Anda di halaman 1dari 15

Proses Pengurutan Mendalam Rangkaian Virus Hepatitis B pada

Pasien Karsinoma Hepatoseluler Menampilkan Proses Integrasi,


Perubahan Struktur, dan Variasi Urutan
Soo Ting Toh, Yu Jin, Lizhen Liu, Jingbo Wang, Farbod Babrzadeh, Baback
Gharizadeh, Mostafa Ronaghi, Han Chong Toh, Pierce Kah- Hoe Chow,
Alexander Y-F.Chung, London L-P-J.Ooi, and Caroline G-L.Lee
Infeksi virus hepatitis B (HBV) kronik secara epidemiologi memiliki
hubungan dengan karsinoma hepatoseluler (HCC), tetapi peranan infeksi
virus hepatitis B kronik dalam terjadinya HCC masih belum sepenuhnya
diketahui karena adanya keterbatasan teknologi. Pada penelitian ini, kami
mengelompokkan HBV pada pasien HCC secara sistematis. Rangkaian virus
hepatitis B didapatkan dari 48 pasien HCC dengan menggunakan strategi
oligo-bead-based, kemudian dikumpulkan dan dilakukan pengurutan dengan
menggunakan FLX-Genome-Sequencer. Pada tumor didapatkan terjadinya
integrasi secara tidak wajar dari HBV ke dalam gen-gen promotor (P <
0.001) dan tampak adanya integrasi secara signifikan pada kromosom 10 (P
< 0.01). Proses integrasi pada kromosom 10 secara signifikan berhubungan
dengan jenis tumor yang sulit untuk dideferensiasikan (poorly differentiated)
(P < 0.05). Secara khusus didapatkan bahwa integrasi yang berulang pada
tumor ke dalam promotor gen yang mengkode enzim telomerase reverse
transcriptase (TERT) ditemukan berkorelasi dengan peningkatan ekspresi
dari TERT itu sendiri. Bagian dari gen HBV yang paling sering terlibat
dalam proses integrasi dan perubahan struktur virus tersebut adalah pada
rangkaian 3-end dari protein X virus hepatitis B (HBx), dimana pada bagian
ini terjadi inisiasi proses replikasi/transkripsi dari virus tersebut. Selama
proses integrasi, rangkaian 3-end sering menghilang. HBx-human chimeric
transcripts sebagai salah satu jenis chimeric transcripts yang paling banyak
dijumpai, dapat diekspresikan sebagai protein chimeric. Variasi urutan yang

terbentuk dalam pergantian asam amino yang bersifat non-konservatif


umumnya dijumpai pada gen HBV. Penelitian ini menemukan bahwa HBV
sangat mudah bermutasi pada pasien HCC dengan adanya daerah yang
sering terlibat pada penjamu dan gen virus demi kepentingan integrasi dan
perubahan struktur dari HBV tersebut.
Pendahuluan
Karsinoma Hepatoseluler (HCC) merupakan subtipe dari kanker pada hepar yang
paling sering ditemukan dan sebagai penyebab ketiga terjadinya kematian akibat
kanker di dunia. Pasien HCC biasanya memiliki prognosis yang buruk disebabkan
oleh tingginya tingkat rekurensi pasca bedah dan terjadinya proses metastasis.
Infeksi virus hepatitis B dan C (HBV dan HCV) secara epidemiologi merupakan
faktor risiko yang paling berhubungan dengan terjadinya HCC yang berkisar
antara 75-80% kasus HCC di seluruh dunia. Manusia pembawa HBV kronik
memiliki risiko 20-100 kali lipat menderita HCC tersebut. HBV merupakan
sebuah virus DNA dengan ukuran 3.2 kb berbentuk sirkuler dan secara parsial
memiliki gen dengan rantai ganda yang berisi empat rangka baca terbuka (open
reading frames/ORFs) yang mengkode protein permukaan (surface/S), protein inti
(core/C), protein polimerase (polymerase/P), dan protein X.
Karakteristik yang menonjol dari infeksi virus HBV adalah adanya proses
integrasi dari fragmen DNA subgenomik dari HBV itu sendiri ke dalam lokasilokasi yang berbeda diantara DNA penjamu. Pertumbuhan tumor biasanya
berkaitan dengan proses penyusunan ulang dan proses pembentukan dan
penghancuran secara parsial dari rangkain virus dan sel penjamu. Akan tetapi,
peranan dari DNA HBV yang terintegrasi dalam proses hepatokarsinogenesis
masih belum terlalu jelas dan menjadi kontroversi. Beberapa penelitian tertutup
dalam jumlah kecil menemukan bahwa HBV terintegrasi secara acak pada gen
penjamu, utamanya pada bagian depan dari gen dan daerah di antara gen gen
tersebut, daerah kromosom yang rapuh, daerah perlekatan lipatan/matriks, dan
daerah dengan rangkaian yang berulang.

Proses integrasi HBV ke dalam gen penjamu memiliki dua akibat yang
potensial yaitu: (i) gen penjamu akan berubah (efek cis) dan (ii) gen HBV akan
berubah (efek trans). Efek cis dari integrasi HBV meliputi mutagenesis yang
bersifat insersional yang dapat secara potensial mengganggu fungsi gen penjamu
atau mengubah regulasi dari gen-gen penjamu [sebagai contoh pada enzim
telomerasi reverse transcriptase (TERT)].
Proses integrasi gen HBV juga ditemukan mengalami beberapa bentuk
perubahan berupa penghapusan beberapa gen dari HBV, selain itu juga terjadi
duplikasi yang terbalik dan proses penyusunan ulang dari gen HBV. Walaupun
terjadi proses penyusunan ulang yang cepat, namun proses pengkodean rangkaian
PreS2 dan protein X dari virus hepatitis B (HBx) dilaporkan pada umumnya dapat
bertahan dan dapat ditranskripsikan. Oleh karena itu, kedua protein HBV ini
diimplikasikan memainkan peranan dalam bentuk efek trans dalam proses
hepatokarsinogenesis.
Oleh

karena

integrasi

HBV

dapat

mengganggu

gen

gen

penjamu/mengganggu regulasi ekspresi dari gen penjamu atau sebuah bagian kecil
dari struktur yang berintegrasi dapat memainkan peranan yang penting dalam
proses hepatokarsinogenesis, hal hal tersebut dapat membantu untuk melakukan
pengelompokan HBV pada pasien HCC dalam jumlah besar secara sistematis.
Keterbatasan teknologi PCR dan metode southern blot-based membatasi
penelitian sebelumnya untuk mengenali bagian terintegrasi dari HBV yang paling
sering ditemukan hanya pada beberapa pasien. HBV sangat mudah bermutasi pada
tingkat struktural dan nukleotida dari virus, keterbatasan pengetahuan pada urutan
rangkaian HBV pada setiap pasien yang menjadi sampel menyebabkan kegagalan
proses pemeriksaan dengan PCR dan terjadinya hasil negatif palsu dengan
menggunakan metode berbasis PCR ketika proses pengenalan terjadi pada daerah
yang terhapus atau mengalami polimorfisme dari gen HBV. Terdapat dua
penelitian terbaru yang melaporkan proses pengenalan pendek (short-read) dari
seluruh gen dan teknik pengenalan bagian akhir secara berpasangan (paired-end)
pada proses pengurutan secara mendalam dari 4 dan 88 pasien HCC secara
berurutan. Oleh karena keterbatasan pada proses pengenalan pendek (short-read)

yang dihasilkan dengan menggunakan teknik ini, daerah yang terintegrasi hanya
dapat ditemukan dari proses pengenalan bagian akhir secara berpasangan (pairedend) yang terdiri dari rangkaian gen penjamu dan virus itu sendiri.
Pada penelitian ini, kami menggunakan strategi untuk menampilkan
fragmen DNA yang mengandung rangkaian HBV dari suatu kompleks gen dari
beberapa pasien HCC untuk dilakukan proses pengurutan dengan menggunakan
Next-Generation-GS-FLX-Sequencer (Roche). Proses pengurutan dilakukan
dengan menggunakan sistem FLX yang mampu melakukan proses pengenalan
pada rangkaian yang panjang (400-600 basa), berbeda dengan teknik lainnya yang
secara signifikan menggunakan proses pengenalan rangkaian yang lebih pendek,
sehingga akan lebih memudahkan untuk melakukan identifikasi secara akurat
pada daerah yang terintegrasi dan menemukan proses penataan ulang baru dalam
satu kali proses pengenalan tanpa adanya proses pengurutan bagian akhir
berpasangan (paired-end) atau hasil kesimpulan secara komputasi yang
memberikan bukti konkrit bahwa variasi struktur kompleks yang ditemukan
kemungkinan kurang memiliki arti yang bermakna. Berbeda dengan penelitian
sebelumnya, yang secara umum berfokus pada integrasi HBV dan keterlibatan
efek cis, pada penelitian ini, kami menampilkan penggolongan secara sistematis
dari HBV pada pasien HCC dengan meneliti efek cis dan trans dari proses
integrasi HBV, perubahan struktur, dan variasi urutan gen HBV.
Bahan dan Metode
Sampel pasien HCC
Sampel tumor (T) dan non-tumor (NT) dari 48 pasien HCC berkebangsaan
Singapura digunakan sebagai tempat pengambilan HBV dan dilakukan
pengurutan secara mendalam. Semua sampel tersebut diambil dari pasien HCC
yang tidak dikenali dan telah mendapat persetujuan dari National Cancer Centre
of Singapore Institutional Review Board (NCC_IRB_No_2007/437/B). Jaringan
tersebut diperoleh dari tempat penyimpanan National Cancer Centre of Singapore
Tissue Repository yang telah mendapatkan persetujuan tertulis dari subjek
penelitian.

Proses pra-pengambilan konstruksi DNA


Sebelum dilakukan pengambilan DNA HBV, proses pra pengambilan konstruksi
DNA dilakukan dengan memberikan getaran suara pada 15 g gen pada DNA
tersebut sehingga terbagi menjadi fragmen-fragmen dengan ukuran 0.4-1 kb
dengan menggunakan alat Bioruptor (Diagenode). Ekstraksi gen dari DNA
dilakukan sesuai dengan tata urutan yang dijelaskan dalam Supplementary
Materials and Methods (SMM), yang dapat diakses pada Carcinogenesis Online.
Bagian akhir dari DNA yang telah terpisah menjadi fragmen fragmen tersebut
diperbaiki dengan menggunakan End-It DNA end-repair kit (Epicentre
Biotechnologies) untuk membentuk bagian tumpul pada akhir fragmen-fragmen
DNA tersebut. Bagian tumpul pada akhir fragmen-fragmen DNA tersebut
kemudian

diligasi

dengan

rantai

(5-

CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-6mer barcode) dan rantai B (5CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-6mer

barcode)

(disintesis

dengan menggunakan AITBiotech). Setiap rantai A dan B memiliki sebuah urutan


kode batang 6mer yang unik pada rangkaian 3-end dari sebuah rangkaian 30
nukleotida, yang berperan sebagai tempat cetakan untuk proses amplifikasi HBV
yang telah melewati proses pengambilan konstruksi DNA. Setiap sampel
diberikan sepasang rantai A dan B yang mengandung kode batang yang unik.
Proses ligasi dari rantai tersebut memberikan kesempatan kepada kita untuk
mengumpulkan sampel dalam suatu tempat untuk dilakukan proses pengambilan
dan pengurutan secara berulang-ulang. Celah yang terbentuk oleh karena proses
ligasi pada fragmen DNA yang dilakukan dengan menggunakan rantai nonfosforilatif diperbaiki dengan menggunakan enzim Bst DNA polymerase,
berbentuk fragmen panjang (New England Biolabs). Proses penggabungan sebuah
rangkaian kode batang 6mer yang unik untuk setiap sampel dapat memberikan
kita kemudahan untuk mengidentifikasi setiap sampel pada tempat sampel-sampel
tersebut dikumpulkan dan mengetahui korelasi dari setiap urutan rangkaian
dengan fenotipe klinis dari setiap sampel.

Rancangan Kuar Oligonukleotida dari HBV


Disebabkan oleh karena terdapat berbagai varian berbeda dari HBV yang
dilaporkan dalam NCBI GenBank, maka dengan tujuan untuk memudahkan
pengambilan secara komprehensif dari urutan HBV yang berbeda pada setiap
pasien HCC dilakukan proses perancangan kuar oligonukleotida ~70mer dari
HBV yang dibuat utamanya di antara daerah dari 96 strain HBV berbeda yang
pada umumnya memiliki tipe genotipe B dan C, mewakili strain yang paling
banyak ditemukan di Singapura. Untuk lebih memastikan jangkauan yang
menyeluruh dari HBV dan proses pengambilan dari semua rangkaian yang
berhubungan dengan HBV baik yang utuh maupun yang telah hilang, maka
dilakukan pembuatan 26 kuar oligonukleotida untuk memisahkan seluruh gen
HBV sepanjang kira-kira 60 basa pada setiap urutan rangkaian (base per
sequence/bps). Sebagai contoh, beberapa pemeriksaan harus dibuat di antara
beberapa daerah dengan tingkat polimorfisme yang rendah dari HBV.
Pemeriksaan ini dibuat dengan prinsip nukleotida dari satu genotipe (baik itu B
atau C) digunakan pada setiap daerah polimorfik yang tersedia untuk lebih
memastikan bahwa pemeriksaan tersebut dapat digunakan dalam proses
pengambilan HBV pada genotipe yang berbeda. Ketika suatu pemeriksaan dibuat
pada daerah dengan tingkat polimorfisme yang tinggi (daerah polimorfisme > 10),
dua haplotipe dari oligonukleotida dirancang untuk melakukan proses
pengambilan pada kedua genotipe tersebut. Seluruh pemeriksaan tersebut
mengalami proses biotinilasi pada rangkaian 3-end.
Pengambilan DNA HBV
Untuk melakukan pengambilan DNA HBV, pada proses pra-pengambilan
konstruksi DNA dilakukan denaturasi pada suhu 95oC dan hibridisasi dengan
menggunakan 10 pmol pada 26 kuar oligonukleotida HBV (disintesisi dengan
AITBiotech) selama 16 jam pada suhu 55oC. Larutan penyangga pada proses
hibridisasi terdiri atas formamide 35%, saline-sodium citrate (SSC) 5x, sodium

dodecyl sulfate (SDS) 0.1%, dan dithiothreitol 0.1 mM dengan volume total 350
l. Kuar yang berikatan dengan DNA kemudian diinkubasi dengan bantalan
magnetik dari streptavidin yang terkonjugasi dan belum mendapatkan perlakuan
apapun (Invitrogen) pada suhu 55oC selama 30 menit. Bantalan tersebut kemudian
diberi perlakuan dengan 1 ml larutan penyangga I-Block 4% (Applied Biosystems)
yang mengandung SDS 0.5% dan 15 ng/l DNA sperma ikan salmon yang telah
dimurnikan dengan gelombang suara (Stratagene) selama 50 menit pada suhu
ruangan sebelum digunakan. DNA yang tidak spesifik/tidak berikatan dibersihkan
dengan 5 tahap pencucian yaitu: tahap 1: menggunakan SSC 1x dan SDS 1%, pada
suhu ruangan, selama 1 menit; tahap 2: menggunakan SSC 1x dan SDS 0.1%, pada
suhu ruangan, selama 10 menit; tahap 3 dan 4: menggunakan SSC 1x dan SDS
0.1%, pada suhu 50oC, selama 10 menit; dan tahap 5: menggunakan H2O, pada
suhu ruangan, selama 30 detik. DNA yang masih tersisa pada bantalan tersebut
setelah melewati tahapan pencucian ini kemudian dipanaskan pada suhu 85oC
selama 10 menit dalam H2O. DNA HBV yang telah diambil dari 24 pasien
kemudian dikombinasikan dan dilakukan amplifikasi menggunakan rangkaian
primer DNA pada rantai A dan B. Rangkaian primer DNA yang spesifik untuk
rantai B adalah 5-biotinylated. Reaksi pada PCR dilakukan dengan menggunakan
Advantage 2 PCR Polymerase Mix (Clontech) dengan tahapan sebagai berikut:
95oC selama 1 menit, 95oC selama 40 detik, 62oC selama 30 detik, 68oC selama 1
menit, dan dilakukan langkah tambahan akhir pada suhu 68oC selama 1 menit.
Hasil reaksi PCR kemudian dipekatkan dengan menggunakan SpeedVac Plus
SC110A (Savant) dan dimasukkan dalam sebuah jel agarose. Fragmen-fragmen
dengan ukuran berkisar antara 0.4 hingga 1 kb kemudian diekstraksi dan
dimurnikan dengan menggunakan paket GeneClean III (MP Biomedicals) sesuai
dengan instruksi dari panduan pabrik pembuatnya. Sebagai hasilnya, hanya
fragmen DNA untai tunggal yang berikatan dengan rantai A/B dipilih dengan
menggunakan bantalan magnetik streptavidin terkonjugasi (Invitrogen). Proses
pengambilan urutan rangkaian HBV dari sampel manusia akan meningkatkan
rasio HBV terhadap urutan rangkaian DNA manusia sehingga memudahkan
proses pengumpulan beberapa sampel pasien ke dalam satu proses pengurutan

rangkaian sehingga biaya yang dibutuhkan lebih sedikit. Uji kualitas dan proses
pengurutan rangkaian konstruksi DNA HBV termasuk analisis data hasil
pengurutan rangkaian dilakukan sesuai yang tertera dalam SMM, yang dapat
diakses pada Carcinogenesis Online.
Evaluasi terhadap lokasi virus atau kromosom dimana integrasi sering terjadi
dan analisis akibat yang potensial dari proses integrasi HBV pada gen penjamu
Lokasi virus, gen, dan kromosom sebagai tempat terjadinya proses integrasi
dievaluasi secara statistik yang signifikan dengan membentuk lokasi integrasi insilico secara acak seperti yang tertera dalam SMM, dapat diakses pada
Carcinogenesis Online. Proses integrasi yang diamati lebih dari persentil ke-99
dari distribusi empiris yang terbentuk dari proses pengambilan sampel secara acak
dianggap memiliki arti yang penting dan signifikan.
Proses analisis dari adanya gangguan yang potensial pada lokasi ikatan
bagian yang mengatur gen penjamu (host gene regulatory element binding
sites/REBS) oleh adanya proses integrasi HBV juga dilakukan sesuai yang tertera
dalam SMM, dapat diakses pada Carcinogenesis Online.
Validasi in silico-inferred contigs dari proses pengurutan rangkaian secara
mendalam
In silico-inferred contigs divalidasi melalui PCR dengan menggunakan rangkaian
primer yang dibuat pada daerah paling akhir dari urutan rangkaian contig atau
sesegera mungkin sebelum lokasi pengulangan dari daerah paling akhir dan
daerah berikutnya dari proses pengurutan rangkaian cara Sanger sebagaimana
tertera dalam SMM, dapat diakses pada Carcinogenesis Online.
Viral-human chimeric transcripts
Ekspresi dari Viral-human chimeric transcripts dievaluasi melalui PCR transkripsi
terbalik (reverse transcription-PCR). Proses amplifikasi cepat pada rangkaian 5dan/atau 3- yang terdapat pada bagian akhir dari cDNA yang dilanjutkan dengan
proses pengurutan rangkaian cara Sanger dilakukan untuk mengenali keseluruhan

HBV-human chimeric transcripts. Secara lebih rinci dijelaskan dalam SMM, dapat
diakses pada Carcinogenesis Online.

Ekspresi dan deteksi protein HBx-human chimeric


Kerangka baca terbuka (open reading frames/ORFs) dari protein HBx-human
chimeric diperkirakan dengan menggunakan vektor NTI Advance 10
(Invitrogen). Perkiraan bagian kerangka baca termuka dari protein chimeric
digabung dengan kontrol positif [gen HBx rantai panjang dari pEco63 (ATCC)]
dan kontrol negatif [chloramphenicol acetyltransferase (CAT)] dikloning dan
diekspresikan dalam sel Huh-7. Analisa secara Western blot dan antibodi antiHBx dalam laboratorium dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi dari protein
chimeric (secara lebih rinci lihat SMM, dapat diakses pada Carcinogenesis
Online).
Analisa variasi urutan rangkaian di antara gen HBV
Semua contigs atau pengenalan HBV yang tidak terbentuk dari genotipe B/C
kemudian dibandingkan dengan urutan rangkaian yang menjadi rujukan untuk
menilai variasi urutan rangkaian gen HBV pada pasien HCC. Variasi pada tingkat
asam amino pada keempat protein utama pada HBV (Polymerase, Large S,
Precore/Core, dan X) dinilai dengan menggunakan translasi in silico pada urutan
rangkaian DNA tersebut (secara lebih rinci lihat SMM, dapat diakses pada
Carcinogenesis Online).
Hasil
Lebih dari 400 kali proses pengambilan DNA HBV
Seperti bukti pada Gambar 1A, yang dapat diakses pada Carcinogenesis Online, >
400 kali proses pengambilan urutan rangkaian HBV dalam berbagai latar
belakang telah teramati sepanjang proses tersebut. Proses pengurutan rangkaian
cara FLX membentuk proses pengenalan dengan panjang urutan rangkaian

berkisar antara 34 sampai 1185 basa per urutan rangkaian (base per
sequences/bps) dengan rata-rata panjang urutan rangkaian yaitu 255 basa per
urutan rangkaian (base per sequences/bps). Analisis data yang berasal dari proses
pengurutan rangkaian tersebut (seperti tertera pada gambar 1B, dapat diakses pada
Carcinogenesis Online) menemukan bahwa ~98% proses pengenalan dari
pengurutan rangkaian tersebut dapat dipetakan pada sampel dari pasien dengan
berdasarkan proses identifikasi kode batang. Jumlah keseluruhan dari proses
pengenalan HBV yaitu 23.516 yang dikelompokkan ke dalam 310 contigs dengan
204 masih belum dikelompokkan dimana keseluruhan proses pengenalan ini
terdistribusi antara 43/48 (89.6%) pasien. (Gambar 1C, dapat diakses pada
Carcinogenesis Online). Terdapat 93 perubahan struktur dalam gen HBV
(meliputi 57 delesi, 31 inversi, dan 5 duplikasi) 97 proses integrasi dalam gen
penjamu (disimpulkan dari 977 proses pengenalan). Dari 43 pasien, 39.5% di
antaranya membawa urutan rangkaian HBV yang telah mengalami perubahan
melalui proses delesi, inversi, atau duplikasi dan 60.5% diantaranya mengandung
HBV yang telah terintegrasi (Gambar 1C, dapat diakses pada Carcinogenesis
Online). Sebagian besar pasien terinfeksi oleh HBV bergenotipe B (60.4%),
sedangkan genotipe C (34.9%). Selain itu, 4.7% terinfeksi dengan HBV
bergenotipe A.
Integrasi HBV diperkirakan mengganggu lokasi ikatan bagian yang mengatur
gen penjamu (host gene regulatory element binding sites/REBS)
Terdapat 97 proses integrasi yang terdeteksi pada 22 sampel tumor (T) dan 13
sampel non-tumor (NT) dan 46/47 proses dipilih secara acak untuk selanjutnya
divalidasi. Gambar 2 menampilkan proses pengenalan infeksi virus pada manusia
yang telah tervalidasi melalui serangkaian eksperimen (dapat diakses pada
Carcinogenesis Online).
Walaupun hasil tersebut tidak terlalu bermakna dan signifikan secara
statistik, beberapa pengambilan lokasi integrasi diamati dalam daerah gen
(dikenali sebagai kombinasi berbagai promotor [5kb di sebelah atas lokasi
transkripsi dimulai (transcription start site; TSS)], exons (meliputi 3-untraslated

region; UTR) dan introns) pada sampel tumor (T) tetapi tidak pada sampel nontumor (NT) (Gambar 1A, sebelah kiri). Secara khusus, terdapat hasil yang
bermakna signifikan secara statistik dari proses pengenalan aktifitas integrasi ke
dalam promotor dari setiap gen (P < 0.001) pada sampel tumor (T) (Gambar 1A,
kanan). Proses integrasi pada masing-masing promotor dari 5/7 (71.4%) gen
diperkirakan mengganggu lokasi ikatan faktor transkripsi (transcription factor
binding sites/TFBS) (Gambar 1B). Lebih khusus lagi, di dalam tumor pada lima
pasien, HBV berintegrasi ke dalam promoter dari gen telomerasi reverse
transcriptase (TERT) (Gambar 1B). Hal yang menjadi perhatian adalah semakin
dalam HBV berintegrasi pada TSS dari TERT, maka semakin tinggi ekspresi
messenger RNA dari TERT (Gambar 1B, sebelah kanan), hal ini menunjukkan
bahwa urutan rangkaian virus dapat bertindak sebagai faktor yang meningkatkan
ekspresi tersebut. Untuk menilai apakah proses integrasi HBV tersebut memiliki
kaitan dengan perubahan ekspresi gen di dalam atau di sekitar lokasi integrasi,
kami melakukan pemeriksaan pada 58 gen dimana tersedia data mengenai
perubahan ekspresi tersebut. Seluruh 58 gen ini dipengaruhi oleh 56 proses
integrasi, dimana terdapat dua gen yang saling tumpang tindih dan dipengaruhi
oleh proses integrasi yang sama dalam dua kasus tersebut. Sebagai kesimpulan
pada Gambar 3, 6/8 (75.0%), 2/3 (66.7%), dan 14/23 (60.9%) proses integrasi
pada promotor, exons (meliputi 3-UTR), dan intron secara berurutan berkaitan
dengan perubahan ekspresi dari gen-gen yang terpengaruh, sedangkan hanya 8/24
(33.3%) integrasi antar gen yang berkaitan dengan perubahan ekspresi gen-gen
yang berada dekat dengan lokasi proses integrasi tersebut. Secara khusus,
integrasi yang bersifat genik (meliputi promoter, exons, dan introns) lebih
berhubungan dengan terjadinya perubahan ekspresi gen jika dibandingkan dengan
integrasi antargen (P < 0.05) (Gambar 3, dapat diakses pada Carcinogenesis
Online) hal itu menunjukkan salah satu mekanisme yang berperan pada perubahan
ekspresi gen pada pasien HCC dapat dikaitkan dengan integrasi HBV pada
beberapa gen terutama pada lokasi pengaturan gen tersebut, misalnya promoter
dan intron.

Proses pengamatan lainnya yang patut diperhatikan mengungkapkan


bahwa lokasi integrasi HBV pada promoter dari KPTN tumpang tindih dengan
rangkaian 3-UTR dari gen NAPA sehingga dapat disimpulkan bahwa proses
integrasi HBV diperkirakan tidak hanya mengganggu SP1 TFBS dari KPTN tetapi
juga mengganggu tempat perlekatan miR-762 dan miR-185 (yang juga dikenal
sebagai miR-185-3p) pada 3-UTR dari gen NAPA (Gambar 1B). HBV juga
ditemukan berintegrasi ke dalam bagian exons dari tumor hanya pada dua pasien
HCC. Pada pasien pertama, HBV berintegrasi ke dalam exon 6 dari gen KRT32,
yang terdiri dari 448 asam amino, dan diperkirakan berpotensi menyebabkan
penghentian codon lebih awal (Gambar 1B) pada proses pengkodean 403 asam
amino percabangan protein chimeric dari gen KRT32-HBV hanya mengandung
tiga asam amino dari HBV. Proses integrasi HBV pada exon 37 dari gen TG yang
terdiri dari 2768 asam amino diperkirakan memiliki potensi melakukan
pengkodean sehingga terbentuk protein TG-HBV chimeric yang selanjutnya akan
mengkode 2167 asam amino yang berasal dari gen TG dan >71 asam amino dari
komponen pelengkap terbalik dari HBV.
Lebih dari 68% dari integrasi yang bersifat genik juga bersifat intronik.
Diperkirakan, 25% dari integrasi intronik terjadi di antara 400 basa per urutan
rangkaian (base per sequence/bps) dari lingkaran intron-exon dari gen-gen yang
tercatat dimana diperkirakan lima di antaranya akan mengganggu lokasi
perlekatan bagian yang mengatur penyambungan intron (intronic splicing
regulatory element/ISRE) (Gambar 1B), hal ini menunjukkan bahwa pengaturan
proses penyambungan dapat terpengaruh oleh proses tersebut. Sebuah integrasi
yang bersifat intronik pada tumor dari seorang pasien HCC diperkirakan akan
mengganggu tempat perlekatan dari sebuah bagian yang mengatur penyambungan
intron (intronic splicing regulatory element/ISRE) dan setelah diamati terletak
pada 383 basa per urutan rangkaian (base per sequence/bps) di sebelah atas dari
sebuah exon yang bersifat alternatively spliced (EAS) dari gen FAS. Untuk menguji
hipotesis yang menyatakan bahwa gangguan dari daerah ISRE dalam tumor
tersebut akan menyebabkan perubahan ekspresi dari EAS pada sampel tumor (T)
tetapi tidak pada sampel non-tumor (NT), sebuah patokan dirancang untuk

memisahkan dan menghitung jumlah EAS (E8 dan E9) sama halnya dengan exon
yang tidak bersifat alternatively spliced, exon yang bersifat konstitutif, Ec (E3 dan
E4). Sebagai bukti pada Gambar 1B (sebelah kanan bawah), penurunan yang
signifikan pada jumlah EAS dibandingkan dengan EC terlihat dalam sampel Tumor
(T) (P < 0.05), dimana integrasi HBV mengganggu daerah ISRE, tetapi tidak pada
sampel non-tumor (NT), dimana tidak ditemukan adanya integrasi HBV.
Kecenderungan HBV berintegrasi ke dalam kromosom 10 pada tumor dan proses
integrasi ke dalam kromosom 10 tersebut berkaitan dengan tumor dengan
diferensiasi buruk
Alur Circos (http://circos.ca/ diakses pada tanggal 1 Maret 2012) dibuat untuk
menampilkan dan menganalisa pola integrasi HBV pada tingkat kromosom dalam
sampel tumor (T) dan sampel non-tumor (NT). Walaupun secara relatif ditemukan
penyebaran acak dari lokasi proses integrasi pada sampel non-tumor (NT), namun
secara statistik dan signifikan ditemukan adanya proses pengambilan lokasi proses
integrasi pada kromosom 10 (P < 0.01, setelah dilakukan koreksi oleh Bonferroni)
khususnya pada lengan q dalam sampel tumor (T) (Gambar 2A). Secara khusus,
proses integrasi HBV ke dalam kromosom 10 secara signifikan berkorelasi
dengan semakin buruknya diferensiasi tumor (P < 0.05) (Gambar 2B). Untuk
memastikan bahwa hal yang dilakukan bukan merupakan suatu proses observasi
yang acak, kami juga membuat sampel secara acak pada proses integrasi dengan
jumlah yang sama dengan menggunakan proses pengumpulan sampel yang sama
dari seluruh lokasi integrasi sebanyak 1.000.000 kali. Kemudian kami melakukan
test Fishers exact untuk menguji korelasi antara lokasi integrasi yang dipilih
secara acak dengan status stadium tumor. Tidak terdapat korelasi yang signifikan
(P > 0.05) yang ditemukan antara lokasi integrasi sampel yang dipilih secara acak
dan stadium tumor pada >99% proses pengacakan sampel (data tidak
ditampilkan), hal ini menunjukkan bahwa korelasi antara proses integrasi HBV ke
dalam kromosom 10 dan tumor dengan diferensiasi yang buruk bukan merupakan
suatu observasi yang bersifat acak.

Dari 97 lokasi integrasi HBV, 14 di antaranya ditemukan terletak diantara


gen yang berkaitan dengan kanker meliputi enam terletak pada promoter dari gen
TERT, sedangkan delapan terletak di antara introns dari onkogen (ERBB4) dan
gen penekan tumor [tumor suppressor genes (CCNA2, MSMB, MYO18B, AIP,
NTN1 dan FAS)] (Tabel 1, dapat diakses pada Carcinogenesis Online). Sebagian
besar dari lokasi integrasi lainnya berukuran ~270 kb (40-31 300 kb) dari gen
yang berkaitan dengan kanker (Tabel 1, dapat diakses pada Carcinogenesis
Online).
Kecenderungan integrasi pada rangakain 3-end dari HBx dan rangkaian 5-end
dari rangkaian Precore/Core
Di antara gen HBV, secara statistik dan signifikan proses pengambilan proses
integrasi didapatkan pada 1600-1900 nukleotida di sekitar rangkaian 3-end dari
HBx dan rangkaian 5-end dari rangkaian gen Precore/Core baik pada sampel
tumor (T) (P < 0.001) dan sampel non-tumor (NT) (P < 0.001) (Gambar 2A dan
3A i). Daerah integrasi di antara gen HBx ini berkaitan dengan pengenalan urutan
rangkaian gen yang rendah pada rangkaian 3-end dari gen HBx yang dibatasi oleh
dua garis vertikal (Gambar 3A iii). Peningkatan cakupan pada bagian paling akhir
dari HBx kemungkinan terjadi akibat terjadinya integrasi yang berulang pada
bagian depan dari rangkaian Precore/Core (yang saling tumpang tindih dengan
rangkaian 3-end dari HBx), dengan demikian tersisa struktur bagian paling akhir
dari rangkaian HBx (Gambar 3A ii). Ketika struktur yang cukup besar dari gen
HBx diperiksa dengan metode pengelompokan dari 49 pasien HCC, rangkaian 3end dari HBx ditemukan terhapus pada 49% sampel tumor (T) tetapi hanya 28.6%
pada sampel non-tumor (NT) (Gambar 3A iv), sesuai dengan hasil observasi yang
dilakukan bahwa proporsi yang lebih tinggi dari lokasi terjadinya proses integrasi
pada rangkaian 3-end dari gen HBx ditemukan pada sampel tumor (T) (56.1%)
dibandingkan dengan sampel non-tumor (NT) (42.5%) (Gambar 3A i). Oleh sebab
itu, observasi ini menunjukkan bahwa ketika terjadi integrasi HBV, rangkaian 3end dari gen HBx sering terhapus.

Perbedaan pola perubahan struktur pada gen HBV di antara sampel tumor (T)
dan sampel non-tumor (NT)
Perubahan struktur di antara gen HBV ditemukan pada 39.5% pasien HCC yang
dilakukan pemeriksaan (Gambar 1C dan 4, dapat diakses pada Carcinogenesis
Online, untuk perubahan validasi penelitian). Sebagaimana tertera pada alur
circos (Gambar 3B), proses delesi (hijau) merupakan proses yang paling banyak
terjadi pada sampel tumor (T) (56.1%) dan sampel non-tumor (NT) (69.4%)
diikuti oleh proses inversi (merah) (38.6% pada sampel tumor (T) dan 25% pada
sampel non-tumor (NT)), sedangkan proses duplikasi (hitam) jarang terjadi.
Hal yang patut diperhatikan bahwa daerah hotspot tempat terjadinya
integrasi HBV juga ditemukan secara statistik menyebabkan terjadi perubahan
struktur baik pada sampel non-tumor (NT) (P < 0.001) dan sampel tumor (T) (P <
0.001) (Gambar 3B), yang juga dapat diperhitungkan memiliki peranan terhadap
terjadinya pengenalan urutan rangkaian yang rendah pada daerah ini dan
terjadinya delesi pada rangkaian 3-end dari gen HBx. Meskipun demikian,
walaupun daerah hotspot ini menyebabkan proses delesi (P < 0.001) dan inversi
(P < 0.001) pada sampel tumor (T), namun pada sampel non-tumor (NT) hanya
terjadi proses inversi saja (P < 0.001) (Gambar 5, dapat diakses pada
Carcinogenesis Online), hal ini menunjukkan bahwa pola perubahan struktur pada
sampel tumor (T) dan sampel non-tumor (NT) memiliki perbedaan.
HBx-human chimeric transcripts diekspresikan hanya jika terjadi proses integrasi
pada rangkaian 3-end dari HBx
Di antara proses pengenalan yang tervalidasi secara eksperimental dengan
keterlibatan urutan rangkaian HBV manusia, chimeric transcripts ditemukan
hanya ketika lokasi integrasi terletak pada 3-end dari HBx tetapi tidak ditemukan
pada tempat lainnya (Gambar 2, dapat diakses pada Carcinogenesis Online).