de Vancouver (1997, edicin revisada de Octubre de 2001), disponible en: http://www.icmje.org.
Todos los autores deben ser citados, independientemente de su numero y deber evitarse escribir para nmeros grandes de autores: et al. No se emplearan frases como comunicaciones
personales. Los trabajos aceptados y no publicados en el momento de ser citados pueden ser
incluidos en las referencias, especificando el nombre de la revista, seguido de la expresin en
prensa entre parntesis. A continuacin se citan algunos ejemplos de los principales tipos de
referencias utilizadas.
a) Artculo de revista:
1. Bryan CS, Reynolds Kl. Bacteremic nosocomial pneumonia. Am Respir Dis 1984;129:668-671.
2. Carratala J, Guidol R, Pallares R, Dorca J, Verdaguer R, Ariza J, et al. Risk factors for nosocomial Legionella pneumophila pneumonia.Am Rev Respir 1994; 149:625-629.
b) Trabajo publicado por una institucin o corporacin:
Ministerio de Sanidad y consumo. Liga Espaola para la Lucha Contra la Hipertensin. Sociedad
Espaola de Hipertensin. Control de la hipertensin arterial en Espaa. Rev Esp Salud Pblica
1996; 70:139-210.
OMS. Informe Anual de Mortalidad Materna en las Amricas. Ao: xxxxx. Disponible en: www.
who.org por ejemplo.
Encuesta Nacional de Salud Materno Infantil, Guatemala: Ao: xxxxs
c) Volumen con suplemento:
Vogel F. Sequential Therapy in the hospital management of lower respiratory infections. Am J
Med 1995; 99 (Supl 6B) : 13S-19S
d) Libros, tesis y monograficas:
1. Hawe P, Degeling D, Hall J. evaluacin en promocin de la salud. Gua para trabajadores de
la salud. 1st ed. Barcelona: Masson;1993.
2.World Health Organization. International drug monitoring the role of national centers. Technical
Report Series N 498.Geneva: 1972.
3.Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly`s access and utilization (dissertation).
St. Louis (MO): Washinton Univ.;1995.
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4. Nues L. Aspectos clnicos, hematolgicos e inmunolgicos en la estrongyloidiasis. Tesis Universidad Central de Venezuela; 1993.
e) Captulo de libro:
Rawlins MD, Thompson JW. Mechanisms of adverse drugs reaction.
En Davies DM, editor. Textbook of Adverse Drug Reaction.4th ed. Oxford University Press; 1991
p 18-45.
f) Resumen de congreso:
Vettorello ML. A influencia de fatores climaticos na incidencia dos acidentes loxoscelicos no
Municipio de Curitiba, no period de 1998 a2001. XXXIX Congresso da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical. 008 TL. Belem, 2003
g) Articulo de fuente o revista electrnica
1. The Counter Bioterrrorism Research Agenda of the National Institute of allergy and Infectious
Diseases for CDC Category A Agents. Washington, DC: National Institute of Allergy and Infectious Diseases; February 202. Disponible en: http://www.nih.gov/dmid/pdf/bioresearchagenda.
pdf.
2. Carucci JA, McGovern TW, Norton SA. Cutaneos anthrax management algorithm. J Am Acad
Dermatol 2001; Nov 21. Disponible en:
http://www.harcourthealth.com/scripts/om.dll/server?arttype=full&article=a121613.
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