Revista Microbiologia 2016

ISSN 2415-251X
Clinica de Enfermedades Infecciosas

Hospital Roosevelt
Revista de microbiologia Volumen No. 1

Enero - Marzo 2016
Revista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
ISSN 2415-251X
Clinica de Enfermedades Infecciosas

Hospital Roosevelt
Revista de microbiologia Volumen No. 1

Enero - Marzo 2016
EDITOR DE LA REVISTA
Licda Maria Remey Gordillo
Coordinadora General Area de Microbiologia y Hospital Roosevelt
Dr. Carlos Meja Villatoro
Jefe de la Clnica de Enfermedades Infecciosas
Hospital Roosevelt
CONTRIBUCIONES
Autores:
Licda Maria Remey Gordillo
Licda. Julia Mirelia Cali Arriaga
Licda. Jackelyn Paola Tol Urizar
Licda. Alejandra Castillo
Licda. Veronica Itzep
Licda. Rosa Alvarez
Licda. Diana Baldizn
Licda. Margarita Boloix
Sr. Hctor Cat
Licda. Lis Jerez
Licda. Ana Luca Lemus
DIAGRAMACIN Y DISEO
Mellross Elswith Salazar Alvarez
Editorial
La Microbiologa Clnica tiene como objetivo principal establecer el agente causal de las infecciones que afectan al hombre. El Diagnstico debe ser certero y oportuno, capaz de dirigir un
tratamiento adecuado que conlleve a la recuperacin del paciente. El logro del diagnstico se
basa en la estandarizacin adecuada de los procedimientos y el conocimiento y uso adecuado
de diferentes tecnologas dirigidas al tipo de microorganismo sospechoso.
En respuesta a las diversas necesidades se tom la iniciativa de actualizar a los profesionales de
diversas reas de la salud, mediante la informacin de temas bsicos a travs de un Diplomado
de Microbiologa Clnica en el cual se incluyeron temas de resistencia antimicrobiana, biologa
molecular, diagnstico y tratamiento de hongos sistmicos y tuberculosis con la participacin de
conferencistas expertos en los temas.
Entre las actividades que se realizaron en el Diplomado se tuvieron:
1. Conferencias tericas donde se presentaron y discutieron temas en aspectos generales y especficos sobre diagnstico, procedimientos estndar, tratamiento de infecciones causadas por
microorganismos bacterianos.
2. Investigacin sobre un tema especfico sobre resistencia antimicrobiana.
3. Elaboracin y presentacin de un manual de procedimientos estndar acorde a las necesidades, capacidades y disponibilidad de recursos para el diagnstico bacteriano microbiolgico.
El Diplomado se desarroll en el Hospital Roosevelt con el apoyo del Programa de Postgrado y
Maestra de la Unidad de Enfermedades Infecciosas que funciona en Hospital Roosevelt desde
el ao 2004 y que es avalado por las autoridades docentes y administrativas del hospital Roosevelt y de la Facultad de Medicina de la Universidad Francisco Marroqun. Tuvo una duracin de
6 meses.
Los principales objetivos especficos que se deseaba alcanzar fueron:
1. Asistir y fortalecer los conocimientos de los laboratoristas y mdicos de instituciones clnicas
pblicas y privadas sobre los principios y la prctica del diagnstico de microorganismos bacterianos, pruebas y tratamiento antimicrobiano.
2. Conocer y aplicar los reportes de susceptibilidad correctos para guiar el tratamiento del paciente, logrando que los laboratorios radicados en distintos hospitales y a nivel comunitario sigan
con exactitud los mismos procedimientos de pruebas y de control de calidad.
3. Conocer y aplicar el manejo de bases de datos que permitan tener informacin que pueda
ser utilizada por especialistas en enfermedades infecciosas, epidemilogos y otros funcionarios
responsables de la salud para establecer patrones de resistencia a agentes antimicrobianos,
promoviendo el tratamiento ptimo e implementando medidas para limitar la difusin de organismos resistentes en los hospitales y la comunidad.
Al Diplomado se inscribieron un total de 67 personas, 42 profesionales, de los cuales 4 eran Mdicos y 38 Qumicos Bilogos, 20 eran estudiantes con pensum cerrado de la carrera de Qumica
Biolgica y 4 tcnicos de laboratorio clnico. Se retiraron 9 personas, quedando 58.
Dentro de la poblacin de profesionales Qumicos Bilogos se tuvo la participacin de profesionales que provenan de Quetzaltenango, Solol, Chimaltenango, Antigua Guatemala, Amatitln,
Mazatenango. El 21% de toda la poblacin estaba trabajando en hospitales en la iniciativa privada.
De los 67 inscritos, completaron el diplomado 58 personas, 52 aprobaron el diplomado lo que
represent un 90% del total de asistentes, 6 no aprobaron, 10.3% y 9 se retiraron. El puntaje
ms alto fue de 89 puntos y el ms bajo de 61 puntos, con una media de 76 puntos. nicamente
7 profesionales obtuvieron puntajes por encima de los 80 puntos. El porcentaje de asistencia
fue del 86% en los 10 mdulos. El porcentaje de puntualidad fue del 48%.
El mdulo que present mayor dificultad fue el de Resistencia Antimicrobiana, lo que se reflej
en los puntajes obtenidos durante el segundo examen parcial que evalu este mdulo, nicamente el 50% de la poblacin aprob. Debido a la dificultad se tom la decisin para el II Diplomado ampliar el mdulo y reforzar los temas sobre resistencia.
En general se puede concluir con los resultados obtenidos que los temas tratados fueron correctamente orientados y asimilados por los participantes. Y la elaboracin de manuales contribuy
a una mejor estandarizacin microbiolgica en los lugares de trabajo de donde provenan los
profesionales que elaboraron los trabajos.
Los profesionales participantes completaron la asistencia a X mdulos con diferentes temas microbiolgicos y desarrollaron trabajos de investigacin. La siguiente edicin presenta los trabajos ms importantes referentes a la informacin que proveen. Son el reflejo del esfuerzo de sus
realizadores para proporcionar informacin estandarizada de procedimientos diarios que son
bsicos en el trabajo diario en Microbiologa. Representan un importante aporte en los temas
desarrollados y son herramientas fundamentales para los laboratorios que trabajan Microbiologa.
Licda. Maria Remei Gordillo
Dr. Carlos Mejia Villatoro
Manual de tinciones en Microbiologia Clinica
-1-1-1-1-1-1-
Normas de seguridad en el laboratorio

Preparacin, fijacin y coloracin de frotes
-1-1-
Introduccin
Generalidades
-2-2-3-3-3-3-4-4-4-4-4-4-4-4-5-5-
Tinciones en Microbiologa Clnica

Tinciones simples
Tincin de Azul de Metileno de Loeffler
Tincin de Azul de Lactofenol
Tincin Naranja de Acridina
Tincin de Negro de Clorazol
KOH con Tinta Azul Parker

Tinciones diferenciales
Tincin de Gram
Tincin de Wright
Tincin de Giemsa
Tincin de Ziehl-Neelsen
Tincin de Kinyoun
Tincin de Ziehl-Neelsen Modificado
Tincin selectiva de esporas Wirtz-Conklin
Tincin de cido Perydico de Schiff (PAS)

Tinciones especiales

Tinta China
Tincin de Auramina-Rodamina
Tincin Blanco de Calcofluor
Tincin de Gomori-Grocott
-6-6-6-6-7-7-8-8-8-8-10-10-11-11-11-11-12-12-
Referencias
-16-16-
Manual de Microbiologia
Introduccin
Generalidades
Normas Mnimas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiologa
Organizacin de rea de Trabajo
Generalidades de la Estructura Bacteriana
Bacterias Gram positivo
Bacterias Gram negativo
-13-13-13-13-13-13-14-14-14-14-
-16-16-17-17-17-17-16-16-16-17-18-18-18-18-19-19-
Tinciones Bsicas
Tincin de Gram
Principio
Procedimiento de la Tincin de Gram
Tincin Ziehl Neelsen
Principio
Procedimiento de Tincin de Ziehl Neelsen
Tincin de Kinyoun
Principio
Procedimiento de Tincin Kinyoun
Tincin Kinyoun Modificado
Principio
Procedimiento de Tincin Kinyoun Modificado
Observacin en Fresco
Principio
Procedimiento de Observacin en Fresco
Toma de Muestra y Procedimientos
Orocultivo
Propsito e importancia
Recoleccin de la muestra y transporte
Procedimiento
Aislamiento Primario
Identificacin Streptococcus pyogenes
Procedimiento
Cultivo de Garganta Especial
Propsito
Recoleccin de Muestra y Transporte
Toma de muestra para Corynebacterium diphteriae
Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella
pertussis
Aislamiento primario
Corynebacterium diphteriae
Neisseria meningitidis
Bordetella pertussis
Identificacin de principales Microorganismos
Corynebacterium diphtheriae
Neisseria Meningitidis
Bordetella pertussis
Hemocultivo y Mielocultivo
Propsito
Toma de muestra
-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-19-20-20-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-21-22-22-22-22-22-22-22-22-22-22-23-23-23-23-23-24-24-24-24-24-24-24-24-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-25-27-27-27-27-27-27-27-27-
Procedimiento de incubacin
Identificacin de principales microorganismos
Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos estriles
Propsito
Aislamiento Primario del Lquido Cefalorraqudeo u otros Lquidos Estriles
Coprocultivo
Propsito e Importancia
Salmonella sp
Shigella
Vibrio Cholerae
Procedimiento para aislar Salmonella sp, Shigella sp
Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae
Identificacin de principales Microorganismo
Pruebas Bioqumicas
Identificacin de Salmonella sp
Identificacin de Shigella sp
Identificacin de Vibrio cholerae
Urocultivo
Recoleccin de la Muestra y Transporte
Asilamiento primario
Identificacin de principales microorganismo
Escherichia coli
Klebsiela pneumoniae
Klebsiella oxytoca
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Secreciones Varias
Secreciones de heridas y abscesos
Toma de muestra de Herida
Toma de muestra de Absceso
Toma de muestra en quemaduras
Toma de muestra de ojo
Toma de muestra de Odo
-27-27-27-28-28-29-29-30-30-31-30-31-31-a la-33-33-3333-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-34-35-35-36-35-36-37-37-37-38-38-39-39-40-40-41-41-41-41-41-41-42-41-41-42-42-42-43-43-43-44-44-44-44-44-44-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-45-46-46-

Esquema de identificacin de Cocos Gram positivo
Identificacin de Gram negativo Fermentadores Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter cloacae
Identificacin de Gram Negativo no Fermentador Pseudomonas aeroginosa
Secrecin Vaginal
Propsito
Identificacin de principales microorganismo
Identificacin presuntiva de N. gonorrhoeae
Identificacin de Gardnerella vaginalis
Identificacin de Streptococcus agalactiae
Identificacin de Candida albicans
Esputo de cultivo bacteriano
Propsito
Realizacin del frote del Esputo
Criterio de Murria
Identificacin de Principales Microorganismo
Identificacin de Streptococcus pneumoniae
Identificacin de Haemophilus influenzae
Anexos
Prueba de Catalasa
Prueba de Coagulasa
Prueba de Manitol Sal
Prueba de DNasa
Prueba de Novobiocina
Prueba de Bacitracina A
Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa)
Prueba de CAMP
Prueba de Hidrlisis de Hipurato
Bilis Esculina
Crecimiento de NaCl 6.5%
Prueba de Sensibilidad a Optoquina
Solubilidad en Bilis
Prueba de Satelitismo
Factor de Crecimiento XV
Bibliografa
-46-46-46-47-47-47-47-47-47-47-47-47-47-47-48-48-48-48-48-48-48-48-49-49-49-49-49-49-49-49-50-50-50-50-50-50-50-50-50-50-51-51-51-51-51-51-51-51-52-52-53-53-53-53-53-53-53-53-54-54-54-54-54-54-54-54-55-55-55-55-56-56-56-56-56-56-56-56-56-56-57-a la -59
Manual de Procedimientos Tamizaje, Aislamiento,

Identificacion y Sensibilidad de Micobacterias
Introduccin
Generalidades
Tuberculosis pulmonar y tuberculosis extrapulmonar
Niveles de laboratorio
Nivel i
Nivel ii
Nivel iii
Toma de muestra y procedimientos por tipo de muestra
Muestras de orina
Toma de muestra
Chorro medio u orina al vuelo
Sondas permanentes
Puncin o aspirado suprapbico
Catter
Procesamiento de la muestra
Requerimientos e instrucciones especiales de muestra de orina
Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes
Muestras de sangre y mdula sea
Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de
sangre y mdula sea
Toma de muestra de sangre y mdula sea
Precauciones para el uso de los frascos
Tratamiento de la muestra en el laboratorio
Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes
Muestras de lquido cefalorraqudeo, lavados y otros lquidos corporales
Toma de muestra para lquido cefalorraqudeo
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra
Preparacin de la muestra para la elaboracin de frotes
Muestras de heces
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la Muestra de
heces
Preparacin de la muestra de heces para la elaboracin de frotes
Muestras de biopsias y secreciones varias
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la muestra
Preparacin de la muestra para la elaboracin de frotes
muestras de esputo
toma de muestra.
-60-60-60-60-61-61-61-61-61-62-62-62-62-62-62-62-62-62-63-63-63-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-64-65-65-65-66-66-66-67-67-67-67-67-67-67-68-68-68-68-68-68-68-68-68-68-69-68-69-69-69-69-69-70-70-70-70-70-70-70-71-71-71-
Procedimiento para obtencin de la muestra.

Procesamiento de la muestra de esputo
Preparacin y observacin directa de una muestra
Preparacin de un extendido
Procedimientos de tincin alcohol-cido resistencia
Coloracin de ziehl-neelsen:
Coloracin de kinyoun:
Interpretacin e informe de baciloscopas
Pruebas de tamizaje
Prueba de lam
Genexpert
Cultivo de micobacterias en lowenstein jensen
Muestras
Mtodos para decontaminacin de muestras.
Mtodo de n-acetil-l-cistena-hidrxido de sodio (nalc-naoh)
Mtodo del hidrxido de sodio
Mtodo del cido oxlico
Mtodo mycoprep bbl (mtodo comercial)
Inoculacin de tubo bactec mgit 960 (indicador de crecimiento de micobacterias).
Mtodos de identificacin
Test de cido nicotnico para tb bbl taxo (niacina)
Tiras bbl taxo para prueba de nitritos
Deteccin de antgeno mpt64
Identificacin de especies comunes de micobacterias (genotype mycobacterium cm)
Identificacin de especies adicionales (genotype mycobacterium as)
Identificacin del complejo mycobacterium tuberculosis (genotype mtbc)
Sensibilidad antibitica
Introduccin
Mtodos de determinacin de sensibilidad antifmica
Mtodo de las proporciones de canetii
Mtodo de pcr: identificacin del complejo mycobacterium tuberculosis
(genotype mtbdrplus)
Mtodo de sensibilidad antifmica por bactec mgit 960 sire kit
Bibliografia
Normas de Publicacin
-71-71-71-72-73-73-73-73-73-74-74-74-75-75-75-75-75-75-76-76-76-77-77-79-80-80-81-82-83-83-83- 84-85-85-86-86-86- 87-89-89-89-92-92-92-92-93-94-107-108-113-114-118-118-118-118-118-119-119-119-125-125-131-131-133-134-134-135-139-
MANUAL DE TINCIONES
EN MICROBIOLOGA CLNICA
Julia Mirelia Cali Arriaga
Jackelyn Paola Tol Urizar
I. INTRODUCCIN
El presente Manual contiene los procedimientos de rutina en el Laboratorio de Microbiologa,
con el fin de conocer todas las tcnicas de tinciones que sirven de base en las identificaciones
bacterianas, a la vez se hace mencin de las normas de bioseguridad tiles para mantener la seguridad dentro del laboratorio y de quienes laboran en el, as como tambin el procedimiento de
elaboracin de frotes y fijacin de los mismos. Adems est elaborado de tal manera que sea aplicable al funcionamiento actual de los diferentes procedimientos del Laboratorio en Microbiologa
II. GENERALIDADES
A. Normas mnimas de seguridad
en el laboratorio de microbiologa
1. Entrar al laboratorio en forma ordenada,
dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para
tal fin.
2. Llevar puesta la bata de laboratorio en
todo momento. La misma debe permanecer
completamente cerrada.
3. Limpiar y desinfectar las superficies de
trabajo, antes de comenzar y al finalizar el
trabajo.
4. Lavar las manos con agua y jabn antes
de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre despus
de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.
5. Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en
las reas de laboratorio.
6. Evitar llevar al laboratorio, accesorios que
podran ser fuente de contaminacin (por
ejemplo joyas).
7. Recoger el cabello largo. Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos.
Hablar slo lo indispensable.
8. No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse
cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de
contacto en ningn rea del laboratorio.
.
9. Conocer el manejo de todos los equipos y

reactivos a emplear antes de iniciar las actividades o hacer uso de ellos. Si usted tiene alguna duda, dirjase al supervisor o encargado
del rea.
10. Mantener el rea de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,
exceptuando aquellos equipos y materiales
necesarios para la realizacin del trabajo.
11. Tener cuidado cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar ste desatendido.
12. Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de
manera ordenada a su respectivo lugar una
vez finalizada la actividad. Reporte cualquier
dao de los mismos al supervisor.
13. Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal
fin. 14. No usar ningn reactivo que no est
debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar seguro de cmo emplearlo.
15. No devolver sustancias a sus envases originales.
16. Emplear pipeteador o bomba de vacio al
medir lquidos. Est rigurosamente prohibido
pipetear con la boca.
17. Realizar solamente aquellas actividades
programadas y asignadas, no llevar a cabo
experimentos actividades no autorizadas.
18. Reportar inmediatamente cualquier accidente al supervisor o encargado del rea (derrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado
como menor.
Pg. 1
19. Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo.

20. Extremar las precauciones cuando se
utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculacin accidental y la generacin de aerosoles durante su manipulacin y desecho.
21. Emplear tcnicas aspticas para el manejo
de cultivos de microorganismos (OMS, 2005) .
B. Preparacin, fijacin y coloracin
de frotes
Debido al pequeo tamao de la mayora de
microorganismos, se requiere de un microscopio ptico, ya sea de campo claro o de campo
oscuro para hacer la descripcin morfolgica
de stos. El microscopio de uso ms comn es
del de campo claro, en el que la observacin
de clulas cicas es limitada debido a que las
clulas son incoloras y permiten el paso de una
gran cantidad de luz (Aquiahuatl, Prez, 2004).
La observacin de frotes teidos es ms recomendable. El frote se prepara haciendo una
extensin de los microorganismos sobre una
superficie transparente, en la cual se fijan y tien los microorganismos. De acuerdo al nmero de soluciones colorantes y a los objetivos de
estudio se pueden realizar diferentes tipos de
tinciones como son: simples, diferenciales y especiales (Aquiahuatl, Prez, 2004).
Los frotes de cultivos lquidos se deberan fijar
con alcohol para evitar residuos del medio, que
al quemarse darn interferencias en las observaciones y los de colonias de medios slidos
se fijan generalmente con calor. Despus de
la fijacin, los frote son teidos con diferentes
colorantes sintticos derivados de anilina en su
mayora (Aquiahuatl, Prez, 2004).
Los colorantes ms utilizados son sales formadas por iones coloridos cargados conocidos como cromforos. Por ejemplo:
Si el cromforo es un in positivo el colorante es de tipo bsico, pero si la carga es negativa ser de tipo cido. La mayora de las
bacterias son teidas por colorantes bsicos,
que permeas la pared celular y se adhieren
por enlaces inicos dbiles a molculas con
cargas negativas de la clula bacteriana. La
tincin de las bacterias con azul de metileno,
es un ejemplo de tincin simple que facilita la
observacin de forma, tamao y arreglo de
las clulas (Aquiahuatl, Prez, 2004).
1. Preparacin de frote:
a. Muestras slidas
Tomar la muestra con un hisopo, de preferencia que el material no sea algodn, puede ser
dacrn o alginato de calcio.
Rodar el hisopo con la muestra sobre una lmina portaobjetos limpia de manera que se
obtenga una preparacin homognea (mismo grueso aproximado en toda la lmina) de
sta forma los colorantes penetran de manera adecuada en las estructuras presentes en
la muestra.
Dejar secar al aire o secar aplicando calor
suave debajo de la lmina portaobjetos sin
quemar la muestra (Gordillo, 2005).
b. Muestras lquidas
Tomar una pequea porcin del lquido ya
sea con pipeta pasteur estril, asa en argolla
flameada, asa estril descartable. Colocar en
la lmina, NO restregar la muestra.
Dejar secar al aire o secar aplicando calor
suave debajo de la lmina portaobjetos sin
quemar la muestra (Gordillo, 2005).
1) Fijacin del frote
Fijar los frotes de cultivos lquidos con dos
gotas de metanos o etanol absoluto y dejar
secar al aire (hacer esto en zonas alejadas
del mechero).
Pg. 2
Los frotes de cultivos slidos, completamente

secos se fijarn con calor. Para esto se debe
pasar la lmina rpidamente 2 3 veces en el
interior de la parte amarilla de la flama del mechero, evitando el sobrecalentamiento. Dejar
enfriar a hasta alcanzar temperatura ambiente (Aquiahuatl, Prez, 2004).
Figura 1. Preparacin y fijacin de frotes bacterianos a partir de cultivos slidos y lquidos.
III. TINCIONES EN MICROBIOLOGA

CLNICA
Este es un colorante catinico y se combina fuertemente con los componentes celulares cargados negativamente, con los cidos
nuclicos y los polisacridos cidos (Koneman, Allen, Janda, Procop, Schreckenberger,
Woods, 2008).
b. Materiales y Reactivos
Azul de metileno
Alcohol etlico 95%
Incinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Soporte de Tinciones
Goteros
Agua desmineralizada
Cronmetro
c. Procedimiento
Extender la muestra en un portaobjetos
limpio y fijar la muestra.
Cubrir la extensin con azul de metileno
de Loeffler durante 1-2 minutos
Retirar exceso de colorante y lavar con
abundante agua desmineralizada.
Dejar secar a temperatura ambiente.
d. Resultados
A. Tinciones simples
Son aquellas en donde se utiliza un solo colorante, es simple y fcil su realizacin.
1. Tincin de Azul de Metileno de
Loeffler
a. Principio
Es una tincin simple utilizada para una gran
variedad de microorganismos, sin embargo
su uso es especfico para detectar bacterias
en frotes de lquido cefalorraqudeo en casos
de sospecha de meningitis bacteriana.
Figura 2. Clulas epiteliales ncleos

teidos de azul oscuro y citoplasma
azul plido, bacterias pequeas azules apenas visibles (100X).
Pg. 3
2. Tincin de Azul de Lactofenol
d. Resultados
a. Principio
La tincin de Azul de lactofenol se emplea
para observar hongos. Es una tincin simple
(un slo colorante) y como tal est basada en
la afinidad del colorante por componentes de
las clulas, en este caso por las estructuras
fngicas.El azul de lactofenol tiene tres caractersticas que lo hacen especial para observar dichas estructuras en los hongos del tipo
moho obtenidos en los cultivos por aislamiento. Figura 3. Estructuras fngicas de coloracin azul.
El fenol destruye la flora acompaante (algunas veces en los cultivos, juntos a los hongos
pueden crecer colonias de bacterias). El cido lctico conserva las estructuras fngicas al
crear, por decirlo de algn modo, una pelcula
que las protege provocado por un cambio de
gradiente osmtico entre el interior y el exterior
de dicha estructura. El azul de algodn tiene la
capacidad de adherirse a las hifas y conidios
de los hongos microscpicos (Garca, Beltran,
Guzmn, Len, Arredondo y Fonseca. 2001).
Solucin de azul de lactofenol
Cultivo a evaluar
Asas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio
Aceite de inmersin
Mechero
Agua salina fisiolgica
3. Tincin Naranja de Acridina

a. Principio
El fluorocromo naranja de acridina se une al
cido nucledo ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones
de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de
la concentracin. A pH neutro las bacterias,
hongos y material celular se tien de naranja rojizo, pero a pH cido las bacterias y los
hongos mantienen su color naranja rojizo, pero
el material de fondo se tie de amarillo verdoso. Se utiliza para la deteccin de hongos
y bacterias en muestras clnicas principalmente (Flores, Albarado, Thomas, Lobo. 2008).
Solucin de naranja de acridina 0.7% (naranja de acridina doble sal, buffer de acetatos pH:4,0)
I ncinerador, mechero Bunsen o de alcohol
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra biolgica
Microscopio de epifluorescencia
Goteros
Cronmetro
c. Procedimiento
Colocar una gota de agua salina fisiolgica
sobre el portaobjetos.
Con el asa picar el cultivo y expandir por
encima de la gota de agua salina fisiolgica,
hasta que no se seque.
Despus seca la muestra, tomar una gota
de azul de lactofenol y se aade sobre la
muestra.
c. Procedimiento
Se cubre la muestra con el cubreobjetos
Se cubrir la lmina
Observar en el microscopio.
naranja de acridina
Procurar que no queden burbujas de aire
Lavar con agua de
en la preparacin, ya que sino lo que se ob Dejar secar al aire
servara mayoritariamente sern las burbuobservacin
jas.
con la solucin de
por dos minutos.
chorro abundante.
para su posterior
Pg. 4
d. Resultados
Las lminas deben enfocarse utilizando un microscopio de epifluorescencia, utilizando filtro
azul o amarillo estndar.
aproximadamente por dos minutos.

Observar al microscopio en los objetivos de
10X y 40X.
d. Resultados
La coloracin observada es negro con diferente
intensidad segn el grosor de la quitina.
Figura 4. Tincin de ascosporas.
4. Tincin de Negro de Clorazol

a. Principio
El colorante negro de clorazol permite visualizar
rpida y con claridad las estructuras fngicas,
unindose a la quitina, sin embargo, debe tenerse especial cuidado ya que el reactivo se degrada con la luz. Es ideal para coloraciones en
fresco y es necesario apoyarse en el hidrxido
de potasio (KOH) para la eliminacin de la queratina presente en la muestra (Arreaza, 2008).
Negro de clorazol
Dimetil sulfoxido (DMSO)
KOH 40%
Portaobjetos
Cubreobjetos
Bistur
Muestra biolgica
Microscopio
Goteros
Agua desmineralzada
c. Procedimiento
Tomar una porcin pequea de la muestra
(si es necesario triturar con un bistur las escamas) y colocar en un portaobjetos.
Agregar una gota de la solucin de negro de
clorazol.
Colocar el material con una lmina cubre
objetos y dejar incorporarse en la muestra
Figura 5. Examen directo con negro de clorazol se

observa parnquima y estructuras fngicas de menos
tamao e intensidad (40X).
5. KOH con Tinta Azul Parker

a. Principio
La bsqueda de estructuras fngicas utilizando
hidrxido de potasio como
aclarante de la queratina es un mtodo sencillo,
pero este mtodo clsico ha sido mejorado con
el uso de tinta azul Parker lo cual colorea el fondo de la tincin con la estructura fngica y las
contrasta para facilitar su visualizacin (Prez,
Weiss, Villanueva, s.f.).
KOH/Tinta Parker relacin 1.1
Portaobjetos
Cubreobjetos
Bistur
Muestra biolgica
Microscopio
Goteros
Cronmetro
c Procedimiento
Tomar una porcin pequea de la muestra
(si es necesario triturar con un bistur las escamas) y colocar en un portaobjetos.
Agregar una gota de KOH 20% preparado
con tinta azul Parker.
Pg. 5
d. Resultados
Figura 6. Examen directo de piel con KOH 20% y tinta

azul Parker, hifas segmentadas y ramificadas dicotmicamente
B. Tinciones diferenciales
Son aquellas donde se utilizan dos o ms colorantes y en contaste permite la diferenciacin
del microorganismo o la visualizacin de la estructura deseada.
1. Tincin de Gram
a. Principio
De gran importancia en Microbiologa porque
permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias (gram positivo y gram negativo), segn
se comporten ante esta tincin. El fundamento radica en la diferente estructura de la pared
celular de ambos grupos: las bacterias gram
positivo tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias
gram negativo tienen una capa de peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica
externa. Tras la tincin con el primer colorante
(Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol
que arrastrar al colorante slo en las bacterias gram negativo, mientras que en las bacterias gram positivo el colorante queda retenido
y permanecern azules. Las gram negativo se
teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse, de
color rosado al microscopio (Lpez-Jcome y
otros, 2014).
Asa de Siembra en argolla
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas
Palillos
Microscopio
Aceite de inmersin
Goteros
Agua destilada
Solucin de cristal Violeta
Lugol
Safranina
Etanol 95%
Cronmetro
c. Procedimiento
Cubrir el frote con Cristal Violeta durante 3
min.
Retirar el colorante mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el
portaobjetos, para no desprender la muestra.
Cubrir ahora con Lugol durante 1 min., realizar otro lavado suave. Todas las clulas se
teirn de violeta.
Agregar unas gotas de etanol 95%, deslizndolo por el portaobjetos, hasta que las
gotas que salen no tengan casi color. Las clulas gram- pierden el colorante violeta y quedarn incoloras. Las gram + seguiran violeta.
Aadir una el colorante safranina (colorante
de contraste) por 2 min.
Lavar el colorante con agua. Este colorante slo entrar en las bacterias gram , que
quedarn rojas. Las gram + seguirn violetas.
Secar las preparaciones sobre papel de filtro.
Observarlas al microscopio utilizando el objetivo de inmersin
d. Resultados
Figura 7. Se observa cocos gram negativo de color rojo por la

safranina y bacilos gram positivo de color morado por el cristal
violeta.
Pg. 6
2. Tincin de Wright
a. Principio
bulos sanguneos. El colorante deber cubrir

completamente el portaobjetos, pero no debe
derramarse por los bordes. Deber agregarse una cantidad adicional si ste se comienza
a evaporar.
Agregar directamente al colorante un volumen igual de amortiguador de Wright, para
evitar la coloracin dbil. Esperar la formacin de brillo metlico. Puede usarse de igual
manera agua desmineralizada. Dejar actuar
de 10-15 minutos.
Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensin presente un aspecto rosado al examinarlo a simple vista.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una
gasa o algodn humedecido en alcohol para
eliminar cualquier resto de colorante.
Secar al aire y observar con el microscopio
con el objetivo de inmersin
Esta tincin tiene diversos usos en microbiologa; en la parasitologa, se le emplea en la

bsqueda de hematozoarios como Plasmodium
spp. El reactivo de Wright est compuesto por
eosina y azul de metileno, cuando ste se oxida
se conoce como azur B a una concentracin de
0.8 g/L empleando como solvente alcohol metlico. La eosina es un colorante cido que tiene
afinidad por componentes alcalinos. La eosina Y
es la ms utilizada en procedimientos rutinarios.
Es un compuesto cido cuya propiedad est basada en su polaridad negativa, lo que le permite
enlazarse con constituyentes celulares de carga
positiva; por esta razn, colorea componentes
citoplasmticos y se les conoce como acidfilos.
La tonalidad resultante de la tincin con eosina
es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo d. Resultados
Los eritrocitos se observarn de color naintenso en el caso de los eritrocitos. El tpico coranja o rosado.
lor de los ncleos celulares, mayoritariamente
El citoplasma de los monocitos presentarn
morado, se basa en la interaccin molecular enuna tonalidad azul griscea con grnulo rojitre eosina y un complejo azul de metileno-DNA.
zos bastante finos y sus vacuolas caractersLa intensidad de la coloracin depende del conticas. El citoplasma de los linfocitos presentatenido de azur B y de la relacin con la eosina
r varias tonalidades azules.
amarilla (Ortega, Garibaldi. 2009)
Los ncleos de los linfocitos y neutrfilos
aparecern de color prpura oscuro. Los nb. Materiales y Reactivos
cleos de los monocitos de color prpura algo
Alcohol 96%
ms claros (lila).
Alcohol Metlico
Los grnulos de los eosinfilos son de color
Portaobjetos
rojo-anaranjado intenso. Los grnulos de los
Wright-Giemsa Stain, Modified
basfilos prpura azulado muy oscuro. Los
Cubetas para tincin
grnulos de los neutrfilos se aprecian de co Pizetas con agua desmineralizada
lor lila, bastante finos.
Toalla de papel
Las plaquetas toman coloracin violeta o
Guantes
prpura.
Microscopio
Libreta
Contador celular
Cronmetro
c. Procedimiento
Colocar el frote secado al aire sobre una
rejilla o cubeta de tincin con el frote hacia
arriba
Cubrir completamente el portaobjetos con el
colorante de Wright gota a gota.
Dejarlo que permanezca en el frote aproximadamente de 5-8 minutos, para fijar los gl-
Figura 8. Frote perifrico con parsitos intracelulares, teidos

de color violeta
Pg. 7
3. Tincin de Giemsa
eliminar cualquier resto de colorante.

Secar al aire y observar con el microscopio
con el objetivo de inmersin.
a. Principio
d. Resultados
Los ncleos celulares se tornan violeta inEs la segunda coloracin en uso, luego de la
tenso.
tincin de Wright, y en importancia de las mez Es frecuente encontrar en el mtodo de
clas de Romanowsky. Es quizs la mejor moGiemsa que la granulacin eosinfila no
dificacin de este tipo de coloraciones para
presenta la tonalidad rojo-anaranjada cadescubrir parsitos en la sangre, como en el
racterstica sino que presenta una tonalidad
caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanopardo rojizo. Esta dificultad puede prevenirsomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de
se aadiendo una gota de fucsina fenicada
Giemsa tambin da excelentes resultados para
por cada 10ml de alcohol metlico utilizado.
la tincin rutinaria de frotes sanguneos. Cuan Las granulaciones neutrfilas (lila) y los
do se va a teir con este colorante, debe fijarse
hemates (rojo plido) se tien mal; sin
primero la muestra con metanol absoluto por un
embargo, esta coloracin permite diferentiempo mnimo de tres minutos (cuando la preciar algunas formas de metamielocitos que
paracin no incluye metanol). El colorante en
pueden ser confundidos con los monocitos,
solucin nunca se utiliza de manera directa, por
pues el protoplasma de los monocitos quelo que se debe diluir con la solucin amortiguada de color azulado y el de los metamielocidora en una proporcin de 1:10 1:20 y el tiemtos de color rosa.
po de coloracin podr ser de 10 20 minutos,
El citoplasma de los linfocitos presenta
respectivamente (Ortega, Garibaldi. 2009).
una tonalidad azul definida y sus ncleos
violetas de intensidad variable.
Los grnulos basfilos y las plaquetas se
Colorante de Giemsa (constituido por una
tien de color azul, no obstante stas ltimezcla de azul de metileno, eosina y varios
mas presentan corpsculos violetas interazures en dilucin acuosa).
nos.
Pinzas
Portaobjetos
Muestra biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Goteros
Cronmetro
c. Procedimiento
Sumergir el frote verticalmente en una solucin de Giemsa preparada temporalmente a
partir de 1 volumen de la solucin colorante
ms 9 volmenes de solucin tampn (pBs,
pH 6.8) o bien en agua desmineralizada.
Esperar durante 10-20 minutos.
Lavar el frote con abundante agua, directamente del chorro.
Limpiar el dorso del portaobjetos con una
gasa o algodn humedecido en alcohol para
Figura 9. Frote perifrico con clulas sanguneas de

color violeta y eritrocitos de color rosado a rojo.
4. Tincin de Ziehl-Neelsen
a. Principio
La tincin de Ziehl-Neelsen (Z-N) fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de
manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clnicas de
pacientes. Esta tcnica es capaz de diferenciar
los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
Pg. 8
La tcnica de Z-N fuerza la penetracin de la

fucsina bsica en la pared celular mediante la
accin combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de cidos miclicos: el calor derrite el componente ceroso y el
fenol acta a modo de disolvente, permitiendo el
paso del colorante bsico que se une a los cidos miclicos con carga negativa. Cuando cesa
la aplicacin de calor y/o se elimina el exceso
de fenol mediante un lavado con agua, la pared
recupera su consistencia cerosa, pero las molculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor. Con la coloracin de Z-N se observan como
bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo
fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul (Lpez y otros, 2014).
Azul de metileno
Alcohol cido
Fucsina
Mechero
Portaobjetos
Cubetas para tincin
Pizetas con agua destilada
Toalla de papel
Guantes
Microscopio
Libreta
Cronmetro
c. Procedimiento
1) Coloracin
Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente
5 cm entre una y otra, una sobre un soporte
dentro del lavabo/pileta de coloracin.
Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para
las tinciones a realizar en la jornada. Si el nmero de baciloscopia a colorear es pequeo,
se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a travs
de un pequeo embudo con papel de filtro.
Colocar sobre el soporte las lminas fijadas
conservando el orden numrico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separacin de al menos 1cm entre ellas.
Cubrir totalmente la superficie del extendi-
do con fucsina bsica fenicada recin filtrada.

Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos.
Con la llama de un hisopo embebido en
alcohol calentar suavemente por debajo de
los extendidos, con movimientos de vaivn,
hasta que observe que se desprenden los
primeros vapores blancos. No calentar con
mechero.
En caso de derrame del colorante, reponer
la fucsina, no dejar secar el preparado.
En el trmino de aproximadamente cinco
minutos calentar tres veces hasta emisin de
vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se
fije a sus lpidos. No hervir la fucsina porque
la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal.
Con una pinza, levantar cuidadosamente la
lmina portaobjetos desde el extremo ms
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presin, con un frasco o un
grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la
superficie eliminando totalmente la solucin
de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posterior.
Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y as evitar diluir los reactivos
que se utilizarn a continuacin.
2) Decoloracin
Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos.
Enjuagar con abundante agua a baja presin.
Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo
sumo conservan un leve tinte rosado). Si se
observan cmulos rojos o coloracin rosada
intensa, volver a cubrir con solucin decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos
y enjuagar nuevamente.
Eliminar el exceso de agua inclinando el
portaobjetos
3) Coloracin de fondo
Cubrir todo el extendido con solucin de
azul de metileno.
Dejar actuar durante un minuto.
Pg. 09
croscopio, un manchado diapositivas Kinyoun

mostrar bacilos como organismos rojos y no
Enjuagar las lminas en ambas caras con cido-rpido como el azul. Se basa en el comagua a baja presin y limpiar parte inferior portamiento cido-resistente de la cubierta de
algunos parsitos como Isospora y Cryptospocon un algodn si ha quedado coloreada.
Observar si las lminas conservan la nu- ridium, los cuales se tien de rojo y destacan
meracin clara y visible. Si no es as volver a sobre un fondo verde o azul, dependiendo del
colorante de contraste usado (Ortigoza Gutienumerarlas.
Dejar secar las lminas a temperatura am- rrez, y Cruz Aguilar, s.f.).
biente, apoyndolas en posicin vertical en
un soporte sobre un papel absorbente. No b. Materiales y Reactivos
Fucsina fenicada
apoyar papel absorbente sobre el extendido..
Verde de malaquita o Azul de metileno
Alcohol metlico
d. Resultados
Alcohol etlico
Alcohol cido
Aceite de inmersin
Portaobjetos
Puente de tincin
Microscopio
c Procedimiento
Realizar un frote de la muestra.
Dejar secar perfectamente.
Cubrir las gotas con unas gotas de alcohol
metlico y dejar que seque.
Cubrir la preparacin con fucsina fenicada
durante 5 mins.
Lavar con alcohol cido durante 3 min.
Figura 10. Se observa las bacterias alcohol cido re Enjuagar con agua corriente
sistentes (BAAR) de color rojo fucsia y el resto de mi Coloracin de contraste, agregar verde de
croorganismos y dems componentes del campo de
malaquita o azul de metileno dejar actuar ducolor azul.
rante 1 min.
Lavar con agua corriente y dejar secar.
5. Tincin de Kinyoun
Observar con objetivo de inmersin.
a. Principio
d. Resultados
El Kinyoun mancha es un mtodo para teir microorganismos resistentes a los cidos, especficamente Mycobacterium y Nocardia. El
procedimiento para la coloracin de Kinyoun
es similar a la tincin de Ziehl-Neelsen, pero
no implica el calentamiento de las diapositivas
siendo stained.1 El mtodo de tincin de Kinyoun utiliza carbolfucsina como una mancha
principal, seguido de decoloracin con una solucin de cido-alcohol y azul de metileno como
Figura 11. Se observan los BAAR de color rojo, las
contrateir. Kinyoun carbolfuschsin tiene una
dems estructuras se tien del color del colorante de
mayor concentracin de fenol y fucsina bsica
contraste en este caso verde de malaquita.
y no requiere de calefaccin con el fin de manchar properly.1 Cuando se observa bajo un miRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 10
6. Tincin de Ziehl-Neelsen Modificado
Cubrir la lmina con colorante azul de metileno por 30 segundos.

Lavar el exceso de colorante con abundante
agua del chorro.
Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio.
a. Principio
Esta tincin es til para visualizar quistes de
protozoos intestinales que tienen la propiedad
de ser cido-alcohol resistente (AAR). Cryptos- d. Resultados
poridium, Cyclospora e Isospora suelen producir diarrea persistente, sobre todo en pacientes
inmunocomprometidos o con infeccin por el
VIH.
La tcnica de Ziehl-Neelsen modificado fuerza
la penetracin de la fucsina fenicada en la pared celular mediante la accin combinada del
fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la
capa de cidos miclicos. Con el lavado con
agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero el colorante fucsina queda dentro del
parsito y este se destaca en contraste al fondo
azul (EHAS, 2012).
Carbol fucsina (fucsina fenicada)
Azul de metileno
Alcohol-cido
Mechero
Portaobjetos
Cubetas para tincin
Pizetas con agua destilada
Toalla de papel
Guantes
Microscopio
Libreta
Cronmetro
c. Procedimiento
En una lmina portaobjetos hacer un extendido delgado de la muestra de heces, dejar
secar a temperatura ambiente y fijar la muestra con calor pasando dos o tres veces por
mechero.
Cubrir la lmina con colorante carbol fucsina
y aplicar calor hasta la emisin de vapores
y mantener por 5 minutos, evitando la ebullicin del colorante.
Lavar el exceso con agua del chorro.
Decolorar con alcohol-cido durante 20-30
segundos.
Lavar con abundante agua del chorro.
Figura 12. Se observa Quistes de Cryptosporidium

(AAR) de color rojo fucsia con contraste azul en el fondo.
7. Tincin selectiva de esporas WirtzConklin

a. Principio
La produccin de endosporas bacterianas es
una forma de resistencia de algunos gneros de
bacterias gram positivas, debido a la ubicacin
intracelular las esporas no se tien convencionalmente. Por esta razn se utiliza la tincin de
Wirtz-Conklin , en donde los microorganismos
son teidos en caliente con el colorante verde
de malaquita y que el calor aumenta la permeabilidad de la membrana bacteriana y de la espora, posterior a esto se realiza una decoloracin
a travs del lavado con abundante agua y los
extremos de la bacteria son teidos posteriormente con el colorante de contraste safranina
(Vzquez, Martn, Siloniz, Serrano, 2010).
Verde de malaquita
Safranina
Etanol 95%
Pinzas
Portaobjetos
Cultivos bacterianos de 24 horas o muestra
biolgica
Microscopio
Pg. 11
Aceite de inmersin
Goteros
Cronmetro
tincin es un mtodo qumico muy utilizado en

histologa y permite la deteccin de hongos en
muestras de tejidos (Pontn, Llovo, 2007).
Pinzas
Portaobjetos
c. Procedimiento
Fijar la muestra en una lmina portaobjetos.
biolgica
Cubrir la lmina con colorante verde de
Microscopio
malaquita y aplicar calor hasta la emisin de
Aceite de inmersin
vapores y mantener por 5 minutos.
Lavar el exceso con agua del chorro.
Goteros
Cubrir con la lmina con colorante safrani Agua desmineralizada
na por 1 minuto.
Cronmetro
Lavar el exceso de colorante con abundan cido peridico
te agua del chorro.
Reactivo de Schiff
Dejar secar a temperatura ambiente y observar al microscopio.
c. Procedimiento
Cubrir el material fijado en la lmina con
d. Resultados
acido peryodico al 0,5% durante 5 minutos.
Lavar con agua destilada.
Agregar el reactivo de Schiff. 20 minutos.
Lavar con agua del chorro.
Dejar secar al aire para su posterior observacin
d. Resultados
Figura 13. Tincin de esporas en Bacillus subtilis, la

flecha indica la espora teida en verde. Microscopia
de campo claro 100X.
8. Tincin de cido Perydico de Schiff (PAS)

a. Principio
Se realiza un tratamiento al material con cido
periydico 0,5%, el cual oxida los 1,2-glicoles
formndose grupos aldehdos en los glucanos y
mananos de las paredes celulares de hongos,
con el reactivo de Schiff (preparacin de fucsina
bsica y metabisulfito de sodio) los aldehdos
reaccionan dando un color rojo luminoso. Esta
Figura 14. Se observa dentro del tejido, la presencia

de levaduras de Candida spp.

C. Tinciones Especiales
Se basan en el hecho que distintas estructuras
celulares tienen distinta composicin qumica,
de modo que se tien selectivamente con ciertos colorantes.
Pg. 12
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta
1. Tinta China
a. Principio
Fue desarrollada originalmente para micros- c. Procedimiento
copia de luz con el fin de rodear y delinear las
En una lmina portaobjetos colocar una
bacterias no teidas u otros materiales biolgigota de la tinta china.
cos. Utilizamos diferentes mtodos para evaluar
Esterilizar el asa y tomar una muestra de
estructuras individuales, tan pequeas como las
cultivo del hongo o en el caso de la muestra
vesculas sinpticas e incluso de gran tamao,
de LCR colocar con una pipeta una gota socomo los microorganismos unicelulares. Este
bre la tinta.
mtodo es muy til, aunque est limitado por la
Con el cubreobjetos mezclar la tinta con la
presencia de un fondo oscuro que no permitir
muestra
la correcta identificacin de forma ntida y deta Colocar el cubreobjetos sobre la preparallada de los componentes de dichas estructuras.
cin
Observar la placa en el microscopio a 40x
En microbiologa, la tincin de Tinta China proy 10x
porciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorga- d. Resultados
nismo causante de meningitis en pacientes con
inmunosupresin, siendo la tcnica ms utilizada para poner de manifiesto su cpsula. Este
hongo presenta dos formas durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la
primera se presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemacin y puede
ser visualizada por medio de la tinta china. El
principio es simple, ya que slo se requiere depositar una gota de la muestra clnica sobre un
portaobjetos, posteriormente se coloca el coloFigura 15. Se observa levaduras capsuladas de C.
rante y se observa al microscopio sin necesidad
neoformans 40X.
de fijacin, algunas estructuras difundirn el colorante y otras no, lo que permitir un contraste
Tincin de Auramina-Rodamina
de las estructuras observadas. Se han utilizado 2.
diferentes colorantes: uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tie el fondo de la a. Principio
muestra de un color oscuro y la cpsula del C. Los cidos miclicos de las paredes celulares
neoformans permanece sin teir. La principal de las micobacterias poseen afinidad para los
dificultad con la tincin negativa es que los mi- fluorocromos auramina y rodamina. Estos colocroorganismos tienden a contraerse durante el rantes se fijan a las bacterias, que aparecen de
periodo de secado; para evitarlo, se ha optado color amarillo o naranja brillante contra un fondo
por usar la tincin negativa hmeda, en la cual verdoso. El permanganato de potasio, empleado
los organismos se suspenden en una pelcula como contraste, evita la fluorescencia inespecde tinta china o mancha oscura y el contorno de fica. Todos los microorganismos cido-alcohol
la cpsula puede ser observado sin el peligro de resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos colorantes. Un aspecto
contraccin (Lpez-Jcome y otros, 2014).
importante de la coloracin rodamina-auramiria
es que luego los frote pueden ser reteidos con
la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun direc Asa
tamente sobre la tincin con el fluorocromo, si
Tinta China
se elimina antes el aceite de inmersin.
Mechero
Pg. 13
De esta forma, los resultados positivos pueden

ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la diferenciacin
morfolgica (Garca, Beltran, Guzmn, Len,
Arredondo y Fonseca. 2001).
Microscopio de flourescencia
Fluorocromos: auromina, rodamina
Solucin decolorante
Permanganato de potasio (contraste)
Glicerol
Fenol
Portaobjetos
Cubreobjetos
Mechero
c. Procedimiento
Fijar el frote al calor, en un mechero
Teir el frote 15 minutos con los fluorocromos auramina-rodamina
Aclarar con agua.
Coloracin de contraste con permanganato
de potasio durante 3 minutos
Aclarar con agua destilada
Lavar con agua y dejar secar al ambiente
d. Resultados
Figura 16. Las bacterias alcohol cido resistentes se

observan en el microscopio de flourescencia (luz ultravioleta) como bacterias de color amarillo anaranjado sobre un fondo oscuro.
3. Tincin Blanco de Calcofluor

a. Principio
Es un mtodo de tincin fluorescente para la
deteccin de hongos incluyendo Pneumocystis
carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron

que este blanqueador de algodn fluorescente,
poda teir hongos al exponerlo a la luz UV. Hageage y Harrington lo utilizaron para la tincin de
tejidos fijados en parafina, logrando identificar
hifas y esporas. La tincin se basa en la capacidad del blanco de calcoflor para unirse a los
1-3, 1-4 polisacridos (celulosa y quitina) de
la pared fngica, y en que el compuesto exhibe
fluorescencia cuando se expone a luz ultravioleta, permitiendo delinear claramente elementos fngicos. Al igual que en un examen directo
se observarn hifas anchas, no septadas, con
ramificaciones en ngulo recto. Se puede utilizar en tejidos frescos y/o congelados, fijados
en parafina y en cultivos puros. Este mtodo
no sirve para teir bacterias. Otros elementos
como por ejemplo fibras vegetales (algodn)
que pudieran teirse, deben diferenciarse cuidadosamente por la morfologa. Para realizar
esta tincin, el tejido debe ser tratado con KOH
al 10% e igual proporcin de solucin de calcoflor al 0,05%. Para examinar el extendido se
requiere un microscopio de fluorescencia. Las
estructuras fngicas se observarn verde claro
o azul, dependiendo del filtro UV que se utilice
(Ortigoza Gutierrez y Cruz Aguilar, s.f.).
Fenol
cido lctico y azul de algodn
Fucsina acida
Rojo allura
Azul brillante
Colorante vegetal
cido actico
Glicerina
c. Procedimiento
El tejido a evaluar debe ser tratado con KOH
al 10% e igual proporcin de solucin de calcoflor al 0,05%.
Para examinar el extendido se requiere un
microscopio de fluorescencia.
Colocar en un portaobjetos la muestra
Agregar una gota de KOH dimetil sulfxido y
una gota de calcofluor
Mezclar, colocar el cubreobjetos
Despus de hacer ocurrido la clarificacin,
observar con el microscopio de flourescencia
(verde brillante o blanco azulado).
Pg. 14
d. Resultados
Las fibras elsticas y colgeno se observan con
fluorescencia amarillo verdosa, estas se pueden confundir con hongos y levaduras, se diferencian en la fluorescencia.
Figura 17. Se observarn hifas anchas, no septadas, con

ramificaciones en ngulo recto con fluorescencia blanca.
4. Tincin de Gomori-Grocott
a. Principio
Es una coloracin especial para hongos, la coloracin est basada en la presencia de cido
crmico, los grupos hidroxilo de los polisacridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehdos y estos a su vez reducen el
complejo nitrato-plata metenamina produciendo la coloracin caf o negra. Utiliza un buffer
(bisulfito de sodio) y tambin un colorante de
contraste (cloruro de oro) y uno de fondo (verde
brillante) (Pontn, Llovo, 2007).
cido crmico
Bisulfito de sodio
Metenamina.-nitrato de plata
Cloruro de oro
Verde brillante
Pinzas
Portaobjetos
biolgica
Microscopio
Aceite de inmersin
Goteros
Cronmetro
c. Procedimiento
Cubrir la muestra fijada en el portaobjetos
con la solucin de cido crmico al 10% durante 10 minutos.
Lavar con abundante agua desmineralizada.
Cubrir con la solucin de metabisulfato sdico 1% durante 1 minuto.
Introducir la lmina en un recipiente con la
solucin de metenamina-nitrato de plata, dicha solucin debi ser previamente calentada
en bao de mara a 800C por 6 minutos, Una
vez introducida la lmina se debe mantener
las condiciones durante 5 minutos ms hasta
observar el cambio de color en solucin de
marrn a negro.
Cubrir el portaobjetos con la solucin de cloruro de oro 1% de 2 a 5 segundos y lavar con
agua desmineralizada.
Cubrir el portaobjetos con la solucin verde
brillante 0.2% en cido actico glacial durante
1 minuto.
Lavar con abundante agua desmineralizada
y dejar secar a temperatura ambiente.
d. Resultados
Figura 18. Se observa levaduras de C. neoformans

100X
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Mxico, DF. Vol. 3 (1). pp 10-18.
Pg. 16
MANUAL DE MICROBIOLOGIA
Alejandra Castillo
Veronica Itzep
1 Introduccin
Las enfermedades infecciosas constituyen un
problema de salud pblica cada vez en aumento generando costos altos para su tratamiento,
esto se ha debido al uso indiscriminado de antibiticos generando la desimanacin de bacterias multiresistente en el mbito hospitalario
o comunitario, dificultando el adecuado tratamiento.
Los pacientes hospitalizados como no hospitalizados presentan una variedad de sintomatologas, poniendo en evidencia el tipo de enfermedad pero en otros casos dificulta al mdico
poder diagnosticar, por lo recurren al laboratorio
de microbiologa para poder obtener diagnsticos certeros y poder tratar al paciente efectivamente.
El objetivo del presente manual es poder utilizarlo como una gua de procesos facilitando el
diagnostico de algunas enfermedades infecciosas frecuentes, describiendo los procedimientos
de aislamiento como las tcnicas presuntivas y
confirmatorias de identificacin.
tes.
- El personal de laboratorio debe utilizar equipo de proteccin apropiados (lentes, mascarilla)
para evitar en lo posible aerosoles o salpicaduras de las muestras. Las muestra que se deben
centrifugar debe ser tapadas previamente, al
destapar algn tubo usar gasas para evitar los
aerosoles.
- Desinfectar las mesas de trabajo antes y despus del manejo de material infeccioso, con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio.
- Recipientes adecuados para desechos de materiales como placas, tubos, muestras clnicas.
El personal de laboratorio debe utilizar equipo

de proteccin como, bata, lentes, mascarillas y
guantes.
Al momento de toma de muestras se debe tener
en cuenta las siguientes instrucciones:
- Verificar que el rea de trabajo est limpia
- Contar con todo los materiales adecuados para
la toma de muestras como, medios de transporte, hisopos, lancetas, portaobjetos, jeringas,
solucin salina, alcohol al 70%, torniquetes, gasas, frascos estriles, bajalengua, etc.
2 Generalidades
- Identificar al paciente, verificar si esta con tra2.1 Normas Mnimas de Seguridad en tamiento de antibitico, revisar el rea de toma
el Laboratorio de Microbiologa
de muestra o qu tipo de prueba solicitan el mdico. Apuntando las anotaciones.
La bioseguridad se refiere a los procesos de - Previo a la toma de muestra verificar y preparar
manejo de los agentes infecciosos para evitar el material adecuado para la toma de muestra.
o proteger al personal de laboratorio, al medio - Rotular los materiales a utilizar
ambiente y a paciente de un riego biolgico. El - Lavarse las manos antes del proceso y usar
manejo de microorganismos dentro del laborato- guantes limpios
rio debe realizarse con mucha precaucin para - Realizar la toma de muestra segn el procedievitar infecciones accidentales. Debe tenerse miento adecuado.
en cuenta las siguientes indicaciones para el
manejo de muestras microbiolgicas:
2.2 Organizacin de rea de Trabajo
- Acceso limitado al rea de trabajo,
- Lavar las manos, antes y despus del manejar El mobiliario debe ser fuerte y resistente. Los
material infeccioso con jabn germicida o con espacios entre mesas, cabinas y equipo han de
alcohol a 70% en caso de manejo de microor- ser de fcil acceso para la limpieza.
ganismos gram positivo.
- No comer, ni beber alimentos dentro del rea - Contar con una campana microbiolgica tipo
de trabajo. No fumar.
I o II.
- Utilizar descartador para objetos punzocortanRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 17
Membrana Citoplsmica: localizada por debajo

de la pared celular, que est formada por una
- Contar con asa calibrada de 0.001, asa en ar- bicapa de fosfolpido integral y protenas perigolla y asa en punta. Para Micologa asa en L, fricas empotradas. La membrana citoplsmica
pinzas.
cumple la funcin de barrera osmtica, tienen
- La superficie de las mesas de trabajo han de permeabilidad selectiva y permite el ingreso de
ser impermeables al agua y resistente al calor nutrientes y la salida de desechos por mecanismoderado, solventes orgnicos, cidos, lcalis mos de transporte activo y pasivo.
y otros productos qumicos.
Citoplasma: en el citoplasma bacteriano se
- La silla que se usen deben estar cubiertas por puede dividir en tres partes, regin citoplsmimaterial que no sea de tela y que se puede lim- ca de apariencia granular conteniendo RNA,
piar fcilmente.
regin nuclear o cromatinica que contiene DNA
- La iluminacin ser adecuada para todas las y la parte liquida que mantiene disueltos los
actividades. Evitar reflejos y brillos molestos.
elementos nutritivos. El ARN combinada con
- Contar con mechero de Alcohol o Bunsen con protenas forma una masa densa y compacta
gas propano, que la llama sea azul.
llamadas ribosomas.
- Contar con un microscopio binocular, aceite
de inmersin, laminillas, cubreobjetos, palillos. 2.3.1 Bacterias Gram positivo
- Contar con colorantes para Gram, Zn, KOH,
Giemsa.
La envoltura de la bacteria comprende de membrana citoplasmtica y una pared celular com2.3 Generalidades de la Estructura puesta por una gruesa capa de peptidoglicano
Bacteriana
de 20 a 80 nm, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtiLas diferentes estructuras bacterianas se pue- ca mediante molculas de cido lipoteicoico. La
den dividir en elementos obligatorios para poder capa de peptidoglicano confiere gran resistensobrevivir como pared celular, membrana celu- cia a estas bacterias y responsable de retener
lar, ribosomas y material gentico y elementos el cristal violeta durante la tincin de Gram. El
facultativos son los que estn presentes en al- cido teicoico de la pared que est en la supergunas celular y pueden seguir viviendo si pier- ficie y se une solo a la capa de peptidoglicano,
den alguna capacidad fisiolgica o patolgica este cido es el responsable del determinante
como pilis o fimbrias, cpsula y esporas.
antignico del organismo. (fig. 1)
Pared Celular: est ubicada por fuera de la
membrana plasmtica, es una estructura vital
para las bacterias que la poseen. Su funcin es
proteger a la bacteria de presin osmtica entre
el medio interno de la bacteria y del exterior, barrera contra sustancias toxicas qumicas y biolgicas y le proporciona rigidez a las bacterias.
Est constituida por aminocidos, aminoazcares, azcares y grasas. Todas las bacterias
contienen en la pared celular peptidoglicano,
que consiste en cadena lineal de dos azcares
alternados, N-acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico que se halla ligado un tetrapptido.
La pared celular permite clasificar las bacterias
en Gram positivo que son capaces de retener
el colorante cristal violeta luego de la decoloracin con alcohol cetona y Gram negativo que
pierden el colorante cristal violeta despus de
la decoloracin.
Pg. 18
2.3.2 Bacterias Gram negativo

La envoltura de la bacteria est compuesta
por una membrana citoplasmtica, una pared
celular delgada de 2 a 7 nm de peptidoglicano
y una membrana externa. Entre la membrana
citoplasmtica y la membrana externa se localiza el espacio periplsmico, relleno de una sustancia denominada periplsma la cual contiene
enzimas para la nutricin, enzimas inactivadora
de antibiticos y protenas de transporte.
La membrana externa contiene diversas protenas: porinas, lipopolisacridos (LPS) y fosfolpidos. El lipopolisacrido forma tres regiones: polisacrido O (antgeno O), polisacrida central
(KDO) y el lipido A (endotoxina). (fig. 2)
2.4 Tinciones Bsicas

2.4.1 Tincin de Gram
2.4.1.1 Principio
Es el mtodo de tincin diferencial ms utilizado en bacteriologa, siendo esencial para la clasificacin y diferenciacin de microorganismos,
la cual divide las bacterias en dos grupos, las
Gram positivas y las Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram est basada en la diferencia en la composicin qumica de la pared
celular bacteriana.
La tincin consta de 4 reactivos qumicos, el primero es el colorante primario cristal violeta, su
funcin dar color a todas las clulas. El segundo reactivo el lugol, actuando como mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared celular de la bacteria. El
tercer reactivo el decolorante Alcohol-acetona,
donde los organismos Gram positivo no se decoloran y los Gram negativo si lo hacen. Y el
cuarto reactivo el colorante de contraste Safranina, poniendo de manifiesto las bacterias
Gram negativas.
2.4.1.2 Procedimiento de la Tincin de
Gram
a. Preparacin del Frote
- Tomar la muestra con un hisopo de dacron o
alginato de calcio.
- Rodar el hisopo sobre un portaobjeto
- En caso de muestras liquidas tomar una porcin con un asa en argolla flameada y fra, colocarlo en un portaobjeto.
- Dejar secar al aire o acelerar el secado acercando el portaobjeto al mechero, pero con precaucin porque el calor puede degradar o deformarse las bacterias.
b. Preparacin de la tincin
- En una bandeja con dos varillas colocar el frote
en forma horizontal
- Colocar el Cristal Violeta suficiente cantidad,
dejar actuar durante 1 minuto
- Lavar suavemente con agua
- Colocar el mordiente Yodo, dejar actuar por 1
minuto
- Lavar suavemente con agua
- Decolorar con Alcohol-Acetona, agregando
gota o gota hasta que salga casi claro o ligeramente azul
- Lavar con agua
- Agregar safranina como contraste, dejar actuar
por 1 minuto
- Lavar con agua
- Dejar secar la muestra
- Examinar al microscopio con objetivo 100X de
inmersin de aceite. Gram Positivo se tien de
morado y Gram negativo de rosado. (fig. 3)
Pg. 19
- Cubrir el frote con el reactivo Carbn fucsina,

- Por debajo del frote calentar con suavidad hasta la aparicin de vapores durante 1 minuto
- Dejar el colorante durante 4-5 minutos, sin caEs una tcnica de tincin diferencial rpida y lentar
econmica, usada para identificar microorga- - Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el
nismos patgenos como M. tuberculosis o el exceso de agua
gnero Apicomplexa (coccidios intestinales) en- - Decolorar el frote con alcohol-cido
tre otros.
- Lavar el frote con agua de chorro y eliminar el
El fundamento de la tincin se basa en resistir exceso de agua
a la decoloracin con alcohol-acido despus de - Cubrir el frote con el reactivo azul de metileno
la tincin con colorantes bsicos. Las paredes durante 1 minuto
celulares de ciertas bacterias contienen cidos - Lavar el frote con agua de chorro, dejar secar
grasos (cidos miclicos) de cadena larga que al aire
les confiere la propiedad de resistir la decolo- - Observar el frote con microscopio con objetivo
racin.
100X en busca de BAAR
La tcnica consiste en la penetracin de carbn
fucsina en la pared celular mediante el calor
como mordiente, luego de cesar la aplicacin
de calor la pared celular cerosa recupera su
consistencia quedando atrapado el colorante.
Las bacterias que resisten la decoloracin son
de color rojo observndolo como bastoncitos
delgados, ligeramente curvos. (fig. 4)
2.4.2 Tincin Ziehl Neelsen
2.4.2.1 Principio
2.4.2.2 Procedimiento de Tincin de

Ziehl Neelsen
a. Preparacin del frote
- Con un palillo o un asa flameada y fra tomar
muestra y colocarla en un portaobjeto limpio
- Dejar secar a ambiente
- Fijar al calor la muestra, con cuidado
b Preparacin de coloracin
- En una bandeja con varillas colocar el frote en
posicin horizontal
Pg. 20
2.4.3 Tincin de Kinyoun

2.4.3.1 Principio
La tincin es similar a la tincin de Ziehl Neelsen, siendo una coloracin en frio, utilizando
un reactivo especial que adems de fucsina
agrega una concentracin alta de fenol. El fenol disuelve los lpidos de la pared celular permitiendo que el colorante primario entre entr,
evitando el calentamiento. (fig. 5 )
2.4.3.2 Procedimiento de Tincin Kinyoun
- En una bandeja con dos varillas, colocar la
laminilla en posicin horizontal
- Cubrir la laminilla con carbn fuscina-fenificada durante 5 minutos
- Lavar con agua de chorro
- Decolorar con alcohol-acido
- Cubrir con el colorante de contraste por 1 minuto
- Lavar con agua de chorro, secar al aire
2.4.4 Tincin Kinyoun Modificado

2.4.4.1 Principio
2.4.4.2 Procedimiento de Tincin Kinyoun Modificado

- Flamear el frote para fijarlo
- Colocar el frote en posicin horizontal en una
bandeja con varillas
- Cubrir el frote con fucsina-fenicada durante 5
minutos
- Decolorar con un cido dbil cido sulfrico,
durante aproximadamente 3 minutos
- Cubrir el frote con el colorante de contraste
Azul de Metileno durante 3 minutos
- Lavar con agua de chorro, dejar secar
2.4.5 Observacin en Fresco
2.4.5.1 Principio
Son todas aquellas formas o mtodos de observacin, mediante los cuales los objetos a investigarse no sufren cambios o alteraciones en
cuando a su forma, estructura o composicin
qumica. Es til para observar especies que se
daaran al teirla o fijarlas, como espirilos, as
como observar movilidad, fenmeno de multiplicacin o esporulacin. (fig. 6)
3 Toma de Muestra y Procedimientos
Parecida a la coloracin de Kinyoun o en frio,

haciendo la fijacin con alcohol metlico para 3.1 Orocultivo
preservar las estructuras celulares y utilizando 3.1.1 Propsito e importancia
cido sulfrico al 2% en agua destilada remplaEsta prueba se realiza para detectar infecciones
zando al alcohol-acido.
en la garganta causada por Estreptococos del
grupo A causando amigdalitis o faringitis.
Pg. 21
El rea farngea puede estar colonizada por

varias bacterias como Staphylococcus, Streptococcus, micococos, Moraxella catarrhalis,
Corinebacterias, Haemophilus spp, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Veillonela,
Peptostreptococcus, Actinomyces, levadura,
etc., pero el microorganismo ms frecuente que
causa faringitis es el Streptococcus pyogenes
Carnero al 5% en un extremo de la caja realizando el inoculo.

g. Enviarlo inmediatamente al laboratorio
3.1.3 Aislamiento Primario
a. Proceder a realizar el estriado en Agar Sangre Carnero al 5%, realizando dos cortadas de
aproximadamente 1 cm para aumentar la identificacin de la beta hemolisis. Entre cada estriada y cortada no flamear el asa. (fig. 8)
3.1.2 Recoleccin de la muestra y

transporte
Previo a la toma de muestra el paciente no debe
estar tomando antibiticos, no haber realizado
gargarismo con algn antisptico y no es necesario que el paciente se presente en ayuno. En
algunos casos el procedimiento puede causar
nauseas o vmitos.
3.1.2.1 Procedimiento
a. Que el paciente este sentado, pedirle que
trague saliva dos veces
b. Indicarle al paciente que vea hacia arriba,
abra la boca y diga aahh
c. Con ayuda de un bajalengua presionar la
lengua hacia abajo y con una linterna observar
el rea afectada, en busca de reas inflamada,
con pus o ulceras blanquecinas.(fig. 7)
d. Con un hisopo estril de dacrn proceder a la
toma de muestra, con el mayor cuidado de no
tocar paredes de la boca ni la lengua.
e. Introducir el hisopo en el medio de transporte

Todd Hewitt, llevarlo a la brevedad posible al
laboratorio.
f. En caso de realizar la inoculacin directa realizar la inoculacin en medio de Agar Sangre de
b. Incubar por 18 a 24 hrs a 35-36 C introducirlo en una jarra con veladora con el objetivo de
crear un ambiente de C02
c.Buscar colonias de pequeas de 1 a 1.5 mm
de dimetro rodeada de un halo de hemolisis
completa sospechosas con beta-hemolisis sospechosas de S. pyogenes
3.1.4 Identificacin Streptococcus
pyogenes
Es el principal microorganismo patgeno humano que produce infeccin local o sistmica
y trastornos inmunitarios postestreptoccicos.
Puede causar Faringitis, Erisipe, Celulitis, Gangrena estreptoccica, Fiebre puerperal, Piodermia estreptoccica, Sndrome de Choque Toxico, fiebre reumtica y glomerulonefritis.
La prueba de catalasa es negativa, susceptible
al Taxo A (bacitracina 0.04 U) formando un halo
de inhibicin, resistente al Taxo SXT, la identificacin de pirrolidonilarilamidasa (PYR) y la deteccin del Antgeno A de Lancefield. (fig. 9)
3.1.4.1 Procedimiento
a. Despus de la incubacin de 16 a 24 horas
del asilamiento primario, proceder a buscar colonias sospechosas de beta hemolisis.
Pg. 22
b. Trasladar una o varias colonias a un agar sangre carnero al 5% en el centro y proceder a realizar
un estriado en forma de tapete
c. Con una pinza flameada y fra colocar un disco de Taxo A (bacitracina 0.04 U)en el centro
d. Incubar por 16 a 24 horas en ambiente de CO2
e. Examinar la caja para observacin de un halo de inhibicin alrededor del Taxo A. La presencia
del halo indica que se aislo S. pyogenes (fig. 10)
f. Proceder a realizar la prueba de susceptibilidad y pruebas serologas de aglutinacin para confirmacin del grupo
3.2 Cultivo de Garganta Especial

3.2.1 Propsito
La presencia de las bacterias especiales por cultivo se realiza mediante solicitud e investigacin
justificada.
Pg. 23
Corynebacterium diphtheriae: conocido como

bacilo Klebs-Lffler, causante de la difteria, es
investigada por sintomatologa que presenta el
paciente, siendo: formacin de pseudo-membranas (pellejos) de color gris en la garganta,
que sangran mucho al desprenderse, fiebre y el
paciente se encuentra severamente intoxicado,
afectando las amgdalas, garganta, nariz, miocardio, fibras nerviosas o piel. Bacterias Gram
Positiva, catalasa positiva, inmvil, no espurulados, bacilos rectos o ligeramente curvados
2-6 um de largo y 0.5 um de dimetro, a menudo con en forma de V lo que se conoce como
forma de letras chinas.
Neisseria Meningitidis: Causante de severa y
contagiosa meningitis, y se investiga principalmente el Lquido Cefalorraqudeo, la presencia
la bacteria se realiza en cultivo de garganta en
personal que han estado en contacto con el paciente, siendo mdicos, enfermeras, tcnicos
de laboratorio, siendo importante identificar y
erradicar la bacterias con tratamiento para evitar la desimanacin.
3.2.2.2 Toma de Muestra para Neisseria meningitidis y Bordetella pertussis
El cultivo de garganta/nasofarngeo para el aislamiento de N. meningitidis, debe obtenerse de

personal que han tenido contacto directo con algn paciente que se ha detectado la presencia
de la bacteria en LCR, se obtiene mayor porcentaje de aislamiento en toma de muestra nasofarngea que de garganta. Figura No. 12
a. Colocar al paciente con la cabeza inmovili Bordetella pertussis: Causante de la tos fe- zada
rina, tambin conocida con tos convulsa o co- b. Con el pulgar de la mano, levantar suavequeluche. Se caracteriza por inflamacin tra- mente la punta de la nariz
queobronquial y accesos tpicos de tos violenta c. Introducir un hisopo de alginato de calcio en
y espasmdica con sensacin a asfixia. Coco- unos de los orificios nasales
bacilo Gram Negativo pequeo mide alrededor d. Mover el hisopo hacia atrs y hacia arriba a
de 0,3-0,5 m de ancho y entre 1,0 y 1,5 m de lo largo del tabique nasal, hasta llegar a la parte
largo, aerobios, posee capsulas, presenta fila- posterior de la faringe.
mentos similares a pilis.
e. Retirar el hisopo con cuidado
f. Inocular el hisopo en medio de transporte o
3.2.2 Recoleccin de Muestra y Trans- directamente en el medio de cultivo.
porte
g. Con otro hisopo tomar muestra y realizar un
3.2.2.1 Toma de muestra para Coryne- frote gram
bacterium diphteriae
a. Con buena iluminacin examinar la garganta, bajar la lengua con ayuda de un bajalengua,
buscar areas necrticas o grisceas (pseudomembrana) Fig. 11
b. Con un hisopo alginato de calcio estril frotar
firmemente las lesiones, retirar el hisopo con
cuidado de no tocar las paredes ni la lengua
de la boca. Tomar por lo menos 3 muestras con
hisopo
c. Un hisopo realizar un frote gram
d. Inocular en los medios de cultivo.
Pg. 24
3.2.3 Aislamiento primario

3.2.3.1 Corynebacterium diphteriae
a. Inocular el hisopo en un medio inclinado de
Loeffer (suero animal ms caldo glucosado coagulado) el medio es de color crema plido.
b. El segundo hisopo inocular en agar Chocolate-Telurito de Potasio
c. Proceder a estriar los medios de cultivo
d. Incubar ambos medios aerobicamente por
36C por 18 a 24 horas
e. Un tercer hisopo inocular en agar Sangre
Carnero al 5% para investigar Streptococcus
pyogenes, incubar en ambiente CO2
f. Teir el frote Gram y buscar caractersticas de
la bacteria
das en Agar Chocolate-Telurito para realizar las

pruebas de Catalasa y Nitritos
Catalasa: Positivo
Nitritos: Positivo
Reporte:
Si la morfologa del crecimiento en medio Loeffler es tpica informar,
Se aisl un bacilo gram-positivo, de morfologa
compatible con Corynebacterium diphtheriae.
Si la morfologa microscpica de crecimiento en
medio Loeffler es tpica y hay colonias negras en
Agar Chocolate-Telurito reportar:
Se aisl Corynebacterium diphtheriae. Identificacin preliminar, pendiente de demostrar la
produccin de toxina en vitro o in vivo
3.2.3.2 Neisseria meningitidis

a. Inocular un hisopo en medio de de Thayer
Martin
b. Estriar el inoculo e incubar a 36C en ambiente CO2 por 18-24 horas
c. Teir el frote Gram
3.2.3.3 Bordetella pertussis
a. Inocular un hisopo en medio de agar Bordet-Gengou o Agar Regan-Lowe
b. Estriar el inoculo e incubar a 36 por 4-5 das
c. Teir el frote gram
3.2.4.2 Neisseria Meningitidis

a. Despus de la incubacin observar colonias
en Agar Chocolate pequeas, grises, brillantes y
3.2.4 Identificacin de principales Mi- ligeramente mucosas
croorganismos
b. Realizar un frote Gram con cuidado, observar
3.2.4.1 Corynebacterium diphtheriae
diplococos Gram-negativo en forma de granos
a. Despus de la incubacin del medio Loeffler de caf, agrupados en pareja
con dos a ocho horas, preparar dos frotes uno c. Realizar un subcultivo para obtener un cultivo
para gram y otro para Azul de metileno, con cui- puro en agar Chocolate sin inhibidores de colodado de remover lo menos posible
nias caractersticas y morfologa microscpicas
b. Tincin de Gram: bacilos gran-positivo pleo- de la bacteria para las pruebas de identificacin
mrficos y en forma de maza, agrupadas en for- como Oxidasa, utilizacin de azucares y pruema de letras chinas o en formas de V o Y.
bas serolgicas.
c. Tincin de Azul de Metileno: utilizar Azul de
Metileno de la coloracin de Ziehl Neelsen ob- Prueba de Oxidasa
servar el mismo patrn que el gram, solo que la a. Tomar una porcin de la colonia a estudio, con
coloracin es discontinua en forma de bandas un palillo de madera o un asa plstica, frotar soazules por los corpsculos metacromticos de bre un disco con reactivo de oxidasa.
polimetafosfato.
b. La reaccin positiva se da en 10 segundos,
d. En agar Chocolate-Telurito se observan colo- con una coloracin morado oscuro a negro indinias de color negro intenso.
cando prueba positiva.
e. Sulcultivar en Agar Sangre de Carnero al 5%
colonias caractersticas de C. diphtheriae creciRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 25
Utilizacin de Azucares Mtodo Agar Cistina

Tripticasa ACT
a. Se utiliza un juego de 4 tubos con agar ACT
con distintas azucares (glucosa, maltosa, lactosa y sacarosa)
b. Tomar una pequea cantidad con un asa
en punta del crecimiento de un cultivo de N.
meningitidis, de un cultivo puro de 24 horas en
agar Sangre y Chocolate
c. Inocular pinchando varias veces los 10 mm
superiores del medio. Y repetir el proceso con
los otros tubos usando un asa flameada y fra.
d. Cerrar los tubos e incubarlos a 35C por lo
menos 72 horas hasta 5 das antes de descartarlos como negativo
e. Si se genera una turbidez visible y un color
amarillo en la porcin superior del medio, es
indicativo de crecimiento y produccin de acido, intepretando como positiva la prueba.
N. meningitidis, oxida glucosa y la maltosa,
pero no la lactosa ni la sacarosa. (Tabla No. 1)
Tabla No. 1 Utilizacin de Azucares
Colonias de B. pertussis
Figura No. 14
3.3
Hemocultivo y Mielocultivo
3.3.1 Propsito
El hemocultivo sirve para detectar las bacterias que se estn reproduciendo en la sangre,
lo que provoca septicemia. El mielocultivo es
el cultivo de mdula sea y sirve para detectar
bacterias en esta muestra, especialmente Salmonella typhi.
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente
estril, por lo tanto, la presencia de microorganismo o sus productos constituyen un problema para todos los rganos y sistemas que son
irrigados por el mismo. La deteccin e identificacin de los diversos microbianos, es de vital
importancia desde el punto de vista clnico para
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiolgico.
Pg. 26
f. Dispensar el volumen de sangre obtenido rpida y suavemente en el medio de cultivo lquido

3.3 Hemocultivo y Mielocultivo
con anticoagulante
3.3.1 Propsito
g. Limpiar con alcohol al 70% para remover el
yodo el cual puede causar irritacin en algunos
El hemocultivo sirve para detectar las bacterias pacientes.
que se estn reproduciendo en la sangre, lo que Las botellas de hemocultivo inoculadas deben
provoca septicemia. El mielocultivo es el cultivo ser enviadas inmediatamente al laboratorio evide mdula sea y sirve para detectar bacterias tando una agitacin vigorosa, sin refrigerar. Si
en esta muestra, especialmente Salmonella no es posible llevarlas de inmediato, conservartyphi.
las a temperatura ambiente por un corto perodo
El aparato circulatorio, es un sitio naturalmente de tiempo sin alterar la viabilidad de las bacteestril, por lo tanto, la presencia de microorga- rias. Por un periodo mayor deben conservarse
nismo o sus productos constituyen un proble- en incubadora a 35C.
ma para todos los rganos y sistemas que son En sepsis: se recomienda tomar dos muestras
irrigados por el mismo. La deteccin e identifi- de lugares distintos en un lapso de media hora.
cacin de los diversos microbianos, es de vital En endocarditis, obtener tres muestras de difeimportancia desde el punto de vista clnico para rentes lugares en un lapso de 1 a 2 horas.
instaurar una terapia antimicrobiana adecuada
y desde el punto de vista epidemiolgico.
3.3.3.1 Procedimiento de incubacin
a. Al obtener la muestra en el frasco de hemocultransporte
tivo, incubar el frasco a 35-36C hasta por 7 das
b. Examinar visualmente y con luz transmitida
El momento ideal para obtencin de la muestra los frascos de hemocultivo despus de 12 y 24
es justo antes del pico ms alto de fiebre, sin horas de incubacin.
esperar el pico mximo de temperatura, ya que c. Observar si presenta turbidez o lisis de gloen este momento hay mayor destruccin del bulos rojos indicando crecimiento bacteriano,
microorganismo. Antes de recibir terapia antimi- entonces realizar una coloracin Gram y un subcrobiana, si est recibiendo ya terapia antimi- cultivo., si no presenta cambios seguir incubancrobina tomar muestra en el momento de baja do por 7 das.
concentracin del antibitico.
3.3.2.1 Toma de muestra
a. Seleccionar el sitio de puncin,
b. Preparar el sitio, lavar con agua y jabn. Limpiar con alcohol etlico a 70%. Si el paciente no
es alrgico al yodo, lavar en forma concntrica
con tintura de yodo por 30 segundos
c. Desinfectar las tapas de la botella del hemocultivo con alcohol o yodo.
d. Proceder a la venopuncin con jeringa, extraer el volumen de sangre necesario para obtener una dilucin en una proporcin de 1:5 o 1:10
Volumen de muestra:
neonatos
0.5 ml

Nios
1-5 ml
Adultos
10 ml
e. Retirar la ligadura y la jeringa al terminar de
obtener la sangre, colocar una torunda de algodn
Subcultivo
a. Los subcultivos deben realizarse en cabina o
cerca de un mechero de bunsen
b. Realizar los subcultivos ciegos dentro de las
12 a 24 horas de incubacin
Pg. 27
c.Antes de realizar el subcultivo, desinfectar la superficie de la tapa del frasco con alcohol al 70%
d. Con una jeringa estril, extraer a travs del tapn de la muestras
e. Inocular una gota de muestra del hemocultivo en un extremo de la superficie de las placas de
Agar Sangre, Agar MacConkey, Agar Chocolate y Agar Manitol sal.
f. Tambin colocar una gota sobe un portaobjeto para la tincin de Gram
g. Proceder a realizar la dispersin para obtener colonias aislada
h. Incubar las placas de Agar sangre carnero 5% y Agar Chocolate a 35-36C por 24 horas en
ambiente de CO2; las placas de MacConkey y Manitol Sal incuabar en ambiente aerobiosis.
i. Observar el gram si se observa morfologa bacteriana informar al medico
j. Si no hay crecimiento a las 24 horas, seguir incubando hasta por 48 horas.
k. Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento de sulbcultivo al 5to y 7 mo dia.
l. Streptococcus pneumoniae tiene tendencia a autolisis, deben ser subcultivado a las 12-17 horas
de incubacin, repetir a las 48 horas y 7mo da de incubacin sin presentar cambio de coloracin
o turbidez.(Tabla No. 2)
Tabla No. 2 Alteracin del hemocultivo y posible bacteria
3.3.4 Identificacin de principales microorganismos

Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de bacillus son contaminantes
frecuetnes y a menudo se aslan en solo una de tres muestras o el paciente no presenta sntomas.
Algunas bacterias frecuente en hemocultivos positivos son:
-
Salmonella typhi
-
Escherichia coli
-
Streptococcus pneumoniae
Pg. 28
Staphylococcus aureus
-
Streptococcus pyogenes
-
-
Haemophilus influenzae
3.4 Lquido cefalorraqudeo y otros lquidos estriles

3.4.1 Propsito
Demostrar mediante el cultivo de Lquido Cefalorraqudeo (LCR) u otro tipo de lquido el diagnostico microbiolgico de una infeccin.
Las infecciones del SNC puede ser causada por bacterias, virus, hongos o parsitos que se hallan en el medio ambiente o que forman parte de la flora normal de la superficies corporales; los
agentes causales son introducidos previamente en los tejidos perifricos del hospedero y se dirigen al SNC a travs del torrente sanguneo o ocasionado por traumatismos craneoenceflicos.
Pg. 29
Las bacterias que tiene mayor importancia en el lquido cefalorraqudeo son:

Bacterias Gram Negativo
Neisseria meningitidis
Haemophilus influenzae
Escherichia coli y otras enterobacterias
Bacterias Gram Positivo
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Lysteria monocytogenes
Entre otros microorganismos esta Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Cryptococcus
neoformans.
Los sntomas de irritacin de las meninges son fiebre, dolor de cabeza, vmitos, rigidez, dolor
de nuca, reflejos aumentados y petequias en la piel.
3.4.2 Recoleccin de Muestra y Transporte

Las muestras de lquido LCR u otro lquido corporal estril deben ser tomadas por un profesional
capacitado, antes de iniciar tratamientos con antibiticos, colectadas en recipientes estriles por
lo menos tres frascos para citolgico (recuento de glbulos rojos, recuento de glbulos blancos,
formula diferencial), qumico (glucosa, protena entre otros) y microbiolgico.
Deben ser transportadas inmediatamente al laboratorio y ser procesadas inmediatamente no despus de 30 minutos de recolectada. Rotular la muestra adecuadamente y tipo de muestra. Si el
mdico sospecha de bacilos alcohol acido resistente BAAR o de hongos debe notificarlo para
evaluar.
Pg. 30
levaduras encapsuladas sembrar en agar Sabourod por 4 semanas

Los lquidos o fluidos corporales estriles son:
e.
Tomar una o dos gotas de lquido con una pi- Lquido cefalorraqudeo
peta pasteur estril o jeringa estril e inocular
- Lquido ventricular (cisternal o craneal)
los medios de cultivo slidos, Agar Sangre Car- Lquido abdominal (peritonel, de dilisis o
nero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar
bilis)
MacConkey.
- Lquido pleural, toracentesis y empiema (
f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero
obtenido del torax)
al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 y
- Lquido pericardio
Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente ae-Lquido sinovial
La muestra de Lquido Cefalorraqudeo LCR se robiosis, a 36C, revisar a las 24 horas.
obtiene por puncin lumbar, se sugiere por lo g. Si el laboratorio cuente con pruebas para demenos la coleccin de la muestra en tres tubos teccin de antgenos, realice estas pruebas con
separados para analizar qumica (glucosa, pro- una pequea cantidad del LCR o del sobrenatenas entre otros), citolgico (glbulos rojos, dante del LCR.
glbulos blancos y formula diferencial) y cultivo h. Si no se observa crecimiento deben ser reinmicrobiolgico de preferencia el tubo no. 2 o el cubados los medios por 72 horas antes de descartados.
ms turbio para el anlisis microbiolgico.
i.Si presenta desarrollo de microorganismos sobre los medios de cultivo slidos realizar coloracin Gram, de acuerdo a lo observado proceder
a montar las pruebas de identificacin y antibiograma.
Reportar al mdico inmediatamente lo observado en la tincin de Gram, ZN o Tinta China.
Segunda Porcin
a Proceder a realizar el examen macroscpico
(color, aspecto, volumen ) y citolgico del Lquido estril
b. El examen citolgico de la segunda porcin
se analizara
- Recuento de glbulos rojos
- Recuento de glbulos blanco
- Formula diferencial
Figura No. 16
c Es este tubo tambin puede realizarse pruebas de latex para identificacin de Criptococ3.4.3 Aislamiento Primario del Lquido
Cefalorraqudeo u otros Lquidos Est- cus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemoriles.
litico.
Tercera Porcin
Primera porcin
a. Tomar un tubo con muestra y Centrifugar la Proceder a realizar el examen qumico con evaluacin de glucosa y protenas.
muestra a 3,000 rpm durante 10 minutos
b.Descartar el sobrenadante y con el sedimen- d. Si en la coloracin de Tinta China se obserto proceder a realizar frotes para Gram y Zielh van levaduras encapsuladas sembrar en agar
Sabourod por 4 semanas
Neelsen ZN; Tinta China
c.Si se observan Bacilos Alcohol Acido Resis- e.Tomar una o dos gotas de lquido con una pitente sembrar en Lowenstein Jensen, siguiendo peta pasteur estril o jeringa estril e inocular
el protocolo para aislamiento e identificacin de los medios de cultivo slidos, Agar Sangre Carnero 5%, Agar Chocolate, Agar Manitol Sal, Agar
micobacterias por 60 das
d.Si en la coloracin de Tinta China se observan MacConkey.
Pg. 31
Interpretacin
Tincin del Gram del sedimento del LCR:
f. Incubar los medios de Agar Sangre Carnero - Observar diplococos Gram Negativo, forma de
al 5% y Agar Chocolate en ambiente de CO2 rion, en parejas como grano de caf, compatiy Agar Manitol Sal y MacConkey en ambiente bles con N.meningitidis.
aerobiosis, a 36C, revisar a las 24 horas.
- Cocobacilos Gram Negativo pleomrficos, con
g.Si el laboratorio cuente con pruebas para de- escasa formas bacilares, compatible con H. inteccin de antgenos, realice estas pruebas con fluenzae
una pequea cantidad del LCR o del sobrena- - Cocos Gram Positivo, lanceolado, ovalado, disdante del LCR.
puestos en parejas o cadena cortas, la capsula
h.Si no se observa crecimiento deben ser rein- se insina como un halo claro alrededor de las
cubados los medios por 72 horas antes de des- bacterias, compatible con S. pneumoniae.
cartados.
- Bacilos Gram Negativo, compatible con Entei.Si presenta desarrollo de microorganismos so- robacterias o Pseudomonas sp.
bre los medios de cultivo slidos realizar colora- - Levaduras redondas con gemacin, Gram pocin Gram, de acuerdo a lo observado proceder sitivo, se insina cpsula hacer tinta china, para
a montar las pruebas de identificacin y antibio- verificar la presencia de C. neoformans
Tincin de Ziehl Neelsen
grama.
Reportar al mdico inmediatamente lo observa- - Si se observan bacilos alcohol cido resistente
cortos, morfologa compatible con M. tuberculodo en la tincin de Gram, ZN o Tinta China.
sis o otras micobacterias.
Segunda Porcin
Al observar crecimiento a las 24 o 48 horas y
a. Proceder a realizar el examen macroscpico observar crecimiento en distintos medios como
(color, aspecto, volumen ) y citolgico del Lqui- gua (Tabla No. 4)
do estril
b. El examen citolgico de la segunda porcin Tabla No. 4
se analizara
- Recuento de glbulos rojos
- Recuento de glbulos blanco
- Formula diferencial
c Es este tubo tambin puede realizarse pruebas de latex para identificacin de Criptococcus neoformans, H. influenzae, N. meningitidis,
Streptococcus pneumoniae y del grupo B-hemolitico.
Tercera Porcin
Proceder a realizar el examen qumico con eva- Realizar Frote gram de las colonias para confirmar morfoluacin de glucosa y protenas.
loga y proceder a identificacin (tabla No. 5)
3.4.4 Identificacin de principales miTabla No. 5
croorganismos
Pg. 32
3.5 Coprocultivo
3.5.1 Propsito e Importancia
Mtodo utilizado para identificar diferentes microorganismos causantes de enfermedades
gastrointestinales, provocando diarreas, vmitos, fiebre y dolores estomacales.
Los principales enteroptogenos estn: Salmonella sp, Shigella sp y Vibrio cholerae.
identificar ms de 40 serotipos. Los factores de

virulencia son Endotoxina, que se libera tras la
lisis de la bacteria, que contribuye a la irritacin
de la pared intestinal y la Exotoxina o Toxina
Shiga que es una protena termolbil inmunognica, su accin afecta tanto al intestino como
sistema nervioso central.
3.5.1.3 Vibrio Cholerae
El gnero Vibrio agrupa a ms de 30 especies,

pero slo 12 se consideran patgenas para el
ser humano. La especie ms patgena es V.
3.5.1.1 Salmonella sp
cholerae, segn el antgeno somtico (O) se
subdivide en los grupos O1, O2, O3 y O139. El
El gnero Salmonella se incluye en la fami- Vibrio cholerae grupo O1 presenta 2 biotipos; el
lia Enterobacteriaceae, integrada por bacilos Clsico, y Eltor y ambos biotipos pueden perteGram negativo anaerobios facultativos, son fer- necer a dis serotipos principales Ogawa e Inaba.
mentadores de glucosa pero no lactosa, suelen Los vibrios causantes de clera son Vibrio choser mviles por sus flagelos peritricos excepto lerae grupo O1 y grupo O139, fabrican una enS. gallinarum, no esporulados, producen cido dotoxina que es la determinante de las diarreas
sulfrico y no producen ureasa.
secretoras tpicas del clera.
Se distinguen tres nicas especies patgenas Son bacilos Gram negativo, con forma de coma,
primarias: S. thphi, S. Cholerae-suis y S. en- aerobios y anaerobios facultativos. No esporulateritidis. Segn la serotipificacin de Kauffman dos, tiene flagelo polar. Fermenta la glucosa sin
y White, estas se clasifican en ms de 2000 produccin de gas, catalasa positivo y la mayoserotipos con base en antgenos flagelares H ra es oxidasa positiva. Tiene Antgeno somtico
(proteicos) y antgeno somticos O (fraccin po- (O), antgeno flagelar (AgH), sus factores de vilisacrida del lipopolisacaridos bacilar). S. typhi rulencia son mucinasa y la toxina colrica.
posee adems un antgeno de virulencia (Vi)
3.5.2 Recoleccin de Muestra y Trans3.5.1.2 Shigella
porte
a. No estar tomando antibiticos
Shigella es un bacilo Gram negativo, inmvil, no b. Colectar la muestra de heces frescas en un
formadoras de esporas e incapaces de fermen- frasco limpio y estril de boca ancha enviarlo antar la lactosa, que puede ocasionar diarrea en tes de 1 hora al laboratorio
especialmente en nios.
c. Si no puede emitir muestra de heces se pueExisten varias especies diferentes y son clasifi- de proceder a toma de muestra con hisopo. En
cados en cuatro subgrupos
nios introducir el hisopo 2.5 cm y en adultos
- Serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos): introducirlo 4 cm; dar 3 vueltas a la derecha y 3
causa disentera bacilar grave y complicaciones vueltas a la izquierda
- Serogrupo B: S. flexneri (6 serotipos): causa d. Si la muestra es tomada con hisopo introdudisentera bacilar moderada
cirlo en el medio de transporte como Cary Blair,
- Serogrupo C: S. boydii (23 serotipos): causa e. Enviar la muestras tomadas lo antes posible
disentera bacilar moderada
al laboratorio
- Serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo): causa disentera bacilar leve
3.5.3Aislamiento Primario
Shigella tienen un patrn antignico complejo, 3.5.3.1 Procedimiento para aislar Salla mayor parte de las especies comparten el an- monella sp, Shigella sp
tgeno O con otras enterobacterias. El antgeno a. Procesar la muestra lo ms pronto posible
O (somtico) es un lipopolisacrido que permite
Pg. 33
b. Con un hisopo estril o asa en argolla tomar

muestras de heces donde hay presencia de
moco, pus o sangre.
c. Tomar un hisopo o una asada de muestra y
colocarlo en caldo de selenito por 12 a 24 horas
a 35-36C (inhibiendo la flora normal y permite
el desarrollo de salmonella sp y Shigella sp.
d. Tomar tercer hisopo o asa con muestra e
inocular los medios de cultivo selectivos como
MacConkey Sorbitol y XLD o SS, realizando un
inoculo de 1 cm.
e. Con un asa en argolla flameada y fra proceder a estriar
f. Incubar por 24 a 48 hrs a 35-36C
g. Revisar la presencia de colonias sospechosas tabla no. 1, realizar identificacin y antibiograma
El Agar MacConkey Sorbitol utilizado para buscar Escherichia coli O 157:H7 en nios menores
de 5 aos.
Caractersticas macroscpicas en los medios
de cultivo de las bacterias ms importantes (Tabla No. 6 y figuras 17)
Tabla No. 6
3.5.3.2
Procedimiento para aislamiento de Vibrio cholerae
a. Procesar la muestra lo ms pronto posible o muestra
proveniente en medio de transporte de Cary Blair
b.Con un hisopo estril o asa en argolla tomar muestras
de heces donde hay presencia de moco, pus o sangre.
c.Tomar un hisopo o asa de muestra y colocarlo en Agua
Peptonada Alcalina por 6 a 8 hr a 35-36 C para enriquecimiento de Vibrio cholerae
d.Sulcultivar en medio TCBS (tiosulfato, citrato sales biliares y sacarosa y Agar Sangre
e. Con un asa en argolla flameada y fra proceder a estriar.
Incubar por 24 hrs a 35-36C
f.Revisar la presencia de colonias circulares de borde entero de color amarillo (sacarosa positivo) en medio TCBS y
en agar Sangre colonias hemolticas. (Figura 18)
Pg. 34
- Proceder a picar una vez el medio por el centro al fondo del tubo
- Sin sacar el asa recta del tubo estriar el sland
del medio
- Incubar a 36 C por 18 / 24 hrs
- Leer la reaccin
B. LIA Agar Lisina Hierro
Mide la capacidad del microorganismo para
descarboxilar un aminocido (lisina o arginina)
para forma una amina con la consiguiente alcalinidad, ponindose de manifiesto por el viraje
del indicador prpura de bromocresol. El medio
es de color prpura intenso pH 6.
Procedimiento
- Con un asa recta no flameada del proceso
del TSI,
- Desenrosque el tubo y flamee la boca del
tubo
- Proceder a picar el medio tres veces hasta el
fondo y estriar el sland
- Incubar a 36C por 18 a 24 hrs
- Leer la reaccin
3.5.4 Identificacin de principales Microorganismo
Tabla No. 6 Interpretacin TSI y LIA
3.5.4.1 Pruebas Bioqumicas

Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos, la cual se fundamentan en
demostrar si el microorganismo es capaz de
fermentar azcares, presencia de enzimas,
degradacin de compuestos; con el objetivo de
diferenciar bacterias.
Para la realizacin de las pruebas bioqumicas
se debe tener cuidado utilizar mesclar bacterias y tomar proceder con aislamientos puros.
A. TSI Agar hierro triple azcar
Determinar la capacidad de la bacteria para
degradar los azucares y la formacin de gas
y Acido Sulfhidrico. Color es rojo ladrillo anaranjado pH 7.4. . La fermentacin aerbica se
produce en el sland del tubo y la anaerbica en
el fondo del tubo.
Procedimiento
- Con un asa recta picar una colonia sospechosa que este aislada
tubo
Pg. 35
C.Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de
carbono es una prueba til en la identificacin
de enterobacterias, se detecta mediante el
crecimiento y alcalinizacin del medio a pH 7.6,
el aumento de pH se visualiza con el indicador
Azul de Bromotimol que vira el medio de color
verde a azul oscuro.
Procedimiento
- Con un asa flameada y fra tomar una colonia
aislada
tubo
- Proceda a estriar el sland
- Incubar a 36 C por 18-24 horas
- Interpretar
Interpretacin
Positivo: Crecimiento y viraje azul
Negativo: Sin viraje el medio (verde)
D. UREA
La triptena y la glucosa aportan los nutrientes
para el desarrollo del microorganismo, el rojo
de fenol es el indicador del pH y el cloruro de
sodio mantiene el balance osmtico. Las bacterias que hidrolizan la urea por medio de la
enzima ureasa liberan amoniaco y dixido de
carbono, esto alcaliniza el medio virando el rojo
de fenol de amarillo al Rosado Intenso, esta
prueba puede realizarse en medio liquido o
slido. El medio es de color amarillo.
Procedimiento
- De un cultivo puro tomar una colonia con una
asa flameada y fra
- Desenrosque el medio y flamee la boca del
tubo
- Estriar la superficie del sland
- Incubar por 18 a 24 hrs a 36C
- Leer reaccin
2. Descarboxilacin de Ornitina, capacidad del

organismo de descarboxilar un aminocido
para formar una amina, por consiguiente la
alcalinizacin
3. Produccin de Indol El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias formando tres metabolitos, Indol, Escatol,
y Indolacetico.
Procedimiento
- Con un asa en lnea flameada y fra tomar una
colonia
- Desenroscar el frasco y flamear la boca del
tubo
- Introducir el asa en medio del agar hasta el fondo
- Incubar por 18-24 hr a 36C
- Para la prueba de Indol, agregar 5 gotas del
reactivo de Kovacs, agitar suavemente
- Interpretar
Interpretacin
Produccin de Orinitina: Positivo: color purpura
Negativo: color amarillo al fondo del tubo
Produccin de Indol: Positivo: anillo rojo en la
superficie
Negativo: no produce color
Movilidad: Positivo: Los microorganismos mviles migran de la lnea de siembre hacia el medio
formando turbidez
Negativo: crecimiento bacteriano solo en la lnea
de siembra.
3.5.4.2 Identificacin de Salmonella sp
Interpretacin
Positivo: Rosado intenso
Negativo: Sin viraje el medio (Amarillo)
E. MIO (Movilidad, Indol y Orinitina)
Utilizado para la identificacin de enterobacterias sobre la base de:
1. Movilidad:
Pg. 36
- Mezcle la suspensin y el antisuero completamente y a modo de mecedora mueva el portaobjeto repetidamente para observar aglutinacin
bajo luz brillante y sobre un fondo negro. Si la
reaccin es positiva en 30 seg a 1 min aparecer
una precipitacin.
- Si presenta aglutinacin en el control se trata
de una cepa rugosa, y no puede ser serotipificado.
3.5.4.3 Identificacin de Shigella sp
a. Reaccin bioqumica
b. Tincin de Gram
Salmonella typhi
c. Serolgica
Los cultivos de TSI sospechosa de S. typhi deben analizarse serolgicamente con antisueros
de Salmonella Vi y O del grupo D. El antgeno
Vi es capsular puede enmascarar la reaccin
del grupo somtico O, por lo que aislamientos
de Salmonella typhi sern normalmente positivos tanto Vi como para el antisuero D.
Procedimiento
- En un portaobjeto lmpido colocar tres pequeas gotas de solucin salina
- Tomar una porcin del crecimiento de la superficie de TSI y suspender cada gota de solucin
salina, mezclar
- Aadir una pequeas gota de antisuero O del
grupo D a una suspensin y una pequea gota
del antisuero Vi a una segunda. La tercera suspensin ser control
Pg. 37
b. Tincin de Gram
c. Serologa
3.5.4.4 Identificacin de Vibrio cholerae

a. Reaccin bioqumica
b. Tincin de Gram
S. dysenteriae es las mas comn en desintera, los aislamientos con reacciones tpicas en la pruebas bioqumicas
deben estudiarse primero con el antisuero monovalente A1, despus con el antisuero polivalente B y por ultimo el antisuero polivalente D.
Procedimiento
- En un portaobjeto dividirlo y en cada seccin
colocar una gota de solucin salina
- Tomar muestra de las colonias sospechosas
del TSI u otro medio no selectivo
- Emulsifique el crecimiento en cada gota de
solucin salina, mezcle completamente las suspensin para hacerla moderadamente lechosa
- Aadir una gota pequea de antisuero y una
se usara como control
- Mezclar bien la suspensin y el antisuero para
observar autoaglutinacin.
- Observar el portaobjeto bajo una luz brillante
y sobre un fondo negro. Reaccin positiva dentro de 30 seg a 1 min.
- Si observar una el control que es la colonia
con solucin salina, se debe observar una mezcla homognea, si hay presencia de aglutinacin no sirve para serotipificado.
c. Prueba de Cuerda
La prueba se utiliza para distinguir cepas de
V. cholerae de Aeromonas. El desoxicolato de
sodio lisas las bacterias, la solucin perder la
turbidez y el ADN se desprender de las clulas
causando la viscosidad.
Procedimiento
- En un portaobjeto colocar una gota de desoxicolato sdico al 0.5 %
- Tomar una colonia a analizar previamente incubada en Agar Infusin de Corazn por 18 a
24 hrs
- Interpretar
Interpretacin
Positivo: Vibrio cholerae; otros vibrios darn positivo o positivo dbil
Negativo: Aeromonas
Pg. 38
3.6 Urocultivo
3.6.1 Propsito e importancia
El urocultivo es utilizado para la identificacin
de microorganismos causantes de infecciones
urinarias asintomticas o sintomticas que van
precedidos de leucocitosos y bacteriuria. Bajo
condiciones normales no hay bacterias en el
tracto urinario. El microorganismo principales
de infeccin urinaria son bacilos gram negativo y con mayor frecuencia es la Escherichia
coli, seguido de Klebsiella sp, Enterobacter sp.,
Proteus sp., Pseudomonas aeruginosa, de menor importancia estn los cocos gram positivos
como Enterococcus sp., Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus y hongos.
Cultivos de orinas con presencia de 2 a ms microorganismos es indicio de una mala limpieza
por lo tanto es una contaminacin.
El criterio de Kass, es til para interpretar del
crecimiento del bacteriano y ser considerada
una verdadera infeccin urinaria, siendo este
criterio de igual o mayor a 100,000 UFC/ML
(UFC/ml Unidad formadora de colonias por mililitro).
3.6.2 Recoleccin
Transporte
de
la
nios.
Llevar la muestra inmediatamente al laboratorio, no pasando ms de una hora despus de la
recoleccin.
Mujeres:
a. Realizar la limpieza en el rea genital, separando los labios mayores, con gasas estril con
jabn antisptico limpiar y con otra gasa estril
con agua quitar el jabn
b. Dejar secar
c. Proceder a recolectar la muestra en un frasco
estril boca ancha, descartando la primera porcin de la orina en el sanitario y luego recolectar
la otra porcin a medio chorro
d. Trasladarla inmediatamente al laboratorio.
Hombres:
a. Realizar la limpieza en la punta del pene con
gasa estril con antisptico, luego con otra gasa
con agua estril quitar el jabn.
b. Dejar secar.
c. Proceder a la recoleccin de la muestra en
frasco estril boca ancha, descartando la primera porcin de la orina en el sanitario y recolectarla otra porcin a medio chorro.
d. Trasladar inmediatamente al laboratorio.
Muestra
y 2. Puncin Supra-pbica
Esta por ser una tcnica delicada debe ser tomada por un mdico pediatra. Es la obtencin de la
De preferencia que el paciente no este con te- muestra por jeringa estril. Esto solo se hace en
rapia antibitica previa a la recoleccin de la casos de que los cultivos aerobios dan negativos
muestra, la muestra adecuada es la primera de y con sintomatologa, malformacin de la uretra
la maana, de no ser posible por lo menos pa- o sospecha de infeccin por un anaerobio.
sar dos horas sin orinar para recolectar la muestra. Al momento de tener la muestra enviarla lo
ms antes posible al laboratorio no mayor de 2
horas. Recolectar en frasco estril previa limpieza adecuada.
Existen varios procesos de recoleccin de la
muestra:
1. Chorro medio
Nios: Realizar la limpieza en el rea con agua
y jabn, secar, colocar la bolsita de recoleccin
de orina peditrica adecuadamente (varones
que el pene quede introducido en el agujero
de la bolsita y mujercitas que el agujero quede
en el centro donde saldr la orina). No dejar la
bolsita por ms de una horas colocada en los
Pg. 39
3. Sondas permanentes
Este procedimiento se utiliza en aquellos enfermos con sonda permanente en los que no es
posible retirar o reemplazar la sonda.
Se desinfecta la parte externa de la sonda en la
zona proximal con alcohol yodado y se punza
la sonda con aguja y jeringa estril. Se vuelca
el contenido en forma asptica en un frasco estril.
Criterio de Kass
- Recuentos inferiores a 10,000 UFC/ml, con
hallazgos de cultivos polimicrobianos indican
que hubo una posible contaminacin.
- Recuentos de 10,000 a 100,000 UFC/ml, posible bacteriuria
- Recuentos igual o mayor a 100,000 UFC/ml
3.6.3 Asilamiento primario
- Proceder a sembrar la orina con un asa cali- en pacientes asintomticos tienen una probabibrada; se utiliza medios de cultivo de Agar San- lidad del 80% de presentar bacteriuria significagre Carnero al 5% permitiendo el crecimiento tiva, probabilidad que aumenta hasta el 96% en
de todo tipo de bacterias, Agar MacConkey paciente sintomtico.
permitiendo el crecimiento de bacterias Gram - Muestras obtenidas por Puncin Suprapbica
negativo. Tambin puede usarse Chromocult o cualquier recuento de colonia es significativo.
CLED este inhibe el swarming de Proteus sp
- Con un asa calibrada de 0.001 ml flameada 3.6.4 Identificacin de principales miy fra proceder a tomar la muestra de orina pre- croorganismo
viamente agitada y abierta cerca del mechero
- Realizar un lnea con el asa calibrada en el 3.6.4.1Escherichia coli
centro de la placa de Agar Sangre y otra lnea Reaccin bioqumica
con el asa flameada y fra en la placa de MacConkey de igual manera
- Con un asa no calibrada realizar las estras en
forma de zigzag.
- Incubar el Agar Sangre en jarra con candela
ambiente de CO2 y el Agar MacConkey en aerobiosis a 35-36 C por 18 a 24 hrs.
- Interpretacin, si no hay crecimiento en un
cultivo por 48 horas reportar Negativo a las 48
horas de Incubacin, si hay presencia de crecimiento contar el nmero de colonias presentes
y multiplicar por 1000 si se usa asa calibrada
de 0.001 y multiplicas por 100 si se us asa
calibrada de 0.01 ml realizar la identificacin de
la bacteria por medio de reacciones qumicas.
Tener en cuenta el criterio de Kass.
Pg. 40
Escherichia coli (gram negativas)

con la tincin de Gram.
Pg. 41
Pg. 42
- Desinfectar la superficie con alcohol al 70% o

yodo
3.7 Secreciones Varias
3.7.1 Secreciones de heridas y absce- - Introducir la aguja a travs de la piel o la pared
de absceso y aspirar aproximadamente 1 ml del
sos
material purulento
3.7.1.1 Propsito e importancia
- Colocarlo en un frasco estril o un medio de
Est indicado para detectar la presencia de transporte y enviar inmediatamente al laboratobacterias causantes de infecciones en piel, ojo, rio
odos, quemaduras, abscesos y otros. La piel
es el rgano ms accesible del cuerpo que pue- 3.7.1.2.3 Toma de muestra en quemade tener mayor probabilidad de ser daado o duras
traumatizado, causando dolor, hinchazn, calor - Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado any enrojecimiento alrededor de la herida hasta tes de la obtencin de la muestra (hisopado del
formar abscesos. La infeccin puede ser mono- exudado o una biopsia)
- Llevar la muestra del tejido en frasco estril
microbianas o polimicrobianas.
Los microorganismos ms frecuentes S. aureus,
S. epidermides, Enterococos, E. coli, Klebsiella 3.7.1.2.4 Toma de muestra de ojo
sp, Enterobacter sp, P. aeruginosa, Candida al- - Realizar la toma de muestra antes de colocado
analgsicos locales, colirio o antibiticos
bicans.
- Proceder a la toma de muestra con hisopo ro3.7.1.2 Recoleccin de la muestra y tando suavemente el hisopo en el ngulo interno
transporte Previo a tomar la muestra del ojo e introducirlo en el medio de transporte
el paciente no debe estar tomando an- - Con un hisopo estril y hmedo con solucin
salina tomar la muestra y realizar los frotes gram
tibitico.
- Si es para investigar Chlamydia trachomatis,
verter el prpado y frotar con una torunda la su3.7.1.2.1 Toma de muestra de Herida
- Realizar una buena asepsia de los bordes con perficie conjuntival y teir con coloracin Giemsolucin salina estril, realizando de adentro sa. Observar inclusiones intracitoplasmaticas
hacia fuera en forma concntrica
- Separa suavemente los bordes de la herida
con el pulgar e ndice de la mano.
- Con la otra mano, con cuidado de no tocar los
bordes cutneos, introducir la punta del hisopo
en la profundidad de la herida, rotando el hisopo
y avanzando hacia fuera.
- Obtener dos muestras
o Una para cultivo, introduciendo en un medio
de transporte amies, stuart.
o La segunda para realizar una coloracin
Gram, KOH o ZN realizar inmediatamente.
3.7.1.2.5 Toma de muestra de Odo
- Enviar el medio de transporte al laboratorio.
- Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo
3.7.1.2.2 Toma de muestra de Absceso impregnado con Sol. Salina estril
- Proceder a la toma de muestra con el medio
La toma de muestra de absceso debe ser toma- de transporte, de atrs hacia delante y de abajo
da por aspiracin con jeringa.
hacia arriba
-Realizar un frote para coloracin Gram con un
- Realizar una limpieza de la superficie con so- hisopo estril humedecido con sol. Salina estlucin salina, debe realizarse de adentro hacia ril, por sospecha de hongo
fuera en forma concntrica.
Pg. 43
3.7.1.3 Aislamiento primario

- Realizar el inoculo en los medios de cultivo; si es material purulento colocar una gota en un
extremo del medio de cultivo; los medios de cultivo a usar son Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar
MacConkey, Agar Manitol Sal
- Flamear y enfriar un asa en argolla y proceder a estriar. A modo de obtener aislamiento de colonias.
- Incubar el Agar sangre y Agar Chocolate en jara con candela a 37C y el Agar MacConkey y
Manitol sal en aerobiosis a 37C por 24 horas
- Observar crecimiento identificando bacterias patgenas. Realizar antibiograma
- Realizar la fijacin del frote gram con el mechero y proceder a teirlo con la coloracin Gram o
ZN.
- Si a las 24 horas no hay crecimiento incubar por 24 horas ms.
3.7.1.4
3.7.1.4.1 Esquema de identificacin de Cocos Gram positivo
Tabla No. 7 Identificacin de Staphylococcus aureus y coagulasa negativa
Pg. 44
Tabla No. 8
Identificacin de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y alfa hemolisis
Tabla No. 9
Identificacin de Cocos Gram Positivo, catalasa negativo y beta hemolticos
Tabla No. 10
Identificacin de Cocos Gram positivo, catalasa negativa y gamma hemolisis
Pg. 45
3.7.1.4.3 Identificacin de Gram Negativo no Fermentador Pseudomonas aeroginosa

Pseudomonas aeroginosa es fcil de reconocer
en medios de aislamiento primario por la morfologa de la colonia que son generalmente plana,
algo extendidas, bordes aserrados y tienen un
brillo metlico, por la produccin de pigmentos
difusibles si est presente porque algunas cepas
no lo producen y son bastante mucoides y son
aislados de pacientes con fibrosis qustica y el
olor caracterstico.(Tabla No. 12, figura No. 20)
3.7.1.4.2 Identificacin de Gram negativo Fermentadores Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae y Enterobacter
cloacae
En agar MacConkey visualizar la morfologa de
las colonias, (Tabla No. 11 Fig. 19)
Escherichia coli: lactosa positiva, colonias de
borde entero, color fucsia opacas de 2-3mm de
dimetro. Usualmente se observa una zona opaca alrededor de la colonia.
Klebsiella pneumoniae: colonias de borde entero color rosado a rosado oscuro de 3-4 mm de
Tabla No. 12
dimetro y aspecto mucoide.
Enterobacter spp: colonias de borde entero, color rosada 2-4 mm de dimetro, no tan mucoide
como Klebsiella pneumoniae.
Pg. 46
Mujeres adultas
- Colocar a la paciente en una camilla en posicin ginecolgica, introducir el especulo hasta
3.7.2 Secrecin Vaginal
visualizar el cuello
3.7.2.1 Propsito
- Introducir el hisopo tomar una muestra e introducirlo en un medio de transporte Stuart o Amies
La mucosa genital es una regin vulnerable a la o Amies con carbn
infeccin producida tanto por microorganismos - Proceder a tomar dos muestras con hisopo,
constitutivos de la microbiota habitual como por uno para hacer el extendido para la tincin y otro
los adquiridos de forma exgena a travs del colocarlo en solucin salina estril para observacontacto sexual, estn normalmente coloniza- cin en fresco
das por diferentes microorganismos que inclu- - Las muestras en medio de transporte deben
yen estafilococos coagulasa negativo, corine- ser enviada inmediatamente al laboratorio, si no
bacterias, estreptococos, bacterias anaerobias es posible mantenerlo a temperatura ambiente y
y con menor frecuencia levaduras. En edad re- no exceder de 18 horas.
productiva destaca la presencia de Lactobaci- En mujeres embarazadas, en busca de Strepllus acidophilus, ejerciendo un control biolgico tococcus agalactiae (beta-hemolitico del grupo
y un mecanismo de defensa para el epitelio va- B) se recomienda la toma de muestra introduginal. Las infecciones del tracto genital femeni- ciendo el hisopo por el canal vaginal sin colocar
no pueden ser de origen endgeno, causadas especulo.
principalmente por Gardnerella vaginalis, Streptococcus agalactiae o Candida sp.
3.7.2.2 Recoleccin de la muestra y
transporte
Condiciones previas a la obtencin de la muestra, no estar en tratamiento de antibitico, no
realizarse ducha vaginales ni relaciones sexuales 24 horas antes de la toma de muestra. Y no
baarse el da de la recoleccin de la misma.
Tabla No. 13
En Nias
En nias NO utilizar especulo.
- Colocar a la nias en posicin ginecolgica
- Realizar una previa limpieza para evitar contaminacin con flora colonizante
- Utilizar hisopos finos estriles (Dacron) humedecido con solucin salina y proceder a tomar la
muestra desde los labios menores, introducirlo
en medio de transporte Stuart o Amies o Amies
con carbn
- Utilizar otro hisopo para el extendido
Pg. 47
Tabla No. 14
3.7.2.3 Aislamiento Primario
- Proceder a realizar el inoculo en medios
de cultivo como Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar MacConkey, Thayer Martin, Manitol Sal, rotando el hisopo sobre la superficie.
- Con asa en argolla flameada y fra proceder a dispersar la muestra en cuatro cuadrantes a modo de tener colonias aisladas.
- Incubar las placas de Agar Sangre, Chocolate y Thayer Martin a 3536C en medio de CO2 por 24 horas Diagrama de identificacin de N. gono- Las placas de MacConkey y Manitol Sal incubar- rrhoeae
la a 35-#6C en ambiente aerobiosis por 24 horas
- Concluida las 24 horas observar crecimiento
de
colonias
sospechosas,
3.7.2.4 Identificacin de principales
microorganismo
Examen en Fresco: Informar la presencia
de clulas descamativas, leucocitos y bacterias, presencia o ausencia de levaduras
y de trofozooitos de Trichomonas vaginalis.
Gram: Identificar clulas clave, que son clulas descamativas recubiertas por cocobacilos gram variable, Lactobacilos, presencia de polimorfonucleares, levaduras.
Giemsa: Observar cuerpos de inclusin
sugestivas de C. trachomatis. La tcnica citolgica tiene baja sensibilidad, pudiendo confirmar por medio de tcnicas inmunolgicas o ampliacin de cidos nucledos.
3.7.2.4.2 Identificacin de Gardnerella vaginalis

Es un bacilo inmvil no encapsulado de 0.5 por
1.5 a 3 mm, anaerobio facultativo, catalasa y
oxidasa negativo. El diagnostico se basa en la
presencia de al menos tres de cuatro criterios
clnicos por Amsel:1) Descarga fina, blanca adherente y homognea, 2) pH superior a 4.5, 3)
3.7.2.4.1 Identificacin presuntiva de
Prueba de Amina Positiva y 4) Clulas indicadoN. gonorrhoeae
ras o clula clave Tabla No. 15 y Fig. 23
Diplococos gram negativo en pareja, ttradas o Prueba de Aminas: olor caracterstico a pescado
racimo en la tincin de gram, las colonias de color al aadir 1 gota de KOH a una gota de la secrerosada a caf o grisceas y brillantes de 0.5-1.0 cin.
de dimetro en medios agar Thayer Martin, oxidasa positiva. Pruebas suplementarias tpicas de
N. gonorrhoeae son (Tabla No. 14 figura No. 22)
Pg. 48
Tabla No. 15
3.7.2.4.3 Identificacin de Streptococcus agalactiae

Streptococcus agalactiae o Estreptococo grupo
B de Lancenfield, es aerobio facultativo, gram
positivo, diplococo que se agrupan en cadena,
en agar sangre carnero al 5% crecen las colonias de color gris a blanquecino, brillantes y un
poco ms brillantes, produce beta hemolisis Tabla No. 16 y fig. 24.
3.7.2.4.4 Identificacin de Candida

albicans
Se caracteriza por presentar colonias cremosas
de color blanco-amarillento, lustroso poco elevado y de bordes bien definidos Figura No. 25
Tubos germinales
- Suspender un inculo de la cepa pura de candida de 24 horas de desarrollo en plasma humano fresco (plasma EDTA)
- Incubar por 2 horas aproximadamente a 3536C
- Luego colocar dos gotas en un portaobjeto,
cubrir con cubreobjeto, observar al microscopio
con objetivo 40X
- Interpretacin:
Positivo: visualiza una estructura elongada que
se origina a partir de la levadura.
Negativo: se ven las levaduras redondas sin
elongacin.
Tabla No. 16
Pg. 49
3.8 Esputo de cultivo bacteriano

3.8.1 Propsito
El esputo es un material mucoso que se segrega en los pulmones o bronquios. El cultivo de
esputo est indicado para investigar infecciones respiratorias inferiores que pueden causar
neumona, bronquitis o tuberculosis.
La neumona bacteriana o infeccin pulmonar
puede ser causada por:
a. Neumona Neumocccica: el agente causal
es el Streptococcus pneumoniae.
b. Neumona No Neumocccica: el agente causal son Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus
influenzae, y ocasionalmente por otras enterobacterias.
La muestra de esputo es muy importante para
poder realizar una buena identificacin por tal
razn la muestra debe ser tomada adecuadamente y rechazar las muestras que estn contaminadas con saliva.
transporte
Condiciones previas antes de la toma de muestra que el paciente no debe estar con terapia
antibitica, de preferencia la primera muestra
de la maana y no realizar gargarismos con antispticos.
Procedimiento
- Indicar al paciente que se realice un lavado
bucal con agua, no cepillar los dientes con pasta dental
- Que el paciente se acuesta en la cama boca
abajo, que desgarre con fuerza el esputo
- Depositar la muestra en un frasco estril de
boca ancha
- Enviar lo ms pronto posible al laboratorio
Chocolate, Agar Manitol Sal y Agar MacConkey

- Con un asa en argolla flamea y fra proceder
a realizar los estriados a modo de obtener colonias aisladas
- Incubar el Agar Sangre y Chocolate en medio de CO2 y los medios de Manitol Sal y MacConkey en ambiente aerobios a 35-36C
- Realizar frote para tincin de Gram y Ziehl Neelsen
- Proceder a verificar colonias sospechosas de
patogenicidad y realizar pruebas primarias y
confirmatorias, y el antibiograma
Valoracin de la muestras es adecuada tomando en cuenta el criterio de Murria con un frote
teido de Gram.
3.8.3.1 Realizacin del frote del Esputo
- Colocarlo una porcin de la muestra sobre un
portaobjeto y con otro portaobjeto colocarlo encimas y realizar leve presin luego deslizar los
portaobjetos en direcciones contrarias, a modo
de obtener frotes delgados
- Dejar secar, y fijarlos con calor sobre el mechero pasando el portaobjeto tres veces
- Realizar la tinciones solicitadas, tincin de
gram y/o tincin de ziehl neelsen (ver Sec. 2.4)
3.8.3.2 Criterio de Murria
Para evaluar que la muestra este correctamente tomada se debe realizar un frote gram observarlo al microscopio con objetivo seco dbil
(100x) evaluando las siguientes condiciones
segn el criterio de Murray y Washington donde son aceptables las muestras del grupo 4 y 5
Tabla No. 17:
Tabla No. 17

- Proceder a inocular los medios de cultivo teniendo en cuenta todas las medidas de bioseguridad
- Con un palillo estril o asa flameada y fra seleccionar porciones del esputo que contenga
sangre o pus
- Inocular en Agar Sangre Carnero al 5%, Agar
Pg. 50
3.8.4 Identificacin de Principales Microorganismo

3.8.4.1 Identificacin de Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pneumoniae es el agente comn de las enfermedades respiratorias bajas
y altas, tales como neumona y otitis media
aguda, y meningitis.
3.8.4.2 Identificacin de Haemophilus

influenzae
Es el agente etiolgico ms frecuente de enfermedades como neumona, meningitis, otitis media y conjuntivitis. Son bacilos gram negativo,
pequeos o cocobacilos, anaerobios facultativos, requieren factores de crecimiento X y V (X
= hematin, V = nicotinamide adenine dinucleotide(NAD)), crecen en agar chocolate pero no en
agar sangre de carnero y tienen un olor picante
a indol, catalasa positivo, oxidasa positiva Figura No. 26
Pg. 51
4 Anexos
4.1 Prueba de Catalasa
til para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en la mayora de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas
que contiene citocromo, excepto Streptococcus
sp.
Material
- Portaobjeto
- H2O2 al 30%
Procedimiento
- En un portaobjeto colocar una gota de H2O2
al 30%
- Tomar con una asa una colonia pura de 18-24
horas y extender la colonia sobre el agua oxigenada suave
Positivo: formacin de burbujas
Negativo: no se observan burbujas
- Descartar el portaobjeto en recipiente con
desinfectante
4.2 Prueba de Coagulasa

Prueba usada especficamente para diferenciar
las especies del gnero Estafilococos.
La coagulasa es una enzima producida por S.

aureus, estable al calor, resistente a temperaturas arriba de 60C por 30 minutos.
Material
- Plasma EDTA
- Portaobjeto o tubo
Procedimiento
En portaobjetos
- Preparar una suspensin gruesa y bien homognea de cada microorganismo en una solucin salina estril.
- Colocar una suspensin de la bacteria con
una gota de plasma humano o de conejo sobre

un portaobjeto
- Mezclar suavemente con el asa y despus por
rotacin
- Observar si hay aglutinacin microscpica indicando positiva la prueba
Positivo hay aglutinacin dentro 5 a 20 segundos
Negativo no hay aglutinacin dentro de 3-4 minutos
En tubo
- Tubo de vidrio estril colocar 0.5 ml de una
dilucin 1:4 de plasma humano o de conejo
- Tomar una asada de bacterias, rotar suavemente el tubo sin sacudir
- Incubar por 4-6 horas observar a cada 30 minutos a 35C
- No sacudir el tubo en cada chequeo, inclinar el
tubo suavemente para ir observando el coagulo.
Positivo: formacin de un cogulo
Negativo: el plasma permanece lquido y no se
form el cogulo.
4.3 Prueba de Manitol Sal

Procedimiento
- Sembrar la bacteria a estudio en un medio manitol sal
-Incubar a 36C durante 18-24 horas
Positivo: Presencia de crecimiento y cambio de
color amarillo del medio indica utilizacin del
manitol (S. aureus)
Negativo: No hay cambio de color en el medio,
permanece rosado o rojizo. (S. epidermidis )
Pg. 52
4.4 Prueba de DNasa

El Staphylococcus aureus, produce una DNAasa termoestable que hidroliza DNA. La produccin de DNAsa puede determinarse incorporando cido desoxirrubonucleico (DNA) en
agar nutritivo
Material
- Agar nutritivo o agar DNAsa con azul de toluidina 0.1 gr/l
- HCL 1%
Procedimiento
- Inocular la bacteria a estudio en mancha densa sobre el agar nutritivo
- Incubar de 18 a 24 horas
- Revelar con HCL 1% que precipita el DNA
nativo del medio si se usa solo el agar Nutritivo
Interpretacin: Colonias rodeadas por una
zona clara donde el ADN ha sido despolimerizado e hidrolizado es una prueba positiva.
- Si se utiliza Agar DNasa, realizar una siembra
espesa formando un pequeo crculo de aprox.
1 cm
- Incubar a 36C de 18-24 horas ambiente
aerbico
Positivo: produccin de un halo rosado alrededor de la colonia que produce DNAsa.
Negativo: no hay cambio de coloracin en el
medio. Alrededor de la colonia permanece
azul.
4.5 Prueba de Novobiocina

Se basa en que ciertas bacterias son sensibles
a la novobiocina.
Procedimiento
- Realizar una suspensin de la bacteria a estudio en caldo de tripticasa soya al 0.5 de MacFarland
- Inocular en agar Mueller Hinton con la metodologa de Kirby Bauer
- Colocar el disco de novobiocina 5ug
- Incubar a 37 C por 24 horas
- Un dimetro mayor o igual a 16mm de inhibicin considerado como susceptible.
Sensible: S. epidermides
Resistente: S. saprophyticus
Pg. 53
4.6 Prueba de Bacitracina A

Esta prueba til para el diagnstico presuntivo
de Streptococcus beta hemoltico del grupo A
de Lancefield.
Material
- Agar Sangre Carnero al 5%
- Disco de Bacitracina de 0.04 U
Procedimiento
- De una aislamiento puro de la colonia beta
hemoltica, suspender en 1 ml de caldo tripticasa alcanzar una turbidez similar al 0.5 MacFarland
- Con un hisopo realizar el inoculo en un agar
sangre carnero al 5%,
- Proceder a estriar en forma de tapete
- Con una pinza flameada y fra colocar un fisco de Bacitracina 0.04 U (Taxo A) en el centro
- Incubar por 16-24 horas en jarra con candela
- Examinar y observar un halo de inhibicin
alrededor del disco de Taxo A.
4.7 Prueba de PRY (pirrolidonilarilamidasa)

Es una prueba presuntiva tanto Estreptococos
del grupo A como del grupo D. Reemplaza la
prueba de Bacitracina y la prueba de tolerancia a la sal para Estreptococos del grupo A y
especies de Enterococo respectivamente. La
enzima detectada es la pirrolidonil arilamidasa
Procedimiento
- Inocular la bacteria a estudio en caldo de que
contenga PYR L-pirrolidonil-b-naftilamida

- Incubar por 4 horas a 35C
- Luego agregar un colorante diazo (NN-dimetil-amino-cinamaldehdo)
Positivo: un desarrollo de color rojo positivo
(Estreptococos del grupo A y Enterococos)
Negativo: no hay cambio de color o se observa
un color naranja
Nota: algunos estafilococos pueden dar positiva
la prueba.
4.8 Prueba de CAMP

Prueba para identificacin presuntiva de Estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae beta hemolitico), es el nico que produce
una prueba de CAMP positiva. La prueba detecta una protena extracelular estable al calor
difusible producida por Estreptococos del grupo
B que mejora la hemlisis de eritrocitos por el
Staphylococcus aureus.
Material
- Cepa ATCC S. aureus ATCC 25923
- Agar Sangre de Carnero 5%
Procedimiento
- La cepa de S. aureus ATCC 25923 rayar una
lnea recta a travs del centro de la placa de
Agar Sangre Carnero.
- Perpendicular a la raya del S. aureus realizar
el inoculo de la bacteria a estudio realizando
una lnea recta de 2-3 cms de longitud, pero sin
tocar.
- Incubar la placa a 37C durante 18 24 horas, en ambiente aerbico.
Positivo: aparece como hemlisis punta de
flecha entre la unin del crecimiento del S.
aureus y Estreptococos del grupo B.
Negativo: no se observa la formacin de flecha
de hemlisis.
Pg. 54
Procedimiento
- Una colonia aislada, sembrar en estra en la
zona del pico de flauta.
- Incubar a 35-36C durante 24-48 horas
Interpretacin
La aparicin de un color castao oscuro o negro en el medio indica hidrlisis de la esculina. Si no hay cambio se considera negativa la
prueba
4.9 Prueba de Hidrlisis de Hipurato

Detectar la capacidad de la bacteria de hidrolizar el hipurato mediante la enzima hipuricasa. La hidrlisis de hipurato dar como resultado glicina, que reaccionara con la ninhidrina
provocando un cambio de color.
Material
- Tubos con 0.4 ml de hipurato de sodio al 1%
Procedimiento
- Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sdio con el microorganismo
- Incubar por dos horas 36-37C
- Agregar 0.2 de ninhidrina, si agitar
Positivo: Color morado fuerte ( S. agalactiae)
Negativo: no hay cambio de color (S. faecalis)
4.11 Crecimiento de NaCl 6.5%

Diferenciacin de Streptococcus del grupo D
con respecto a Enterococos.
Procedimiento
- Inocular 2 3 colonias del microorganismo
en el medio de caldo tripticasa soya + 6.5% de
NaCl
- Incubar a 35C por 24-48 horas
- Observar el caldo de cultivo
Positivo: turbidez (enterococos)
Negativo: limpio no se observa crecimiento
4.10 Bilis Esculina

Propiedad de algunos microorganismos de hidrolizar el glucsido esculina en esculetina y
glucosa, la esculetina producida reacciona con
un sal de hierro incorporada al medio, dando
un color castao oscuro o negro.
Pg. 55
- Agregar 0.5 ml de solucin salina al otro tubo

Control
4.12 Prueba de Sensibilidad a Optoqui- - Agitar suavemente ambos tubos e incubarlos a
na
35C por 3 horas
La prueba se utiliza un disco de 6mm con 5ug Positivo: Desaparece la turbidez del tubo prueba
de optoquina, tiene como objetivo diferenciar (S. pneumoniae)
Streptococcus pneumoniae de las de Estrepto- Negativo: permanece turbio.
coco viridans.
En Agar
Procedimiento
- Colonias aisladas en un agar sangre de car- Inocular una colonia alfa-hemoltica con un asa nero, agregar una gota de deoxicolato de sodio
estril en una placa de Agar Sangre Carnero al al 2% (diluir el reactivo al 10% 1:10 con agua
5%, extender la bacteria.
destilada)
- Colocar aspticamente un disco de optoquina - Sin invertir la caja incubar a 35C por 30 minuo disco P sobre el estriado.
tos
- Incubar en ambiente de CO2 por 18-24 horas Positivo: las colonias desaparecen dejando una
a 36C.
zona de hemlisis parcial en el rea donde se
- Interpretar los resultados
encontraban. (S. pneumoniae)
Sensible: presencia de un halo mayor a 14mm Negativo: Las colonias son insolubles y perma(S. pneumoniae), si se usa disco de 10 mm el necen intactas. (Estreptococos del grupo virihalo ser mayor o igual a 16mm
dans)
Resistente: No hay presencia de halo de inhibicin son estreptococos viridans
4.13 Solubilidad en Bilis

La prueba de solubilidad en bilis es otra prueba
para identificacin de S. pneumoniae.
Procedimiento
En tubo
- Transferir 0.5 ml de un cultivo de 18-24 horas
de un caldo TOdd Hewitt a dos tubos limpios.
- Agregar una gota de rojo de fenol a cada uno
de los tubos
- Ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1N
- Agregar 0.5ml de doxicolato de sodio al 10% a
uno de los dos tubos (Prueba)
4.14 Prueba de Satelitismo

Se conoce como satelitismo al fenomeno de
H. influenzae de crecer en colonias diminutas
cercanas a una bacteria productora de factor V
cuando se cultiva en agar sangre de carenro.
Esto ocurre generalmente con Staphylococcus
beta hemoltico porque produce altas cantidades
de factor V (NAD).
Procedimiento
-En un agar Sangre de Carnero al 5% estriar en
toda la superficie en una sola direccin de Haemophilus.
Pg. 56
- Tomar una asada de un cultivo de Staphylococcus aureus o beta hemoltico, realizando

una estria perpendicular al sembrado.
- Incubar en jarro con canderla o en CO por 24
horas a 36C,
- Luego examinar el crecimiento de pequeas
colonias puntiformes muy cerca de la estria de
estafilococo.
5 Bibliografa
4.15 Factor de Crecimiento XV

Esta prueba de utilizar medios sin factor X y V,
como agar de soya basa triptona o agar caldo
infusin de corazn.
Material
- Caldo de tripticasa soya o Caldo de infusin
de Corazn
- Agar de Soya base Triptona o Agar Caldo Infusin de Corazn
- Discos de Factores X, V y XV
Procedimiento
- Preparar en un caldo adecuado (caldo tripticasa soya o caldo infusin de corazn) una suspensin densa de clulas a evaluar al 0.5 del
estndar del McFarland
- Inocule una placa de Agar de Soya base Triptona o Agar Caldo Infusin de Corazn, con un
hisopo o asa estril, estriar la suspensin sobre
el agar en dos direcciones
- Colocar los discos de papel que contienen los
factores X, V y XV despus del inoculo se haya
secado
- Invertir la placa con cuidad y ponerla a incubar
en ambiente de CO2 o en una jarra con vela,
durante 18-24 horas a 35C.
- H. influenzae crecer alrededor del fisco XV
1. Alados, JC., et al. Procedimientos en Microbiologa Clnica. Diseo de un laboratorio de Microbiologa

Clnica. Recomendaciones de la Sociedad Espaola
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Pg. 59
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TAMIZAJE, AISLAMIENTO,

IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD DE MICOBACTERIAS
Rosa Alvarez, Diana Baldizon
Margarita Boloix, Hctor Cat
Lis Jerez, AnaLucia Lemus
1. INTRODUCCION
En la ltima dcada, la tuberculosis (TB) ha resurgido como una de las mayores causas de muerte
ya que anualmente se registran cerca de 3 millones; en 1995 caus ms de 75,000 muertes en
Latino Amrica y el Caribe, lo cual significa que cerca de 1,100 personas enfermaron y ms de
200 murieron por TB cada da. Se estima que existen 8.8 millones de nuevos casos cada ao
que corresponden a 52,000 muertes por semana o ms de 7,000 cada da, lo que se traduce en
ms de 1,000 nuevos casos cada hora, cada da. Estas tasas de muerte reflejan solo parcialmente la tendencia global de la TB, ya que ms del 80% de los pacientes se encuentran en la edad
econmicamente activa (15 49 aos). Se estima que en el ao 2000, 2 mil millones de personas
se encuentran infectadas con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium, 3 millones de
personas mueren anualmente por complicaciones de tuberculosis en todo el mundo. Se calcula
que hay 8 millones de nuevos casos cada ao, el 95% de los cuales aparecen en pases en vas
de desarrollo. En los pases industrializados, el 80 % de los casos aparecen en personas mayores
de 50 aos; en los pases en vas de desarrollo el 80% se produce entre los 15 y los 50 aos. Se
estima que 3 millones de personas que padecen tuberculosis tambin tienen VIH/SIDA.
Existen factores predisponentes en los pases en vas de desarrollo como:
Inmigracin de personas de zonas de alta endemicidad.
Condiciones socioeconmicas bajas en ciudades con alta poblacin.
Aumento de personas infectadas con VIH/SIDA.
Durante las primeras dcadas del siglo XX, se dio una disminucin progresiva de la incidencia de
la tuberculosis, y alcanz su menor nivel a comienzos de la dcada de 1980. Muchos microbilogos pensaron que la tuberculosis estaba por ser vencida, dado que la enfermedad alcanz la
lnea basal de cero en muchas partes del mundo a fines de la dcada de los 70s. Pero sucedi
todo lo contrario.
Actualmente las tasas de morbilidad y mortalidad han aumentado, con el aparecimiento de cepas
resistentes de Mycobacterium a mltiples drogas y por el VIH/SIDA.
Para Guatemala la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) report una tasa de incidencia de 80
por cada 100,000 habitantes en el ao 2000.
La epidemia del Sndrome de Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y el descenso de los estndares socioeconmicos, entre otros, contribuyen al resurgimiento de
la enfermedad en pases industrializados. Aunque en la mayora
de los pases en desarrollo, la TB ha sido siempre endmica, su
severidad se ha incrementado debido a la pandemia del Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH) y a los niveles de pobreza imperantes. La situacin de la TB a nivel mundial se ha agravado con
el aparecimiento de cepas multirresistentes a las drogas antituberculosas, que incrementan las tasas de mortalidad y representan
un serio problema para el control de esta enfermedad, por ello la
realizacin de una susceptibilidad antibitica con un perfil delimitado de antibiticos es de gran ayuda para poder evitar y/o disminuir
la multirresistencia y poder brindar tratamientos efectivos.
Pg. 60
La TB puede ser tanto pulmonar, que es la ms

comn y ocurre en ms del 80% de los casos,
2. GENERALIDADES
como extrapulmonar. Es importante mencionar
La TB es una enfermedad infecciosa aguda o que aproximadamente un 90% de las personas
crnica que en nues- que se infectan nunca desarrollan la enfermetro medio es la infec- dad ya que el bacilo permanece dormido dencin humana ms im- tro del organismo del husped y su presencia
portante causada por (infeccin) puede determinarse por una reacmicobacterias puede cin positiva a la prueba tuberculnica PPD
afectar a cualquier (derivado proteico purificado). Adems es netejido del organismo cesario poder determinar la presencia de la enpero generalmente se fermedad para poder minimizar la cantidad de
localiza en los pulmo- pacientes con cepas resistentes a los medicanes por la inhalacin mentos antituberculosos y poder disminuir con
del agente causal que por lo general es Myco- ello la cantidad de enfermos bacilferos crnicos
bacterium tuberculosis (muy rara vez M. bovis o en las comunidades.
M. africanum). El nombre de Tb deriva de la formacin de unas estructuras celulares caracte- 3. PROPSITO E IMPORTANCIA
rsticas denominadas tuberculomas, donde los
bacilos quedan encerrados. Este microorganis- La finalidad primordial es demostrar por medio
mo, tiene forma bacilar, es aerobio estricto, de de coloraciones, pruebas de tamizaje, cultivos
crecimiento lento, inmvil, no poseen cpsula especiales y pruebas de identificacin la preni producen esporas, se tie con dificultad por sencia de bacterias que pertenecen al gnero
su contenido alto de grasas en la pared celular Mycobacterium, especialmente Mycobacterium
por lo que el colorante a utilizar debe poseer tuberculosis. Aproximadamente doce especies
fenol y/o realizarse con calor por lo que una vez de ste gnero se asocian a infeccin humana,
teidas con fuchsina carblica (fenolada) no se pero en nuestro medio Mycobacterium tubercudecoloran al agregar el alcohol acidificado y de losis es la especie de mayor importancia.
all el trmino Bacilos alcohol cido resisten- La deteccin de micobacterias es una gran restes (BAAR). Es resistente al fro, la congela- ponsabilidad para el laboratorio de microbiolocin y desecacin. Es muy sensible al calor, la ga, ya que un resultado positivo de frote o cultiluz solar y ultravioleta. Se divide lentamente, vo implica serias consecuencias para el paciente
y afecta su vida con un tratamiento especfico
por lo que su crecimiento es lento.
por varios meses, o incluso aos; por lo que un
La TB se transmite de un enfermo con tubercu- resultado positivo debe informarse de inmediato
losis pulmonar a otras personas por medio de al mdico responsable. Se debe tener todo el
pequeas gotitas que el paciente expulsa, al to- cuidado de no confundir las muestras, especialser o estornudar. El riesgo a infectarse depen- mente cuando hay en grandes cantidades; se
de de la concentracin de gotitas en el aire y recomienda trabajarlas de cinco en cinco. Esto
del perodo de tiempo que se respire; se reduce evitara que se den resultados falsos ya que los
mediante la renovacin del aire, por ventilacin mismos traeran serias consecuencias para el
paciente.
del exterior y
por la expo3.1. TUBERCULOSIS PULMONAR Y TUsicin a la luz
BERCULOSIS EXTRAPULMONAR
solar o rayos
El diagnstico de la TB extrapulmonar depende
ultravioleta.
de la probabilidad de encontrar los bacilos en
Cada enfermo
los sitios de infeccin, los cuales se encuentran
puede contaen cantidades muy pequeas, excepto si hay
giar a 10 a 15
caseificacin o formacin de cavidades,
personas.
Pg. 61
4.1. Nivel I
las biopsias del tejido pueden rendir resultados
positivos en comparacin a los fluidos en donde
el nmero de los bacilos se ve disminuido por la
dilucin. El diagnstico de la TB extrapulmonar
es difcil a menudo por su localizacin en sitios
del organismo de acceso complicado, adems
el carcter serio de esta forma de tuberculosis
se debe frecuentemente a su diagnstico tardo.
Previo a la
pandemia del
VIH, aproximadamente
el 15% de
los
nuevos
casos de TB
eran
extrapulmonares.
Estos casos
son de difcil
diagnstico, dado que son menos comunes a
los mdicos y porque los sitios de infeccin son
menos accesibles y visibles. La TB extrapulmonar ms frecuente son la linftica, pleural, genitourinaria, miliar, sea, menngea y peritoneal.
Los pacientes con TB pulmonar activa son altamente infecciosos para otros pacientes y para
el personal de cuidados de salud, como ya se
ha mencionado en la parte de introduccin del
presente trabajo. Este tipo de transmisin se
asocia a desarrollo rpido de la enfermedad en
unas cuatro semanas, con mal pronstico. De
igual manera este tipo de transmisin contribuye en los casos de alta resistencia.
.
El aumento de casos de Tb extrapulmonar, crea
la necesidad de un mejor diagnstico y nuevas
tcnicas para el aislamiento y susceptibilidad
micobacteriana, estableciendo como punto crtico el menor tiempo posible para el aislamiento
y la informacin sobre la drogo resistencia de
las micobacterias.
4.NIVELES DE LABORATORIO
Los niveles de laboratorio en micobacteriologa
han sido adoptados por la Sociedad Torcica
Americana (American Thoracic Society), la cual
ha establecido tres niveles de la siguiente manera:
Realiza lo siguiente:
a. Recoleccin de muestras clnicas adecuadas
(incluyendo esputo inducido por aerosol).
b. Transporte y envo de muestras a un laboratorio de nivel superior para el aislamiento e identificacin.
c. Puede preparar y examinar frotes para el
diagnstico presuntivo y/o como monitoreo del
progreso de los pacientes diagnosticados que
estn siendo tratados con medicamentos.
4.2. Nivel II
Adems de todas las funciones del laboratorio
Nivel I, realiza lo siguiente:
a. Procesa muestras para su cultivo en medios a
base de huevo y medios a base de agar y huevo.
b. Identificacin de Mycobacterium tuberculosis
c. Puede realizar estudios de susceptibilidad antimicrobiana con drogas antituberculosas primarias
d. Retiene cultivos de micobacterias para test
adicionales o repeticin de pruebas (se recomiendan 6 meses de retencin)
4.3. Nivel III
Adems de las funciones de los laboratorios I y
II, realiza lo siguiente:
a) Identificacin de todas las especies micobacterianas de muestras clnicas
b) Puede realizar estudios de susceptibilidad
antimicrobiana de micobacterias
c) Puede dirigir investigaciones y brindar entrenamiento.
5. TOMA DE MUESTRA Y PROCEDIMIENTOS POR TIPO DE MUESTRA
TOMA DE MUESTRA
Actualmente se realiza la implementacin de
tcnicas que producen resultados exactos y precisos en menor tiempo. El motivo principal es el
mejoramiento de la calidad del servicio que se le
presta al paciente y al sistema hospitalario.
Pg. 62
Para lograr esto es necesario que todo el personal mdico y de enfermera encargado de
la obtencin y extraccin de muestras conozca
los procedimientos estandarizados para tales
propsitos, a manera de evitar falsos resultados.
mal que contamina la orina a su paso, de tal

manera que la orina por miccin contiene un
pequeo nmero de bacterias. Debido a que es
necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los etiolgicamente importantes,
se debe de efectuar un examen cuantitativo de
orina para que los resultados puedan ser significativos.
Para una seleccin y recogida correctas de material de cultivo es necesario comprender las localizaciones, variedades y papel de la microbiota normal de la regin urinaria.
5.1.2. Toma de Muestra
La toma de muestra de orina es muy importante, pues la veracidad de los resultados depende
casi en un 100% de la forma correcta en la cual
se recolect la muestra.
Es preciso entonces, establecer la responsabilidad e importancia de la TOMA DE MUESTRA,

ya que resulta ser la clave en el aislamiento de TABLA No 1. BACTERIAS COMUNES EN
cualquier microorganismo, depende de esta en VIAS GENITO-URINARIAS
un 100% obtener resultados satisfactorios, en
menor tiempo, lo que conduce a un tratamiento
efectivo del paciente.
Para obtener un buen resultado en el aislamiento de microorganismos, en especial de
micobacterias, es preciso comenzar con una
buena toma de muestra, tener una buena estandarizacin en el preparado de medios de
cultivo, con los que se har el aislamiento correcto para tener una identificacin posterior. La
pureza del aislamiento determinar el xito de
la sensibilidad y por consiguiente del tratamiento del paciente.
5.1. MUESTRAS DE ORINA
5.1.1. Propsito e importancia
En la actualidad, el examen de micobacterias
en la orina se hace cuando hay signos o sntomas de una tuberculosis renal, insuficiencia
renal o hipertensin. Debe hacerse siempre en
personas, en que se sospecha infeccin general y ya ha sido comprobado que no es de tipo
bacteriano, o tengan antecedentes de tuberculosis.
Washington JA. Bacteriologa Mdica. En Lynch MM
La orina excretada por el rin es estril a me- Diagnstico Clnico por el laboratorio
+/- Irregular
+ comn ++ predominante
nos que el rin este infectado. La orina de la
vejiga no contaminada tambin es estril. Sin
embargo, la uretra contiene una microbiota norRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 63
5.1.2.1. Chorro medio u orina al vuelo

Hombre:
Limpiar el meato urinario con agua y jabn.
Colectar la orina a la mitad de la miccin en
un recipiente estril tratando de que la orina no
toque la boca del frasco.
Llevar la orina al laboratorio.
inyectar la muestra en un tubo expulsando las

burbujas de aire que pueda contener la jeringa,
y se lleva de inmediato al laboratorio.
Este tipo de muestra constituye la nica muestra de orina aceptable para cultivos anaerobios,
se indica nicamente en pacientes con bacteriuria anaerobia. Este tipo de infeccin es rara
y se sospecha su existencia cuando aparecen
cultivos negativos de especimenes con frotes
positivos para tincin de Gram.
Mujer:
Limpiar la vulva con bastante agua y jabn,
teniendo cuidado de quitar bien el jabn.
Secar el rea.
Separando los labios, colectar la orina a la mitad de la miccin en un recipiente estril tratando de no topar la boca del frasco con los labios.
Llevar la orina al laboratorio.
5.1.2.4. Catter
Nios:
En los nios pequeos para evitar al mximo
la contaminacin es necesario limpiar la regin
genital con agua y con jabn y/o con solucin
salina.
Colocar la bolsa estril sobre la regin.
En el momento de obtener la muestra, retirar
cuidadosamente la bolsa, de manera que la orina no se escurra.
Cerrar la bolsa y llevar inmediatamente al laboratorio.
Como se mencion con anterioridad la orina es

estril, pero tambin puede encontrarse contaminada con alguna bacteria adems de encontrarse presente la micobacteria. Por lo que toda
muestra de orina debe pasar por un proceso de
decontaminacin.
5.1.2.2. Sondas permanentes
NO es aconsejable debido al riesgo de bacteriuria asociada al procedimiento. El riesgo es del

1% en hombres y mujeres ambulatorias, y hasta
el 20% en mujeres en trabajo de parto.
5.1.3. Procesamiento de la muestra
5.1.4. Requerimientos e instrucciones

especiales de muestra de orina
a. Recolectar 40 ml de orina como mnimo
b. No debe ser recoleccin por fracciones, ni orina de 24 horas
c. La primera orina de la maana
d. Tomarla con todas las medidas aspticas sealadas con anterioridad
e. Utilizar un frasco estril, de boca ancha.
f. Si se trata de un beb se tomar en una bolsita peditrica.
g. El protocolo de evaluacin es enviar cinco
muestras de forma seriada
En caso de tenerse un catter a permanencia

con un sistema cerrado de coleccin, obtener
la muestra:
a. Limpiar el rea del catter o sonda con antisptico.
b. Utilizando una aguja y jeringa estriles introducir en el rea desinfectada.
c. Dejar la muestra dentro de la jeringa. NO
trasvasar a un recipiente estril.
5.1.5. Preparacin de la muestra pred. NO recolectar la muestra de la bolsa o des- vio a la elaboracin de frotes
conectando el catter del tubo de recogida.
a. Mezclar cuidadosamente la muestra a mane5.1.2.3. Puncin o aspirado suprapbi- ra de obtener una muestra representativa
co
b. Transferirla a un tubo con tapn de rosca. Utilizar la mayor cantidad posible
En este procedimiento se obtiene la muestra. c.Centrifugarla por 15min a 3000rpm
Directamente de la vejiga. Se recolecta con
aguja y jeringa estriles; se efecta la puncin;
Pg. 64
tivo para la recuperacin de micobacterias de

muestras sanguneas y MO. El medio incluye
d. Descartar el sobrenadante con cuidado de un agente ltico (saponina), SPS y otros supleno perder la mayor cantidad de sedimento
mentos que eliminan el paso de procesamiento,
e. Tomar con una pipeta de vidrio 1 gota del se- evitan la coagulacin de la sangre y mejoran
dimento y colocarla en un portaobjetos, esperar el crecimiento de las micobacterias. Se puede
a que se seque dentro de la campana (repetirlo inocular directamente un volumen de 3 a 5 ml
por 3-5 veces) a manera de obtener un frote de sangre, y se incuban entre 35C 36C.
que contenga una cantidad representativa
Las botellas contienen 29 ml de medio y un senf. Esperar a que se seque por lo menos 10 mi- sor interno que detecta dixido de carbono como
nutos para evitar que se lave al teir
indicador de crecimiento microbiano. El sistema
registra lecturas cada 10 minutos.
5.2. MUESTRAS DE SANGRE Y MDULA SEA
REACTIVOS
En condiciones normales la sangre y la mdula
sea (MO) son estriles. Debido a que la piel
normal est cubierta de abundante microbiota
normal es muy importante tomar la muestra en
condiciones totalmente aspticas.
NOTA IMPORTANTE: Todos los especmenes deben de considerarse potencialmente
infecciosos, por lo que deben de tenerse en
cuenta las medidas universales para
su manipulacin y desecho adecuado.
Observaciones importantes
La recuperacin de micobacterias en
un hemocultivo depende de los siguientes factores:
Obtencin de la muestra de sangre en condiciones aspticas.
Cantidad de sangre cultivada y momento de la
toma de muestra.
La relacin entre la sangre y el caldo de cultivo, la cual debe ser 1:10, es decir sangre al
10%.
Se debe de tomar el hemocultivo antes de iniciar un tratamiento con antibiticos
5.2.1. Medio de cultivo para aislamiento de micobacterias de muestras de
sangre y Mdula sea
a. Botellas de tapn negro

BacT/Alert MB: frascos estriles y desechables, contienen 29
ml de medio y un sensor interno
que detecta dixido de carbono
como indicador del crecimiento
bacteriano. NO AIREAR LAS BOTELLAS. El medio contiene:
Caldo Middlebrook 7H9 (0.47%
p/v)
Sntesis pancretica de casena
(0.1% p/v)
Glicerol (1.0% p/v)
SPS (0.025% p/v)
Agua purificada
b. Lquido de enriquecimiento MB7BacT: El contenido total del frasco es de 5.5 ml. Se
compone de:
Albmina srica bovina (14.5%
p/v)
Cloruro Sdico (2.5% p/v)
cido oleico (0.174 % p/v)
Saponina (4.4% p/v)
Agua purificada
c. Suplemento de antibiticos: Requiere de dos componentes los cuales
se complementan:
Botellas de tapn negro para aislamiento de micobacterias tanto de sangre como de MO. Las
botellas BacT/ALERT MB en combinacin con
el Lquido de enriquecimiento y el suplemento
de antibiticos son un medio de cultivo selecRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 65
vena y obtener aspticamente 3ml-5ml de sangre.

g. Inyectar la sangre en la botella que contiene
el caldo. Se debe de inyectar la sangre suavemente sin hacer presin en el mbolo, de manera que se evite la hemlisis que puede interferir
en el momento de la interpretacin de la positividad del cultivo.
h. Despus de obtenida la muestra, llevar los
frascos al laboratorio lo ms rpidamente posible. Antes de transcurridos 30 minutos. En el
Conservacin del medio de cultivo Botellas para transcurso de este tiempo se le debe agregar
obtencin de la muestra.
tanto el suplemento antibitico como el lquido
Conservar los frascos en un lugar seco, fres- de enriquecimiento, una vez transcurrido este
co, en oscuridad y a temperatura ambiente. NO tiempo, no tendr ningn valor para la muestra
REFRIGERAR. Una exposicin prolongada a el agregar ambos constituyentes.
la luz directa podra alterar el indicador fluores- i. NO REFRIGERAR por ninguna razn.
cente.
j. Colocar la identificacin correspondiente en el
Por ningn motivo deben de airearse las bote- frasco utilizando NICAMENTE la zona desllas.
tinada para ello. NO COLOCAR MASKING
TAPE, MICROPORE, o cualquier otro tipo de
5.2.2. Toma de muestra de sangre y tape alrededor del frasco.
Mdula sea
Procedimiento para toma de muestra de Mdula
Procedimiento para toma de muestra de sangre sea.
por venopuncin.
a. Las muestras de mdula sea para cultivo
a. Tomar la botella para micobacterias. Revisar de micobacterias siempre deben ser obtenidas
y examinar los frascos con el fin de eliminar por el mdico, quien puncionar el esternn o
cualquier frasco que presente signos de con- la cresta ilaca. Procesar exactamente igual que
taminacin o defectos. Identificar con los datos para muestra de sangre.
del paciente.
b. Tomar la muestra tomando todas las medidas
b. Tomar la botella, Retirar la cpsula o tapn aspticas necesarias
de proteccin que se encuentra en el tapn del c. De la PRIMERA FRACCIN obtenida inofrasco. NO DESCARTARLA, y con algodn cular las cajas de petr que contienen agar Saempapado en solucin yodada al 3% en alco- bouraud, Micosel y Micosel con sangre ya que
hol (tintura) limpiar perfectamente bien el tapn sta es la porcin ms rica en lo que a celulariperforable. Dejar secar mientras se atiende al dad se refiere.
paciente.
d. De la SEGUNDA FRACCIN inocular un
c. Extraer las muestras de manera asptica con volumen de 3 a 5 ml en las botellas para culel fin de reducir los riesgos de contaminacin. tivo BacT/ALERT MB que en combinacin con
Utilizar en general una jeringa o un dispositivo el Fluido de enriquecimiento y el suplemento de
de toma de muestra con cnula
antibiticos son un medio de cultivo selectivo
d. Colocar la ligadura en el brazo del paciente; para la recuperacin de micobacterias de muespalpar la vena y localizar exactamente el sitio tras sanguneas y otros lquidos
de la puncin.
e. Si va a llevarse en jeringa debe ser la mayor
e. Limpiar el sitio exacto donde se localiz la cantidad posible con un anticoagulante como
vena con un algodn empapado de tintura de SPS heparina en relacin 1:1 (No utilizar
yodo al 3%. con movimientos en crculo, hacien- EDTA)
do una espiral que inicia en el sitio de puncin f.Transportarlas a temperatura ambiente al laboy termina en la parte de afuera. NO vuelva a ratorio durante la primera hora luego de la toma
palpar la vena. Dejar secar.
de muestra (NO REFRIGERARLAS)
f. Con aguja y jeringa estriles, puncionar la
Manejo del suplemento antibitico ya
reconstituido:
Reconstituir con 10 ml del lquido reconstituyente.
Guardar en refrigeracin una vez reconstituido
de 2-8C
Es estable 7 das despus de reconstituido.
Un vial de 10 ml de antibitico reconstituido
alcanza para 20 botellas.
Pg. 66
5.2.3. Precauciones para el uso de los

frascos
a. Los frascos de cultivo de micobacterias son
para uso in vitro.
b. Antes de utilizarlos los frascos deben ser
observados. NO utilizar frascos que presenten
signos de contaminacin, Ej.: color amarillo o
turbidez. No utilizar frascos que presenten algn dao.
c. No pegar nada sobre la ventana de lectura,
y tampoco sobre el cdigo de barras. Utilizar
UNICAMENTE la zona de identificacin.
d. No descartar la cpsula o tapn de proteccin. Colocarla en el frasco nuevamente despus de haber inoculado ste.
e. Antes de inocular la botella desinfectar el tapn con alcohol o solucin yodada.
f. Inyectar aspticamente con la aguja montada
en la jeringa, el volumen necesario de sangre,
teniendo cuidado de NO PRODUCIR HEMLISIS ya que esta interfiere en la lectura de los
frascos.
g. Los frascos inoculados deben de ser transportados al laboratorio en el menor tiempo posible.
h. NO ABRIR EL FRASCO POR NINGN
MOTIVO.
5.2.4. Tratamiento de la muestra en el
laboratorio
Una vez que la botella ha sido ingresada correctamente al laboratorio proseguir de la siguiente
manera:
a. Chequear que los datos del paciente estn
completos, tanto en la papeleta de ingreso
como en la botella.
b. Identificar las pruebas que se le realizarn a
la botella y si es el medio adecuado para ello.
Botellas de tapn negro para cultivo y aislamiento de micobacterias.
c. Retirar la tapa de proteccin y limpiar con alcohol el tapn perforable.
d. Agregar 1.0 ml de lquido de enriquecimiento
con una jeringa estril en forma asptica.
e. Posterior al lquido de enriquecimiento, agregar 0.5 ml de Suplemento de antibitico (esta
solucin debe de sacarse de la refrigeradora y
alcanzar la temperatura ambiente) con una jeringa estril en forma asptica.

f.NO DEBEN DE TRANSCURRIR MAS
DE 30 MINUTOS PARA AGREGAR EL
LIQUIDO DE ENRIQUECIMIENTO Y EL
SUPLEMENTO ANTIBITICO, DESDE
EL MOMENTO EN QUE FUE TOMADA
LA MUESTRA. Un mayor tiempo puede alterar los resultados.
g. Luego de haber tratado las botellas (lquido
de enriquecimiento y suplemento antibitico)
introducir la botella en el equipo BacTAlert 3D y
registrarlo, asignndole una posicin.
h. Registrar la posicin y completar la hoja de
registro con los datos correspondientes.
i. Llenar la hoja de trabajo adjuntando la papeleta y colocarla en su cartapacio respectivo.
j. Leer diariamente la botella durante 42 das.
k. Si el equipo da alarma de positivo, sacarlo y
colocar en la hoja de registro la fecha y la hora
a la cual dio positivo. Hacer frote de Ziehl Neelsen y reportarlo.
l. Si el cultivo es negativo, luego de 42 das de
incubacin, hacer un frote de ZN al caldo de
la botella, si es negativo, reportarlo negativo.
Anotar en la hoja de registro la fecha y la hora.
5.2.5. Preparacin de la muestra previo a la elaboracin de frotes
SANGRE Y MDULA SEA
a. Transferir a un tubo estril con tapn de rosca
b. Centrifugar la mayor cantidad de la muestra
posible por 15min a 3000rpm
c. Descartar el sobrenadante con mucho cuidado porque la mayor de la parte como su nombre lo indica es lquida
d. Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar el frote
e. Si es Lquido Cefalorraqudeo: tomar con
una pipeta de vidrio 1 gota del sedimento y colocarla en un portaobjetos, esperar a que se
seque (repetirlo por 3-5 veces)
f.Hacer la tincin
5.3. MUESTRAS DE LQUIDO CEFALORRAQUDEO, LAVADOS Y OTROS LQUIDOS CORPORALES
Pg. 67
El diagnstico rpido, temprano y preciso de

meningitis tiene un lugar predominante entre las urgencias mdicas. Depende en alto
porcentaje de mantener un elevado ndice de
sospecha, de obtener en forma adecuada las
muestras y examinarlas a la mayor brevedad.
Debido al elevado riesgo de muerte y/o dao
tisular irreversible, a menos que se inicie un tratamiento inmediato, rara vez hay una segunda
oportunidad de obtener una segunda muestra
pretratamiento, lo que hace esencial la primera
muestra para el diagnstico etiolgico especfico y ptima atencin al paciente.
El dato diagnstico ms urgente es la diferenciacin entre la meningitis bacteriana purulenta
y la meningitis granulomatosa y la meningitis
viral.
Las muestras que se incluyen dentro de Lquidos corporales son:
Lquido cefalorraqudeo (LCR)
Lquido ventricular
Lquido abdominal (peritoneal, de paracentesis, dilisis biliar)
Lquido pleural, toracentesis y empiema (obtenidos de trax)
Lquido pericrdico
Lquido sinovial
5.3.2. Toma de muestra para Lquido
Cefalorraqudeo
La puncin lumbar se lleva a cabo con tcnica
asptica estricta, teniendo cuidado de no provocar compresin del bulbo por extraccin rpida del lquido cuando la presin intracraneana
esta notablemente elevada.
El LCR usualmente se colecta en 3 o 4 partes,

de 2 a 5ml cada una, en tubos o recipientes estriles. Esto permite el examen ms conveniente y de ms confianza para los distintos valores
que determinan la conducta a seguir por el mdico.
El anlisis bsico efectuado al LCR y al Lquido
pleural y otros lquidos corporales:
Cultivo de rutina
Cultivo para tuberculosis y hongos.
Anlisis qumico (protenas y glucosa)
Anlisis fsico y citolgico (aspecto del lquido,
recuento de clulas, frmula diferencial).
Pruebas de ltex para deteccin de antgeno
de Cryptococcus neoformans.
5.3.3.
Requerimientos e instrucciones para el procesamiento de la
muestra
Lquidos corporales
5-10 ml como mnimo (enviar el mximo de
volumen posible)
Obtenido en condiciones aspticas
En recipiente estril
Enviar la muestra fraccionada para otros exmenes microbiolgicos
Lavados
5-10 ml como mnimo
Recipiente estril y desechable
En ayunas (para asegurar coleccionar la
muestra que ha sido tragada durante el sueo)
El Broncoscopio debe estar estril (evitar contaminar con agua de chorro por las micobacterias saprofticas)
5.4. MUESTRAS DE HECES
Demostrar por medio de cultivo, la presencia
de micobacterias. Es decir, micobacterias que
infectan el intestino. Esto causa diarrea, dolor
abdominal, fiebre y en ocasiones la muerte.
Es importante que en pacientes con VIH/SIDA
se realice un diagnstico diferencial de la siguiente manera, utilizando las siguientes tinciones:
Pg. 68
Recipiente estril (frasco o caja de petri de vidrio sellado (a))

No sumergir las muestras en solucin salina,
formol o formalina

para el procesamiento de la muestra
de heces
1 gr. aproximadamente
En recipiente estril, desechable y de boca ancha
Llevar inmediatamente al laboratorio
5.4.3. Preparacin de la muestra de
heces para la elaboracin de frotes
Observar las caractersticas de la muestra y
buscar la parte dnde se encuentre mucoso o
con estras de sangre
De esta muestra suspender 1 gramo aproximadamente en 2-5ml de caldo 7H9 Middlebrook, solucin salina o agua destilada estril
en un tubo estril
Agitar en vrtex por 5min
Centrifugar por 15min a 3000rpm
Descartar el sobrenadante con cuidado de no
perder la mayor cantidad de sedimento
Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar el frote
Hacer la tincin
Si no se observan BAAR NO procesar la
muestra para cultivo
5.5. MUESTRAS DE BIOPSIAS Y SECRECIONES VARIAS
para el procesamiento de la muestra
Biopsias
1 gr. aproximadamente
Obtenido en condiciones aspticas
Secreciones
0.5 ml como mnimo
En recipiente estril, de preferencia en jeringas (si se va a coleccionar la muestra por medio
de una puncin es mejor si se cuenta con las de
tipo tuberculina)
El rea de toma de muestra debe estar bien
limpia
Si son hisopos deben transportarse en Stuart
o Amies
5.5.2. Preparacin de la muestra para
la elaboracin de frotes
Biopsias de tejido
Colocarla en una caja de petri estril de vidrio
preferentemente
Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, solucin salina o agua destilada estril
Triturar con bistur la biopsia en partes pequeas a manera de formar una mezcla homognea
Transferir la solucin a un tubo
Agitar por 5min aproximadamente en vortex
Centrifugar la solucin por 15min a 3000rpm
Descartar el sobrenadante
Del sedimento tomar de 2-3 gotas para realizar
el frote
Hacer la tincin
Biopsias de Hueso
Colocarla en una caja de petri estril de vidrio
preferentemente
Agregarle 2 ml de caldo 7H9 Middlebrook, solucin salina o agua destilada estril
Triturar con bistur a manera de formar partculas lo ms pequeas posibles.
Hacer por lo menos tres improntas frotando
una laminilla contra otra a manera de obtener
un frote en cada uno de los extremos y uno en el
centro de la lmina portaobjetos
Hacer la tincin
5.6. MUESTRAS DE ESPUTO
La muestra de esputo es de utilidad para investigar la causa de infecciones respiratorias inferiores (bronquitis, neumona) y en la investigacion.
Pg. 69
de tuberculosis. Siempre hay bacterias en una

muestra de esputo, por la contaminacin del
material bronquial con saliva. Una muestra de
esputo es satisfactoria para estudio si contiene
secreciones respiratorias inferiores.
Muestras que consisten solo de material hialino o liquido o con abundante saliva son rechazadas por inadecuadas y no ser procesadas
(Ver Valor Q.). En casos muy especiales puede
estudiarse una puncin transtraqueal. Aspirados o lavados bronquiales son adecuados en el
paciente intubado o en respirador, si se transporta el material al laboratorio en una jeringa o
contenedor estril.
La neumona bacteriana, o infeccin del pulmn causada por bacterias puede ser de dos
tipos:
- Neumocccica: Causada por Streptococcus
pneumoniae
- No neumocccica: Causada por Klebsiella
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y
rara vez por otras bacterias.
Los cultivos bacterianos del esputo son un problema importante, suelen ser recolectados sin
cuidado, y a menudo son mas representativos
de saliva que de las secreciones respiratorias
inferiores, adems contienen de ordinario gran
cantidad de bacterias propias de la cavidad oral
y en pacientes graves hospitalizados contienen
con frecuencia bacilos gram negativo que han
colonizado la orofaringe despus de la hospitalizacin. Este tipo de cultivos carece de sensibilidad y especificidad y son, por lo tanto, difciles
de interpretar.
5.6.1. Toma de muestra.
cualquier muestra que no cumpla con el Valor

Q establecido.
5.6.2. Procedimiento para obtencin
de la muestra.
Esputo para infeccin bacteriana
Obtenerse la primera muestra de la maana,
dado que el la ms espesa y no est contaminado con comida.
Indicar al paciente que al despertar se enjuague la boca con agua corriente (sin ningn tipo
de antisptico o pasta dental). Luego acostado
en su cama, boca abajo, expectore esputo con
fuerza, tosiendo, y lo deposite directamente en
un recipiente estril de boca ancha (proporcionado por el laboratorio), sin mantenerlo en la
boca para evitar que se mezcle con saliva.
Aproximadamente 1 a 3 ml de esputo mucopurulento son suficientes para el gram y el cultivo de rutina, as tambin para el cultivo de micobacterias (BK).
Llevar la muestra de inmediato al laboratorio.
Realizar el valor Q, para establecer la calidad
de la muestra y establecer si es apta para su
procesamiento.
5.6.3. Procesamiento de la muestra de
Esputo
Para que una muestra de esputo, sea vlida
para su adecuado cultivo, debe de cumplir con
ciertos criterios. Estos criterios determinan la
Calidad de la muestra, y su representatividad.
A continuacin se encuentra la tabla para Clculo de valor Q. Este mtodo se basa en la
cuantificacin de leucocitos polimorfonucleares
y clulas epiteliales presentes en la muestra, de
manera que la relacin entre stos determina el
Valor de la calidad del esputo, y por consiguiente su aceptacin o rechazo para cultivarse.
La infeccin bacteriana de trquea y bronquios

produce abundante esputo. En el caso del diagnstico de neumona y tuberculosis es crucial
obtener una buena muestra. El cultivo de material no satisfactorio (saliva), causa confusin
al mdico, ya sea porque no se detect el verdadero patgeno, o se cultiv un patgeno incidental sin importancia como agente etiolgico
primario. Por esta razn el laboratorio rechaza
Pg. 70
TABLA No. 2 DETERMINACIN DEL VALOR Q
TABLA No. 3
Resumen de Requerimientos de Muestras
Pg. 71
6. PREPARACIN Y OBSERVACIN DIRECTA DE UNA MUESTRA

Las tinciones utilizadas para observacin directa son Ziehl Neelsen, Kinyoun y Auramina-Rodamina, conocidas como tinciones de
alcohol-cido resistencia y juegan un importante papel en el diagnstico temprano de infecciones por micobacterias. La baciloscopa ha
sido adoptada por la mayora de los pases en
desarrollo como el procedimiento diagnstico
de eleccin en los enfermos sintomticos respiratorios por ser un mtodo sencillo, rpido,
confiable y econmico.
Las paredes celulares de las micobacterias
debido a su alto contenido de lpidos, le confieren la propiedad de ligarse al colorante de
carbolfuchsina y ser decolorados con una solucin de alcohol cido, de ah su nombre Bacilos
Alcohol cido Resistente (BAAR). Del mismo
modo, los cidos miclicos de la pared celular de las micobacterias tienen afinidad por los
fluorocromos auramina-rodamina, los cuales
emiten fluorescencia a cierta longitud de onda
en el microscopio de fluorescencia, permitiendo observar a las micobacterias fcilmente.
Respecto a la especificidad es de 99%, ya que
en la mayora de los casos los BAAR observados en esputo corresponden a Mycobacterium
tuberculosis. Pero respecto a su sensibilidad no
es ptimo, ya que puede existir variacin del
9-46%. Se estima que deben existir de 5,00010,000 bacilos/ml de expectoracin para que
puedan ser detectados al microscopio. Es por
ello que se recomienda que las muestras para
tincin sean de forma seriada mnimo tres), y
en el caso de orina se recomienda que sean
cinco.
La sensibilidad del frote se incrementa de

acuerdo al tipo de coloracin. Son ms sensibles los frotes teidos con Auramina-Rodamina, tincin fluorescente que necesita de un microscopio fluorescente. Estas tcnicas aunque
ms sensibles resultan ser ms costosas y no
cualquier laboratorio cuenta con un microscopio de fluorescencia.
La importancia de conocer la sensibilidad y la
especificidad de la baciloscopa en especmenes de formas pulmonares y extrapulmonares
de la tuberculosis, se encuentra en el hecho de
que en muchas instituciones de atencin mdica y servicios de urgencias no cuentan con
otros mtodos diagnsticos de reconocida sensibilidad y especificidad como el cultivo. Si bien
la complejidad del cultivo y su costo resultan ser
mayores que la baciloscopa, es mejor alternativa en comparacin a otras tcnicas sofisticadas. Por lo tanto, la baciloscopa no puede ser
utilizada como nica opcin en el diagnstico
de la tuberculosis extrapulmonar y se debe utilizar el cultivo en todos los especmenes no pulmonares.
En un estudio realizado en el Hospital Universitario de la Universidad Len, Mxico, se lleg a
establecer que nicamente pudieron detectarse el 30% de los casos por medio de un frote directo, y no un 70% como lo seala la literatura.
Como sabemos existen muestras en las cuales
la cantidad de bacilos se encuentra muy diluida
y no llega a ser suficiente para ser detectada
mediante un frote directo de la muestra, y ni aun
cuando la misma es centrifugada, por lo que no
puede confiarse solamente en la baciloscopa y
cualquier caso que sea altamente sospechoso
debe de ser cultivado y esperar el resultado de
ste, para dar como negativo al paciente.
6.1. Preparacin de un extendido

En la enfermedad extensa donde se eliminan Todas las fases de preparacin del extendido
grandes cantidades de micobacterias, existe deben ser sistematizadas y estandarizadas; la
una buena relacin entre frote y cultivo y la sen- disposicin del material debe ser siempre la
sibilidad es alta. Pero muchos pacientes pre- misma, de manera que se pueda obtener una
sentan enfermedad mnima o menos avanzada seguridad mxima y garantizar la calidad de la
donde la cantidad de micobacterias es menor tcnica.
y la correlacin disminuye llegando a ser de un Algunas recomendaciones son las siguientes:
- Cada serie de muestras a procesar no debe
2540%.
exceder de doce.
Pg. 72
Fijar el extendido pasndolo por encima del

incinerador dentro de la campana (es el ms
- Debe utilizarse un portaobjetos (laminilla) por seguro).
cada de las muestras.
Pasar la lmina por el rea azul de la llama de
- Los portaobjetos deben ser nuevos de prefe- un mechero Bunsen tres o cuatro veces, pero
rencia en buen estado y desgrasados (sumer- evite el sobrecalentamiento.
girlos en alcohol al 95% y pasarlas por la llama Permita que los frotes se fijen en un calentador
del mechero)
elctrico (65 a 70C) al menos por 2 horas.
- Los colorantes deben conservarse en frascos Colocar las lminas en un recipiente con mede color mbar por un mximo de 3 meses.
tanol absoluto por un minuto (puede haber contaminacin de muestras por micobacterias suelAlgunas muestras necesitan tratamiento previo tas).
para poder realizar los extendidos, para esto NOTA: la fijacin por calor puede que no mate
revise cada una de las secciones por tipo de todas las micobacterias, por lo tanto las lminas
muestra, en la seccin Preparacin de la mues- deben ser manejadas cuidadosamente y destra para la elaboracin de frotes.
cartadas en un recipiente adecuado despus de
su observacin.
Procedimiento
h. Antes de sacar las manos de la campana quia. Asignar un nmero de identificacin a la tarse un par de guantes, dejarlo dentro de ella
muestra y colocarlo a la laminilla con tinta inde- dentro de una bolsa de descarte.
leble
i. LOS FROTES TANTO POSITIVOS COMO
b. Ordenar las muestras con numeracin ascen- NEGATIVOS DEBEN GUARDARSE POR LO
dente de forma horizontal.
MENOS SEIS MESES.
c. Colocar cada laminilla frente al envase correspondiente teniendo el cuidado de no dejar 6.2. Procedimientos de Tincin alcoimpresiones digitales en la parte de la lmina hol-cido resistencia
reservada para el extendido.
d. Colocarse la bata, la mascarilla, doble par de El diagnstico de las micobacterias es basado
guantes y lentes de seguridad.
en la observacin de BAAR en las muestras y su
e. Realizar los frotes colocando la muestra uti- cultivo in vitro, para poder observarlos es necelizando un asa bacteriolgica, un palillo o una sario realizar coloraciones como la de Ziehl-Nepipeta sobre la laminilla dependiendo el tipo de elsen (utiliza calor) o Kinyoun (no utiliza calor y
muestra, haciendo un extendido fino y circu- su fuchsina es ms concentrada).
lar, de aproximadamente 3 cm. de dimetro y La caracterstica de alcohol-cido resistencia
en dos terceras partes de la laminilla (No hacer tpica de las micobacterias hace que la bacilosms de un frote por laminilla para evitar confu- copa tenga una importancia fundamental ya
siones), luego se dejan secar dentro de la cam- que se utiliza para seguir el curso del tratamienpana. Para que se sequen se necesita por lo to y para dar de alta al paciente en el hospital,
menos esperar de 10 a 15 minutos.
para luego poder continuar con su tratamiento
f. Si se trata de esputo es preferible hacer el fro- ambulatorio.
te con palillo de madera cortado en L ya que
por la consistencia mucosa de la muestra tien- 6.2.1. Coloracin de Ziehl-Neelsen:
de a adherirse mayor cantidad de muestra en a) Fijar el frote con calor dentro de la campana
l que en un asa. Se debe tener en cuenta que b) Dejar enfriar
el lugar en dnde hay ms probabilidades de c) Colocar papel filtro
encontrar bacilos est en las partculas slidas, d) Agregar fuchsina carbnica sobre el frote, caverdosas y sanguinolentas de la expectoracin lentar cuidadosamente la lmina por debajo, ya
y en gran medida el resultado del examen desea con un mechero o con un algodn con alpende de la eleccin de esas partculas.
cohol hasta emitir vapores blancos (no hervir) y
g. Fijar el frote por alguno de los siguientes m- dejar reposar por 5 minutos.
todos:
Pg. 73
debe repetirse el frote.

En caso de que se observen bacilos con morfologa dudosa solicitar una nueva muestra
para control.
Si el frote es muy grueso es probable que se
desprenda de la lmina durante la coloracin
por esto debe evitarse la transferencia de BAAR
de una preparacin a otra por medio del aceite
de inmersin, lentes sucios o colorantes (por lo
6.2.2. Coloracin de Kinyoun:
que debe limpiarse con papel limpialentes entre
una y otra muestra)
a) Fijar el frote con calor dentro de la campana Ocasionalmente, la buena seleccin de las
b) Agregar fucshina de Kinyoun sobre el frote y partes anormales de la muestra para preparar el
dejar reposar por 4 minutos
frote puede dar resultados mucho mejores que
c) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso el uso de concentraciones.
d) Agregar alcohol-cido y dejar reposar por 1-2 Puede ocurrir que la misma muestra sea negaminutos
tiva por frote, pero positiva por cultivo pero no lo
e) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso contrario, porque la baciloscopa es menos senf) Agregar azul de metileno
sible para detectar micobacterias que el cultivo.
g) Permitir el reposo del colorante por 1-2 mi- Un frote para diagnstico de Tb debe examinutos
narse de 8-10 minutos antes de darse por negah) Lavar con agua de chorro
tivo. Si se trata de LCR debe observarse an
i) Permitir que el frote se seque al aire
por ms tiempo.
j) Examinar con objetivo de inmersin
La liberacin irregular de micobacterias de los
focos endotraqueales puede dar frotes positivos
6.3. Interpretacin e informe de Baci- y negativos en el mismo paciente.
loscopas
Hay varias tablas para el reporte de la cuantifi Los extendidos deben examinarse total y cui- cacin de baciloscopa. La siguiente forma de
dadosamente con lente de inmersin (100x) y reportar ha sido estandarizada por la Asociacin
oculares 10x y una gota de aceite de inmersin. Nacional de Tuberculosis y Enfermedades Res Se debe limpiar completamente el lente de piratorias de los Estados Unidos. con el objeto
inmersin entre una y otra muestra que se ob- de poder comparar los resultados de distintos
serve.
laboratorios y poder orientar de forma adecua Los bacilos son aproximadamente de 1 a 10 da al personal mdico.
m de largo y aparecen como bacilos como Tabla No. 3 Cuantificacin de Baciloscopa
bastoncitos delgados bien definidos, ligeramente curvos (pueden aparecer doblados) teidos de rojo brillante (se aprecian mejor con
luz intensa), generalmente con grnulos ms
coloreados en su interior, aislados, en parejas o
en pequeos grupos, destacados sobre el azul
claro de la tincin de fondo.
NOTA: algunas micobacterias distintas a Mycobacterium tuberculosis pueden aparecer pleomrficas que van desde bacilos largos hasta
Fuente: Asociacin Nacional de Tuberculosis y Enfermeformas cocoides.
dades Respiratorias de Estados Unidos.
En el frote pueden aparecer artefactos alcoBAAR (Bacilos alcohol-cido resistentes)
hol-cido resistentes, especialmente si el frote
es grueso o no fue suficientemente decolorado.
En caso que se observen muy escasos BAAR
g) Lavar con agua de chorro y quitar el exceso
h) Agregar azul de metileno
i) Permitir el reposo del colorante por 1-2 minutos
j) Lavar con agua de chorro
k) Permitir que el frote se seque al aire
l) Examinar con objetivo de inmersin
Pg. 74
trocelulosa capturan este complejo inmunolgico que se hace visible gracias a la presencia
del marcador de oro coloidal.
Un resultado positivo (una banda visible de color prpura/gris) indica que el antgeno LAM de
las micobacterias est presente en la muestra
en el lmite de deteccin de la prueba o por encima de l.
Fuente: Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social
Un resultado negativo (sin banda visible de code Guatemala.
lor purpura/gris) indica que este no est presen (mayor) (menor)
NOTA: De 1-4 BAAR en toda la lmina Repetir muestra te o que se encuentra por debajo del lmite de
Si la cantidad de BAAR en la nueva muestra sigue sien- deteccin. Con el fin de garantizar la validez del
do la misma el resultado es POSITIVO (+)
ensayo se ha incorporado una banda de control
de procedimiento en el dispositivo del ensayo.
7. PRUEBAS DE TAMIZAJE
Materiales
Las pruebas de tamizaje son pruebas que ayu- Tarjetas de anlisis de la prueba Alere Deterdan a dar un diagnstico presuntivo de infec- mineTM TB LAM Ag 10 tarjetas (10 pruebas por
cin por Mycobacterium tuberculosis. Se ob- tarjeta)
tiene un resultado ms rpido que el cultivo y Recipientes de recoleccin de orina
generalmente ms sensible que las tinciones. Pipetas con precisin de 60 L
Sin embargo, deben ser interpretadas correla- Tips descartables
cionando la clnica del paciente y los datos de Temporizador
la historia clnica del paciente.
Obtencin de la muestra
7.1. PRUEBA DE LAM
Antes de recoger la muestra de orina, se recoPrincipio
mienda limpiar la zona genitourinaria con una
La prueba de antgeno de LAM es un anlisis toalla limpia. Recoja la orina en un recipiente
inmunocromatogrfico diseado para la de- estndar de recoleccin de orina fresca.
teccin cualitativa del antgeno lipoarabinoma- Conservacin de la muestra
nano (LAM) de las micobacterias en orina hu- 1.Si se conservan a temperatura ambiente las
mana. La prueba Alere DetermineTM TB LAM muestras de orina fresca pueden utilizarse a lo
Ag emplea anticuerpos altamente purificados, largo de las 8 horas siguientes a la obtencin.
especficos del principal antgeno polisacrido 2. Si el anlisis se va a realizar a lo largo de los
del gnero Mycobacterium: lipoarabinomanano 3 das posteriores a la obtencin de las muestra
(LAM).
de orina, estas deben almacenarse a una temperatura de entre 2 y 8 C. Si el anlisis se va a
Estos anticuerpos se utilizan tanto como traza- realizar ms de 3 das despus, se deben condores de captura como de deteccin. Los an- gelar las muestras a -20 C o menos.
ticuerpos de captura se absorben en la mem- 3. Si las muestras estn congeladas o refrigebrana de nitrocelulosa de las tiras reactivas. El radas, se deben poner a temperatura ambiente
anticuerpo de deteccin se marca con un con- una hora antes de utilizarlas.
jugado de partculas de oro coloidal.
4.Las muestras congeladas pueden contener
agregados. Todas las muestras congeladas se
Una vez que la muestra de orina se haya agre- deben centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos
gado a la seccin de muestra, los anticuerpos a temperatura ambiente. La muestra a utilizar
conjugados con oro coloidal se adhieren al an- se recoge con cuidado del sobrenadante.
tgeno LAM y la muestra los libera de la seccin 5.Evitar ciclos de congelado/descongelado repetidos. No se pueden utilizar las muestras que
de conjugado. A continuacin, los anticuerpos
se hayan congelado y descongelado ms de
anti-LAM inmovilizados en la membrana de nitres veces.
Pg. 75
Procedimiento
1. El nmero deseado de unidades de prueba
de las 10 tarjetas de anlisis pueden extraerse
doblando o rasgando la perforacin.
NOTA:
La extraccin de las unidades de prueba debe iniciarse
en el lateral derecho de la tarjeta de anlisis con el fin
de conservar el nmero de lote que aparece en el lateral
izquierdo de esta.
El anlisis debe iniciarse a lo largo de las 2 horas posteriores a la retirada de la cubierta protectora de aluminio
de cada prueba.
Inserto Prueba de LAM, Alere

7.2. GENEXPERT
Principio
El sistema GeneXpert integra y automatiza el

procesamiento de muestras, la amplificacin de
cidos nucleicos y la deteccin de las secuen2. Retire la cubierta protectora de aluminio de cias diana en muestras sencillas o complejas
mediante ensayos de PCR y PCR de transcripcada prueba.
tasa inversa en tiempo real. El sistema consta
3. Aplique 60 L de la muestra (pipeta de pre- de un instrumento, una computadora, un lector
cisin) a la seccin de muestra (seccin blanca de cdigos de barras y un software precargado
para la realizacin de pruebas con las muesmarcada con el smbolo de la flecha).
tras recogidas y la visualizacin de los resulta4. Espere un mnimo de 25 minutos y lea el re- dos. Este sistema requiere el uso de cartuchos
sultado. Visualice la tira en un entorno con una GeneXpert desechables de un solo uso para
iluminacin interior estndar o en la sombra. los reactivos y el proceso de PCR. Dado que
No la visualice bajo la luz directa del sol. Los los cartuchos son independientes, se elimina
resultados permanecen estables hasta unos 35 el riesgo de contaminacin cruzada entre las
minutos despus de haber aplicado la muestra. muestras.
Si han transcurrido ms de 35 minutos no lea
El Xpert MTB/RIF incluye reactivos para la delos resultaos de la muestra.
teccin de MTB y la resistencia a RIF, as como
un control de procesamiento de la muestra
Control de calidad
(SPC, por sus siglas en ingles) para controlar el
En la tira de reaccin se debe observar una procesamiento adecuado de las bacterias diabanda control de la prueba. Si, una vez aca- na y detectar la presencia de inhibidores en la
bado el ensayo, la banda de control no torna a reaccin PCR. El control de comprobacin de la
un color purpura/gris, el resultado de la prueba sonda (PCC, por sus siglas en ingls) comprueno es vlido y no se debe volver a analizar la ba la rehidratacin de los reactivos, el llenado
del tubo de PCR en el cartucho, la integridad de
muestra.
la sonda y la estabilidad del colorante.
Interpretacin de los resultados
Los cebadores del Xpert MTB/RIF Assay amPara facilitar la lectura e interpretacin de los plifican una parte del gen rpoB que contiene la
resultados cuando stos se observan muy p- regin central de 81 pares de bases. Las sonlidos, se puede utilizar la Tarjeta de Escala de das son capaces de distinguir entre la secuenReferencia (incluida en el kit), la cual se sostie- cia natural conservada y las mutaciones de la
regin central que se asocian a la resistencia a
ne a la par del resultado.
rifampicina.
Pg. 76
Materiales
Cartuchos Xpert MTB/RIF con tubos de reaccin integrados.
Sistema GeneXpert Dx equipado con el software GX4.0.
Recipientes estriles y hermticos, con tapa
para toma de muestra.
Guantes desechables y proteccin ocular
Etiquetas o rotulador permanente
Pipetas de transferencia para el procesamiento de la muestra
Procedimiento
Limpie adecuadamente el rea de trabajo
(pase un algodn con cloro 10% y luego otro
con etanol 70%, secar con algodn)
Remueva un cartucho y un vial del reactivo de
muestra del kit GeneXpe rt MTB/RIF
Agregue 2 volmenes de reactivo de muestra
por una de esputo en el recipiente colector (2:1)
3. Aparecer una pantalla para seleccionar sesin en windows, seleccione cepheid e introduzca la contrasea cphd
4. Al ingresar a windows, el software de genexpert se iniciara automticamente, si no, presione el icono de genexpert dx software en el escritorio.
5. Introducir el usuario y contrasea correspondiente para cada usuario.
6. Al ingresar, aparecer un recuadro preguntando si quiere hacer algn manejo de la base
de datos, presionar no.
7. Luego aparecer un recuadro preguntando si
quiere hacer un backup, presionar no.
8. Al terminar de ingresar los mdulos del genexpert deben aparecer en el lado izquierdo
como disponibles.
9. El equipo est listo para usar.
Actualizacin de un test (nueva versin)

1. Introduzca el cd que viene con el nuevo kit
de reactivos en el lector del cds del computador.
NOTA: para este paso, se puede utilizar la muestra di- 2. Dentro del software, presione el botn definir
recta; es decir, sin haber realizado proceso de deconta- ensayo.
minacin o se puede utilizar muestra ya decontaminada.
En general, todas las muestras se decontaminan primero 3. Presione el botn importar en la parte infey nicamente las muestras de lquido cefalorraqudeo se rior de la pantalla.
utilizan directas. Para ver el proceso de decontaminacin 4. En la ventana que se despliega seleccionar el
de muestras previo a este paso, consultar seccin 8.2 y directorio del cd en la barra superior.
ubicar el mtodo de decontaminacin que se est reali- 5. Abra la carpeta de que corresponde para el
zando, de preferencia el mtodo de NALC-NaOH ya sea
sistema genexpert (nombre de la prueba gecon reactivos preparados in house o comerciales.
nexpert system).
6. En la carpeta seleccione el archivo con termi Enrosque adecuada mente la tapa
Asegrese que la tapa cierre adecuadamente. nacin .gxa
Mezcle el contenedor vigorosamente 10- 20 7. Presiona aceptar
8. En la parte izquierda de la pantalla definir
veces.
Dejar reposar a temperatura ambiente por 15 ensayo aparecer la nueva versin del test actualizado listo para usarse.
minutos (al minuto 10 vuelva a mezclar).
Utilizando la pipeta desechable transfiera,
CUIDADOSAMENTE la muestra (llene la pipe- Realizacin del test en el GeneXpert
1. Presione el primer botn en la parte superior
ta hasta la marca).
Agregue la muestra al contenedor de mues- del software crear ensayo
2. En la ventana que se despliega lea el cdigo
tra, despacio, evite salpicaduras.
de barras del cartucho del ensayo ya preparado.
Cierre la tapa del cartucho.
Coloque el cartucho en el equipo antes de 30 3. Al leer el cdigo de barras en la ventana aparecer la informacin del ensayo a realizar.
minutos
4. Coloque la identificacin de la muestra en el
apartado id de muestra.
Encendido del equipo
1. Encienda el equipo presionando el switch en 5.Si desea cambiar el modulo en el que ser
procesada la muestra seleccinelo.
la parte posterior del equipo genexpert.
6.Cuando est listo para procesar la muestra
2. Encienda la computadora.
presione el botn iniciar.
Pg. 77
1. Despus de terminar de procesar las mues7. Aparecer el recuadro para que introduzca tras, saque los cartuchos de los mdulos.
de nuevo su usuario y contrasea, introdzca- 2. Cierre el software presionando en la x de la
los.
parte suprior derecha.
8. Al darle ok la luz del mdulo seleccionado 3. Aparecer un recuadro preguntando si quiere
para procesar la muestra empezara a parpa- hacer algn manejo de la base de datos, presiodear.
nar no.
9. Introduzca el cartucho en el mdulo y cierre 4. Luego aparecer un recuadro preguntando si
quiere hacer un backup, presionar no.
la compuerta.
10. El equipo iniciara
5. El software se cerrara.
11. a procesar su muestra. El tiempo restante 6. Presione inicio en la barra de inicio de windows.
depender del ensayo a realizar.
7. Presione apagar
Inserto del test MTB/RIF Cepheid
8. Apague el monitor.
Apagado del equipo
Resultados e interpretacin
Pg. 78
Precauciones y limitaciones
Trate todas las muestras biolgicas, incluidos
los cartuchos usados, como posibles agentes
transmisores de infecciones.
Todas las muestras biolgicas debern tratarse
con las medidas de precaucin habituales
Utilice guantes protectores desechables, bata
de laboratorio y proteccin ocular cuando manipule las muestras y los reactivos.
Lvese las manos a fondo tras manipular las
muestras y los reactivos de la prueba.
Siga los procedimientos de seguridad del centro para trabajar con productos qumicos y manipular muestras biolgicas.
Si se va a procesar ms de una muestra a
la vez, abra solo un cartucho, aada la muestra tratada con el reactivo de la muestra (o una
muestra liquida descontaminada) y cierre el cartucho antes de aadir la muestra tratada con el
reactivo de la muestra al siguiente cartucho.
No abra la tapa del cartucho Xpert MTB/RIF
salvo para aadir la muestra tratada.
No use un cartucho que se haya cado o agitado despus de aadir la muestra tratada.
malaquita) en Middlebrook 7H10 (sales de

fosfato y magnesio, vitaminas, cofactores, cido
olico, albmina, catalasa, glicerol y dextrosa)
cuando es necesario enriquecer las muestras,
recuperarlas o para conservacin de cepas se
utiliza el segundo medio de cultivo que se ha
mencionado.
8.1. Muestras
Las muestras para realizarles cultivo de micobacterias estn clasificadas dentro de dos categoras:
De origen pulmonar (esputo, liquido y biopsia
pleural, hisopados larngeos, cepillados y lavados bronquiales).
8. CULTIVO DE MICOBACTERIAS EN
De origen extrapulmonar (orina, heces, piel,
LOWENSTEIN JENSEN
sangre, mdula sea, tejidos blandos, aspirados
suprapbicos de vejiga, biopsias, lquido cefaloLos procedimientos para obtener el crecimiento
rraqudeo (LCR), lquido pericrdico, lquido pein vitro de las micobacterias son especializados;
ritoneal, secreciones varias, fluidos y muestras
deben seguirse estrictamente las instrucciones
tisulares en general).
para tener xito en su recuperacin. Por lo geneDe estas categoras hay dos niveles:
ral, las muestras para cultivo contienen muchas
bacterias de las microbiotas, especialmente el
Tabla No. 5 Tipos de muestras.
esputo que siempre se contamina con microbiota de la boca. Adems el esputo es una muestra difcil de manipular por su mucosidad, tenacidad y adherencia. Por estas razones para su
cultivo, el esputo debe digerirse para hacerlo
lquido y descontaminarse; es decir darle algn
tratamiento qumico para destruir las bacterias
contaminantes que crecen rpido, pero sin destruir a las micobacterias.
El cultivo se realiza en Lowenstein Jensen que
es un medio muy nutritivo (Huevos enteros frescos, fcula de papa, glicerol, sales de fosfato
y magnesio, L-asparagina, glicerol y verde de
Pg. 79
Las muestras normalmente contaminadas ya

sea por microbiota normal que es arrastrada al
obtenerla o por su propia naturaleza requieren
el paso de digestin-decontaminacin, por el
contrario las muestras normalmente no contaminadas no lo requieren pero en la mayora de
los casos pueden requerir de concentracin. En
la tabla No.6 se encuentra la preparacin segn tipo de muestra previo al procedimiento de
decontaminacin.
* Si se cuenta con triturador para biopsias proceder de la siguiente manera:
- Transferir la muestra al triturador de tejido estril usando un asa o aguja para colocarla en la
pared lateral del tubo del triturador
- Agregar 10 partes de NaCl 0.85%, albmina
TABLA No. 6
bovina 0.2%, o caldo lquido para micobacterias (Ej. Middlebrook 7H9 Dubos) al triturador
de tejido. Si la muestra es mucoide puede agregarse N-acetil-L-cistena (NALC)
- Mantener el tubo de lado e insertar el pistilo.
Empujar la muestra al fondo del tubo
- Detener el tubo en la mano, empujar el pistilo
hacia delante y atrs en ngulo 90
- Triturar la muestra hasta lograr una suspensin homognea
- Remover cuidadosamente el pistilo del tubo.
Utilizar un volumen pequeo de medio para enjuagar la punta del pistilo dentro del recipiente
de descarte
- Tapar el tubo con un tapn de rosca estril
PREPARACION DE MUESTRAS PREVIO AL PROCEDIMIENTO

DECONTAMINACION
Pg. 80
preparacin genera calor.

8.2. Mtodos para decontaminacin Combinar volmenes iguales de las soluciode muestras.
nes 1 y 2, autoclavear a 121C por 15 minutos
en balones de preferencia con tapn de rosca.
Las micobacterias se recuperan ptimamente NOTA: la solucin puede ser guardada a tempede muestras clnicas cuando se utilizan mto- ratura ambiente, pero es preferible que se mandos para liberarlas de clulas y fluidos corpo- tenga en refrigeracin; la desventaja de tenerla
rales (digestin) y para remover o reducir los preparada es que el hidrxido de sodio forma
organismos competidores (decontaminacin). estructuras blancas como precipitado y en ste
Ningn mtodo es ideal para todas las mues- caso ya no puede utilizarse; por lo que de pretras clnicas en todas las circunstancias. Algu- ferencia hay que prepararlo el da que va a ser
nos mtodos utilizan un solo reactivo tanto para utilizado.
digerir como para decontaminar, mientras que
otros utilizan reactivos separados para estas A continuacin se presentan cantidades de didos funciones. Cualquiera que sea el mtodo gestor y decontaminante dependiendo de la
elegido, se debe estar prevenido de las limita- cantidad de solucin total necesaria para trabaciones inherentes al mtodo por lo que deber jar un determinado nmero de muestras:
seguir el procedimiento de digestin-decontaminacin que maximice la recuperacin de mi- Tabla No. 7 Cantidades para la prepacobacterias a partir de muestras no estriles.
racin del Digestante-Decontaminante
8.2.1. Mtodo de N-Acetil-L-Cistena-Hidrxido de Sodio (NALC-NaOH)
Principio:
La N-acetil-L-cistena (NALC) es un agente mucoltico que a concentraciones de 0.5 a 2.0%
puede digerir rpidamente an el esputo ms
tenaz en slo 2 minutos. La decontaminacin
se lleva a cabo por medio de una solucin preparada con hidrxido de sodio y citrato de sodio.
Materiales:
Indicar en la etiqueta y en el libro de trabajo
la fecha de inicio y expiracin. Etiquetar todos
los reactivos con fecha de preparacin, receta,
contenido, concentracin, condiciones de almacenamiento.
Solucin stock de Citrato de Sodio-NaOH
Solucin 1 (2.9%)
- Citrato de sodio dihidratado 29g
- Agua desmineralizada 1000ml
Solucin 2 (4%)
NaOH en granallas 40g
Agua desmineralizada 1000ml
Precaucin el NaOH es custico y su
Buffer de fosfatos 0.067 M (pH 6.8)

a. Buffer alcalino stock
Na2HPO4 (Fosfato disdico anhidro)
Agua desmineralizada 1000 ml
9.47 gr
b. Buffer cido stock

KH2PO4 (fosfato monopotsico) 9.07 gr
1000 ml
Agregar cada sal a balones volumtricos de
1000 mL.
Adicionar agua desmineralizada a la marca de
1000 mL.
Cada buffer puede ser transferido a recipientes con tapn de rosca y esterilizados a 121C
por 15 min, para ser mezclados despus, o pueden combinarse inmediatamente y esterilizarse
La solucin puede ser guardada a temperatura
ambiente pero es preferible que se refrigere (28C).
Pg. 81
c.Solucin de trabajo de buffer de fosfatos (pH

6.8)
Combinar volmenes iguales de los stocks alcalino y cido 640ml del fosfato disdico con
360ml de la solucin de fosfato monopotsico y
chequear el pH de la solucin.
Agregar pequeas cantidades de buffer alcalino para incrementar el pH o pequeas cantidades de buffer cido para disminuirlo.
Solucin NALC-NaOH-Citrato de sodio
Justo antes de usar, combinar el NALC con
la solucin de NaOH-Citrato de sodio. La solucin detrabajo puede ser utilizada por las 2
horas consecutivas de su preparacin, luego
debe descartarse.
Procedimiento
a. Agregar un volumen de la solucin de trabajo
NALC-NaOH-Citrato de sodio igual al volumen
de la muestra en un tubo Falcon con tapn de
rosca.
b. Mezclar suavemente y de forma invertida
para asegurar que la solucin tenga contacto
con todas las superficies del interior del tubo y
tapn.
c. Agitar el tubo (muestra + solucin de trabajo)
en Vortex por 5 a 30 segundos hasta dejar la
muestra licuada, se debe evitar una agitacin
en exceso ya que NALC es inestable en presencia de oxgeno y adquiere un color amarillo
por oxidacin de NALC, si esta coloracin se
da el NALC se inactiva.
d. Dejar reposar el tubo de forma vertical y a
temperatura ambiente por 15 minutos para que
se lleve a cabo el proceso de decontaminacin.
e. Si fuera necesaria una decontaminacin ms
activa, incrementar la concentracin de sosa
de la tabla al 5% o al 6% en lugar de aumentar
el tiempo de exposicin al reactivo decontaminante.
f. Neutralizar la muestra aadiendo agua destilada estril buffer de fosfatos (pH 6.8) hasta
la marca de 45-50; para detener el proceso de
decontaminacin.
g. Mezclar de forma invertida y suave el tubo.
h. Centrifugar a 3000rpm en centrfuga refrigerada durante 15 minutos.
i. De preferencia descartar el sobrenadante en

un recipiente de descarte que contenga fenol
al 5% y del sedimento remover una porcin (ya
sea una asada grande de preferencia 2-3 gotas con una pipeta estril) para colocar sobre el
medio slido de cultivo.
j. Inocular el sedimento de la muestra en 2 tubos
de Lwenstein Jensen.
k. Incubar los tubos de forma horizontal a 37C
por 2-5 das
l. Seguir incubando los tubos de forma vertical
en una gradilla.
m. Realizar lecturas 2 veces por semana.
n. Observar crecimiento de colonias con las siguientes caractersticas: color crema, rugosas,
secas y bien adheridas al medio.
o. Realizar frotes con Zielh Neelsen, para comprobar crecimiento de bacilos alcohol cido resistentes.
p. Si se completan 8 semanas y no hay crecimiento se dejan de incubar y se reportan como
negativos para micobacterias.
8.2.2.
Mtodo del Hidrxido de
Sodio
Principio:
El hidrxido de sodio es tanto un digestante
como un decontaminante, y su efecto es muy
bueno. Su actividad mucoltica ms efectiva
ocurre a una concentracin de 4%.
Materiales:
Solucin NaOH 4%
- Granallas de NaOH
40g
- Agua desmineralizada 1000ml
-Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121C.
Procedimiento
a. Agregar un volumen de NaOH igual al volumen de la muestra en un tubo con tapn de rosca.
b. Mezclar suavemente y de forma invertida el
tubo.
c. Agitar el tubo (muestra + NaOH) en Vortex
por 30 segundos.
e.Diluir la muestra con agua desmineralizada
para detener el proceso de decontaminacin.
Pg. 82
f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo.

g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos.
h. De preferencia descartar el sobrenadante en
un recipiente de descarte que contenga fenol
al 5% y del sedimento remover una porcin
(ya sea una asada grande de preferencia 2-3
gotas con una pipeta estril) para colocar sobre
el medio slido de cultivo.
El NaOH debe utilizarse a la menor concentracin que efectivamente digiera y decontamine
efectivamente las muestras. Si ocurre contaminacin excesiva con el uso de NaOH 2% hay
que incrementar la concentracin primero al
3% y luego a 4% antes de aumentar el tiempo
de exposicin.
8.2.3. Mtodo del cido Oxlico
Principio:
c. Agitar el tubo (muestra + cido oxlico) en

Vortex por 30 segundos.
e. Diluir la muestra con solucin salina 0.85%
estril para detener el proceso de decontaminacin.
f. Mezclar de forma invertida y suave el tubo.
g. Centrifugar a 3000rpm por 15 minutos.
h. De preferencia descartar el sobrenadante en
un recipiente de descarte.
i. Agregar algunas gotas de rojo de fenol al sedimento.
j. Neutralizar el sedimento con NaOH 4% hasta
obtener un color rosa plido.
k. Del sedimento remover una porcin (ya sea
una asada grande de preferencia 2-3 gotas
con una pipeta estril) para colocar sobre el medio slido de cultivo.
El cido oxlico (cido etanodioico) es comn a

muchas plantas y vegetales por lo que depende de un viraje de colores para poder decontaminar efectivamente las muestras.
Materiales:
a. Reactivo de cido oxlico al 5%
cido oxlico

50gr
1000ml
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a
121C.
b. Indicador de Rojo de fenol
Rojo de fenol
8mg
NaOH
20ml
Agua desmineralizada 000ml
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a
121C.
Disolver el rojo de fenol en NaOH al 4% en un
agitador magntico, puede que se requiera de
calentamiento leve. Transferir la solucin a un
baln volumtrico y aforar a 1000ml con agua
destilada. Guardar la solucin a temperatura
ambiente.
Procedimiento
a. Agregar un volumen de cido oxlico al 5%
igual al volumen de la muestra en un tubo con
tapn de rosca.
b. Mezclar suavemente y de forma invertida el
tubo.
8.2.4. Mtodo MycoPrep BBL (mtodo

comercial)
Principio
La mayora de las muestras enviadas para confirmacin de infeccin por micobacterias con
cultivo estn contaminadas por la microbiota
normal. Por esta razn deben ser tratadas con
un procedimiento de digestin y descontaminacin. La solucin de N-acetil-L-cistena-hidrxido sdico (NALC-NaOH) es Cuando el reactivo
se diluye con la muestra en cantidades iguales
provee digestin y decontaminacin con una
concentracin NaOH al 1 %, el citrato de sodio
enlaza los iones de metal pesado presentes en
la muestra que pueden inactivar el NALC. El
tampn fosfato ph 6.8 disminuye la actividad de
la solucin de NALC-NaOH y reduce la gravedad especfica de la muestra. Materiales
Verificar la etiqueta y fecha de expiracin.
Pg. 83
Materiales
Verificar la etiqueta y fecha de expiracin.
Reactivo BBL MycoPrep Frmula aproximada (ajustada y/o enriquecida para satisfacer
los criterios de rendimiento) por un litro de agua
- NaOH en granallas
20g
- Citrato trisdico (Na3C6H5O7.2H2O) 14.5g
Cada ampolla de vidrio sellada dentro del frasco contiene un mnimo de 0.370 g de NALC(C5H9NO3S)
Tampn fosfato BBL Mycoprep Frmula aproximada (ajustada y/o enriquecida para satisfacer los criterios de rendimiento) por 500 ml de
agua purificada
-Fosfato disdico (Na2HPO4)
-Fosfato monopotsico (KH2PO4)
2.37g
2.27g
Ph Final de 6.8
Advertencias y precaucin: Para uso de diagnostico in vitro.
si las ampollas estn rotas, ausentes o bien si

no contienen polvo. No utilice si hay evidencia
de deterioro (e. g. el color del reactivo se vuelve amarillo). No utilice el tampn fosfato si los
paquetes estn desgarrados o abiertos.
RECOGIDA Y MANIPULACIN DE LAS
MUESTRAS
Se requiere la utilizacin de prcticas y procedimientos de bioseguridad de nivel 2 y equipo e
instalaciones para contencin cuando se manipulen muestras clnicas sin producir aerosoles,
como en la preparacin de frotis acidorresistentes. Todas las actividades que generen aerosoles deben llevarse a cabo en una campana de
flujo laminar nivel II. Se requiere utilizacin de
prcticas de bioseguridad de nivel 3 y equipo e
instalaciones para contencin en las actividades de laboratorio que incluyan la propagacin
y manipulacin de cultivos de M. tuberculosis
y M. bovis. Los estudios en animales tambin
requieren la implementacin de procedimientos
especiales.
Procedimiento
a. Prepare el tampn fosfato BBL MycoPrep

El reactivo NALC-NaOH contiene alcalinos segn sea necesario, vaciando el contenido de
fuertes y causa quemaduras graves. Se debe un paquete en un matraz volumtrico de 500
usar guantes y proteccin para los ojos y la mL y rellenado con agua purificada. Transfiera
cara. El NaOH irrita los ojos y la piel. En caso la solucin tampn a un envase con tapa de
de contacto con los ojos o la piel, enjuagar in- rosca y pngala en el autoclave a 121 C dumediatamente con un producto para lavado rante 15 minutos con la tapa floja. Djela enfriar
ocular o abundante agua potable durante al a temperatura ambiente y apriete la tapa.
menos 15 minutos y consulte al mdico. Si es
ingerido, tome leche, clara de huevo o abun- b. Con cuidado para no derramarlo, afloje la
dante agua y consulte al mdico. Mantenga tapa de rosca del frasco de reactivo MycoPrep.
fuera del alcance de los nios.
Extraiga todo exceso de aire del frasco y asegure la tapa. Coloque el frasco en posicin verPrecaucin: Rompa la ampolla cerca del tical y apritelo hasta que se rompa la ampolla.
centro una sola vez. No siga manipulando la (Nota: el frasco de 150 mL contiene dos ampoampolla ya que el frasco de plstico puede per- llas y se deben romper las dos). Agite suaveforarse y causarle heridas.
mente para disolver el NALC.
Instrucciones para el almacenamiento: En cuanto se reciba, guardar a una temperatura entre 15 y 30C. No congelar. No abrir
hasta que vayan a utilizarse.
Evite agitar en exceso. UNA VEZ ROTA LA

AMPOLLA, EL REACTIVO DEBE USARSE EN UN LAPSO DE 24 HORAS.
Deterioro del producto: No utilice los reactivos

Pg. 84
c. En un gabinete de seguridad biolgica, utilice un tubo para centrifuga estril libre de aerosoles de 50 mL y con tapa de rosca, aada cantidades iguales de la muestra y de la solucin
de NALC-NaOH activada (aproximadamente 5
mL de cada uno)
cimiento BACTEC MGIT y la mezcla antibitica

BBL MGIT PANTA est destinado para la deteccin y recuperacin de micobacterias utilizando los sistemas BACTEC MGIT 960. Los tipos
de muestras aceptables son muestras clnicas
digeridas y decontaminadas (excepto orina) y
fluidos corporales estriles (excepto sangre).
Principio
d. Tape el tubo para centrifuga y mezcle en
un vortex hasta que la muestra se lice. Si la Se tiene un compuesto fluorescente en la parte
muestra es muy viscosa aada ms solucin inferior de los tubos de 16x100 mm de fondo rede NALC-NaOH y vuelva a mezclar.
dondo. El compuesto fluorescente es sensible
a la presencia de oxgeno disuelto en el caldo.
e. Deje reposar la mezcla a temperatura am- Al inicio la gran cantidad de oxgeno disuelto
biente durante 15 minutos y agite suavemente apaga las emisiones procedentes del compuesde vez en cuando. Evite tratar la muestra en to y se puede detectar muy poca fluorescencia.
exceso.
Ms tarde, los microorganismos que respiran
activamente consumen el oxgeno y permiten
f. Aada el tampn de fosfatos ya preparado al que se detecte la fluorescencia.
tubo para centrifuga hasta alcanzar los 40 mL
y mezcle. Centrifugar entre 15 y 20 minutos a Los tubos que se introducen en el instrumento
3,000 gravedades.
BACTEC MGIT son incubados continuamente a
37C y este controla los tubos cada 60 minutos
g. Decante con cuidado todo el fluido sobrenapara detectar un aumento en la fluorescencia.
dante
El anlisis de la fluorescencia, este anlisis se
h. Aada una pequea cantidad de tampn de utiliza para determinar si el instrumento detecta
fosfatos con un pH 6.8 (0.5 a 2 mL) y vuelva a el tubo como positivo con organismos viables.
suspender el sedimento. Utilice la suspensin Cada tubo positivo contiene aproximadamente
para preparar frotis y para los procedimientos 105 a 106 UFC/ml. Los frascos de cultivo que
permanecen negativos durante un mnimo de
micobacteriolgicos.
42 das (hasta 56 das) y que no muestran indicios de ser positivos se retiran del instrumenControl de Calidad del Usuario:
Examine los componentes del equipo de cada to como negativos y se esterilizan antes de ser
lote o envo que se reciba por Deterioro del Pro- desechados.
ducto.
Inocular una caja de agar sangre para bs- El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT
se aade a cada tubo MGIT para proporcionar
queda de bacterias u hongos contaminantes.
Inocular los reactivos del Mycoprep (buffer y substancias esenciales para el crecimiento rpisolucin NaOH-citrato de sodio-NALC en tubo do de micobacterias. El cido oleco es usado
de medio slido y tubo de medio lquido para por las micobacterias y es muy importante en el
verificar esterilidad.
metabolismo micobacteriano. La albmina acta como agente protector al ligar cidos grasos
8.3. Inoculacin de Tubo Bactec MGIT libres que pueden ser txicos para las especies
960 (Indicador de crecimiento de Mi- de Mycobacterium, ayudando a su recuperacobacterias).
cin. La dextrosa es una fuente de energa.
El uso del tubo BBL MGIT indicador de crecimiento enriquecido con el suplemento de creRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 85
La catalasa destruye las peroxidasas txicas

que pueden estar presentes en el medio.
La contaminacin se reduce al suplementar el
caldo de base con el suplemento de crecimiento BACTEC MGIT/mezcla antibitica BBBL
MGIT PANTA antes de la inoculacin con una
muestra clnica.
Base de caldo Middlebrook 7H) modificado

5.9 g.
Peptona de casena
1.25 g.
El suplemento de crecimiento BACTEC MGIT

contiene 15 mL de Caldo de enriquecimiento
Middlebrook OADC.
Frmula aproximada por L de agua purificada:
Albumina bovina 50.0 g
Materiales y Reactivos
Catalasa
0.03 g.
20.0 g
El tubo indicador de crecimiento BBL MGIT Dextrosa
0,1 g.
contiene: 110 uL de indicador fluorescente y 7 cido olico
1.1g.
mL de caldo. El indicador contiene cloruro pen- Estearato de polioxietileno (POES)
tahidratado de Tris-4, 7-difenil-1, 10-fenantroli-
na rutenio en una base desilicona. Los tubos MGIT 960 INGRESO O EGRESO DE TUse limpian con un chorro de CO2 al 10% y se BOS O GRADILLAS
1.Ingreso de los tubos o gradillas al equipo (este
cierran con tapones de polipropileno.
Formula aproximada por L de agua purificada procedimiento no es realizado por nosotros)
A.Ingreso desde el instrumento
del tubo indicador de crecimiento BBL-MGIT:
Pg. 86
Despus del ingreso de los tubos, el instrumento automticamente realizara la lectura de los
tubos cada hora durante el tiempo necesario para la interpretacin del procedimiento.
MANTENIMIENTO DIARIO MGIT 960
Verificar luces internas y externas:
Correcto funcionamiento
Pg. 87
Verificar de Temperatura
Correcto funcionamiento
Pg. 88
Registrar los resultados
con una amina primaria o secundaria (anilina).

Kilburn y Kubica modificaron utilizando una tira
9. MTODOS DE IDENTIFICACIN
impregnada con los reactivos. El tiocianato potsico acidificado con cloramina T libera cloruro
9.1. TEST DE CIDO NICOTNICO PARA de ciangeno, el cual reacciona con cido niTB BBL TAXO (NIACINA)
cotnico y produce un color amarillo. Si no hay
cido nicotnico no aparece ningn color.
Principio
Materiales
Las tiras de anlisis de cido nicotnico para TB Las tiras de anlisis de cido nicotnico para
contienen reactivos para la deteccin de la pro- TB BBL Taxo son tiras de papel absorbente imduccin de cido nicotnico por micobacterias. pregnadas con tiocianato potsico, cloramina
Se utiliza el control de cido nicotnico para TB T, cido citrco y aminosalicilato de sodio.
BBL taxo como control positivo en el anlisis de
cido nicotnico.
Los discos de papel control estn impregnados
con nicotinamida. Cuando se usan siguiendo
Todas las micobacterias producen cido nico- las instrucciones, producen una solucin amatnico, o niacina, sustancia que desempea rilla equivalente aproximadamente a 5 ug de
un papel esencial en las reacciones de oxida- cido nicotnico.
cin-reduccin. Debido al bloqueo de una va Medios de cultivos.
metablica, M. tuberculosis y ciertas cepas ais- Agua destilada o desionizada estril o soluladaS de M. simiae y de M. chelonae producen cin salina 0.85% estril.
las mayores cantidades de este compuesto. El Tubos estriles de 13 x 75 mm.
cido nicotnico se acumula en los medios de Tapones para tubo.
cultivo en los que estn creciendo los microor- Pipetas de trasferencia estril.
ganismos y puede extraerse de dichos medios. Pinzas.
El cido nicotnico producido por el microorga- Cepas para control de Calidad
nismo reacciona con el bromuro de ciangeno y
Pg. 89
jo en cada uno de los tubos (control positivo,

control negativo, muestra) y taparlos inmediaAlmacenamiento: Conservar las tiras a 2 a 8 tamente.
C. La fecha de vencimiento es vigente para el d. Mezclar gentilmente pero no agitar. Repetir
producto cuando est envasado en su recipien- este movimiento despus de 5 a 10 min.
te intacto y ha sido conservado segn las ins- e. Despus de 15 min. pero no ms de 30 min.,
trucciones.
comparar el color de los extractos
f. Autoclavear y descartar los tubos despus de
Preparacin de la muestra
completar la prueba.
Agregar 1.5 ml de solucin salina 0.85% o
agua desmineralizada estril a un cultivo de 3-4
semanas de crecimiento con al menos 50 a 100
colonias.
Frotar con un asa plstica estril sobre el crecimiento para permitir la extraccin de la niacina. No utilizar cultivos contaminados.
Inclinar los tubos de modo que la superficie
del medio est en posicin horizontal y cubierta
con el lquido utilizado. Permitir que permanezca en esta posicin por 20 a 30 minutos.
Cuidadosamente remover aproximadamente
0.6 ml del extracto de cada muestra con una
pipeta estril y transferirlo a un tubo de 13 x 75
mm.
a. Preparacin de controles
* Positivo:
-Colocar 0.6 ml de solucin salina 0.85%
agua desmineralizada estril en un tubo de 13
x 75 mm
-Agregar uno de los discos control de niacina,
tapar y agitar moderadamente 3 veces por 15
min.
-Rotular como control positivo.
*Negativo:
-Colocar 0.6 ml de solucin salina 0.85%
agua desmineralizada estril en un tubo de 13
x 75 mm
- Rotular como control negativo.
Procedimiento
a. Procesar el cultivo como se indica en preparacin de la muestra y colocar 0.6 ml del extracto de cada muestra en tubos de 13 x 75 mm
b. Mantener a mano los tubos control positivo y
negativo
c. Utilizando pinzas flameadas, dejar caer una
tira del test de niacina, con la flecha hacia aba-
Resultados
Un resultado positivo para el test de niacina se
evidencia por la aparicin de color amarillo en
el extracto de la muestra y en el control positivo;
la ausencia de color en el control negativo.
Precauciones
nicamente cultivos de 3 a 4 semanas de crecimiento con al menos 50 a 100 colonias deben

usarse en el test de produccin de niacina. Una
menor cantidad de colonias puede dar resultados negativos o dudosos.
No deben utilizarse cultivos contaminados.
Deben observarse las precauciones para el
manejo de Mycobacterium tuberculosis al realizar sta prueba.
Los tubos tapados deben ser autoclaveados
despus de completar la prueba.
Limitaciones
Aunque un resultado fuertemente positivo para
el test de niacina en micobacterias no cromognicas, es altamente indicativo de Mycobacterium tuberculosis se considera nicamente una
identificacin preliminar de este organismo. La
identificacin completa y final de Mycobacterium tuberculosis y otras micobacterias clnicamente significativas se basa en los resultados
obtenidos en una batera de informacin que incluye test bioqumicos, patrones de susceptibilidad antibitica y caractersticas morfolgicas.
Pg. 90
Se considera que los medios de cultivo desarrollados en medios a base de huevo son los que
producen los resultados ms homogneos, se
obtienen resultados satisfactorios con agar de
Middlebrook y Cohn suplementado con cido
asprtico al 0.1 %.
9.2. TIRAS BBL TAXO PARA PRUEBA

DE NITRITOS
Principio
Se utilizan para detectar los microorganismos
nitrato reductasa positivos, especialmente micobacterias en la prueba de reduccin de nitrato.
La capacidad que tiene la micobacteria de reducir los nitratos a nitritos es til para diferenciarlas. Esta prueba separa las micobacerias
de crecimiento lento que son nitrato positivas
como ejemplo M. tuberculosis, M. kansasii y
M. fortuitum de las de crecimiento rpido que
son negativas o dbilmente positivas como por
ejemplo M. bovis, M. avium complex y M. intracellulare.
La presencia de la enzima nitrato reductasa se
detecta por la produccin de un producto final
coloreado.
Materiales
Las tiras BBL Taxo para prueba de nitrito son
tiras de papel absorbente impregnadas de nitrato sdico tamponado, cido ctrico, yoduro
potsico y almidn.
Medios de cultivos.
Agua destilada o desionizada estril.
Tubos estriles de 20 x 110 mm con tapn de
rosca.
Pipetas de trasferencia o esptula.
Pinzas.
Incubadora.
Cepas para control de Calidad
Almacenamiento
Conservar las tiras de 2 a 8 C. No exponer
a humedad y temperaturas elevadas. Proteger
de la luz, las tiras son fotosensibles. La fecha
de vencimiento es vigente para el producto
cuando est envasado en su recipiente intacto
y ha sido conservado segn las instrucciones.
Procedimiento
a. Utilice un cultivo de 3 4 semanas hecho en
medio de Lowenstein-Jensen, medio Petragnani u otro medio de huevo coagulado.
b. Aada 0.5 ml de agua destilada a un tubo
limpio de 20x110mm con tapn de rosca.
c. Utilizando una pipeta estril de 1 mL o una
esptula, saque dos agregados de colonias del
cultivo. Aada las colonias al agua destilada y
disperse las colonias utilizando la pipeta o la esptula. Alternativamente, aada 1.5 ml de solucin salina estril en cada cultivo inclinado y remueva el cultivo para una suspensin espesa.
Transfiera 0.5 ml de esta suspensin de cultivo
a un tubo vaco y estril para analizar.
d. Con las pinzas esterilizadas al fuego, aada
cuidadosamente una tira BBL Taxo para prueba de nitrito al tubo. Oriente la tira para poder
introducir primero la parte inferior de la misma,
sealada con una flecha, en el tubo. Sostenga
el tubo en sentido vertical.
e. Cierre el tubo con el tapn e incbelo a 35 +/2C durante 2 horas. Agite el tubo suavemente
al concluir la primera y la segunda hora de incubacin. No incline el tubo
f. Despus de 2 horas de incubacin, incline el
tubo cuidadosamente de un lado a otro 6 veces
para humedecer la tira entera. Inclnelos tubos
a temperatura ambiente para cubrir la tira con el
lquido. Deje los tubos en esta posicin durante
10 min.
Resultados
El cambio del color de la parte superior de la tira
a azul claro o azul oscuro indica la reduccin
de nitrato. La ausencia de un cambio de color
indica una reaccin negativa.
Control de Calidad
Especificaciones de la identidad, las tiras de papel blancas con flecas negras apuntando hacia
abajo.
Respuesta del cultivo: Prepare tubos con agua
destilada. Inoclelos con los organismos a analizar.
Pg. 91
Introduzca las tiras en los tubos con la flecha

apuntando hacia abajo. Incube a 35 +/- 2C
durante 2 horas. La presencia del color azul
en la parte superior de la tira indica una reaccin positiva.
anticuerpo-conjugado coloide dorado, se une

al antgeno MPT64 en la muestra, en medio
lquido.
El complejo entonces continua fluyendo y se
une al anti- MPT64 monoclonal de ratn sobre
la fase slida en la lnea de prueba, produciendo una banda de color de rojo a purpura. En
ausencia del MPT64 no hay lnea en la regin
de banda de prueba.
Materiales y Reactivos
Limitaciones
La prueba de reduccin de nitrato es valiosa
para l identificacin de M. tuberculosis y otras
micobacterias clnicamente significativas. Sin
embargo, esta prueba es slo una parte de la
batera bioqumica necesaria para la identificacin preliminar de estos organismos.
9.3.
DETECCIN
MPT64
DE
ANTGENO
Principio
Prueba de casete que consta de una almohadilla para la muestra, una almohadilla de conjugado dorado, una membrana de nitrocelulosa
y una almohadilla absorbente. Los anti-MPT64
monoclonal de ratn estn inmovilizados sobre la membrana de nitrocelulosa como material de captura (lnea del test). Tiene aadidos otros anticuerpos los cuales reconocen
otros eptopes del MPT64, conjugados con las
partculas del coloide dorado, fueron usados
para la captura del antgeno y la deteccin en
un ensayo tipo sndwich. El dispositivo de la
prueba rpida SD BIOLINE Ag MPT64 tiene
una letra C (Lnea control) y la letra T (Lnea
de prueba) sobre la superficie del casete.
Ambas lneas, control y test no son visibles
en la ventana de resultado antes de la aplicacin de cualquier muestra. La Lnea Control
es usada como control del procedimiento. La
lnea control debe siempre aparecer si el procedimiento de prueba es realizada adecuadamente y los reactivos de prueba de la lnea
control estn funcionando. Cuando la muestra
es aplicada en el pozo de muestras, esta fluye lateralmente a travs de la membrana, el
Dispositivo de prueba individualmente empacado en una bolsa de aluminio con un desecante

Buffer de extraccin (para preparacin de
muestras a partir de cultivos slidos).
Instrucciones de uso.
Procedimiento
a. Retirar el dispositivo de prueba de su bolsa de aluminio y ubquelo sobre una superficie
plana y seca.
b. Adicionar 100l del cultivo lquido (o 100l
del cultivo solido suspendido en buffer) dentro
del pozo de muestra.
c. Cuando la prueba comience a correr, se
ver el color purpura desplazndose a travs
de la ventana de resultados en el centro del
dispositivo de prueba.
d. Interprete los resultados de prueba 15 minutos despus de la aplicacin de la muestra.
Pg. 92
Resultados
La hibridacin incluye los siguientes pasos: desnaturalizacin qumica del producto a amplificar;
hibridacin de amplicones de una sola cadena,
marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adicin de conjugado
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
reaccin de tincin mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa molecular)
Bao de agua
Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
ADN polimerasa termoestable con tampn (recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase de
Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Precauciones
Todos los procedimientos se deben realizar en Pinzas
campanas biolgicamente seguras. Use tubos Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 L
de ensayo con tapa para evitar infeccin del Plataforma de agitacin/TwinCubator
usuario cuando requiera de cultivos con mues- Probeta graduada
Puntas de pipeta desechables con filtro
tras.
Reactivos para extraccin de ADN, as como
9.4. IDENTIFICACIN DE ESPECIES equipos necesarios
COMUNES DE MICOBACTERIAS (Ge- Termociclador (rango de calentamiento 3C/
seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
noType Mycobacterium CM)
+/0,2C)
Termmetro calibrado
PRINCIPIO
El kit GenoType Mycobacterium CM (Common Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
Mycobacteria) est basado en la tecnologa
DNASTRIP y permite la identificacin de las si- 1. Preparacin de muestra y controles (si apliguientes especies de micobacterias: M. avium can controles)
ssp., M. chelonae, M. abscessus, M. for- Las muestras para extraccin son a partir de
tuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, en 300 L agua ultrapura libre de DNasa y RNaM. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. sa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
ulcerans, M. tuberculosis complex, y M. xenopi. Las muestras tambin pueden extraerse a partir
El procedimiento completo se divide en tres pa- de cultivos positivos en medio lquido, se traslasos: extraccin de ADN procedente de cultivo da 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridacin reversa.
Pg. 93
5 L 10x de tampn para incubacin de poliPROCEDIMIENTO

merasa no suministrado.
x L de solucin MgCl21) no suministrado
EXTRACCIN DE ADN
1-2 unidades de DNA polimerasa termoestaPuede usarse un crecimiento bacteriano en ble (consulte el manual) no suministrado
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- y L de agua para obtener un volumen de 45
ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, l (sin considerar el volumen de enzima) no
MB-Check). Este test no puede usarse para suministrado.
detectar micobacterias directamente de mues- Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng
tras de pacientes. La zona de trabajo ha de es- de ADN) para obtener un volumen final de 50
tar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- L (sin considerar el volumen de enzima).
lentamiento de las muestras a 95C durante,
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar 1) Dependiendo del sistema enzima/tampn
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- usado, la concentracin ptima de MgCl2 puequier procedimiento de extraccin de ADN que de variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta
produzca ADN de bacterias amplificable. El si- que algunos tampones para incubacin ya conguiente protocolo rpido normalmente produce tienen MgCl2.
ADN adecuado para amplificacin:
La evaluacin del rendimiento del ensayo Ge1a. Cuando use crecimiento bacteriano en me- noType Mycobacterium CM fue realizada utilidio slido, recoja bacterias con un asa de ino- zando la Polimerasa HotStarTaq ADN de Qiaculacin y suspndalas en aproximadamente gen. Las cantidades necesarias por muestra
300 L de agua (grado Biologa Molecular).
cuando utilice esta enzima son las siguientes:
1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio lquido, aplique directamente 35 L de PNM suministrado
1 mL. Concentre las bacterias mediante centri- 5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (confugacin 15 min en una centrfuga de sobreme- tien e 15 mM de MgCl2) no suministrado
sa en un rotor con contenedor de aerosoles y 2 L 25 mM de solucin MgCl2 no suminisen una cabina de seguridad de clase II a 10000 trado
x g aproximadamente. Deseche el sobrenadan- 0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado
te y resuspenda las bacterias en 100-300 L de 3 L de agua (para uso en biologa molecular)
agua (ver ms arriba) con un vrtex.
no suministrado
2 Incube las bacterias procedentes del aparta- 5 L de solucin de DNA (aada el ADN en
do 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao una zona distinta)
de agua.
La concentracin final de MgCl2 en la mezcla
3 Incube durante 15 min en un bao de ultra- de amplificacin ser de 2,5 mM.
sonidos.
4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci- Determine el nmero de muestras a amplificar
dad y utilice directamente 5 L del sobrenadan- (nmero de muestras a analizar ms las mueste para la PCR. En caso de que la solucin de tras de control). Por ejemplo, un control de conADN haya de almacenarse por perodos pro- taminacin contiene 5 L de agua en lugar de
longados de tiempo, transfiera el sobrenadante solucin de ADN. Prepare una mezcla que cona un tubo nuevo.
tenga todos los reactivos excepto la solucin de
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex.
AMPLIFICACIN
Alicuote la mezcla madre en volmenes de 45
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en l en tubos preparados de PCR.
una habitacin libre de ADN. La muestra debe
aadirse en un rea separada.
Mezcle por tubo:
35 L de PNM suministrado
Pg. 94
2) Perfil de amplificacin
Los productos para amplificacin pueden almacenarse entre +8 y 20C.

Para comprobar la reaccin de amplificacin,
aplique directamente 5 L de cada muestra a
un gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Gnero)
y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especfico).
HIBRIDACIN
Preparacin
Precaliente en bao de agua con agitacin o
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin tolerada en la temperatura idnea es de +/1C.
Precaliente las soluciones HYB y STR a 3745C antes de usar.
Los reactivos han de estar libres de precipitado
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario.
Caliente a temperatura ambiente los restantes reactivos, con la excepcin del CON-C y
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
con sus tampones respectivos (CON-C con
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperatura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si
se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz.
1.Dispense 20 L de la Solucin de Desnaturalizacin (DEN, azul) en una esquina de cada
uno de los pocillos usados.

2. Aada a la solucin 20 L de muestra amplificada, pipetee arriba y abajo para mezclar
bien e incube a temperatura ambiente durante
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos
usando pinzas e identifquelas marcando bajo
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siempre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) precalentado. Agite suavemente la bandeja hasta
que la solucin tenga un color homogneo.
Tenga la precaucin de no derramar solucin
en los pocillos cercanos.
4. Ponga una tira en cada pocillo.
Las tiras tienen que quedar completamente cubiertas por la solucin y el lado con la sonda
hacia arriba (identificable por el marcador coloreado prximo al extremo inferior). Usando
pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran haberse girado durante su inmersin. Limpie cuidadosamente las pinzas despus de cada uso
para evitar contaminacin. Ello, es tambin de
aplicacin en los pasos siguientes.
5. Ponga la bandeja en el bao de agua con
agitacin o en el TwinCubator durante 30 minutos a 45C.
Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de
agua para que realice una mezcla completa y
constante de la solucin. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
su altura.
6. Aspire completamente el Tampn de Hibridacin.
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
a una bomba de vaco.
7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astringente (STR, roja) a cada tira e incube durante
15 minutos a 45C en un bao con agitacin o
TwinCubator.
Desde este paso, en adelante, trabaje a temperatura ambiente. Elimine completamente la
Solucin de Lavado Astringente.
Deseche la Solucin de Lavado en un contenedor y elimine todo el lquido restante volcando
la bandeja y golpendola suavemente sobre un
papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin
a todos los dems pasos de lavado.
Pg. 95
8.Lave una vez cada tira con 1 mL de Solucin

de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN despus
de la incubacin).
9. Aada 1 mL de Conjugado diludo (ver ms
arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
10. Elimine la solucin y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
aproximadamente con 1 mL de agua destilada (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma
de agitacin del TwinCubator (deseche la solucin cada vez).
Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
despus del lavado anterior.
11. Aada 1 mL de sustrato diludo (ver ms
arriba) a cada tira e incube sin agitacin y protegindolas de la luz.
Dependiendo de las condiciones del test (por
ej. la temperatura ambiente), el tiempo de incubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20
minutos. Tiempos prolongados de incubacin
del sustrato pueden conducir a una tincin incrementada del fondo y podra dificultar la interpretacin de los resultados.
12. Detenga la reaccin aclarando brevemente
por dos veces con agua destilada.
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bandeja y squelas entre dos capas de papel absorbente.
RESULTADOS E INTERPRETACIN
Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la
luz. Con cada kit se proporciona un formulario
de evaluacin. Cuando se utilice este formulario de evaluacin, pegue las tiras reveladas en
los campos marcados, alineando las bandas
CC y UC con las respectivas lneas del formulario. Anote el nmero de las bandas positivas
en la penltima columna y determine la especie
con la ayuda de la tabla de interpretacin y registre el nombre de las especies identificadas
en la ltima columna. La plantilla suministrada
tambin sirve como ayuda para evaluacin y
ha de ser alineada con las bandas UC y CC de
la tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de
reaccin (ver esquema).
Control de Conjugado (CC)

Debe aparecer una lnea en esta zona, documentando la eficacia del conjugado unido y la
reaccin del sustrato.
Control Universal (UC)
Esta zona detecta, como es conocido, todas
las micobacterias y miembros del grupo de
bacterias gram-positivas con alto contenido de
G+C. Si esta zona y el Control de Conjugado
se tien como positivas, pero el restante esquema de bandas no puede ser asignado a
una micobacteria especfica, se deben aplicar
mtodos adicionales para identificar la especie bacteriana correspondiente.
Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o
ms fuertes, que la intensidad del Control Universal.
Control de Gnero (GC)
La coloracin en esta zona documenta, como
conocida, la presencia de un miembro del gnero Mycobacterium. La intensidad de esta
banda vara dependiendo de la especie de Micobacteria.
La banda del Control de Gnero puede desaparecer a pesar de la presencia de DNA micobacteriano; sin embargo, siempre que est
presente un patrn de bandeo especfico de
especie, la reaccin de amplificacin se llev
acabo correctamente y el resultado del ensayo
es vlido.
Pg. 96
Cuando no aparece patrn de bandas especfico de especie, un patrn que indique la presencia de una bacteria gram-positiva con alto
contenido en G+C puede, en casos raros, estar
originado por una Micobacteria que no puede
ser detectada por este kit. Por favor, tenga en
cuenta que puede identificar especias adicionales de micobacterias con el kit GenoType Mycobacterium AS.
PRECAUCIONES
Almacene la Mezcla del Primer/Nucletido
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cualquier fuente potencial de DNA contaminante. Si
se requiere almacenar durante ms de 4 semanas, almacene a 20C. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote
el PNM. Almacene el resto de los componentes
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus de su fecha de caducidad.
Los especmenes de los pacientes y los cultivos realizados a partir de especmenes de pacientes deben ser considerados siempre como
potencialmente infecciosos. Las muestras de
Otras bandas
Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
tabla de interpretacin.
No todas las bandas de una tira han de mostrar
la misma intensidad.
Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
pueden aparecer bandas adicionales.
TABLA DE INTERPRETACIN
pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
cultivos realizados a partir de esas muestras
deben ser etiquetados y manejados siempre
bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
de acuerdo con las guas institucionales. Observe todas las normas medioambientales y de
seguridad, tanto federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparacin de la muestra, incluyendo el paso de inactivacin por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II.
Pg. 97
Antes del paso de inactivacin por calor las

muestras deben ser centrifugadas en un rotor
con contenedor de aerosoles. Abrir el rotor con
contenedor de aerosoles solamente en la cabina de seguridad. Despus de la inactivacin
por calor se puede utilizar un rotor standard
para centrifugar las muestras fuera de la cabina
de seguridad.
Observe las precauciones normales para preparar la amplificacin. Es esencial que todos los
materiales y reactivos usados para extraccin
de DNA y amplificacin estn libres de DNasas.
Cuando manipule los reactivos del kit debe tomar las siguientes medidas especiales de seguridad:
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y piel.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Dimetil Sulfxido y es irritante.
personas cualificadas, bien entrenadas en el

procedimiento de utilizacin del ensayo y familiarizadas con mtodos de biologa molecular.
La evaluacin de este sistema de anlisis fue
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polimerasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
caractersticas de rendimiento de este ensayo
no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario es
el encargado de evaluar la aplicabilidad de otras
polimerasas distintas de las arriba mencionadas.
9.5. IDENTIFICACIN DE ESPECIES
ADICIONALES (GenoType Mycobacterium AS)
PRINCIPIO
El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal
Species) est basado en la tecnologa DNASTRIP y permite la identificacin de las siguientes
especies de micobacterias:
M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.
LIMITACIONES
celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
Los miembros del M. tuberculosis complex no lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
pueden ser diferenciados.
intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M. kanAntes de la amplificacin, el DNA ha de ser ais- sasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum, y M.
lado de cultivo bacteriano realizado por un m- shimoidei.
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que El procedimiento completo se divide en tres pala muestra de DNA ha sido amplificada eficien- sos: aislamiento de ADN procedente de cultivo
temente durante la reaccin de amplificacin.
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos
El test slo funciona dentro de los lmites de las necesarios no se suministran), una amplificaregiones genmicas para las que los primers cin mltiplex con primers marcados con biotina
y sondas han sido elegidos. El anlisis de se- (la ADN polimerasa termoestable no se incluye),
cuencias potenciales permanece reservado y una hibridacin reversa.
para la reanudacin de investigaciones.
La hibridacin incluye los siguientes pasos: desLa presencia de mltiples especies de bacte- naturalizacin qumica del producto a amplificar;
rias en la muestra a analizar puede dificultar la hibridacin de amplicones de una sola cadena,
interpretacin de resultados.
marcados con biotina, a sondas unidas a memComo cualquier sistema de deteccin basado brana; lavado astringente; adicin de conjugado
en la hibridacin, este sistema contempla la po- de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
sibilidad de que variaciones de las secuencias reaccin de tincin mediada por AP. Una plantien las regiones genmicas que fueron elegidas lla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
para los primers y sondas, y la deteccin de re- esquema de bandas obtenido.
giones para las cuales el kit no fue diseado,
pueden conducir a resultados falsos. Debido a MATERIALES
la gran variabilidad existente en los genomas Agua destilada (para uso en biologa molecubacterianos es posible que ciertos sub-tipos lar)
puedan no ser detectados. El test refleja los co- Bao de agua
nocimientos de Hain Lifescience.
La utilizacin de este ensayo est limitada a Bao de ultrasonidos
Pg. 98
Centrfuga de mesa
Cronmetro
ADN polimerasa termoestable con tampn
(recomendacin: HotStarTaq DNA Polymerase
de Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Pinzas
Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
Plataforma de agitacin/TwinCubator
Probeta graduada
equipos necesarios
Termociclador (rango de calentamiento 3C/
+/0,2C)
Termmetro calibrado
Tubos para PCR, libres de DNasa y RNasa
PREPARACIN DE LA MUESTRA
Las muestras para extraccin son a partir de
colonias aisladas de cultivo slido, suspendidas
en 300 l agua ultrapura libre de DNasa y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y RNsa.
Las muestras tambin pueden extraerse a partir
de cultivos positivos en medio lquido, se traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR, libre de
DNasa y RNasa.
PROCEDIMIENTO
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, MBCheck). Este test no puede usarse para detectar
micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de
ADN amplificado. Es crucial el calentamiento
de las muestras a 95C durante, al menos, 20
minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de ADN que produzca ADN de
bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce ADN adecuado para
amplificacin:
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio slido, recoja las colonias de bacterias con
un asa de inoculacin y suspndalas en aproximadamente 300 l de agua (grado Biologa

Molecular).
1b. Cuando use crecimiento bacteriano procedente de medio lquido, aplique directamente 1
ml. Concentre las bacterias mediante centrifugacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
en un rotor con contenedor de aerosoles y en
una cabina de seguridad de clase II a 10000 x
g aproximadamente. Deseche el sobrenadante
y resuspenda las bacterias en 100-300 L de
2. Incube las bacterias procedentes del apartado 1a o 1b durante 20 min a 95C en un bao
de agua.
3 Incube durante 15 min en un bao de ultrasonidos.
4 Centrifugue durante 5 min a mxima velocidad y utilice directamente 5 l del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solucin de
ADN haya de almacenarse por perodos prolongados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
un tubo nuevo.
AMPLIFICACIN
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en
Mezcle por tubo:
5 L 10x de tampn para incubacin de polimerasa no suministrado.
x L de solucin MgCl 1) no suministrado
1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable
(consulte el manual) no suministrado
y L de agua para obtener un volumen de 45
l (sin considerar el volumen de enzima) no
suministrado.
Aada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de
ADN) para obtener un volumen final de 50 L
(sin considerar el volumen de enzima).
1) Dependiendo del sistema enzima/tampn
usado, la concentracin ptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
algunos tampones para incubacin ya contienen MgCl .
La evaluacin del rendimiento del ensayo GenoType Mycobacterium AS fue realizada utilizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qiagen.
Las cantidades necesarias por muestra cuando
utilice esta enzima son las siguientes:
Pg. 99
5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contiene 15 mM de MgCl2) no suministrado
2 L25 mM de solucin MgCl2 no suministrado
0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado
3 L de agua (para uso en biologa molecular)
no suministrado
5 L de solucin de DNA (aada el DNA en
una zona distinta)
La concentracin final de MgCL2 en la mezcla
de amplificacin ser de 2,5 mM.
Determine el nmero de muestras a amplificar
(nmero de muestras a analizar ms las muestras de control). Por ejemplo, un control de contaminacin contiene 5 L de agua en lugar de
solucin de ADN. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solucin de
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
mezcla madre en volmenes de 45 L en tubos
preparados de PCR.
2) Perfil de amplificacin *)
Los productos para amplificacin pueden almacenarse entre20CY 8 C

aplique directamente 5 l de cada muestra a un
gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn
de carga. Los amplicones tienen una longitud
aproximada de 230 pb (Control de Gnero) y
200 pb (Control Universal/amplicon especie-especfico).
HIBRIDACIN
Preparacin
concentrado a 1 mlL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si
se almacena a temperatura ambiente y se protege de la luz.
1. Dispense 20 L de la Solucin de Desnaturalizacin (DEN, azul) en una esquina de cada
Pg. 100

agua para que realice una mezcla completa
y constante de la solucin. Para obtener una
adecuada transferencia de calor, la bandeja
debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3
de su altura.
TwinCubator.
8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solucin
de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitado del TwinCubator (elimine el RIN despus de
la incubacin).
aproximadamente con 1 ml de agua destilada
(ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
agitacin del TwinCubator (deseche la solucin
cada vez).
del sustrato pueden conducir a una tincin in-
crementada del fondo y podra dificultar la interpretacin de los resultados.

de evaluacin. Cuando se utilice este formulario de evaluacin, pegue las tiras reveladas en
los campos marcados, alineando las bandas
CC y UC con las respectivas lneas del formulario. Anote el nmero de las bandas positivas
en la penltima columna y determine la especie
con la ayuda de la tabla de interpretacin y registre el nombre de las especies identificadas
en la ltima columna. La plantilla suministrada
tambin sirve como ayuda para evaluacin y ha
de ser alineada con las bandas UC y CC de la
tira. Cada tira tiene un total de 17 zonas de reaccin (ver esquema).

Esta zona detecta, como es conocido, todas las
micobacterias y miembros del grupo de bacterias gram-positivas con alto contenido de G+C.
Si esta zona y el Control de Conjugado se tien
como positivas, pero el restante esquema de
bandas no puede ser asignado a una micobacteria especfica, se deben aplicar mtodos adicionales para identificar la especie bacteriana
correspondiente.
Pg. 101

La coloracin en esta zona documenta, como cuenta que puede identificar especias adicionaconocida, la presencia de un miembro del g- les de micobacterias con el kit GenoType Myconero Mycobacterium. La intensidad de esta bacterium AS.
Otras bandas
La banda del Control de Gnero puede desapa- Sondas Especficas; para la evaluacin ver la
recer a pesar de la presencia de DNA micobac- tabla de interpretacin.
teriano; sin embargo, siempre que est presente un patrn de bandeo especfico de especie, No todas las bandas de una tira han de mostrar
la reaccin de amplificacin se llev acabo co- la misma intensidad.
rrectamente y el resultado del ensayo es vlido. Si fue usada una gran cantidad de amplicn,
Cuando no aparece patrn de bandas espec- pueden aparecer bandas adicionales.
fico de especie, un patrn que indique la presencia de una bacteria gram-positiva con alto TABLA DE INTERPRETACIN
Cuando utilice bacterias crecidas en medio lquido, la contaminacin bacteriana puede posiblemente generar el mismo patrn de bandas.
Este resultado, por tanto, es vlido nicamente
cuando el DNA fue aislado del crecimiento bacteriano en medio slido (colonias individuales/
idntica morfologa de colonias).
Pg. 102
2) M. nebraskense muestra el mismo patrn de

bandas que M. haemophilum.
3) Si se genera este patrn de bandas con el
kit GenoType Mycobacterium AS, se puede diferencia entre M. szulgai y M. intermedium utilizando GenoType Mycobacterium CM.. M szulgai mostrar bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10
y 11, y M. Intermedium mostrar bandeo en las
bandas 1, 2, 3 y 10.
4) Debido a variaciones de secuencia M. kansasii puede producir 4 patrones diferentes de
bandeo.
PRECAUCIONES
se requiere almacenar durante ms de 4 semanas, almacene a 20C. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el
PNM. Almacene el resto de los componentes del
kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus de
su fecha de caducidad.
Los especmenes de los pacientes y los cultivos
realizados a partir de especmenes de pacientes
deben ser considerados siempre como potencialmente infecciosos. Las muestras de pacien-
tes de riesgo (infectados por microorganismos

patgenos incluyendo Hepatitis B y Virus de
Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cultivos
realizados a partir de esas muestras deben ser
etiquetados y manejados siempre bajo las condiciones de seguridad adecuadas, de acuerdo
con las guas institucionales. Observe todas las
normas medioambientales y de seguridad, tanto
federales, estatales como locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
El tratamiento y preparacin de la muestra, incluyendo el paso de inactivacin por calor, deben ser llevados a cabo en una cabina de seguridad de clase II. Antes del paso de inactivacin
por calor las muestras deben ser centrifugadas
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir
el rotor con contenedor de aerosoles solamente
en la cabina de seguridad. Despus de la inactivacin por calor se puede utilizar un rotor standard para centrifugar las muestras fuera de la
cabina de seguridad.
Pg. 103
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y
piel.
LIMITACIONES
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser aislado de cultivo bacteriano realizado por un mtodo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que
la muestra de ADN ha sido amplificada eficientemente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de
las regiones genmicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El anlisis de
secuencias potenciales permanece reservado
La presencia de mltiples especies de bacterias en la muestra a analizar puede dificultar la
Como cualquier sistema de deteccin basado
en la hibridacin, este sistema contempla la
posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genmicas que fueron
elegidas para los primers y sondas, y la deteccin de regiones para las cuales el kit no fue
diseado, pueden conducir a resultados falsos.
Debido a la gran variabilidad existente en los
genomas bacterianos es posible que ciertos
subtipos puedan no ser detectados. El test refleja los conocimientos de Hain Life- science.
La utilizacin de este ensayo est limitada a
no han sido validadas para todas las polimerasas disponibles comercialmente, el usuario
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de
otras polimerasas distintas de las arriba mencionadas.
9.6. IDENTIFICACIN DEL COMPLEJO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
(GenoType MTBC)
PRINCIPIO
El kit GenoType MTBC est basado en la tecnologa DNASTRIP que permite en base a los
polimorfismos genticos, por los que la ADN
girasa B diferencia genticamete de especies/
cepas pertenecientes al grupo Mycobacterium
tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis
BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae,
M. microti, y M. tuberculosis/M. canettii.
El procedimiento completo se divide en tres pasos: extraccin de ADN procedente de cultivo
necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con biotina (la ADN polimerasa termoestable no se incluye), y una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos:
desnaturalizacin qumica del producto a amplificar; hibridacin de amplicones de una sola
cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
a membrana; lavado astringente; adicin de
conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
(AP), y una reaccin de tincin mediada por AP.
Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y
rpida del esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
Bao de agua
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
de Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Pinzas
Probeta graduada
Reactivos para extraccin de DNA, as como
equipos necesarios
+/0,2C)

Termmetro calibrado

Tubos para PCR, libres de DNasa y
RNasa
Pg. 104
DNasa y RNasa.
dad y utilice directamente 5 L del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solucin de
un tubo nuevo.
AMPLIFICACIN
Mezcle por tubo:

PROCEDIMIENTO
35 L de AM B suministrado
10 L de AM A- suministrado
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en ADN) para obtener un volumen final de 50 L
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Mi- (sin considerar el volumen de enzima).
ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
MB-Check). Este test no puede usarse para Determine el nmero de muestras a amplificar
detectar micobacterias directamente de mues- (nmero de muestras a analizar ms las muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estras de control). Por ejemplo, un control de contar libre de ADN amplificado. Es crucial el ca- taminacin contiene 5 L de agua en lugar de
lentamiento de las muestras a 95C durante, solucin de ADN. Prepare una mezcla que conal menos, 20 minutos con objeto de inactivar tenga todos los reactivos excepto la solucin de
bacterias vegetativas. Se puede seguir cual- ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
quier procedimiento de extraccin de ADN que mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
produzca ADN de bacterias amplificable. El si- preparados de PCR.
guiente protocolo rpido normalmente produce
ADN adecuado para amplificacin:
Molecular).
mL. Concentre las bacterias mediante centrifugacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
de agua.
4 Centrifugue durante 5 min a mxima veloci-
Los productos para amplificacin pueden almacenarse entre 20C y 8C.

aplique directamente 5 L de cada muestra
a un gel de agarosa al 2% sin la adicin de
tampn de carga. Los amplicones tienen una
longitud aproximada de 230 pb (Control de Gnero) y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especfico).
Pg. 105
HIBRIDACIN
Preparacin
concentrado a 1 mL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso. El
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas
si se almacena a temperatura ambiente y se
protege de la luz.
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos usando pinzas e identifquelas marcando
bajo el marcador coloreado con un lpiz. Lleve
siempre guantes cuando manipule tiras.

agua para que realice una mezcla completa
y constante de la solucin. Para obtener una
adecuada transferencia de calor, la bandeja
debe estar sumergida en el agua, al menos, 1/3
de su altura.
TwinCubator.
papel absorbente. Ello es tambin de aplicacin a todos los dems pasos de lavado.
la incubacin).
cada vez).
minutos.
Pg. 106
Tiempos prolongados de incubacin del sustrato pueden conducir a una tincin incrementada
del fondo y podra dificultar la interpretacin de
los resultados.
de evaluacin. Cuando se utilice este formulario
de evaluacin, pegue las tiras reveladas en los
campos marcados, alineando las bandas CC
y UC con las respectivas lneas del formulario.
Anote el nmero de las bandas positivas en la
penltima columna y determine la especie con
la ayuda de la tabla de interpretacin y registre
el nombre de las especies identificadas en la
ltima columna. La plantilla suministrada tambin sirve como ayuda para evaluacin y ha de
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reaccin
(ver esquema).


correspondiente.
Solamente han de considerarse aquellas bandas cuyas intensidades sean tan fuertes, o ms
fuertes, que la intensidad del Control Universal.
MTBC
Esta zona hibrida, como es conocido, con amplicones generados de todos los miembros conocidos de Mycobacterium tuberculosis complex.
Otras bandas
PRECAUCIONES
(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cualquier fuente potencial de ADN contaminante. Si
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
de su fecha de caducidad.
Pg. 107
en la cabina de seguridad. Despus de la inactivacin por calor se puede utilizar un rotor
standard para centrifugar las muestras fuera de
la cabina de seguridad.
de ADN y amplificacin estn libres de DNasas.
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) contiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y
piel.
LIMITACIONES
El test slo funciona dentro de los lmites de
las regiones genmicas para las que los primers y sondas han sido elegidos. El anlisis de
secuencias potenciales permanece reservado

La presencia de mltiples especies de bacterias en la muestra a analizar puede dificultar la
posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genmicas que fueron
elegidas para los primers y sondas, y la deteccin de regiones para las cuales el kit no fue
diseado, pueden conducir a resultados falsos.
Debido a la gran variabilidad existente en los
genomas bacterianos es posible que ciertos
subtipos puedan no ser detectados. El test refleja los conocimientos de Hain Life- science.
9.5. IDENTIFICACIN DE ESPECIES
ADICIONALES (GenoType Mycobacterium AS)
PRINCIPIO
El kit GenoType Mycobacterium AS (Additinonal Species) est basado en la tecnologa
DNASTRIP y permite la identificacin de las
siguientes especies de micobacterias:
M. simiae, M. mucogenicum, M. goodii, M.
celatum, M. smegmatis, M. genavense, M.
lentiflavum, M. heckeshornense, M. szulgai/M.
intermedium, M. phlei, M. haemophilum, M.
kansasii, M. ulcerans, M. gastri, M. asiaticum,
y M. shimoidei.
Pg. 108
El procedimiento completo se divide en tres pasos: aislamiento de ADN procedente de cultivo

necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con biotina
(la ADN polimerasa termoestable no se incluye),
y una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos: desnaturalizacin qumica del producto a amplificar;
hibridacin de amplicones de una sola cadena,
marcados con biotina, a sondas unidas a membrana; lavado astringente; adicin de conjugado
de fosfatasa alcalina/streptavidina (AP), y una
reaccin de tincin mediada por AP. Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y rpida del
esquema de bandas obtenido.
MATERIALES
Bao de agua
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
de Qiagen)
Guantes desechables
Papel absorbente
Pinzas
Probeta graduada
equipos necesarios
+/0,2C)
Termmetro calibrado
DNasa y RNasa.
PROCEDIMIENTO
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC, MBCheck). Este test no puede usarse para detectar
micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de
ADN amplificado. Es crucial el calentamiento
de las muestras a 95C durante, al menos, 20
minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de ADN que produzca ADN de
bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce ADN adecuado para
amplificacin:
Cuando use crecimiento bacteriano en medio
slido, recoja las colonias de bacterias con un
asa de inoculacin y suspndalas en aproximadamente 300 l de agua (grado Biologa Molecular).
de agua.
un tubo nuevo.
AMPLIFICACIN
Pg. 109
Mezcle por tubo:
5 L 10x de tampn para incubacin de polimerasa no suministrado.
x L de solucin MgCl 1) no suministrado
1-2 unidades de DNA polimerasa termoestable (consulte el manual) no suministrado
y L de agua para obtener un volumen de 45
l (sin considerar el volumen de enzima) no
suministrado.
ADN) para obtener un volumen final de 50 L
1) Dependiendo del sistema enzima/tampn
usado, la concentracin ptima de MgCl puede
variar entre 1,5 y 2,5 mM. Tenga en cuenta que
algunos tampones para incubacin ya contienen MgCl .
Los productos para amplificacin pueden almacenarse entre20CY 8 C
La evaluacin del rendimiento del ensayo Ge- Para comprobar la reaccin de amplificacin,
noType Mycobacterium AS fue realizada uti- aplique directamente 5 l de cada muestra a un
lizando la Polimerasa HotStarTaq DNA de Qia- gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn
gen. Las cantidades necesarias por muestra de carga. Los amplicones tienen una longitud
cuando utilice esta enzima son las siguientes:
aproximada de 230 pb (Control de Gnero) y
200 pb (Control Universal/amplicon espe35 L de PNM suministrado
cie-especfico).
5 L 10x PCR Buffer de la HotStarTaq (contiene 15 mM de MgCl2) no suministrado
HIBRIDACIN
2 L25 mM de solucin MgCl2 no suminis- Preparacin
trado
0,2 L (1 U) de HotStarTaq no suministrado TwinCubator a 45C; la mxima desviacin to3 L de agua (para uso en biologa molecular) lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
no suministrado
Precaliente las soluciones HYB y STR a 375 L de solucin de DNA (aada el DNA en 45C antes de usar.
una zona distinta)
La concentracin final de MgCL2 en la mezcla (tenga en cuenta, no obstante que la solucin
de amplificacin ser de 2,5 mM.
Caliente a temperatura ambiente los restanDetermine el nmero de muestras a amplificar tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
(nmero de muestras a analizar ms las mues- el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
tras de control). Por ejemplo, un control de con- Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el
taminacin contiene 5 L de agua en lugar de Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100
solucin de ADN. Prepare una mezcla que con- con sus tampones respectivos (CON-C con
tenga todos los reactivos excepto la solucin de CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperamezcla madre en volmenes de 45 L en tubos tura ambiente. Para cada tira aada 10 L de
preparados de PCR.
concentrado a 1 mlL de los respectivos tampones. Diluya el CON- C antes de cada uso.
Pg. 110

Deseche la Solucin de Lavado en un conteneEl SUB-C diludo es estable durante 4 sema- dor y elimine todo el lquido restante volcando
nas si se almacena a temperatura ambiente y la bandeja y golpendola suavemente sobre un
se protege de la luz.
1. Dispense 20 L de la Solucin de Desnatu- 8. Lave una vez cada tira con 1 mL de Solucin
ralizacin (DEN, azul) en una esquina de cada de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitauno de los pocillos usados.
do del TwinCubator (elimine el RIN despus de
2. Aada a la solucin 20 L de muestra am- la incubacin).
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar 9. Aada 1 mL de Conjugado diludo (ver ms
bien e incube a temperatura ambiente durante arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
usando pinzas e identifquelas marcando bajo 10. Elimine la solucin y lave cada tira dos veel marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem- ces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
pre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 mL aproximadamente con 1 ml de agua destilada
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre- (ej.: botella de lavado) sobre la plataforma de
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta agitacin del TwinCubator (deseche la solucin
cada vez).
Tenga la precaucin de no derramar solucin Asegrese de eliminar cualquier resto de agua
Las tiras tienen que quedar completamente cu- arriba) a cada tira e incube sin agitacin y probiertas por la solucin y el lado con la sonda tegindolas de la luz.
hacia arriba (identificable por el marcador co- Dependiendo de las condiciones del test (por
loreado prximo al extremo inferior). Usando ej. la temperatura ambiente), el tiempo de inpinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran ha- cubacin del sustrato puede variar entre 3 y 20
berse girado durante su inmersin. Limpie cui- minutos. Tiempos prolongados de incubacin
dadosamente las pinzas despus de cada uso del sustrato pueden conducir a una tincin inpara evitar contaminacin. Ello, es tambin de crementada del fondo y podra dificultar la interaplicacin en los pasos siguientes.
pretacin de los resultados.
5. Ponga la bandeja en el bao de agua con 12. Detenga la reaccin aclarando brevemente
agitacin o en el TwinCubator durante 30 minu- por dos veces con agua destilada.
tos a 45C.
13. Usando pinzas, saque las tiras de la bandeAjuste la frecuencia de agitacin del bao de ja y squelas entre dos capas de papel absoragua para que realice una mezcla completa y bente.
constante de la solucin. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe RESULTADOS E INTERPRETACIN
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de Pegue las tiras y almacnelas protegidas de la
su altura.
6. Aspire completamente el Tampn de Hibrida- de evaluacin. Cuando se utilice este formulario
cin.
Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada campos marcados, alineando las bandas CC
y UC con las respectivas lneas del formulario.
7. Aada 1 mL de Solucin de Lavado Astrin- Anote el nmero de las bandas positivas en la
gente (STR, roja) a cada tira e incube durante penltima columna y determine la especie con
15 minutos a 45C en un bao con agitacin o la ayuda de la tabla de interpretacin y registre
TwinCubator.
Desde este paso, en adelante, trabaje a tem- ltima columna.
peratura ambiente. Elimine completamente la
Pg. 111
La plantilla suministrada tambin sirve como

ayuda para evaluacin y ha de ser alineada
con las bandas UC y CC de la tira. Cada tira
tiene un total de 17 zonas de reaccin (ver esquema).
especie, la reaccin de amplificacin se llev

acabo correctamente y el resultado del ensayo
es vlido.
Cuando no aparece patrn de bandas especfico de especie, un patrn que indique la presencia de una bacteria gram-positiva con alto
cuenta que puede identificar especias adicionales de micobacterias con el kit GenoType
Mycobacterium AS.
Otras bandas

correspondiente.
La coloracin en esta zona documenta, como
conocida, la presencia de un miembro del gnero Mycobacterium. La intensidad de esta
La banda del Control de Gnero puede desaparecer a pesar de la presencia de DNA micobacteriano; sin embargo, siempre que est
presente un patrn de bandeo especfico de
Cuando utilice bacterias crecidas en medio lquido, la contaminacin bacteriana puede posiblemente generar el mismo patrn de bandas.
Este resultado, por tanto, es vlido nicamente
cuando el DNA fue aislado del crecimiento bacteriano en medio slido (colonias individuales/
idntica morfologa de colonias).
Pg. 112
2) M. nebraskense muestra el mismo patrn de

bandas que M. haemophilum.
3) Si se genera este patrn de bandas con el
kit GenoType Mycobacterium AS, se puede diferencia entre M. szulgai y M. intermedium utilizando GenoType Mycobacterium CM.. M szulgai mostrar bandeo en las bandas 1, 2, 3, 10
y 11, y M. Intermedium mostrar bandeo en las
bandas 1, 2, 3 y 10.
4) Debido a variaciones de secuencia M. kansasii puede producir 4 patrones diferentes de
bandeo.
PRECAUCIONES
del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
de su fecha de caducidad.
LIMITACIONES
El test slo funciona dentro de los lmites de las
regiones genmicas para las que los primers
y sondas han sido elegidos. El anlisis de secuencias potenciales permanece reservado
La presencia de mltiples especies de bacterias
en la muestra a analizar puede dificultar la interpretacin de resultados.
posibilidad de que variaciones de las secuencias en las regiones genmicas que fueron elegidas para los primers y sondas, y la deteccin
de regiones para las cuales el kit no fue diseado, pueden conducir a resultados falsos.
Pg. 113
MATERIALES
Agua destilada (para uso en biologa moleDebido a la gran variabilidad existente en los cular)
genomas bacterianos es posible que ciertos Bao de agua
subtipos puedan no ser detectados. El test re- Bao de agua con agitacin/TwinCubator
Bao de ultrasonidos
fleja los conocimientos de Hain Life- science.
La utilizacin de este ensayo est limitada a Centrfuga de mesa
personas cualificadas, bien entrenadas en el Cronmetro
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami- ADN polimerasa termoestable con tampn
liarizadas con mtodos de biologa molecular.
La evaluacin de este sistema de anlisis fue de Qiagen)
llevada a cabo utilizando la HotStarTaq polime- Guantes desechables
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las Papel absorbente
caractersticas de rendimiento de este ensayo Pinzas
no han sido validadas para todas las polime- Pipetas ajustables de 10, 20, 200, 1000 l
rasas disponibles comercialmente, el usuario Plataforma de agitacin/TwinCubator
es el encargado de evaluar la aplicabilidad de Probeta graduada
otras polimerasas distintas de las arriba men- Puntas de pipeta desechables con filtro
cionadas.
equipos necesarios
9.6. IDENTIFICACIN DEL COMPLE- Termociclador (rango de calentamiento 3C/
JO MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS seg., rango de enfriamiento 2C/seg., precisin
+/0,2C)
(GenoType MTBC)
Termmetro calibrado
PRINCIPIO
El kit GenoType MTBC est basado en la tecnologa DNASTRIP que permite en base a los PREPARACIN DE LA MUESTRA
polimorfismos genticos, por los que la ADN Las muestras para extraccin son a partir de
girasa B diferencia genticamete de especies/ colonias aisladas de cultivo slido, suspendicepas pertenecientes al grupo Mycobacterium das en 300 l agua ultrapura libre de DNasa
tuberculosis complex: M. africanum, M. bovis y RNasa en tubos para PCR, libre de DNasa y
BCG, M. bovis ssp. bovis, M. bovis ssp. caprae, RNsa.
Las muestras tambin pueden extraerse a parM. microti, y M. tuberculosis/M. canettii.
El procedimiento completo se divide en tres pa- tir de cultivos positivos en medio lquido, se
sos: extraccin de ADN procedente de cultivo traslada 1mL del mismo a un tubo para PCR,
(placas de cultivo/medio lquido; los reactivos libre de DNasa y RNasa.
necesarios no se suministran), una amplificacin mltiplex con primers marcados con bioti- PROCEDIMIENTO
na (la ADN polimerasa termoestable no se inEXTRACCIN DE ADN
cluye), y una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos: Puede usarse un crecimiento bacteriano en
desnaturalizacin qumica del producto a am- placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Miplificar; hibridacin de amplicones de una sola ddlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
cadena, marcados con biotina, a sondas uni- MB-Check). Este test no puede usarse para dedas a membrana; lavado astringente; adicin tectar micobacterias directamente de muestras
de conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidi- de pacientes. La zona de trabajo ha de estar
na (AP), y una reaccin de tincin mediada por libre de ADN amplificado. Es crucial el calenAP. Una plantilla asegura la interpretacin sen- tamiento de las muestras a 95C durante, al
cilla y rpida del esquema de bandas obtenido. menos, 20 minutos con objeto de inactivar bacterias vegetativas.
Pg. 114
20 minutos con objeto de inactivar bacterias

vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de ADN que produzca
ADN de bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce ADN adecuado para amplificacin:
Molecular).
mL. Concentre las bacterias mediante centrifugacin 15 min en una centrfuga de sobremesa
de agua.
4 Centrifugue durante 5 min a mxima velocidad y utilice directamente 5 L del sobrenadante para la PCR. En caso de que la solucin de
un tubo nuevo.
solucin de ADN. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solucin de
ADN y mezcle bien. No utilice vrtex. Alicuote la
mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
preparados de PCR.
Los productos para amplificacin pueden almacenarse entre 20C y 8C.

aplique directamente 5 L de cada muestra a
un gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn de carga. Los amplicones tienen una longitud aproximada de 230 pb (Control de Gnero)
y 200 pb (Control Universal/amplicon especie-especfico).
HIBRIDACIN
Preparacin
TwinCubator a 45C; la mxima desviacin toAMPLIFICACIN
lerada en la temperatura idnea es de +/1C.
Prepare la mezcla de amplificacin (45 L) en Precaliente las soluciones HYB y STR a 37una habitacin libre de ADN. La muestra debe 45C antes de usar.
Mezcle por tubo:
35 L de AM B suministrado
10 L de AM A- suministrado
Caliente a temperatura ambiente los restanAada 5 L de solucin de ADN (20-100 ng de tes reactivos, con la excepcin del CON-C y
ADN) para obtener un volumen final de 50 L el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el
Determine el nmero de muestras a amplificar con sus tampones respectivos (CON-C con
(nmero de muestras a analizar ms las mues- CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades
tras de control). Por ejemplo, un control de con- necesarias. Mezcle bien y equilibre a temperataminacin contiene 5 L de agua en lugar de tura ambiente.
Pg. 115
en las cantidades necesarias. Mezcle bien y

equilibre a temperatura ambiente. Para cada
tira aada 10 L de concentrado a 1 mL de los
respectivos tampones. Diluya el CON- C antes
de cada uso. El SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si se almacena a temperatura
ambiente y se protege de la luz.
agua para que realice una mezcla completa y
constante de la solucin. Para obtener una adecuada transferencia de calor, la bandeja debe
estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
su altura.
TwinCubator.

la incubacin).
cada vez).
campos marcados, alineando las bandas CC y
UC con las respectivas lneas del formulario.
Anote el nmero de las bandas positivas en la
penltima columna y determine la especie con
la ayuda de la tabla de interpretacin y registre
Pg. 116

ltima columna. La plantilla suministrada tambin sirve como ayuda para evaluacin y ha de
ser alineada con las bandas UC y CC de la tira.
Cada tira tiene un total de 13 zonas de reaccin TABLA DE INTERPRETACIN
(ver esquema).

PRECAUCIONES

(PNM) a 2-8C a su llegada aislndola de cualEsta zona detecta, como es conocido, todas las quier fuente potencial de ADN contaminante. Si
micobacterias y miembros del grupo de bacte- se requiere almacenar durante ms de 4 semarias gram-positivas con alto contenido de G+C. nas, almacene a 20C. A fin de evitar congelaSi esta zona y el Control de Conjugado se tien ciones y descongelaciones repetidas, alicuote
como positivas, pero el restante esquema de el PNM. Almacene el resto de los componentes
bandas no puede ser asignado a una micobac- del kit en 2-8C. No utilice los reactivos despus
teria especfica, se deben aplicar mtodos adi- de su fecha de caducidad.
cionales para identificar la especie bacteriana Los especmenes de los pacientes y los culticorrespondiente.
vos realizados a partir de especmenes de paSolamente han de considerarse aquellas ban- cientes deben ser considerados siempre como
das cuyas intensidades sean tan fuertes, o ms potencialmente infecciosos. Las muestras de
fuertes, que la intensidad del Control Universal. pacientes de riesgo (infectados por microorganismos patgenos incluyendo Hepatitis B y ViMTBC
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los
Esta zona hibrida, como es conocido, con am- cultivos realizados a partir de esas muestras
plicones generados de todos los miembros co- deben ser etiquetados y manejados siempre
nocidos de Mycobacterium tuberculosis com- bajo las condiciones de seguridad adecuadas,
plex.
de acuerdo con las guas institucionales.
Otras bandas
Observe todas las normas medioambientales y
Sondas Especficas; para la evaluacin ver la de seguridad, tanto federales, estatales como
locales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada.
Pg. 117
de ADN y amplificacin estn libres de DNasas.
fleja los conocimientos de Hain Life- science.

10. SENSIBILIDAD ANTIBITICA
10.1. INTRODUCCIN
La tuberculosis (Tb) es una enfermedad reemergente causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis y que infecta a un tercio
de la poblacin mundial. Dentro de los principales objetivos en el desarrollo de procedimientos para realizar susceptibilidad antibitica es
poder identificar la presencia de cepas resistenLIMITACIONES
tes y multiresistentes.
Antes de la amplificacin, el ADN ha de ser ais- Para el tratamiento se utilizan varios medicalado de cultivo bacteriano realizado por un m- mentos para evitar la aparicin de resistencias
todo idneo. Ha de tenerse la seguridad de que por mutaciones naturales en las micobacterias.
la muestra de ADN ha sido amplificada eficien- Las drogas de primera lnea son rifampicina
(RIF), isoniacida (INH), estreptomicina (SM) y
temente durante la reaccin de amplificacin.
El test slo funciona dentro de los lmites de las etambutol (EMB); todas tienen cierto grado de
regiones genmicas para las que los primers toxicidad pero son relativamente seguras y cauy sondas han sido elegidos. El anlisis de se- san pocos efectos secundarios.
cuencias potenciales permanece reservado Los test de susceptibilidad desempean un papel muy importante en epidemiologa, debido a
La presencia de mltiples especies de bacte- que detectan la aparicin de resistencia provorias en la muestra a analizar puede dificultar la cada por fallas en la administracin o en la supervisin de un tratamiento adecuado. Tambin
Como cualquier sistema de deteccin basado es importante porque los resultados pueden ser
en la hibridacin, este sistema contempla la utilizados como una gua para iniciar la terapia,
posibilidad de que variaciones de las secuen- para confirmar la resistencia antibitica en un
cias en las regiones genmicas que fueron paciente que demuestra respuesta insatisfactoelegidas para los primers y sondas, y la detec- ria al tratamiento y para la evaluar la tendencia
cin de regiones para las cuales el kit no fue de resistencia primaria y adquirida dentro de
diseado, pueden conducir a resultados falsos. una comunidad.
Debido a la gran variabilidad existente en los En Guatemala las pruebas de susceptibilidad a
genomas bacterianos es posible que ciertos frmacos no se llevan a cabo rutinariamente,
subtipos puedan no ser detectados. El test re- lo cual hace surgir la posibilidad de esquemas
inadecuados de tratamiento para pacientes
Pg. 118
con cepas multiresistentes.

a. Tratamiento.
El tratamiento est condicionado al comportamiento en el crecimiento del bacilo, a partir
de un bacilo se origina una colonia, luego se
multiplica dependiendo de las caractersticas
de cada bacilo el crecimiento puede ser inerte
con metabolismo inactivo, lento intermedio;
cuando se alcanza cierto nmero de bacilos se
empiezan a producir mutaciones naturales y
espontneas, sta mutacin da lugar a la aparicin de resistencias de tipo cromosmicas y
por ello irreversibles las cules se encuentran
en relacin con el nmero de bacilos presentes
y el frmaco utilizado, es por ello que el tratamiento debe ser combinado ya que no todos
los elementos de las colonias poseen el mismo
comportamiento frente a las drogas.
miten que las fuentes de infeccin se detengan.

El esquema se divide en dos fases:
Fase intensiva: durante la cual se toma el tratamiento todos los das.
Fase de continuacin: durante la cual los medicamentos se toman dos tres veces por semana.
10.2. MTODOS DE DETERMINACIN
DE SENSIBILIDAD ANTIFMICA
10.2.1. MTODO DE LAS PROPORCIONES DE CANETII
Un mtodo utilizado para la determinacin de la

susceptibilidad de micobacterias es el mtodo
modificado de las proporciones. Los resultados
de ste mtodo son reportados como un porcentaje del total de la poblacin bacteriana, el cul
es definido por la cantidad de crecimiento en
un medio que contiene el medicamento, comparada con el crecimiento en un medio control
b. Drogas de primera lnea.
libre de medicamento. Cuando ms del 1% de
INH, RIF, SM, EMB y Pirazinamida (PZA) son la poblacin bacilar es resistente a la concenlos cinco medicamentos clasificados como dro- tracin crtica de la droga, la micobacteria se
gas de primera lnea debido a que poseen baja considera resistente. La concentracin crtica
toxicidad y por la actividad que poseen, la INH del medicamento es aquella a la cual se inhibe
es la droga de mayor utilidad y de mayor uso.
el crecimiento de la mayora de bacterias.
Entre las dosis utilizadas de las drogas para el El principio del mtodo se basa en que una sustratamiento del Tb se pueden mencionar:
pensin estandarizada del organismo a evaluar
INH 300mg diarios Posee baja toxicidad para se inocula en cajas de agar 7H10 que contiene
el hgado.
un agente antimicrobiano, generalmente droRIF 600mg diarios Posee baja toxicidad.
gas de primera lnea INH, RIF, SM, EMB comSM De uso limitado debido a su forma de admi- parado con un control que no contiene droga.
nistracin (va intramuscular), causa citotoxici- Entre las ventajas de este mtodo se pueden
dad y disfuncin renal.
citar que de los mtodos que existen en la acEMB 15mg/kg/da
Posee baja toxicidad.
tualidad, ste es el ms accesible y aplicable
PZA 25mg/kg/da Es hepatotxica y produ- para la mayora de los laboratorios de salud
ce hiperuricemia.
del pas. Entre las desventajas estn, que las
micobacterias algunas veces se agrupan en
c. Drogas de segunda lnea.
grumos, o no crecen satisfactoriamente por lo
Este grupo de drogas es poco utilizado, excep- tanto es difcil obtener suspensiones homogto en reas en las que existen rangos grandes neas del inculo. Es un mtodo que requiere
de resistencia a las drogas de primera lnea, personal capacitado por ser un mtodo muy laste grupo incluye ofloxacina, cicloserina, ca- borioso en cuanto a tiempo para preparacin de
preomicina, etionamida, tiacetazona, kanamici- medios, adems el procedimiento es minuciona/amikacina.
so. Utiliza un medio de cultivo muy enriquecido
y si no se tiene el equipo y las condiciones de
d. Esquemas de tratamiento.
esterilidad que exige el mtodo, puede contaSi los esquemas de tratamiento se siguen de minarse fcilmente.
forma adecuada y con supervisin estricta perRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 119
- Disolver 106 mg (100,000g) de INH en 10

ml de agua destilada. Esta es una solucin de
PROCEDIMIENTO
10,000g/ml.
- Esterilizar con filtro millipore.
El mtodo modificado de las proporciones fue - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
seleccionado por las condiciones de laboratorio Esta es una solucin 1,000g/ml.
con las que se cuenta actualmente, se conside- - Agregar 1ml de 1,000g/ml a 9ml de agua desra reproducible y exacto. El mismo consiste en tilada estril. Esta es una solucin de 100g/ml.
utilizar los antibiticos de primera lnea selec- -Agregar 0.5 ml de 100g/ml a 250ml de medio
cionados a diferentes valores de concentracin. para obtener una concentracin final de 0.2g
Cada antibitico reconstituido se incorpora al INH/ml de medio.
agar Middlebrook 7H10 previamente enriqueci- - Agregar 0.25 mL de 1,000g/ml a 250ml de
do con cido oleico-albmina-dextrosa-catala- medio para obtener una concentracin final de
sa (OADC) y luego se prepara en cajas de Petri 1g INH/ml de medio.
de cuatro cuadrantes, o 15x125 mm. (10 ml.
aprox.) o con 13x100 mm (6 ml aprox). Dilucio- Estreptomicina (SM) en caja
nes estandarizadas de las micobacterias son - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de
inoculadas en el agar con antibitico. Las cajas SM
de Petri se colocan en una incubadora a 37C - Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrepy se observan durante 2 a 3 semanas para de- tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es
tectar crecimiento.
una solucin de 10,000g/ml.
Cada erlenmeyer con 225 middlebrook agar a - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
esto se le agrega 25 mL de OADC TOTAL: 250 Esta es una solucin 1,000g/ml.
mL
- Agregar 0.4ml de solucin 1,000g/ml a 200ml
A. Preparacin de soluciones antimicrobianas
de medio para obtener una concentracin final
Preparar 1,000g/ml de soluciones stock de de 2.0g SM/ml de medio.
isoniacida, estreptomicina, rifampicina y etambutol de la casa sigma.
Estreptomicina (SM) en tubo
Alicuotar la solucin stock en tubos de poli- - 131.4 mg dihidrosulfato de SM = 100mg de
propileno estriles y congelar por no ms de 12 SM
meses a -20C (preferiblemente a -70C).
- Disolver 131.4 mg de dihidrosulfato de estrepIsoniacida (INH) en caja
tomicina en 10 ml de agua destilada. Esta es
- 106mg INH = 100 mg INH
una solucin de 10,000g/ml.
- Disolver 106 mg (100,000g) de INH en 10 - Esterilizar con filtro millipore.
ml de agua destilada. Esta es una solucin de - Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
10,000g/ml.
Esta es una solucin 1,000g/ml.
- Agregar 0.5ml de solucin 1,000g/ml a 250ml
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. de medio para obtener una concentracin final
de 2.0 g SM/ml de medio.
- Agregar 1ml de 1,000g/ml a 9ml de agua destilada estril. Esta es una solucin de 100g/ml. Rifampicina (RIF) (Rifampin) en caja
- Agregar 0.4ml de 100g/ml a 200ml de medio - 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina.
para obtener una concentracin final de 0.2g - Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de
INH/ml de medio.
dimetil sulfxido (DMSO) dimetilformami- Agregar 0.2 mL de 1,000g/ml a 200ml de me- da y completar hasta 10 mL con agua destiladio para obtener una concentracin final de 1g da (8 mL agua). para hacer una solucin de
INH/ml de medio.
10,000g/ml.
-Esterilizar con filtro millipore
Isoniacida (INH) en tubo
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
- 106mg INH = 100 mg INH
Pg. 120
Agregar 0.2 ml de solucin 1,000g/ml a 200ml

de medio para obtener una concentracin final
de 1.0 g rifampicina/ml de medio.
especificada por el fabricante, y lentamente

agregar al agua. Permitir que el medio se disuelva ligeramente antes de agregar ms. Agregar
el medio al agua de una sola vez puede causar
grumos que no se disolvern.
Rifampicina (RIF) (Rifampin) en tubo
6. Agregar 10ml de glicerol al baln y continuar
- 105 mg rifampicina = 100mg de rifampina.
mezclando por otros 3 a 5 minutos. Continuar
- Disolver 105 mg. de rifampicina en 2 ml. de calentando (con agitacin constante) hasta que
dimetil sulfxido (DMSO) dimetilformamida y el medio se aclare (aproximadamente son 20
completar hasta 10 mL con agua destilada (8 mL minutos)
agua). para hacer una solucin de 10,000g/ml. 7. Remover el baln del calor.
8. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. derretido dentro de los balones como sigue:
- Agregar 180ml de agar a 6 balones de 500ml
- Agregar 0.25ml de solucin 1,000g/ml a - Agregar 540ml de agar a 1 baln de 1 litro
250ml de medio para obtener una concentracin - Agregar un magneto a cada baln
final de 1.0g rifampicina/ml de medio.
- Cubrir los balones con tapaderas plsticas de
tapn de rosca, tapones de esponja, o papel
Etambutol (EMB) en caja
aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121C.
- 136 mg d-etambutol = 100mg de EMB
9. Despus de autoclavear, colocar los balones
- Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de en un bao de agua en horno programado a
agua destilada.
50 a 56C para enfriar.
10. Si se desea, el agar puede dejarse solidificar
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril. a temperatura ambiente y guardado en envases
bien tapados protegidos de la luz a 2-8C hasta
- Agregar 1.0 ml de solucin 1,000g/ml a 200ml por 2 semanas. Previo a la preparacin de cade medio para obtener una concentracin final jas, derretir el agar colocando el envase en un
de 5 g etambutol/ml de medio.
bao de agua hirviendo.
Etambutol (EMB) en tubo
- 136mg d-etambutol = 100mg de EMB
- Disolver 100mg de d-etambutol en 10 ml de
agua destilada.
- Agregar 1ml a 9ml de agua destilada estril.
- Agregar 1.25ml de solucin 1,000g/ml a
250ml de medio para obtener una concentracin
final de 5 g etambutol/ml de medio.
B. Preparacin de medios.
1. Calentar el bao de agua a 50-56C.
2. Preparar el agar base 7H10
3. Agregar 1,800ml de agua destilada a un baln
de 2 litros.
4. Agregar un magneto para agitacin, y agitar
el agar en una estufa con agitacin magntica
a velocidad media y a temperatura media a elevada.
5. Pesar la cantidad de agar Middlebrook 7H10
EN TUBO
11. Usar la probeta de 500ml, y alicuotar el agar
derretido dentro de los balones como sigue:
- Agregar 225ml de agar a 6 balones de 500ml
(PARA ANTIBIOTICOS)
- Agregar 250ml de agar a 1 baln de 1 litro
(PARA CONTROL DE CRECIMIENTO)
- Agregar un magneto a cada baln
Cubrir los balones con tapaderas plsticas de
tapn de rosca, tapones de esponja, o papel
aluminio, y autoclavear por 15 minutos a 121C
AGREGAR 25 mL de OADC (ESTO ES PARA
20 TUBOS MXIMO 25 TUBOS EXACTOS)
C. Etiquetado de las cajas.
1. Preparar 70 cajas cuadriplate en dos columnas de 35 cajas cada una.
2. Etiquetar todas las cajas de una columna con
el nmero 1.
3. Etiquetar todas las cajas de la segunda columna con el nmero 2.
Pg. 121
4. El nmero en la caja es un cdigo para los

antimicrobianos dispensados en esa caja.
antimicrobianos.
Tabla No. 8 Nmero de organismos por campo
NOTA:
- Contar un acumulo como un solo organismo.
- Utilizar objetivo de aceite de inmersin (para
conteo de organismos teidos con carbolfucshina)
- Utilizar objetivo seco fuerte (para conteo de
organismos teidos con fluorocromo)
D. Preparacin de cajas.
1. Permitir que los antimicrobianos se descongelen a temperatura ambiente, y usarlos lo ms
rpido posible. Nunca permitir que se recongelen.
2. Retirar un frasco de 200ml de enriquecedor
OADC del refrigerador, y atemperar.
3. Retirar un frasco de tapn de rosca de 500ml
conteniendo 180ml de agar Middlebrook 7H10
y agitar en un plato de agitacin para homogenizar el medio (sin calor)
4. Agregarle 20ml de enriquecedor OADC cuando el agar tenga una temperatura de 56C y homogenizar (no aplicar calor)
5. Agregar la cantidad apropiada de antimicrobiano para obtener una concentracin final de
0.2m de INH y continuar la agitacin por 1 a 2
min (ver tabla No. 9)
6. Utilizando una pipeta estril o un dispensador, dispensar 5ml de agar con INH en el cuadrante II de las 35 cajas etiquetadas con 1 (ver
tabla No. 9)
7. Repetir los pasos del 1 al 6 para los otros
antimicrobianos y dispensarlos dentro de los
cuadrantes de las cajas 1 y 2 (ver tabla No. 9)
Tabla No 9. Preparacin de cajas con
(g/ml)= microgramos por mililitro

a = la solucin stock de antimicrobianos
(1,000g/ml excepto que se especifique otro)
se agrega a 180ml de agar con 20mL OADC.
*1=100 ug/ml
8. Retirar un frasco de tapn de rosca conteniendo 360ml de agar a 56C.
9. Agregar 40ml de OADC al frasco y agitar lentamente (no aplicar calor)
10. Continuar la agitacin por 1 a 2min.
11. Utilizando una pipeta estril o un dispensador, dispensar 5ml del agar libre de droga dentro del cuadrante I de las 70 cajas.
12. Permitir que el agar se solidifique a temperatura ambiente dentro de una campana de flujo laminar.
13. Cuando el agar est solidificado colocarlo
en bolsas plsticas y guardar a 2-8C en la oscuridad.
14. Etiquetar con una fecha de expiracin de 1
mes.
. Preparacin del inculo.
1.Escoger de 3-5 colonias (representando todos los tipos de colonias si se encuentran mltiples tipos) y emulsificarlas en 4ml de caldo Dubos-Tween-albmina contenido en un tubo de
vidrio (13x100mm) al cual se le han agregado
de seis a ocho perlas de vidrio.
2. Agitar en vrtex por 1 a 2 min.
3. Dejar reposar el tubo por 30 minutos, de
modo que las partculas grandes sedimenten.
4. Decantar el sobrenadante y transferirlo a otro
tubo de vidrio estril (13x100).
Pg. 122
absorbido dentro del medio (aproximadamente

por una hora).
5. Ajustar la turbidez de la suspensin del so- 12. Envolver cada caja en una bolsa de poliprobrenadante con caldo Dubos-Tween-albmina pileno permeable a CO2 y colocar las cajas con
hasta alcanzar el estndar 1.0 de McFarland el agar hacia abajo.
(Conteniendo aproximadamente 107 UFC/ml). 13. Incubar las cajas a 36C en una atmsfera
6. Diluir la suspensin a 10-2 y 10-4 con agua de 5 al 10% de CO2.
destilada estril.
G. Lectura de cajas.
F. Inoculacin e incubacin.
1. Despus de 1 a 2 das de incubacin, exami1. Para cada organismo a ser evaluado, llevar a nar el agar sangre y el agar Middlebrook 7H10
temperatura ambiente 2 grupos de cajas cuadri- para evidenciar bacterias contaminantes. Si se
plate con el medio para susceptibilidad (un gru- detecta contaminacin, descartar todas las capo de cajas incluye: una caja etiquetada como jas y repetir la evaluacin con un nuevo inculo.
1 y otra como 2). Asegurar que la superficie (Algunas veces es necesario preparar varios
del agar este seca (secar cualquier gota con un subcultivos para obtener un inculo puro).
hisopo de algodn estril).
Incubar y continuar examinando la pureza del
2. Etiquetar estas dos cajas para la evaluacin agar sangre diariamente por 7 das y la pureza
de susceptibilidad con el nmero de cultivo del del agar 7H10 semanalmente mientras dure la
paciente y la dilucin, por ejemplo 10-2.
evaluacin.
3. Inocular este primer grupo de cajas para 2. Examinar el cuadrante control (sin antimicroevaluar susceptibilidad de dilucin 10-2 con la biano) semanalmente. Cuando se observe cresuspensin de la dilucin 10-2 de la siguiente cimiento de 1+ o ms (ver tabla 2), leer todas
manera.
las cajas. Si el crecimiento no es suficiente
4. Usando una pipeta estril con algodn en el entre 2 y 3 semanas de incubacin, se repite el
extremo posterior, inocular una gota de la sus- test. Es importante tener en cuenta que:
pensin a evaluar, sin que la pipeta toque la No hay que dar un reporte final de resultados
superficie del medio, en cada esquina de cada de resistencia o susceptibilidad hasta que las
cuadrante (3 gotas por cuadrante).
cajas hayan sido incubadas por 3 semanas.
5. Mantener la pipeta perpendicular al agar para 3. Examinar todos los cuadrantes, y estimar
asegurar la uniformidad de las gotas, tener cui- el nmero de colonias creciendo en cada cuadado de no tocar la superficie del agar con la drante (contando el nmero total de colonias
punta de la pipeta.
creciendo en los tres crculos de crecimiento).
6. Tener cuidado de colocar las gotas de modo 4. Cuantificar el crecimiento como se especifica
que no se corran al borde de la caja de petri (es a continuacin.
difcil contar colonias en el borde de la caja).
5. Se debe notar la presencia de cualquier mi7. Repetir el procedimiento anterior para cada crocolonia como las colonias en el medio concuadrante de la caja.
teniendo antibitico que son ms pequeas que
8. Etiquetar e inocular el segundo grupo de aquellas en el medio control.
cajas para evaluacin de susceptibilidad con la 6. Cuantificar el crecimiento y registrar el nmedilucin 10-4 de la misma manera.
ro de colonias.
9. Evaluar una cepa de control de calidad a di- 7. Calcular el porcentaje de resistencia dividienluciones 10-2 y 10-4.
do el nmero de colonias creciendo en el medio
10. Inocular una caja de agar sangre y una caja con antibitico dentro del nmero de colonias
de agar Middlebrook 7H10 con 1 2 gotas de creciendo en el medio control y multiplicando
la suspensin anterior y estriarlas con asa en por 100.
argolla a manera de aislar colonias.
11. Permitir que las cajas inoculadas permanez- Tabla No.10 Cuantificacin del crecican con el agar hacia arriba a temperatura am- miento de colonias de micobacterias
biente (en la campana) hasta que el inculo sea en cajas de agar.
Pg. 123
1 Cantidad exacta de colonias contadas.

H. Resultados.
1. Interpretacin.
Si el control de calidad es aceptable, interpretar como se especifica a continuacin:
1.1. Interpretar los resultados de la dilucin de organismos que presente un nmero contable de
colonias (idealmente de 50 a 100) en el crecimiento del cuadrante control.
1.2. Nunca utilizar la dilucin con recuento de colonias 50.
1.3. Utilizar la dilucin con recuento de colonias de 4+ con precaucin.
1.4. Si ambas diluciones muestran crecimiento 4+ y el organismo es susceptible a todos los antibiticos, interpretar los resultados. Si el organismo muestra resistencia a cualquier antibitico, la
resistencia puede deberse a un inculo muy cargado. Repetir completamente la prueba.
Tabla No. 11
Ejemplos de reportes.
1.5. La presencia de microcolonias sugiere que el aislamiento puede ser resistente al antibitico
pero que tiene algn efecto en el organismo y puede ser efectivo en combinacin con otras drogas.
1.6. Interpretar un resultado como resistente cuando la proporcin del crecimiento en el medio
conteniendo antibitico es 1% del crecimiento en el medio libre de antibitico.
1.7. Ejemplos:
Pg. 124
El kit GenoType MTBDRplus est basado en

la tecnologa DNASTRIP y permite la identia. nterpretacin de resistencia.
ficacin mediante gentica molecular del comCrecimiento control (cuadrante I) 200 colonias plejo Mycobacterium tuberculosis y su resistencia a rifampicina y/o isonizida, desde cultivo
(3+)
o muestras clnicas pulmonares baciloscopia
INH, 0.2 g/ml (cuadrante II)
7 colonias
positivas. La identificacin de la resistencia a
7 colonias x 100% = 3.5%, i.e., Resistente.
rifampicina es posible gracias a la deteccin de
200 colonias
las mutaciones ms significativas del gen rpoB
No es necesario realizar un recuento real de las (que codifica por la subunidad de la ARN pocolonias para aquellas concentraciones cuan- limerasa). Para testar la resistencia de isoniazida de alto nivel es examinado el gen katG (que
do el crecimiento es obviamente <1% 1%.
codifica por la catalasa perioxidasa), y para tesb. Con un control de calidad aceptable, reportar tar la resistencia a isoniazida de bajo nivel, es
examinada la regin del promotor del gen inhA
como sigue el siguiente ejemplo.
(que codifica por la NADH enoil ACP reductasa). El procedimiento completo se divide en
Tabla No. 12 Control de calidad
tres pasos: aislamiento de DNA procedente de
cultivo (medio slido/medio lquido) o de muestra clnica (muestras pulmonares baciloscopia
positivas decontaminadas) los reactivos necesarios no se suministran una amplificacin
mltiplex con primers marcados con biotina (la
DNA polimerasa termoestable no se incluye), y
una hibridacin reversa.
La hibridacin incluye los siguientes pasos:
desnaturalizacin qumica del producto a amplificar, hibridacin de amplicones en una sola
cadena, marcados con biotina, a sondas unidas
INH= isoniacida, SM= estreptomicina, RIF= ri- a membrana, lavado astringente, adicin de
conjugado de fosfatasa alcalina/streptavidina
fampicina, EMB= etambutol
(AP), y una reaccin de tincin mediada por AP.
R= resistente, S= susceptible
Una plantilla asegura la interpretacin sencilla y
(g/ml)= microgramos por mililitro.
rpida del esquema de bandas obtenido.
Mdicos experimentados algunas veces utilizan el porcentaje de organismos resistentes al
agente antimicrobiano como una gua para la
eficacia de la terapia. Por ello es importante
calcular y registrar el porcentaje de resistencia
en una hoja de trabajo, y mantener esta informacin disponible para los mdicos que la requieran.
MATERIALES
Bao de agua
Bao de ultrasonidos
Centrfuga de mesa
Cronmetro
10.2.2. MTODO DE PCR: IDENTIFI- DNA polimerasa termoestable con tampn (reCACIN DEL COMPLEJO MYCOBAC- comendacin: HotStarTaq DNA Polymerase de
TERIUM TUBERCULOSIS (GenoType Qiagen)
Guantes desechables
MTBDRplus)
Papel absorbente
PRINCIPIO
Pg. 125
Pinzas
Probeta graduada
equipos necesarios
+/0,2C)
Termmetro calibrado
DNasa y RNasa.
PROCEDIMIENTO
EXTRACCIN DE ADN
Puede usarse un crecimiento bacteriano en
placas de cultivo (ej.: Loewenstein-Jensen, Middlebrook), o en medio lquido (ej.: BACTEC,
MB-Check). Este test no puede usarse para
detectar micobacterias directamente de muestras de pacientes. La zona de trabajo ha de estar libre de DNA amplificado. Es crucial el calentamiento de las muestras a 95C durante,
al menos, 20 minutos con objeto de inactivar
bacterias vegetativas. Se puede seguir cualquier procedimiento de extraccin de DNA que
produzca DNA de bacterias amplificable. El siguiente protocolo rpido normalmente produce
DNA adecuado para amplificacin:

g aproximadamente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las bacterias en 100-300 l de
agua (ver ms arriba) con un vortex.
de agua.
DNA haya de almacenarse por perodos prolongados de tiempo, transfiera el sobrenadante a
un tubo nuevo.
AMPLIFICACIN
Prepare la mezcla de amplificacin (45 l) en
una habitacin libre de DNA. La muestra debe
Mezcle por tubo:
35 l de AM B suministrado
10 l de AM A- suministrado
Aada 10 l de solucin de DNA (20-100 ng
de DNA) para obtener un volumen final de 55 l
Determine el nmero de muestras a amplificar
(nmero de muestras a analizar ms las muestras de control). Por ejemplo, un control de contaminacin contiene 5 l de agua en lugar de
solucin de DNA. Prepare una mezcla que contenga todos los reactivos excepto la solucin de
DNA y mezcle bin. No utilice vortex. Alicuote la
mezcla madre en volmenes de 45 l en tubos
preparados de PCR.
1a. Cuando use crecimiento bacteriano en medio slido, recoja bacterias con un asa de inoculacin y suspndalas en aproximadamente
300 l de agua (grado Biologa Molecular).
Pg. 126

Los productos para amplificacin pueden alma- en los pocillos cercanos.
cenarse entre +8 y 20C.
Para comprobar la reaccin de amplificacin, Las tiras tienen que quedar completamente cuaplique directamente 5 l de cada muestra a un biertas por la solucin y el lado con la sonda
gel de agarosa al 2% sin la adicin de tampn hacia arriba (identificable por el marcador code carga. Los amplicones tienen una longitud loreado prximo al extremo inferior). Usando
aproximada de 230 pb (Control de Gnero) pinzas, de la vuelta a las tiras que pudieran hay 200 pb (Control Universal/amplicon espe- berse girado durante su inmersin. Limpie cuidadosamente las pinzas despus de cada uso
cie-especfico).
HIBRIDACIN
Preparacin
Precaliente en bao de agua con agitacin o agitacin o en el TwinCubator durante 30 minuTwinCubator a 45C; la mxima desviacin to- tos a 45C.
lerada en la temperatura idnea es de +/1C. Ajuste la frecuencia de agitacin del bao de
Precaliente las soluciones HYB y STR a 37- agua para que realice una mezcla completa y
constante de la solucin. Para obtener una ade45C antes de usar.
Los reactivos han de estar libres de precipitado cuada transferencia de calor, la bandeja debe
(tenga en cuenta, no obstante que la solucin estar sumergida en el agua, al menos, 1/3 de
CON-D es opaca). Mezcle si fuera necesario. su altura.
Caliente a temperatura ambiente los restan- 6. Aspire completamente el Tampn de Hibridates reactivos, con la excepcin del CON-C y cin.
el SUB-C. Usando un tubo adecuado, diluya el Por ejemplo, use una pipeta Pasteur conectada
Conjugado Concentrado (CON-C, naranja) y el a una bomba de vaco.
Sustrato Concentrado (SUB-C, amarillo) 1:100 7. Aada 1 ml de Solucin de Lavado Astrincon sus tampones respectivos (CON-C con gente (STR, roja) a cada tira e incube durante
CON-D, SUB-C con SUB-D) en las cantidades 15 minutos a 45C en un bao con agitacin o
necesarias. Mezcle bien y equilibre a tempera- TwinCubator.
tura ambiente. Para cada tira aada 10 l de Desde este paso, en adelante, trabaje a temconcentrado a 1 ml de los respectivos tampo- peratura ambiente. Elimine completamente la
nes. Diluya el CON- C antes de cada uso. El Solucin de Lavado Astringente.
SUB-C diludo es estable durante 4 semanas si Deseche la Solucin de Lavado en un contenese almacena a temperatura ambiente y se pro- dor y elimine todo el lquido restante volcando
tege de la luz.
1. Dispense 20 l de la Solucin de Desnaturali- a todos los dems pasos de lavado.
zacin (DEN, azul) en una esquina de cada uno 8. Lave una vez cada tira con 1 ml de Solucin
de Aclarado (RIN) sobre la plataforma de agitade los pocillos usados.
2. Aada a la solucin 20 l de muestra am- do del TwinCubator (elimine el RIN despus de
plificada, pipetee arriba y abajo para mezclar la incubacin).
bien e incube a temperatura ambiente durante 9. Aada 1 ml de Conjugado diludo (ver ms
5 minutos. Entre tanto, saque tiras de sus tubos arriba) a cada tira e incube durante 30 minutos
usando pinzas e identifquelas marcando bajo sobre la plataforma de agitado del TwinCubator.
el marcador coloreado con un lpiz. Lleve siem- 10. Elimine la solucin y lave cada tira dos veces durante 1 minuto con 1 ml de Solucin de
pre guantes cuando manipule tiras.
3. Aada cuidadosamente a cada pocillo 1 ml Aclarado (RIN) y de nuevo durante 1 minuto
de Tampn de Hibridacin (HYB, verde) pre- aproximada- mente con 1 ml de agua destilada
calentado. Agite suavemente la bandeja hasta (ej.: botella de lavado) ) sobre la plataforma de
cada vez).
Pg. 127

11. Aada 1 ml de sustrato diludo (ver ms arriba) a cada tira e incube sin agitacin y protegindolas de la luz.
campos marcados, alineando las bandas CC
y AC con las respectivas lneas del formulario.
Por razones tcnicas, la distancia entre cada
sonda de la tira puede variar ligeramente. Por
tanto, para una lectura precisa, por favor utilice
la plantilla que encontrar en cada kit, y alinee
separadamente para cada uno de los tres loci
detectados, con su respectivo Locus Control.
Determine el estado de la resistencia y anote
en las respectivas columnas. Como ayuda para
la interpretacin se dan ejemplos de evaluaciones en el siguiente apartado. No todas las bandas de una tira muestran la misma intensidad.
Cada tira tiene un total de 27 zonas de reaccin
(ver esquema).

correspondiente.
M. tuberculosis complex (TUB)
Esta zona hibrida, como es conocido, con amplicones generados de todos los miembros conocidos de Mycobacterium tuberculosis complex.
Si la zona TUB es negativa, la bacteria testada
no pertenece al complejo M. tuberculosis y no
puede ser evaluada mediante este sistema.
Locus Control (rpoB, katG, y inhA)
Las zonas del Locus Control detectan una regin del gen especfica para cada respectivo
locus y siempre han de ser positivas, cuando la
banda de TUB haya documentado la presencia
de M. tuberculosis.
Sondas Wild type
Las sondas wild type comprenden las reas de
resistencia ms importantes de los genes respectivos (ver figura 1, tabla 1, 2 y 3) Cuando todas las sondas Wild type de un gen son positivas, no se detectan mutaciones en las regiones
examinadas. La cepa testada es sensible para
el respectivo antibitico.
En caso de una mutacin, el respectivo amplicn no puede unirse a la correspondiente sonda Wild type. La ausencia de seal en al menos
una de las sondas Wild type indica, por tanto,
resistencia de la cepa testada al respectivo antibitico.
Solamente sern consideradas como positivas
aquellas bandas cuya intensidad sea igual o
mayor que la banda de Control de Amplificacin.
Pg. 128
Si todas las bandas wild type muestra seal,

este resultado es clasificado como positivo y
Cada patrn que se desve del patrn wild type marcaremos la columna de WT de los respeindica resistencia de la cepa testada. El patrn tivos genes con el signo +. Si la menos una
de bandas obtenido con las sondas rpoB permi- de las bandas de Wild type est ausente, este
te dibujar una conclusin sobre la resistencia a resultado es clasificado como negativo y marcarifampicina de las cepas testadas, el patrn de remos la columna de WT de los mismos genes
bandas obtenido con las sondas katG permite con .
dibujar una conclusin sobre las resistencias de Las columnas de mutacin solamente se marcaalto nivel a isoniazida, el patrn de bandas ob- rn con un signo negativo cuando no aparezca
tenido con las sondas inhA permiten dibujar una ninguna de las bandas correspondientes a las
conclusin sobre las resistencias de bajo nivel mutaciones. Si al menos una de las bandas de
a isoniazida de las cepas testadas, respectiva- mutacin aparece positive, este resultado se
mente.
clasificar como positivo, y la columna MUT del
respectivo gen se marcar con un +.
Sondas de mutacin
Las sondas de mutacin detectan algunas de Seguidamente se explican dos de los ejemplos
las resistencias ms comunes mediadas por arriba mostrados:
mutaciones (ver 1, 2 y 3). Comparadas con El ejemplo 1 muestra el patrn de bandas del
otras muestras, las seales positivas de las son- wild type. Todas las sondas de Wild type muesdas de mutacin rpoB MUT2A y MUT2B pueden tran seal, pero ninguna de las sondas de mutamostrar una seal ms dbil.
cin lo hacen, por tanto, la tarjeta de evaluacin
Solamente deben ser consideradas aquellas muestra un + en las tres columnas del wild
bandas cuya intensidad es de la misma inten- type y un en las tres columnas de las mutasidad o mayor que las del Control de Amplifica- ciones. De acuerdo a estos datos, las casillas
cin.
RMP sensitive e INH sensitive se marcarn
Cada patrn que se desve del patrn del wild +.
type indica resistencia de la cepa testada. El patrn de bandas obtenido con la sonda rpoB per- Una de las sondas de rpoB y de katG wild type
mite dibujar una conclusin sobre la resistencia estn ausentes en el ejemplo 5; por tanto en las
a rifampicina de la cepa testada, el patrn de casillas de rpoB WT y katG WT se marcar .
bandas del katG sobre un nivel alto y el patrn Ya que ninguna de las sondas de mutacin son
de bandas del inhA sobre una nivel bajo de re- positivas, estas casillas se marcarn tambin
sistencia a isoniazida respectivamente.
con . La regin promotora de inhA no se desva del patrn wild type. La cepa es evaluada
como RMP e INH resistente. La resistencia a
INH est causada por una mutacin en el gen
katG y es por tanto una resistencia a isoniazida
de alto nivel.
PRECAUCIONES
se requiere almacenar durante ms de 4 semanas, almacene a 20C. A fin de evitar congelaciones y descongelaciones repetidas, alicuote el
PNM. Almacene el resto de los componentes del
kit en 2-8C.
Pg. 129
bilidad.
Como en cualquier anlisis basado en DNA,
No utilice los reactivos despus de su fecha de este test slamente analiza la secuencia de
caducidad.
cidos nuclicos y no la de aminocidos. Es
Los especmenes de los pacientes y los culti- posible, por tanto, que mutaciones que no cauvos realizados a partir de especmenes de pa- san un cambio de aminocido (mutaciones sicientes deben ser considerados siempre como lenciosas) podran producir la ausencia de una
potencialmente infecciosos. Las muestras de de las sondas wild type.
pacientes de riesgo (infectados por microorga- Los datos ms recientes indican que a pesar de
nismos patgenos incluyendo Hepatitis B y Vi- aparezca una mutacin L533P en la respectiva
rus de Inmunodeficiencia Humana (VIH)) y los cepa, esta puede todava ser sensible a RMP.
cultivos realizados a partir de esas muestras Por tanto, si la banda WT8 est ausente y la
deben ser etiquetados y manejados siempre sonda de la mutacin rpoB MUT3 no se tie,
bajo las condiciones de seguridad adecuadas, deben ser considerados los resultados de la
de acuerdo con las guas institucionales. Ob- resistencia fenotpica.
serve todas las normas medioambientales y de En los ltimos aos han sido publicadas mutaseguridad, tanto federales, estatales como lo- ciones adicionales dentro de las testadas en la
cales. Lleve siempre guantes y ropa adecuada. regin del gen rpoB causantes de la resistenEl tratamiento y preparacin de la muestra, in- cia a rifampicina. Ya que estas mutaciones son
cluyendo el paso de inactivacin por calor, de- muy raras, estas no fueron accesibles para la
ben ser llevados a cabo en una cabina de segu- validacin de este sistema y fueron solamente
ridad de clase II. Antes del paso de inactivacin detectadas in silico. Sin embargo, una detecpor calor las muestras deben ser centrifugadas cin in silico no excluye la posibilidad de que
en un rotor con contenedor de aerosoles. Abrir alguna de las mutaciones no pueda ser detecel rotor con contenedor de aerosoles solamen- tada in vitro.
te en la cabina de seguridad. Despus de la El GenoType MTBDRplus solamente detecta
inactivacin por calor se puede utilizar un rotor aquellas resistencias del M. tuberculosis comstandard para centrifugar las muestras fuera de plex que tienen sus orgenes en la regiones de
rpoB, katG e inhA examinadas aqu. ResistenObserve las precauciones normales para pre- cias que tienen sus orgenes en mutaciones en
parar la amplificacin. Es esencial que todos los otros genes o regiones de genes, as como,
materiales y reactivos usados para extraccin otras resistencias o mecanismos de resistencia
de DNA y amplificacin estn libres de DNasas. rifampicina e isoniazida no sern detectados
por este test.
Cuando manipule los reactivos del kit debe to- El usuario debe tener o adquirir informacin somar las siguientes medidas especiales de se- bre el patrn de distribucin de las mutaciones
guridad:
locales de los genes investigados con este test.
La Solucin de Desnaturalizacin (DEN) con- La presencia de mltiples especies de bactetiene <2% de NaOH y es irritante para ojos y rias en la muestra a analizar puede dificultar la
piel.
El Sustrato Concentrado (SUB-C) contiene Di- Tericamente, puede existir resistencia a pesar
metil Sulfxido y es irritante.
de que aparezca un modelo wild type. Si, en
un ensayo, la muestra contiene una cepa que
LIMITACIONES
ha desarrollado una he- teroresistencia y la reLa declaracin dada en este manual con res- sistencia se debida a una mutacin no cubierta
pecto a la capacidad del mtodo, se refiere a por las sondas, aparecer el patrn de bandas
muestras de cultivos y muestras clnicas pul- de wild type. Del mismo modo, si la muestra
monares baciloscopia positivas. Los datos dis- contie nen ms de una cepa del complejo M.
ponibles sobre muestras clnicas extrapulmo- tuberculosis (debido a un cultivo mixto o una
nares baciloscopia positivas no son suficientes contaminacin) y una de ellas alberga una mupara trazar una conclusin acerca de su aplica- tacin que no est cubierta por las sondas
Pg. 130
geno disuelto en caldo por crecimiento de los

microorganismos.
de mutacin, aparecer tambin el patrn de El kit BACTEC MGIT 960 SIRE es un anlisis
cualitativo con duracin de 4 a 13 das. El anbandas de wild type. Como en el caso de otras
lisis se basa en la comparacin del crecimienpruebas de diagnstico, los resultados de este
to de la cepa aislada de M. tuberculosis en un
ensayo slo pueden interpretarse en conjuncin
tubo que contiene antibitico con el crecimiento
con otros datos clnicos y de laboratorio adicioen un tubo sin antibitico (control del crecimiennales a disposicin del facultativo responsable.
to). El instrumento BACTEC MGIT controla los
Antes de la amplificacin, el DNA ha de ser aistubos para detectar un aumento de su fluorelado de cultivo bacteriano o muestras clnicas
cencia. Utiliza el anlisis de la fluorecencia del
pulmonares baciloscopia positivas, utilizando
tubo con antibitico en comparacin de la fluoun mtodo idneo. Ha de tenerse la seguridad
recencia del tubo de control de crecimiento para
de que la muestra de DNA ha sido amplificada
determinar los resultados de sensibilidad.
eficientemente durante la reaccin de amplificacin. El test solo funciona dentro de los lmites
de las regiones genmicas para las que los pri- Materiales
mers y sondas han sido elegidos. El anlisis de Kit SIRE contiene frascos individuales liofilizasecuencias potenciales permanece reservado dos de estreptomicina 332 ug, isoniazida 33.2
ug, rifampicina 332 ug y etambutol 1,660 ug y 8
Como cualquier sistema de deteccin basado frascos de suplemento SIRE.
en la hibridacin, este sistema contempla la po- Suplemento BACTEC SIRE contienen 20 ml de
sibilidad de que variaciones de las secuencias medio de enriquecimiento Middlebrook OADC.
en las regiones genmicas que fueron elegidas Formula por litro de agua:
para los primers y sondas, y la deteccin de re- Albumina bovina 50 gr. Catalasa 0,03gr.
20 gr.
giones para las cuales el kit no fue diseado, Dextrosa
cido
oleico
0,6 gr.
pueden conducir a resultados falsos. Debido a
la gran variabilidad existente en los genomas Suminstrados: Kit BACTEC MGIT 90 SIRE con
bacterianos es posible que ciertos sub-tipos un frasco de cada antibitico liofilizado y ocho
puedan no ser detectados. El test refleja los co- frascos de suplemento SIRE (se obtiene aproximadamente 40 anlisis por cada antibitico
nocimientos de Hain Lifescience.
La utilizacin de este ensayo est limitada a del kit).No sumisntrados: Tubos de crecimiento
personas cualificadas, bien entrenadas en el MGIT 7 ml, medios de cultivo auxiliares como
procedimiento de utilizacin del ensayo y fami- Middlebrook caldo 7H9, reactivos como solucin salina estril, cepas ATCC para el control
liarizadas con mtodos de biologa molecular.
La evaluacin de este sistema de anlisis fue de calidad y equipo de laboratorio para el prollevada acabo utilizando la HotStarTaq polime- ceso como vortex, nefelmetro,etc.
rasa de Qiagen (Hilden, Alemania). Ya que las
caractersticas de rendimiento de este ensayo Almacenamiento
no han sido validadas para todas las polime- Los antibiticos liofilizados deben estar a 2 -8C.
rasas disponibles comercialmente, el usuario Una vez reconstituidos se puede congelar y ales el encargado de evaluar la aplicabilidad de macenar a temperatura igual o menor a -20C
otras polimerasas distintas de las arriba men- durante un mximo de 6 meses siempre que no
se pase la fecha de caducidad original. Una vez
cionadas.
descongeladas deben usarse inmediatamente,
10.2.3. MTODO DE SENSIBILIDAD AN- desechar cualquier porcin no utilizada.
TIFMICA POR BACTEC MGIT 960 SIRE Suplemente SIRE debe almacenar en lugar oscuro de 2 -8 C. Evitar congelacin y sobrecaKIT
lentamiento. Abrir y usar antes de la fecha de
Principio
caducidad. Reducir al mnimo la exposicin a
El tubo MGIT para deteccin de crecimiento mila luz
cobateriano es caldo midlebrook 7H9 con compuesto fluorescente el cual es sensible al oxRevista No. 1 Enero - Marzo 2016 Clinica de Enfermedades Infecciosas Hospital Roosevelt ISSN 2415-251X
Pg. 131
Procedimiento
Preparacin antifimicos: Reconstituir cada frasco de liofilizado del kit SIRE con 4 ml de agua
estril destilada/desionizada para preparar soluciones de reserva de estreptomicina de 83
ug/ml, de isoniazida de 8.3 ug/ml, rifampicina
de 83 ug/ml y de etambutol de 415 ug/ml
Preparacin del inculo: Todos las preparaciones deben realizarse a partir de cultivos puros
de M. tuberculosis. Deben estar previamente
identificadas y aseguras que es de cultivo puro.
El inoculo puede prepararse a partir de un medio slido de un tubo BATEC MGIT 7 ml positivo, adems los que crecen en medios lquidos
y slidos se pueden utilizar para preparar un
tubo MGITi de siembra que sirve para preparar
el inculo.
8. Diluir 1 ml de la suspensin ajustada en 4 ml

de solucin salina estril (dilucion 1:5). Continuar con el proceso de inoculacin para el anlisis de sensibilidad.
A partir de un tuboBACTEC MGIT de 7 ml positivos:
1. El primer da en que el instrumento registra
un resultado positivo para un tubo MGIT se
considera el das 0.
2. Para preparacin del inculo de anlisis,
debe usarse un tubo MGIT de 7 ml positivo el
da despus de que el instrumento BACTEC
MGIT registre el resultado positivo (da 1) hasta
el quinto da, inclusive (da 5) despus de que
el instrumento registre el resultado positivo. Si
un tubo permanecido positivo ms de cinco
das, se debe hacer un subcultivo en un nuevo
tubo MGIR de7 ml que contenga suplemento
para crecimiento BACTEC MGIT, analizarlo en
el instrumento BACTEC MGIT hasta que se registre positivo y utilizarlo de uno a cinco das
despus de mostrar positividad.
3. Si el tubo es positivo los das 1 2, utilice
el caldo de suspensin MGIT para los procedimientos de inoculacin. Mezcla bien. Continuar
con el proceso de inoculacin para el anlisis
de sesibilidad.
Preparacin de un tubo MGIT de siembra a
partir de medios slidos
1. Con un asa de inoculacin estril retire el
crecimiento del agar inclinado y adalo a un
tubo MGIT de 7 ml suplementado con 0.8 ml de
suplemento para crecimiento BACTEC MGIT.
2. Cierre bien y mezcle suavemente invistiendo
2 a 3 veces.
3. Ponga el tubo en el instrumento BACTEC
MGIT y analice hasta obtener un resultado positivo. El tiempo para obtener positivo debe ser
igual o superior a 4 das para su uso como inculo AST. Si se vuelve positivo antes de los 4
das volver al paso 1 y preparar un tubo nuevo
de siembra.
4. Proceda a utilizar el tubo durante el da uno
al cinco despus de la positividad. Continuar
con el procedimiento a partir de un tubo BACTEC 7 ml positivo.
A partir de Medios Slidos:

1. Aagregar 4 ml de cald Middlebrook 7H9 o
caldo de MGIT a un tubo estril de 16.5 x 128
mm con tapon de rosca con 8 a 10 microesferas de vidrio.
2. Con un asa estril separar el mayor nmero de colonias de un cultivo de 14 das como
mximo, evitando recoger medio slido. Poner
en suspensin las colonias en el caldo Middlebrook 7H9.
3. Agitar la suspensin en un agitador Vortex
durante 2 3 min para dispensar los grumos
ms granes. La turbidez de la suspensin debe
superar el patrn 1.0 de McFarland.
4. Dejar que la suspensin repose durante 20
minutos sin moverla.
5. Transferir el lquido sobrenadante a otro
tubo estril de 16.5 x 128 mm con tapn (evitar
transferir parte del sedimento) y deja reposar
por 15 minutos.
6. Transferir el lquido sobrenadante (debe estar homogneo sin grumos) a un tercer tubo
estril de 16.5 por 128 mm. (en este paso la
suspensin el microorganismo debe ser superior a 0.5 de MacFArland
7. Ajustar la suspensin a un patrn 0.5 de
MacFarlan mediante comparacin visual con Procedimiento de inoculacin para el anlisis
un patrn 0.5 o con u nefelmetro. No ajustar de sensibilidad con el kit BACTEC MGIT 960
por debajo del 0.5 de Mac fArland.
SIRE:
Pg. 132
1. Etiquetar cinco tubos MGIT de 7 ml para cada

cepa aislada analizada. Etiquetar uno como CC
(control de crecimiento), uno como STR, uno
como INH, uno como RIF y uno como EMB.
Colocar los tubos en la secuencia correcta en
el transportador del tamao apropiado para el
conjunto de AST.
2. Agregar aspticamente 0.8 mL de suplemento BACTEC MGIT SIRE a cada tubo. Importante utilizar el suplemento suministrado con el kit.
3. Con una micropipeta, transferir aspticamente 100 ul de la solucin MGIT STR de 83
ug/mL al tubo MGIT que tiene la etiqueta correspondiente. Con una micropipeta, transferir
aspticamente 100 uL de la solucin MGIT INH
de 8.3 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta correspondiente. Con una micropipeta 100 uL de
RIF de 83 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta
correspondiente.
Con una micropipeta transferir 100 uL de EMB
de 415 ug/mL al tubo MGIT con la etiqueta correspondiente. Importante agregar el antifmico apropiad al tubo corresponiente. No agregar antifmico al tubo de control de crecimiento.
precauciones estndar y las normas operativas

de seguridad.
El trabajo con cultivos de M. tuberculosis requiere prcticas, equipo de contencin e instalaciones de nivel des eguridad biolgica (BSL)3.
Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
en busca de indicios de contaminacin o dao.
Desecharse los que no parezcan aptos. No deben usarse tubos con daos.
En caso que se rompa un tubo:
1. Cierre los cajones del instrumento
2. Apagar el instrumento.
3. Desalojar la zona inmediatamente
4. Consultar las normar de manejo de manipulacin de lquidos y materias contaminadas as
como aerosol de micobacterias descritas.
4. Preparacin de inculo del tubo de Control de
Crecimiento: Con una pipeta, transferir aspticamente 0.1 mL de la suspensin de microorganismos (Preparacin de inculo) a 10 ml de
solucin salina estril para preparar la suspensin 1:100 de control de crecimiento. Mezclar
bien la suspensin de control de crecimiento.
Inocular 0.5 mL de la suspensin 1:100 de control de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la
etiqueta CC
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para anlisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
precauciones estndar y las normas operativas
de seguridad.
El trabajo con cultivos de M. tuberculosis requiere prcticas, equipo de contencin e instaLos antifmicos se reconstituyen con 4 ml de laciones de nivel des eguridad biolgica (BSL)3.
agua estril/desionizada para lograr la concen- Antes de usar debe revisar los tubos y frascos
tracin adecuada
en busca de indicios de contaminacin o dao.
4. Preparacin de inculo del tubo de Control de Desecharse los que no parezcan aptos. No deCrecimiento: Con una pipeta, transferir aspti- ben usarse tubos con daos.
camente 0.1 mL de la suspensin de microor- En caso que se rompa un tubo:
ganismos (Preparacin de inculo) a 10 ml de 1. Cierre los cajones del instrumento
solucin salina estril para preparar la suspen- 2. Apagar el instrumento.
sin 1:100 de control de crecimiento. Mezclar 3. Desalojar la zona inmediatamente
bien la suspensin de control de crecimiento. 4. Consultar las normar de manejo de manipuInocular 0.5 mL de la suspensin 1:100 de con- lacin de lquidos y materias contaminadas as
trol de crecimiento en el tubo MGIT que tiene la como aerosol de micobacterias descritas.
etiqueta CC
Advertencias y Precauciones
Toda muestra para anlisis debe manejarse
como potencialmente infecciosas y seguirse las
Pg. 133
11. BIBLIOGRAFA
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Manual de Tcnicas y Procedimientos de Bacteriolgica

de la Tuberculosis. Ministerio de Salud Pblica y Asistencia Social. Laboratorio Nacional de Salud. Laboratorio Central y de Referencia en Tuberculosis. (2001). 2da
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Palacios, M., Gordillo, M. (2004). Manual de Diagnstico
Microbiolgico. rea de Micobacterias y Hongos. Seccin de Microbiologa, Departamento de laboratorios Clnicos, Hospital Roosevelt. Guatemala. 23 p.
Smithwick, Ronald W. M.S. (1980). Laboratory Manual
Pg. 134
NORMAS DE PUBLICACIN 2014

La revista de Medicina Interna de Guatemala es el rgano oficial de divulgacin de la Asociacin
de Medicina Interna de Guatemala (AMIG) y tiene como principal objetivo establecer un eje de
comunicacin e integracin entre los mdicos internistas de Guatemala. La publicacin es cuatrimestral y es distribuida en hospitales, facultades de ciencias de la salud, clnicas, instituciones
educadoras y de investigacin, as como por va electrnica y colocada en la pgina electrnica
de la AMIG. Nuestros principales lectores son especialistas en Medicina Interna y sub-especialistas de Medicina Interna. El contenido de la revista puede ser consultado va internet, en el sitio
www.asomigua.org o a travs de Facebook: Asociacin de Medicina Interna de Guatemala.
La revista recibe trabajos en espaol, con resumen en ingls, y est constituida por secciones de
editorial, artculos originales, artculos de revisin (actualizacin), notas previas/cartas al editor,
derecho a respuesta (una sola), fotos clnicas, casos interesantes. Asimismo, la revista ofrece
cobertura e informacin sobre los principales eventos cientficos relacionados a la especialidad.
Los artculos de revisin (actualizacin) sern solicitados por el comit editorial segn las necesidades epidemiolgicas y clnicas para Guatemala.
Los manuscritos en triplicado sern dirigidos al Dr. Carlos Rodolfo Meja Villatoro coordinador
del comit editorial de la revista y recibidos en la sede de la Asociacin de Medicina Interna de
Guatemala en la 12 calle 2-04, zona 9, edificio Plaza del Sol, oficina 319 nivel 3, ciudad de Guatemala. Se puede remitir el texto por va electrnica a la direccin revista.asomigua@gmail.com
en formato Word utilizando letra arial 12 a doble espacio en una solo columna.
Los trabajos sern evaluados por el coordinador del comit editorial y por dos especialistas annimos elegidos entre los miembros del comit Editorial y entre los afiliados de la Asociacin de
Medicina Interna de Guatemala con reconocida experiencia en el asunto. El comit Editorial tiene
la facultad de rechazar aquellos trabajos que no juzgue apropiados, as como de proponer modificaciones cuando lo considere necesario. La correspondencia con los autores ser realizada, por
correo electrnico exclusivamente.
Los trabajos deben de seguir la siguiente estructura:
1. Carta de presentacin
Los trabajos debern ser precedidos de una carta de presentacin dirigida al coordinador del
comit editorial, en la que se incluya el ttulo del trabajo, un prrafo destacando la importancia
del artculo y la seccin en la que se solicita la publicacin. Los autores deben explicitar que el
trabajo no ha sido publicado con anterioridad ni ha sido enviado simultneamente a otra revista.
Asimismo, se indicar que todos los autores estn de acuerdo con el contenido del trabajo, que
ceden los derechos de publicacin a la Revista Medicina interna de Guatemala y que no existen
conflicto de intereses.
El formato general para las diversas secciones de la Revista se presenta de la siguiente manera:
Pg. 135
2. Primera pagina
La primera pgina del trabajo incluir obligatoriamente los siguientes puntos:
- Ttulo del trabajo conciso, completo y explicativo sobre el asunto al que se refiere.
- Nombre completo de los autores, sin abreviaciones. Los autores debern indicar la forma en
que deseen ser citados.
- Ttulo acadmico completo de los autores, con el nombre y la direccin de la institucin de trabajo a la que estn afiliados.
- Especificacin de la unidad o departamento de la institucin donde el trabajo fue realizado.
- Nombre, direccin, e-mail y nmero de telfono/fax del autor designado para recibir la correspondencia.
3. Resumen:
El resumen debe presentar los siguientes puntos:
Ser enviado en el idioma original (espaol o ingls). En los casos de artculos en ingls, se deben
enviar el resumen en espaol e ingls.
Extensin mxima de 300 palabras para los artculos originales y revisiones, y de 250 palabras
para las notas previas y relatos de casos.
Ser informativos y no indicativos, explicando de forma clara los objetivos, mtodos, resultados y
conclusiones derivadas del estudio.
En los descriptores deben incluirse por lo menos 3 y hasta un mximo de 10 palabras-clave,
en el idioma original y en ingls, empleadas en el DeCS Descriptores en Ciencias de la Salud,
publicacin de la BIREME (Centro Latino-Americano y del Caribe de informacin en ciencias de
la Salud), disponible en http://decs.bvs.br o en el ndex Medicus (Medical Subject Headings),
disponible en http://www.ncbi.nlm.gov/entrez/meshbrower.cgi
Pg. 136
4. Cuerpo del texto

El trabajo debe de ser dividido en las siguientes partes:
Introduccin: debe de ser sucinta, proporcionando nicamente la informacin necesaria para
comprender el trabajo que ser presentado posteriormente. No se deben incluir datos ni conclusiones. El ltimo prrafo deber exponer de forma clara los objetivos del trabajo.
Materiales (o Pacientes) y Mtodos: debe explicar la metodologa utilizada, los criterios de seleccin empleado informacin sobre la poblacin, estudiada, datos sobre los anlisis estadsticos e
informacin concerniente a los aspectos ticos del estudio.
Aspectos ticos: los artculos sobre investigaciones con seres humanos deben presentar la autorizacin previa del Comit de tica de la institucin en la que se realiz el estudio, as como
mencionar la obtencin de consentimiento por escrito, despus que el paciente, sus familiares o
su representante legal (en el caso de menores o discapacitados) hayan sido informados sobre los
procedimientos o estudios a ser realizados. Los artculos sobre ensayos con modelos biolgicos
deben presentar la aprobacin de los protocolos obtenidos.
Los nombres comerciales de los medicamentos deben ser acompaados del nombre genrico
correspondiente, esclareciendo siempre las dosis y la vas de administracin.
Resultados: deben de exponerse exclusivamente la descripcin y no la interpretacin de los datos
obtenidos con la metodologa utilizada en el trabajo. Deben de resumir las observaciones ms
importantes con cuidado de no repetir las informaciones mostradas en tablas, figuras o grficos.
En caso que se requiera presentar un volumen grande de datos, deber preferirse los grficos en
lugar de las tablas.
Discusin: deben de resaltarse las conclusiones y los aspectos ms importantes del trabajo. Deber evitarse repetir las informaciones ya presentadas. Se resaltaran las inferencias de los resultados, las deducciones elaboradas y tambin las limitaciones del estudio. Deber de comparase
los resultados con los de otros estudios y confrontar las observaciones finales con los objetivos
del trabajo.
Agradecimientos: deben ser limitados a los individuos e instituciones que efectivamente contribuyeron para la realizacin del estudio.
Financiamientos: informacin detallada sobre la fuente de financiamiento. Si no existe ayuda financiera, los autores debern declarar que no existe conflicto de intereses.
5.Material ilustrativo
Cualquier material utilizado para ilustrar el trabajo (tablas, figuras o fotografas) debe ser presentado en hojas aparte, al final del texto, cada una en una pgina diferente.
Tablas: deben ser numeradas conforme el orden de parecimiento en el texto, utilizando nmero
arbigos y deben ser auto explicativas. El ttulo debe ser claro e informativo. Las observaciones
necesarias para esclarecer abreviaturas u otros sern colocadas al pie de la tabla. El formato de
la misma debe de utilizar los comandos de tabulacin (tab) y nueva lnea (enter).
Pg. 137
Figuras: Deben de ser numeradas conforme orden de aparecimiento en el texto, en nmeros arbigos. Todas las explicaciones deben de ser presentadas en las leyendas. Los grficos y figuras
deben de ser enviados en power point. En el caso de figuras y fotografas, se deber colocar
en el dorso una etiqueta adhesiva en la que se indique el nombre del primer autor y una flecha
sealando el margen superior. Las fotografas digitales deben de ser enviadas con buena definicin (mnimo 300DPI). De ser necesario, utilizar siempre imgenes producidas por impresoras
de alta resolucin y en blanco y negro.
6. Referencias bibliogrficas
Las referencias deben ser numeradas consecutivamente en el orden en que fueron mencionadas
en el texto, debiendo ser identificadas en nmeros arbigos colocados como exponentes. Los
nombres de las revistas deben ser abreviados de acuerdo con el ndex Medicus, disponible en:
http://www.ncbi.nlm.gv/jrbrowser.cgi.
Las citas debern comprobarse sobre los artculos originales y se ordenaran segn las normas
de Vancouver (1997, edicin revisada de Octubre de 2001), disponible en: http://www.icmje.org.
Todos los autores deben ser citados, independientemente de su numero y deber evitarse escribir para nmeros grandes de autores: et al. No se emplearan frases como comunicaciones
personales. Los trabajos aceptados y no publicados en el momento de ser citados pueden ser
incluidos en las referencias, especificando el nombre de la revista, seguido de la expresin en
prensa entre parntesis. A continuacin se citan algunos ejemplos de los principales tipos de
referencias utilizadas.
a) Artculo de revista:
1. Bryan CS, Reynolds Kl. Bacteremic nosocomial pneumonia. Am Respir Dis 1984;129:668-671.
2. Carratala J, Guidol R, Pallares R, Dorca J, Verdaguer R, Ariza J, et al. Risk factors for nosocomial Legionella pneumophila pneumonia.Am Rev Respir 1994; 149:625-629.
b) Trabajo publicado por una institucin o corporacin:
Ministerio de Sanidad y consumo. Liga Espaola para la Lucha Contra la Hipertensin. Sociedad
Espaola de Hipertensin. Control de la hipertensin arterial en Espaa. Rev Esp Salud Pblica
1996; 70:139-210.
OMS. Informe Anual de Mortalidad Materna en las Amricas. Ao: xxxxx. Disponible en: www.
who.org por ejemplo.
Encuesta Nacional de Salud Materno Infantil, Guatemala: Ao: xxxxs
c) Volumen con suplemento:
Vogel F. Sequential Therapy in the hospital management of lower respiratory infections. Am J
Med 1995; 99 (Supl 6B) : 13S-19S
d) Libros, tesis y monograficas:
1. Hawe P, Degeling D, Hall J. evaluacin en promocin de la salud. Gua para trabajadores de
la salud. 1st ed. Barcelona: Masson;1993.
2.World Health Organization. International drug monitoring the role of national centers. Technical
Report Series N 498.Geneva: 1972.
3.Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly`s access and utilization (dissertation).
St. Louis (MO): Washinton Univ.;1995.
Pg. 138
4. Nues L. Aspectos clnicos, hematolgicos e inmunolgicos en la estrongyloidiasis. Tesis Universidad Central de Venezuela; 1993.
e) Captulo de libro:
Rawlins MD, Thompson JW. Mechanisms of adverse drugs reaction.
En Davies DM, editor. Textbook of Adverse Drug Reaction.4th ed. Oxford University Press; 1991
p 18-45.
f) Resumen de congreso:
Vettorello ML. A influencia de fatores climaticos na incidencia dos acidentes loxoscelicos no
Municipio de Curitiba, no period de 1998 a2001. XXXIX Congresso da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical. 008 TL. Belem, 2003
g) Articulo de fuente o revista electrnica
1. The Counter Bioterrrorism Research Agenda of the National Institute of allergy and Infectious
Diseases for CDC Category A Agents. Washington, DC: National Institute of Allergy and Infectious Diseases; February 202. Disponible en: http://www.nih.gov/dmid/pdf/bioresearchagenda.
pdf.
2. Carucci JA, McGovern TW, Norton SA. Cutaneos anthrax management algorithm. J Am Acad
Dermatol 2001; Nov 21. Disponible en:
http://www.harcourthealth.com/scripts/om.dll/server?arttype=full&article=a121613.
Pg. 139

Revista Microbiologia 2016

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ISSN 2415-251X

Clinica de Enfermedades Infecciosas

Revista de microbiologia Volumen No. 1

Clinica de Enfermedades Infecciosas

Revista de microbiologia Volumen No. 1

Manual de tinciones en Microbiologia Clinica

Normas de seguridad en el laboratorio

Tinciones en Microbiologa Clnica

Identificacin de principales microorganismos

Manual de Procedimientos Tamizaje, Aislamiento,

Procedimiento para obtencin de la muestra.

-71-71-71-72-73-73-73-73-73-74-74-74-75-75-75-75-75-75-76-76-76-77-77-79-80-80-81-82-83-83-83- 84-85-85-86-86-86- 87-89-89-89-92-92-92-92-93-94-107-108-113-114-118-118-118-118-118-119-119-119-125-125-131-131-133-134-134-135-139-

9. Conocer el manejo de todos los equipos y

19. Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo.

Los frotes de cultivos slidos, completamente

Figura 1. Preparacin y fijacin de frotes bacterianos a partir de cultivos slidos y lquidos.

III. TINCIONES EN MICROBIOLOGA

Figura 2. Clulas epiteliales ncleos

2. Tincin de Azul de Lactofenol

3. Tincin Naranja de Acridina

aproximadamente por dos minutos.

Figura 4. Tincin de ascosporas.

4. Tincin de Negro de Clorazol

Figura 5. Examen directo con negro de clorazol se

5. KOH con Tinta Azul Parker

Figura 6. Examen directo de piel con KOH 20% y tinta

Figura 7. Se observa cocos gram negativo de color rojo por la

bulos sanguneos. El colorante deber cubrir

Esta tincin tiene diversos usos en microbiologa; en la parasitologa, se le emplea en la

Figura 8. Frote perifrico con parsitos intracelulares, teidos

eliminar cualquier resto de colorante.

Figura 9. Frote perifrico con clulas sanguneas de

La tcnica de Z-N fuerza la penetracin de la

do con fucsina bsica fenicada recin filtrada.

croscopio, un manchado diapositivas Kinyoun

6. Tincin de Ziehl-Neelsen Modificado

Cubrir la lmina con colorante azul de metileno por 30 segundos.

Figura 12. Se observa Quistes de Cryptosporidium

7. Tincin selectiva de esporas WirtzConklin

tincin es un mtodo qumico muy utilizado en

Figura 13. Tincin de esporas en Bacillus subtilis, la

8. Tincin de cido Perydico de Schiff (PAS)

Figura 14. Se observa dentro del tejido, la presencia

De esta forma, los resultados positivos pueden

Figura 16. Las bacterias alcohol cido resistentes se

3. Tincin Blanco de Calcofluor

carinii. Maeda & Ishida en 1967, describieron

Figura 17. Se observarn hifas anchas, no septadas, con

Figura 18. Se observa levaduras de C. neoformans

G. Koneman., E. Allen., S. Janda., W. Procop.,

El personal de laboratorio debe utilizar equipo

Membrana Citoplsmica: localizada por debajo

2.3.2 Bacterias Gram negativo

2.4 Tinciones Bsicas

- Cubrir el frote con el reactivo Carbn fucsina,

2.4.2.2 Procedimiento de Tincin de

2.4.3 Tincin de Kinyoun

2.4.4 Tincin Kinyoun Modificado

2.4.4.2 Procedimiento de Tincin Kinyoun Modificado

3 Toma de Muestra y Procedimientos

Parecida a la coloracin de Kinyoun o en frio,

El rea farngea puede estar colonizada por

Carnero al 5% en un extremo de la caja realizando el inoculo.