Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geocincias

Departamento de Eletrnica e Sistemas

Graduao em Engenharia Eletrnica

Montagem de um sistema de microscopia

confocal para anlise de estruturas
nanomtricas
Fbio Ferraz e Bruno Arruda
Trabalho de Graduao

Recife
03 de Junho de 2016

Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Tecnologia e Geocincias
Departamento de Eletrnica e Sistemas

Fbio Ferraz e Bruno Arruda

Montagem de um sistema de microscopia confocal para

anlise de estruturas nanomtricas

Trabalho apresentado ao Programa de Graduao em Engenharia Eletrnica do Departamento de Eletrnica e Sistemas da Universidade Federal de Pernambuco como requisito parcial para obteno do grau de Bacharel em Engenharia Eletrnica.
Orientador: Prof. Dr. Frederico Dias Nunes
Co-orientador: Profa. Dra. Mariana Torres Carvalho

Recife
03 de Junho de 2016

Dedicamos este trabalho a todos aqueles que lutam e no

desistem de sonhar, pois, assim como o alimento o
combustvel necessrio para o nosso corpo, o sonho o
alimento necessrio para nossa alma.

Agradecimentos

Fbio Ferraz
Primeiramente, quero agradecer a Deus por ter me proporcionado a fora e a motivao
necessria para chegar ao objetivo deste trabalho. A minha famlia de forma geral, mas em
especial, minha me, meu pai, minha tia Marleide e minha av Maria Jos por todo amor,
carinho, pacincia e incentivos.
Agradeo ao meu orientador, o professor Frederico Dias Nunes, por todo conhecimento
transmitido, mas, principalmente, pela pacincia e pelo incentivo em querer que cada um de
ns d o melhor de si sempre, independente da atividade a qual estamos submetidos.
Um agradecimento especial para Guilherme Boa Viagem Ribeiro, companheiro de curso e
irmo na mesma f, pela disponibilidade em querer me ajudar com este trabalho.
Agradeo tambm a todos os amigos do Laboratrio de Engenharia Multidisciplinar (I-9)
que contriburam de forma direta e indireta para que este trabalho acontecesse. Principalmente
aos alunos de Doutorado, Marcel Bezerra e Thiago Campos e tambm ao meu companheiro de
trabalho Bruno Arruda, por ter aceitado trabalhar junto comigo.

iv

Agradecimentos

Bruno Arruda
Agradeo toda minha famlia pelo apoio durante toda minha vida, principalmente a minha
me, meu pai e minhas irms, e recentemente a minha sobrinha tambm, Yasmin.
Agradeo ao meu orientador, o professor Dr. Frederico Dias Nunes, que graas sua grande
experincia profissional e de vida incentiva e ajuda a desenvolver humano e profissionalmente
quem lhe procura.
Agradeo tambm a todos meus amigos (Robson, Paulo, Ricardo, Flvio) que ajudam no
dia-a-dia ao torn-lo mais divertido e a Fbio que foi um parceiro de trabalho muito compreensivo e dedicado.

At os adolescentes podem esgotar-se, e jovens robustos podem cambalear,

mas aqueles que contam com o Senhor renovam suas foras; ele d-lhes
asas de guia. Correm sem se cansar, vo para a frente sem se fatigar.
ISAAS, 40:30-31 (Bblia Sagrada)

Sumrio

I Desenvolvimento

Introduo

Fundamentao Terica
Microscopia ptica
Lasers
Aquisio Digital de Imagens

3
3
13
15

Microscopia Confocal

18

II Implementao

20

Metodologia
Fonte laser
Filtro polarizador
Filtro de densidade neutra
Espelho plano
Transladadores
Lente objetiva
Lente de magnificao
Cmera CCD

21
22
23
23
24
24
25
25
26

Execuo do projeto
Etapa 1
Etapa 2
Point Grey
Matlab
Origin 8.0
Etapa 3

27
28
29
29
29
30
30

Resultados

31

Concluses

41

Trabalhos futuros

42

A Cdigo MATLAB

43
vii

SUMRIO

B Folha de Especificaes da CCD

viii
48

Lista de Figuras

8
9
10

2.11
2.12
2.13
2.14
2.15
2.16

Definio de .
Variao da intensidade de luz no plano focal.
Disco de Airy para um disco de 0,5 mm de dimetro.
Sobreposio de imagens.
Difrao numa lmina afiada.
Diagrama de luz no-polarizada.
Esquema de refrao da luz na interface entre meios de ndices de refrao n1
e n2 .
Lentes finas.
Imagem de uma lente objetiva Zeiss.
Diagrama de um sistema ptico com exemplos das partes reais dos espaos
pticos.
Diagrama de um sistema ptico com exemplos de pontos e planos focais.
Modelo simples de formao de imagem com diagrama de raios destacado.
Diagrama de transio de um ente quntico.
Diagrama de um Laser He-Ne.
Diagrama dos estados de energia do laser He-Ne.
Diagrama esquemtico do funcionamento de um CCD.

3.1

Empilhamento de amostradas formando uma pilha-z.

18

4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9

Estrutura do Microscpio Confocal.

Foto do Laser de Hlio-Nenio.
Filtro Polarizador.
Filtro de densidade neutra.
Espelho Plano.
Transladador.
Lente Objetiva.
Lente para magnificao.
Cmera CCD.

21
22
23
23
24
24
25
25
26

5.1
5.2
5.3

Especificao de uniformidade do feixe

Etapas do Projeto
Diagrama da montagem inicial do projeto.

27
28
29

6.1

Amostra de filme fino metlico (ouro).

31

2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
2.10

ix

3
4
4
5
6
7

11
11
12
13
14
15
16

LISTA DE FIGURAS

6.2
6.3
6.4
6.5
6.6
6.7
6.8
6.9
6.10
6.11
6.12
6.13
6.14
6.15

Imagem do feixe do laser na cmera de acordo com a estrutura da figura 2.1.

Distribuio espacial do feixe atravs das linhas e colunas da imagem captada.
Dimenso do pixel referente ao sensor CCD de 1/3 de polegada.
Grfico da distribuio espacial da linha e coluna central.
Grfico da distribuio espacial da linha e coluna anterior a central.
Grfico da distribuio espacial da linha e coluna posterior a central.
Grfico da linha central do spot de luz
Grfico da coluna central do spot de luz
Grficos de ajuste e erro residual da curva Gaussiana.
Grficos de ajuste e erro residual da curva Lorentziana.
Parmetro extrado do Origin circulado em vermelho
Grfico referente ao valor do comprimento da regio central
Diagrama esquemtico das ranhuras e suas dimenses.
Imagens capturadas da amostra.

x
32
33
34
34
35
35
36
36
37
38
39
39
40
40

PARTE I

Desenvolvimento

C APTULO 1

Introduo

A microscopia confocal uma tcnica que tem adquirido uma grande popularidade e possui muita aplicabilidade na cincia, na obteno de imagens de amostras vivas e de informao computadorizada tridimensional na pesquisa biolgica, na anlise qumica e de materiais, principalmente na rea de neuroanatomia e neurofisiologia (WANG; BABBEY; DUNN,
2005; AMOS; WHITE, 2003; COX, 2002; PADDOCK, 2008). Este trabalho tem por objetivo
construir um sistema de microscopia confocal para visualizao de amostras nanomtricas. A
amostra varrida por um laser de HeNe e sua imagem virtualmente ilustrada numa cmera
CCD que detecta a intensidade de luz que passa por estas amostras. Esta tcnica mostra com
um desempenho satisfatrio para cumprir com o objetivo final de visualizar as estruturas.
No captulo 1 deste trabalho apresentado uma fundamentao terica e histrico de modo
a embasar a tcnica utilizada.
O captulo 2 apresenta os equipamentos e mtodos utilizados na montagem do microscpio.
O captulo 3 mostra os resultados obtidos atravs do procedimento experimental utilizado
para a montagem e anlise das estruturas.
O captulo 4 apresenta as concluses, tendo como base os resultados obtidos e tambm
sugestes para trabalhos futuros. Por fim, so apresentadas as referncias bibliogrficas na
realizao deste trabalho.

C APTULO 2

Fundamentao Terica

Microscopia ptica
Eletromagnetismo um ramo da fsica que trata das interaes e comportamentos de campos eltricos e magnticos em um meio e das variaes desses campos ao atravessarem para
outro meio. Neste ramo, foi desenvolvida a teoria das ondas eletromagnticas, que postula que
a luz simplesmente mais uma manifestao de ondas eletromagnticas (ondas compostas de
campos magnticos e eltricos em formas senoidais), e que as diferenas entre esses diversos
fenmenos da natureza so definidas atravs das caractersticas de ondas (HECHT, 2002, p.
36)
Como visto na figura 2.1, uma das caractersticas de ondas o comprimento de onda ,
que indica a distncia que deve ser percorrida na direo de propagao da onda para que o
formato da onda se repita (HECHT, 2002, p. 15). A partir desse conceito, pode-se definir
Resoluo ptica lmin , uma grandeza importante na caracterizao de microscpios, pois ela
descreve a capacidade de um sistema ptica de distinguir ou discriminar detalhes no objeto que
est sendo visualizado, mas primeiro necessrio definir um dos fenmenos mais interessantes
da fsica: a difrao.
y

Figura 2.1 Definio de .

Difrao uma caracterstica de qualquer fenmeno fsico relacionados a propagao de

ondas, tais como ondas eletromagnticas, ondas acsticas e ondas de De Broglie, etc. Ela
acontece sempre que um objeto interposto a trajetria da onda e os efeitos so especialmente
notveis sempre que as dimenses do objetos no forem consideras infinitas em relao ao
comprimento de onda (CHARTIER, 2005, p.299).
O padro de difrao formado por uma abertura circular irradiando no infinito (uma lente
capaz de trazer o infinito para o seu foco) conhecido como disco de Airy (figuras 2.2 e 2.3)
3

2.0 MICROSCOPIA PTICA

em homenagem ao astrnomo Sir George Biddell Airy (1801-1892) que derivou a seguinte
equao da irradiao do padro (AIRY, 1835):
{
}
2I1 (ka sin )
I( ) = I(0)
(2.1)
ka sin
onde Im ( ) a funo de Bessel de ordem m, e I(0) a irradiao no centro do padro formado.
(HECHT, 2002, p.469).
Intensidade da luz

Plano Focal
Figura 2.2 Variao da intensidade de luz no plano focal.

0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

= I0

Figura 2.3 Disco de Airy para um disco de 0,5 mm de dimetro.

O raio do centro do primeiro disco escuro at o centro q1 de fundamental importncia pois

ele determina o limite de resoluo lmin do sistema de visualizao de acordo com o critrio
de Rayleigh (explicado a seguir) (HECHT, 2002, p.470). Ele dado por:
R
(2.2)
2a
Se houver uma lente no sistema focada no tela de projeo , ento podemos aproximar a
equao 2.2 por:
q1 = 1, 22

q1 = 1, 22

f
2a

(2.3)

2.0 MICROSCOPIA PTICA

Imagine-se agora que duas fontes pontuais distantes de luz so observadas atravs de uma
pupila (um exemplo de uma abertura circular que proporciona observao do padro de difrao). Como visto anteriormente, sero formados para cada fonte luminosa um disco de Airy,
como visto na figura 2.4. O critrio de Rayleigh define o limite de resoluo do sistema ptica
como:
f
lmin = q1 = 1, 22
(2.4)
2a
Ou seja, o sistema tem capacidade de distinguir (ou resolver) dois pontos que sofreram os

PLA

NO

min

FOC

AL

min

L2

lmin

Figura 2.4 Sobreposio de imagens.1

efeitos de difrao somente se a distncia deles for no mnimo igual ao raio q1 . Isto , se o
critrio de Rayleigh for aplicado, as fontes so ditas como imediatamente resolvidas quando o
centro de um disco de Airy tangenciar o primeiro mnimo do padro de Airy da outra fonte.
Coerncia no estudo de ptica e microscopia um conceito de fundamental importncia
porque so somente fontes de luz coerentes que produzem interferncia ao serem detectadas
por um fotodetector, por exemplo. Perfeita coerncia entre duas ondas existe se elas possuem
a mesma fase relativa e exatamente a mesma frequncia; dita perfeita porque essa coerncia capaz de produzir interferncia estacionria (isto , tempo e espacialmente constante)
(CHARTIER, 2005, p.36,37).
Interferncia um fenmeno, no sentido matemtico, de adio: quando h interferncia
e a amplitude gerada maior, dito que houve interferncia construtiva, quando menor,
dita destrutiva. A visibilidade de interferncia definida pelo grau de coerncia entre as
ondas. O padro de interferncia produzida por ondas incoerentes possui a mesma intensidade
em todos os pontos da tela onde ela foi produzida, porque a diferena de fase entre elas no
pode ser considerada constante e varia aleatoriamente com o tempo (CHARTIER, 2005, p.38)
e portanto a intensidade simplesmente a soma de cada raio, como observado no dia dia
quando duas fontes de luz comuns so superimpostas.
1 FONTE:

Adaptado de (HECHT, 2002)

2.0 MICROSCOPIA PTICA

interessante notar que padres de interferncia somente podem ser produzidos se um

fotodetetor receber diretamente diversos raios interferentes. Isso acontece porque interferncia
uma interao no-linear entre os campos eletromagnticos e o detetor: o ltimo faz uma
mdia no tempo do quadrado da soma das amplitudes das ondas (CHARTIER, 2005, p.34).
O sistema ptico da figura 2.5 exibe raios de luz se propagando num meio homogneo.
Alguns desses raios de luz tangente ponto da lmina sofrem difrao. importante notar que
difrao sempre seguida por interferncia entre os feixes iniciais (antes de sofrerem difrao)
e os feixes difratados, e por isso h a produo de franjas de difrao. Como j dito, embora
a difrao seja um fenmeno que ocorre durante a propagao, a interferncia s observada
quando h a interao dos campos eletromagnticos interferentes com algum tipo de detetor.

Raios de Luz
Geometricos
Franjas
Lente
Luz Geometrica

Sombra Geometrica
L
amina

Tela

Figura 2.5 Difrao numa lmina afiada. Um feixe de raios paralelos parcialmente impedido por um
obstculo limitado por uma borda afiada. Alguma luz difratada pela borda e interfere com a parte no
difratada da luz: franjas podem ser vista na tela de observao.3

Polarizao de uma onda o sentido, direo e magnitude do vetor associado ao campo eltrico4 , como visto na figura 2.6. De uma forma generalizada, o sentido, a direo e a magnitude
so todos variantes no tempo, isto , os vetores eletromagnticos vibram de forma que vistos
no sentido de propagao da onda eles formam um padro elptico. Se os vetores eltricos
e magnticos ortogonais que formam o campo eletromagntico ditos linearmente polarizados
variam somente a magnitude e o sinal (sentido) em relao aos respectivos eixos, e observados
perpendicularmente em relao ao eixo de propagao da onda, formam linhas retas no eixo
em que variam (CHARTIER, 2005, p.149, 150).
3 FONTE:

Adaptado de (CHARTIER, 2005)

polarizao pode ser definida tambm atravs do campo magntico, mas este trabalho define-a de acordo
com o campo eltrico.
4A

2.0 MICROSCOPIA PTICA

Luz
C

ircula

rmen

te Po

rlariz

ada

Luz
linea
rm

ente

pola
riz

ada

Luz

Lm

ina d

to
q uar

de o

no-

pola

rizad

nda

zado
olar i

r L in

ear

Figura 2.6 Diagrama de luz no-polarizada atravs de alguns polarizadores e o efeito da transmisso
na polarizao.6

A luz natural dita no-polarizada, pois seu campo eltrico possui amplitude constante e
uma polarizao que varia aleatoriamente a cada momento. A importncia do estudo da luz polarizada devido ao fato de que materiais interagem diferentemente com ondas de polarizao
diferentes (BOHREN, 2013).
Meios (isto , materiais) que possuem a propriedade de dicrosmo (diferentes nveis absoro para diferentes polarizaes) linear so utilizados como polarizadores ou analisadores
(definidos a seguir) e possuem as seguintes propriedades (CHARTIER, 2005, p.152):
So quase totalmente transparentes a feixes linearmente polarizados com polarizao
paralela a uma certa direo , definida pelo material.
Tem uma coeficiente de absoro considervel para feixes linearmente polarizados numa
direo diferente de , possuindo absoro mxima com feixes polarizados paralelamente a direo .
Ao receber um feixe com luz no polarizada, um material dicroico transmite um feixe
com luz linearmente polarizada com exatamente metade da potncia e ento chamado de
polarizador; se o feixe incidente j possuir uma polarizao, o feixe transmitido ser a projeo
da polarizao inicial na direo e chamado de analisador (CHARTIER, 2005, p.153).
Refrao a mudana da direo da propagao de onda quando h uma mudana no
meio de transmisso (figura 2.7) (CHARTIER, 2005, p.155). Uma frmula que lida com a
transmisso da luz entre fronteira de meios isotrpicos conhecida com a lei de Snell (ou
Snell-Descartes) (WOLF, 1995):
n1 sin1 = n2 sin 2
onde n1 e n2 indica o ndice de refrao do meio i, definido como:
ni =
6 FONTE:

Velocidade da luz no vcuo

Velocidade da luz no meio i

Adaptado de <https://en.wikipedia.org/wiki/Waveplate>. Acessado em 14 de maio de 2015.

2.0 MICROSCOPIA PTICA

Simplificando a notao:
n=

Velocidade da luz no vcuo

Velocidade da luz no meio

n1
n2

Figura 2.7 Esquema de refrao da luz na interface entre meios de ndices de refrao n1 e n2 .

A seguir so dadas algumas definies teis para este trabalho de origem da ptica geomtrica.
1. Uma abstrao bastante conhecida a de raios de luz: um raio de luz do ponto de
vista fsico simplesmente o caminho percorrido por uma energia eletromagntica, e
do matemtico, uma curva; por isso utilizado simplesmente como uma ferramente
para realizar clculos. A parte da ptica que utiliza extensivamente esse conceito a
ptica geomtrica, que estuda a formao de uma imagem a partir do objeto e faz uso de
aproximaes de ngulo pequeno ou paraxial, que torna o comportamento matemtico
dos componentes pticos linear, e eles ento podem ser descritos por simples matrizes
(CHARTIER, 2005, p.91).
2. Um dispositivo que causa refrao num raio de luz a lente. Lentes finas so lentes
na qual a sua espessura desprezvel em relao aos raios de curvatura R1 e R2 das
superfcies da lente, como visto na figura 2.8. A sua funo principal num sistema ptica
a mudana de foco do raio de luz. H basicamente dois tipos de lentes: convexas
e cncavas. A primeira causa raios paralelos convergirem, a segunda, divergirem. Na
figura 2.8, tem-se um diagrama de raios para lentes convergentes. Lentes finas seguem a
seguinte frmula que determina a distncia d2 de formao da imagem de acordo com a
distncia do objeto d1 e o foco f da lente (HECHT, 2002, p.158):
1
1 1
= +
d2 d1 f
3. Uma lente objetiva um elemento ptico que coleta luz do objeto (ou amostra) a ser
observado e foca os raios de luz para produzir uma imagem real. Ela pode ser formada
por uma lente nica ou diversos dispositivos pticos combinados. Duas caractersticas
comuns a lentes objetivas so: magnificao M e abertura numrica NA.
7 Adaptado

de <https://en.wikipedia.org/wiki/Thin_lens>. Acessado em 14 de maio de 2015.

2.0 MICROSCOPIA PTICA

Eixo
Ponto Focal

Figura 2.8 A lente desta figura pode ser considerada fina se d << R1 ou d << R2 .7

4. Magnificao para um instrumento ptico definido como o aumento relativo do comprimento da imagem sobre o comprimento do objeto (TKACZYK, 2009, p.23). Embora
tenha-se a intuio primria de usar a maior magnificao possvel, a maior magnificao
til limitada pela resoluo do sistema ptico. De fato, o poder de resoluo do sistema
dado pela seguinte frmula:

2 NA
frmula derivada diretamente do limite de Rayleigh.
5. A abertura numrica NA possui uma definio mais complicada que a magnificao.
Ela definida pela a metade do ngulo do cone de coleo da lente objetiva e pelo
ndice de refrao n do meio em que a lente se encontra (INOUE, 1986, p.37):
R=

NA = n sin( )
Tais informaes so encontradas em marcaes caractersticas de lentes objetivas, exemplificada pela figura 2.9, uma lente objetiva da marca Zeiss (outros fabricantes utilizam o
mesmo estilo de marcao).
6. H dois espaos pticos referentes a um sistema ptico: o espao do objeto e o espao
da imagem (figura 2.10). Ambos os espaos estendem-se de + a e so ambos
divididos em duas partes: real e virtual, e a capacidade de ter-se acesso a imagem ou
8 FONTE:

Site do Hofstragroup. Disponvel em: <https://www.hofstragroup.com/media/product_images/

productimage-picture-zeiss-461940-planapo-objective-1598_jpg_280x186_q85.jpg>. Acesso em 01 maro de
2016.

2.0 MICROSCOPIA PTICA

10

Figura 2.9 Imagem de uma lente objetiva Zeiss.8

objeto define a parte real do respectivo espao (TKACZYK, 2009, p.21). Por exemplo,
na figura 2.10 so mostrados objeto e figura reais.
7. O ponto focal de um sistema ptico o local no eixo ptico para onde feixes colimados
convergem ou de onde divergem. O plano focal um plano perpendicular ao eixo ptico
e o atravessa no ponto focal (TKACZYK, 2009, p.21). Podem ser visto exemplos de
pontos focais F1 e F2 e seus respectivos planos focais na figura 2.11.
Atravs da ptica geomtrica e de seus conceitos intuitivos possvel iniciar projetos de sistemas pticos com resultados iniciais satisfatrios (quanto a magnificao, plano focal, e outros
parmetros da ptica geomtrica) sem a complexidade de modelos mais completos da natureza
e da propagao da luz.
Algumas caractersticas da formao de uma imagem podem ser descritas atravs de um
simples modelo, como o da figura 2.12. Uma primeira caracterstica proveniente famosa
equao 2.5 que descreve a distncia d1 da lente em que a imagem formada :
f1 f2
+ =1
d1 d2

(2.5)

onde d1 e d2 so as distncias, respectivamente, do objeto e da imagem lente e f1 e f2 so as

distncias, tambm respectivamente, dos pontos focais F1 e F2 lente.

11

2.0 MICROSCOPIA PTICA

ESPAO DO OBJETO
REAL
Lente

ESPAO DA IMAGEM
REAL

Imagem
Objeto

Figura 2.10 Diagrama de um sistema ptico com exemplos das partes reais dos espaos pticos.

Plano Focal de F1

Plano Focal de F2

Lente

n
F1

F2

Figura 2.11 Diagrama de um sistema ptico com exemplos de pontos e planos focais.

2.0 MICROSCOPIA PTICA

Lente

F1

F2
f1

f2

d1
d2

Figura 2.12 Modelo simples de formao de imagem com diagrama de raios destacado.

12

13

2.0 LASERS

Lasers
A palavra portuguesa Laser deriva do acrnimo para o processo chamado em ingls de
Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (em portugus, amplificao da luz
por emisso estimulada de radiao). Esse processo deriva de um processo chamado de maser,
o qual produzia amplificao de ondas com comprimento de onda (ou frequncia) na escala de
micro-ondas, com baixssimo rudo. Ele funcionava de um modo incomum: utilizava-se diretamente da interao quantum-mecnica da matria com a energia irradiada. Esse processo logo
abriu a imaginao de outros cientistas para a pergunta de se esse processo poderia ser estendido para a regio ptica do espectro eletromagntico9 . Os tipos de lasers mais frequentemente
encontrados so os produzidos com semicondutores, principalmente pelo fato de que podem
ser fabricados em larga quantidade, por utilizarem tecnologia muito semelhante s tecnologias
de microeletrnica (HECHT, 2002, p.581).
Como j discutido anteriormente, fontes comuns de luz, como LEDs e lmpadas fluorescentes, produzem radiao quando seus entes qunticos10 excitados (isto , no esto no seu
estado natural, foram excitados por alguma fonte externa de energia, como por exemplo, um
fton ou um fnon) passam de um nvel energtico para um de menor energia por flutuaes
aleatrias e no-relacionadas, o que faz com que a luz seja incoerente, isso chama-se emisso
espontnea11 . No caso do processo de emisso estimulada, a radiao emitida por tomos
ou molculas proveniente de uma estimulao desses entes por um campo eletromagntico
externo, e portanto as suas fases so correlacionadas. Alm disso, a radiao do laser monocromtica, isto , na prtica as frequncias da radiao emitida cobrem uma estreita faixa do
espectro (REZENDE, 2004, p.348-352).
E2

E1

E2

E1
Emisso de fton.

Absoro de fton.

Figura 2.13 Diagrama de transio de um ente quntico de um estado energtico entre dois estados de
energia E1 < E2 ao absorver ou emitir a energia de um fton.13

Na figura 2.14, encontra-se um diagrama de um laser de Hlio-Nenio (He-Ne). Os seus

componentes tem funes que so comuns a praticamente todas estruturas de lasers. Antes
9 No

h limitao terica para obteno de emisso estimulada para raios-X nem para raios-.
ente quntico qualquer ente fsico que sabe-se possuir estados qunticos, isto , no pode possuir
qualquer nvel de energia, somente quantidades discretas de uma energia especfica.
11 Um estado excitado em que o ente quntico permanece por um tempo maior que em outros estados, exceto
pelo estado fundamental, chama-se estado meta-estvel.
13 Adaptado de (REZENDE, 2004).
10 Um

14

2.0 LASERS

de enumerar e explic-las, importante introduzir o importante conceito de inverso de populao. Considere um sistema quntico com populaes de entes qunticos N1 no nvel de
energia E1 e N2 no nvel de energia E2 com temperatura T . De acordo com a estatstica de
Maxwell-Boltzmann, a razo entre as populaes em equilbrio trmico14 dada pela frmula
2.6 (TOLMAN, 1979).
1
N1
=
E
E1
N2 exp 2kT

(2.6)

onde k a constante de Boltzmann.

Sendo E2 > E1 , no limite de T , as populaes N2 e N1 sero iguais, mas em geral,
N1
para qualquer T , a razo N
menor que 1 (um) e desse modo a populao N2 menor que a
2
de N1 . Logo para atingir esse evento de inverso de populao necessrio levar o sistema a
um estado de no-equilbrio trmico.
Deseja-se atingir a inverso da populao porque para o sistema descrito, a intensidade de
uma radiao ao atravess-lo dada pela equao 2.7:
I(x) = I(0) exp( x)

(2.7)

onde o coeficiente de absoro de radiao do sistema e proporcional a diferena N1 N2 .

Logo se N1 N2 < 0, a intensidade da radiao aumenta exponencialmente com x, obtendo
assim uma emisso estimulada que tem as caractersticas de fase, frequncia e polarizao
iguais s da radiao a estimulou (REZENDE, 2004, p.349).
O modelo terico construdo anteriormente, quando continuamente excitado do estado fundamental para outro estado, atinge um equilbrio trmico por fim atravs de processos estimulados e espontneos de emisso, dessa forma atingindo transparncia ptica (SVELTO, 1998).
Na prtica, pode-se, por exemplo, utilizar um sistema de trs estados ou quatro estados energticos (REZENDE, 2004, p.351).
Espelho Refletor

Tenso de descarga

Espelho Parcial

Feixe de Sada
Janela de Brewster

Figura 2.14 Diagrama de configurao simples de um laser de Hlio-Nenio.15

As partes essenciais de um laser He-Ne so mostradas na figura 2.14. Ela so descritas a seguir:
14 Quando

no h calor sendo trocado entre os estados E2 e E1 .

de (HECHT, 2002)

15 Adaptado

15

2.0 AQUISIO DIGITAL DE IMAGENS

1. Janela de Brewster essa janela faz a radiao de sada ser polarizada linearmente, alm
de diminuir as perdas por reflexo;
2. Tenso de descarga aplicada ao tubo de descarga;
3. Espelho refletor utilizado para refletir de volta a luz polarizada linearmente;
4. Espelho parcial geralmente possui refletividade de 99%.
A tenso de descarga aplicada ao tubo de descarga que contm uma mistura de dois gases,
hlio e nenio, sendo que a maior parte da mistura constituda por hlio, para que os tomos
de hlio possam ser excitados; esse processo conhecido como bombeamento. Os eltrons
livres produzidos por essa descarga se chocam com tomos de hlio e atravs dessas colises
inelsticas16 levam os tomos a estados excitados. Como mostrado no diagrama da figura
2.15, depois de os tomos de hlio se estabelecerem nos estados meta-estveis 21 S e 23 S,
colidem com os tomos de nenio no estado fundamental, excitando-os para os nveis 4s e 5s,
e dessa forma o processo de inverso de populao em relao aos estados 4p e 3p acontece.
A partir de ftons de emisses espontneas, o processo de emisso estimulada tem incio. Os
principais comprimentos de onda correspondentes s transies de energia da figura 2.15 nesse
processo correspondem a 1152, 3 nm e a 3391, 2 nm na regio de infravermelho e a famosa
632.8 nm, que utilizada neste trabalho, na regio visvel da luz, de cor vermelha (HECHT,
2002, p.596)(REZENDE, 2004, p.357,358).
Hlio

coliso

21 S

4s

23 S
Energia (eV)

Nenio
5s

3391,2 nm
4p
632,8 nm
3p

Excitao por
coliso eletrnica

Estado fundamental

Figura 2.15 Diagrama dos estados de energia do laser He-Ne.17

Aquisio Digital de Imagens

Aquisio digital de imagens a criao de imagens digitais. Como visto na seo de
microscopia digital, a atenuao de uma radiao eletromagntica transmitida ou refletida
16 Colises

nas quais h troca de energia cintica

de (HECHT, 2002)

17 Adaptado

2.0 AQUISIO DIGITAL DE IMAGENS

16

por um objeto carrega informao sobre esse objeto. (TKACZYK, 2009, p. 114)
Microscopia digital surgiu com o desenvolvimento de sensores eletrnicos de imagem; ela
baseada em aquisio, armazenamento e processamento de imagens adquiridas com as mais
variadas tcnicas de microscopia. Este modo de aquisio tem as seguintes vantagens em relao microscopia que se utilizava de tcnicas de micrografia(TKACZYK, 2009, p. 114):
1. Combinao de dados de imagens adquiridas atravs de modalidades diferentes de microscopia;
2. Correo de imagem;
3. Gravao remota de imagens e experimentos de longa durao;
4. Tcnicas de melhoria de contraste;
5. Facilidade em anlise estatstica atravs de dados da imagem digitalizada. (TKACZYK,
2009, p. 114)
Um sensor de carga-acoplada (CCD do ingls Charged-coupled device) uma conjunto de fotodiodos acoplados em um padro de grade 2D. Ftons incidentes produzem pares
eltrons-buracos em cada pixel em proporo quantidade de luz em cada pixel. Ao coletar o sinal de cada pixel, uma imagem correspondente intensidade da luz incidente pode ser
reconstruda (TKACZYK, 2009, p. 115).
A seguir esto o processo passo-a-passo num CCD, em geral:
1. Um matriz CCD iluminada durante o tempo de integrao ;
2. Ftons incidentes produzem portadores de carga mveis;
3. Os portadores de carga so coletados dentro da estrutura p-n;
4. A iluminao bloqueada depois do tempo , em arquiteturas do tipo full-frame;
5. A carga coletada transferida de cada pixel para um amplificador na borda da matriz;
6. O amplificador converte o sinal de carga em tenso;
7. A tenso analgica convertida para um formato digital para processamento e exibio.
(TKACZYK, 2009, p. 115)
Porta

+V

0V

0V

Isolante

Poco de potencial
eletron

Semicondutor tipo-p

Figura 2.16 Diagrama esquemtico do funcionamento de um CCD. O controle sequencial da tenso em

cada porta causa o movimento dos eltrons atravs da manipulao do poo de potencial.19

Cada pixel (fotodiodo) reversamente polarizado causando os eltrons se moverem na direo do eletrodo positivamente carregado (figura 2.16). Tenses aplicadas aos eletrodos produ19 FONTE: Adaptado da Wikipdia. Disponvel em: <https://en.wikipedia.org/wiki/Charge-coupled_device>.
Acesso em 14 maio de 2016.

2.0 AQUISIO DIGITAL DE IMAGENS

17

zem um poo de potencial dentro da estrutura semicondutora. Durante o tempo de integrao,

eltrons se acumulam no poo de potencial at a capacidade total do poo. A capacidade total
do poo atingida quando as foras repulsivas entre os eltrons excedem as foras atrativas do
poo. Ao fim do tempo de exposio, cada pixel armazenou um nmero de eltrons proporcional quantidade de luz recebida. Esses pacotes de carga devem ser transferidos sem perdas
do sensor, de cada pixel para um nico amplificador. Isto alcanado atravs de uma srie de
registradores de deslocamentos seriais e paralelos. A carga armazenada em cada pixel transferida atravs do matriz por sequncias de tenses de porta aplicadas aos eletrodos. Este pacote
de eltrons segue a onda de clock positiva de pixel-a-pixel, coluna-a-coluna. Uma barreira de
potencial sempre mantida entre pacotes de cargas de pixels (TKACZYK, 2009, p. 115).
Os pixels CCD no so sensveis cores, mas utilizam-se de filtros de cores para separadamente medir intensidade de cor vermelha, verde e azul (RGB). O mtodo mais comum cobrir
o sensor com uma matriz de filtros RGB, que combinam quatro pixel individuais para gerar
um nico pixel colorido. A mscara de Bayer usa dois pixels verdes para cada pixel azul e
vermelho, simulando assim a sensitividade do olho humano. (TKACZYK, 2009, p. 117)

C APTULO 3

Microscopia Confocal

O princpio de imagem confocal foi patenteado por Marvin Minsky em 1957 com objetivo
de superar algumas limitaes de microscpios de fluorescncia de campo-amplo (MINSKY,
1988). Em microscpios de fluorescncia de campo-amplo, o espcime inundado homogeneamente com luz da fonte luminosa. Todas as partes do espcime no caminho ptico so
excitadas ao mesmo tempo e a fluorescncia resultante detectada pela cmera ou fotodetector
do microscpio incluindo uma grande rea desfocada do plano de fundo. Ao contrrio, um
microscpio confocal usa iluminao pontual e um pinhole (orifcio) e um plano opticamente
conjugado em frente do detector para eliminar o sinal fora de foco - o nome confocal segue
dessa configurao (PAWLEY, 2006). Como somente luz produzida por fluorescncia bem
prxima (dependendo do dimetro do pinhole) pode ser detectada, a resoluo ptica da imagem, particularmente na direo de espessura da amostra muito melhor que a de microscpios
de campo-amplo. Entretanto, pelo fato de muita da fluorescncia da amostra bloqueada no
pinhole, o aumento de resoluo custa diminuio da intensidade do sinal desse modo exposies de longa durao so geralmente requeridas. Para compensar essa queda no sinal aps
o pinhole, a intensidade da luz detectada por um detector sensvel (geralmente um tubo fotomultiplicador ou um fotodiodo avalanche), transformando o sinal de luz num sinal eltrico que
ento gravado por um computador (FELLERS; DAVIDSON, 2007).

Figura 3.1 Empilhamento de amostradas formando uma pilha-z1 .

A profundidade alcanvel do plano de foco definida principalmente pelo comprimento

1 Fonte:

<http://cam.facilities.northwestern.edu/files/2014/07/Picture-17.png>. Acessado em 16 de maio de

2015.

18

CAPTULO 3 MICROSCOPIA CONFOCAL

19

de onda da luz utilizada dividida pela abertura numrica da lente objetiva, mas tambm por
propriedades pticas do espcime. O possvel fino seccionamento ptico2 torna esses tipos de
microscpios particularmente apropriados para imagens 3D e caracterizao de superfcies de
amostradas: fatias sucessivas da amostra produzem uma pilha-z, como na figura 3.1, que
pode ser processado por algum software de modo a produzir uma imagem 3D (MINSKY,
1988).

2 o processo pelo qual um microscpio adequadamente projetado pode produzir imagens ntidas planos focais
profundos dentro de uma amostra espessa.

PARTE II

Implementao

C APTULO 4

Metodologia

As etapas do projeto foram realizadas no Laboratrio de Engenharia Multidisciplinar (I-9)

localizado no 8o andar do prdio administrativo do Centro de Tecnologia e Geocincias (CTG
UFPE). O sistema composto por um laser de HeNe com 633nm de comprimento de onda
para iluminar a estrutura, e a imagem captada transferida para a memria de uma cmera CCD
(charge-coupled device) onde estas imagens so geradas num formato eletrnico. As imagens
por fim so encaminhadas (via cabo USB) pela prpria cmera e enviadas para um laptop, onde
so feitas anlises dessas imagens.

Figura 4.1 Estrutura do Microscpio Confocal.

Os principais componentes do microscpio confocal utilizados neste trabalho foram:

1. Fonte laser;
2. Filtro polarizador;
3. Filtro de densidade neutra;
4. Espelho plano;
5. Lente objetiva;
6. Transladadores (2 e 3 eixos);
7. Lente de ampliao;
8. Cmera CCD;
9. Laptop.

21

22

4.0 FONTE LASER

Fonte laser

Figura 4.2 Foto do Laser de Hlio-Nenio.

Foi utilizado um laser na faixa espectral do vermelho com comprimento de onda de 633nm
e emisso contnua. O feixe do laser de HeNe utilizado possui potncia de sada nominal
de 0, 95 mW , e classificado como um laser do tipo Classe II, que inclui os lasers visveis
que emitem at 1 mW de potncia mdia e s so perigosos se o usurio olhar continuamente
para o feixe (PRENTICE, 2002, p.261). Este laser tambm possui grande aplicabilidade para
visualizar estruturas nanomtricas devido ao seu comprimento de onda estar dentro da faixa do
espectro visvel e tambm pela facilidade de obt-lo (baixo custo, em relao a outros lasers).
A figura 4.2 mostra as caractersticas principais do laser utilizado na montagem do microscpio
confocal.
Tabela 4.1 Caractersticas do laser He-Ne.
Parmetros

Unidade

Comprimento de onda

= 532.8

nm

Potncia

mW

Banda Espectral

2 10 3

nm

ngulo Slido de Emisso

10 6

esteroradianos

Luminncia Espectral

5 107

W/cm2 -Sr-nm

4.0 FILTRO POLARIZADOR

23

Filtro polarizador

Figura 4.3 Filtro Polarizador.

O polarizador um filtro que s permite a passagem de luz polarizada em um plano especfico. Permite-nos retirar reflexos possibilitando a visualizao da imagem sem quaisquer
interferncias causada pelo mesmo. O uso do polarizador neste trabalho serviu justamente para
eliminarmos componentes de campo eltrico do feixe, garantindo que somente componentes
horizontais ou verticais passem pela amostra. Alm disso, o polarizador tambm foi utilizado
para controlar a intensidade do feixe que chegava at a cmera.

Filtro de densidade neutra

Figura 4.4 Filtro de densidade neutra.

O filtro de densidade neutra, assim como o polarizador, utilizado para reduzir a intensidade do feixe sobre a amostra, para que no ocorra saturao do sinal na cmera. Este filtro
tambm possui a funo de minimizar o efeito da difrao na superfcie da amostra. Este
fenmeno consequncia da natureza ondulatria da luz, a qual pode ter suas frentes de onda
distorcidas por um obstculo (amostra) de dimenses comparveis ao comprimento de onda da
luz. Uma forma de reduzir este efeito, inserindo lasers com comprimento de onda menores.
Sem a utilizao de um filtro ptico, a quantidade excessiva de luz aumentar a difrao na
superfcie da amostra, causando um estado saturado de luz na cmera.

4.0 ESPELHO PLANO

24

Espelho plano

Figura 4.5 Espelho Plano.

Neste trabalho, foi utilizado o espelho plano para o nico fim de guiar o feixe at uma outra
extremidade da mesa ptica, onde a amostra e a cmera se encontram localizados.

Transladadores

Figura 4.6 Transladador.

A funo deste equipamento permite o ajuste fino da posio das amostras, afim de desloclas at o ponto focal da lente e moviment-las no plano perpendicular ao feixe. As amostras so
fixadas na parte frontal do transladador, e assim tem-se a autonomia de mover a amostra arbitrariamente, tanto para achar o ponto focal da imagem na cmera como para varrer horizontal e
verticalmente cada amostra a ser analisada. Foram utilizados transladadores de 2 e de 3 eixos.

4.0 LENTE OBJETIVA

25

Lente objetiva

Figura 4.7 Lente Objetiva.

A lente objetiva a lente responsvel pela formao da imagem. Toda lente objetiva
especificada pelos seus valores de abertura numrica (NA) e da magnificao. Os principais
parmetros que determinam a resoluo do microscpio so: abertura numrica e comprimento
de onda da luz incidente.

Lente de magnificao

Figura 4.8 Lente para magnificao.

Com o objetivo de ampliar a imagem formada aps a lente objetiva, foi inserida uma lente
de alta magnificao para que a imagem formada pudesse ser visualizada com mais detalhes. O
uso deste aparato ptico ajuda na visualizao de estruturas nanomtricas e, com isso, permite
a melhor anlise das amostras.

4.0 CMERA CCD

26

Cmera CCD

Figura 4.9 Cmera CCD.

O sensor de imagem do tipo CCD o principal item da cmera utilizada. Ele que detecta as
imagens e as digitaliza. A qualidade das imagens capturadas depende diretamente da qualidade
do sensor da cmera. De uma forma mais tcnica, o sensor CCD, que fica na estrutura interna
da cmera, um dispositivo semicondutor que ir gravar a luz, recebida pelo laser, num formato
digital (matriz de pixels) e transfer-la (em tempo real) via USB para o laptop.

C APTULO 5

Execuo do projeto

Inicialmente, foi feita a montagem dos equipamentos pticos com o objetivo de uniformizar
o feixe de luz do laser que chega na CCD. Para isso, foram utilizados: filtro polarizador, filtro
de densidade neutra e espelho plano. A anlise do feixe foi realizada atravs do software da
prpria cmera, que exibe em tempo real a imagem adquirida pelo sensor. Observando o feixe
que chegava na cmera, foi possvel realizar ajustes finos para melhorar a sua qualidade. Nesta
etapa, tambm foram utilizados softwares de anlise numrica (MATLAB e ORIGIN 8.0) para
plotar grficos da linha e coluna central das imagens captadas, referentes a intensidade de luz
por pixel. Os grficos foram plotados com o objetivo de auxiliar na verificao do quo o feixe
est uniforme. Como especificao de projeto, o feixe de luz captado deve possuir uma regio

Intensidade do feixe de luz

100%

80%

Eixo Horizontal ou Vertical da CCD

200 m

Figura 5.1 Especificao de uniformidade do feixe: no mnimo 200 m de dimetro em 80 % da intensidade.

central com intensidade de 80% do seu valor mximo e com largura de pelo menos 200 m,
como indicado na figura 5.1. Estes valores foram estabelecidos apenas como medida razovel
para o padro de uniformidade, ou seja, necessrio que a regio onde a amostra est sendo
iluminada seja o mais uniforme possvel.
Aps garantir uma boa clareza da imagem do feixe, suficiente para fazer a anlise das estruturas nanomtricas, foram inseridos na montagem dos equipamentos: lente objetiva, trans27

5.0 ETAPA 1

28

ladador de 2 e de 3 eixos e uma lente de ampliao. Por fim, com a estrutura ptica completa,
uma amostra foi inserida no sistema para visualizao e anlise. O projeto foi dividido em trs
etapas e implementado seguindo o fluxograma da figura 5.2.

Montagem da
estrutura inicial

Visualizao da
distribuio espacial do
feixe de luz pelo
software da CCD e
Anlise Quantitativa
atravs do Matlab e
Origin

Montagem final e
anlise das estruturas

Figura 5.2 Etapas do Projeto

Etapa 1
Nesta primeira etapa, foi realizada a montagem dos aparatos pticos com o objetivo de analisar o feixe de luz que a cmera CCD recebia do laser. Inicialmente, posicionou-se o laser
numa altura de 13, 4 cm para formar um eixo ptico de referencia e utiliz-lo como guia de todo
aparato ptico. Aps o laser, foi inserido um filtro polarizador para controlar o nvel de saturao da imagem oriunda da grande intensidade recebida. Posteriormente, foi fixado um filtro
de densidade neutra para contribuir ainda mais na reduo da intensidade e um espelho plano
para gerar uma reflexo total do feixe guiando-o para uma outra extremidade da mesa ptica.
Neste espelho plano, a direo do feixe pode ser controlada em 3 direes: horizontal, vertical
e diagonal. Logo aps o espelho plano, a cmera CCD foi fixada para que fosse realizada a
anlise em tempo real do feixe incidente.

29

5.0 ETAPA 2

Laser (He-Ne)

Polarizador
Filtro de
densidade
neutra

CCD

Espelho
plano
Figura 5.3 Diagrama da montagem inicial do projeto.

Etapa 2
Nesta segunda parte, analisou-se o feixe de luz capturado pela cmera . Foram utilizados
trs softwares para termos uma anlise mais segura sobre a uniformidade do feixe:
Software Point Grey;
MatLab;
Origin 8.0.
A seguir uma descrio da anlise que foi feita utilizando cada um destes softwares.
Point Grey
Aps a anlise da uniformidade do feixe em tempo real pelo software, foi feita a captura da
imagem (utilizando as ferramentas prprias do software) para uma anlise mais qualitativa da
intensidade de luz que chegava na cmera. Aps a captura, a imagem foi gravada em formato
JPEG, de modo a coletar os dados da intensidade de luz por pixel.
Matlab
Atravs das imagens captadas, o software Matlab foi utilizado para uma anlise mais quantitativa. Foram extrados os parmetros de intensidade de luz e do comprimento relativo a dimenso total do feixe, representado pela dimenso de cada pixel da imagem. Com a aquisio
destes dados, foram plotados grficos das linhas e colunas centrais da imagem. Foram armazenados em vetores tanto o valor correspondente intensidade, como o valor do comprimento da
imagem em micrmetros.

5.0 ETAPA 3

30

Origin 8.0
O uso deste software teve por objetivo fazer um ajuste (fitting) das curvas plotadas no Matlab. Neste caso, foram estudadas duas curvas especficas (Gaussiana e Lorenztiana) para determinar quais delas se enquadraria no padro da curva real dos grficos plotados. Essas curvas
so aquelas que mais se aproximam do comportamento grfico da representao de um feixe
de luz. Assim, foi criado um padro para todas as curvas de acordo com as imagens que foram
capturadas.

Etapa 3
Esta etapa compe a montagem final do projeto. Aps a gerao de um resultado satisfatrio
em relao a uniformidade do feixe, foi realizada a montagem final do aparato ptico com
um transladador de 2 e de 3 eixos, seguido de uma haste onde estavam suportados uma lente
objetiva, um polarizador, uma lente de aumento e a cmera. Com isso, buscamos centralizar o
feixe de luz passando por todos os dispositivos a fim de continuarmos visualizando o mesmo
feixe uniforme captado anteriormente pela cmera.

C APTULO 6

Resultados

Com o objetivo final de visualizar as imagens em tempo real a partir da montagem realizada,
foi utilizada como amostra de teste um filme fino metlico (ouro) de 120 nm de espessura numa
placa de vidro de 170 m como mostra a figura 6.1.

Figura 6.1 Amostra de filme fino metlico (ouro).

Aps realizada a montagem, foi necessrio analisar a qualidade do feixe em termos de uniformidade utilizando o software Point Grey e posteriormente avaliar se a distribuio espacial
da intensidade de luz que chegava na cmera correspondia aos critrios estabelecidos no projeto, antes de incidir o feixe propriamente dito na amostra. Ento, aps alguns ajustes finos
utilizando os prprios dispositivos pticos, segue na figura 6.3 a imagem capturada do feixe
utilizado para iluminar a amostra.
Alm da visualizao da imagem em tempo real, foram utilizados tambm os recursos do
software da prpria cmera que auxiliaram na visualizao da distribuio espacial do feixe,
em termos da intensidade de luz e da posio do pixel, como mostra a figura 6.3.
Posteriormente, foi desenvolvido um cdigo no MATLAB para uma anlise mais qualitativa
da imagem do feixe luminoso, atravs da visualizao dos grficos das suas linhas e colunas
centrais, anteriores e posteriores. Com base nas dimenses fsicas do pixel gerado pelo sensor
CCD (SOLUES, 2016), segundo a figura 6.4, a posio horizontal de cada pixel foi representada no grfico intensidade vs. posio como correspondendo a comprimento em m. No
Matlab, foi desenvolvido um cdigo que fizesse esta mudana, assim, foi possvel deixar os
31

CAPTULO 6 RESULTADOS

32

Figura 6.2 Imagem do feixe do laser na cmera.

grficos da intensidade de luz em funo do comprimento (em m) que cada pixel representa
na imagem.
Tanto os grficos das linhas quanto os das colunas comportam-se como previsto (regio
central do spot de luz com intensidade de 80% do seu valor mximo e largura de pelo menos 200 m), mas foi necessrio utilizar o software de anlise estatstica Origin (verso 8.0)
para uma preciso maior da anlise. Ento, os dados referentes intensidade de luz e ao comprimento da distribuio espacial, apenas da linha e coluna centrais, foram gravados em um
vetor no Matlab e realocados para o Origin e plotados novamente como mostra a figura 6.8.
Os grficos das figuras 6.8 e 6.9 mostram a distribuio espacial da linha e da coluna central,
respectivamente.
Pode-se notar que as distribuies da linha e coluna central so estatisticamente parecidas, de
modo que as anlises a seguir so feitas com os dados da linha central do spot de luz.
Para a certificao de que o grfico gerado est prximo do comportamento de uma Gaussiana, foi realizado um fitting (ajuste) utilizando duas curvas especficas (Gaussiana e Lorenztiana). Com isso, aps a simulao e anlise, o grfico que mais se aproxima do comportamento
da representao de um feixe de luz o grfico da Gaussiana por apresentar menor erro residual como mostram as figuras 6.11 e 6.10. Assim, um padro de ajuste foi criado para todas as
curvas de distribuio espacial.

CAPTULO 6 RESULTADOS

33

Figura 6.3 Distribuio espacial do feixe atravs das linhas e colunas da imagem captada.

Aps feito o ajuste, extraiu-se o valor da intensidade mxima de luz do spot capturado,
referente ao parmetro (Height) da curva Gaussiana conforme mostra a figura 6.12.
Com um valor extrado de 235,2 e calculando 80% dele, chegamos ao valor de intensidade

CAPTULO 6 RESULTADOS

34

Figura 6.4 Dimenso do pixel referente ao sensor CCD de 1/3 de polegada.

Figura 6.5 Grfico da distribuio espacial da linha e coluna central.

prximo de 188,2. Ento, foi necessrio voltarmos ao Matlab para descobrirmos que valor de
comprimento referente a esta intensidade. Assim, observando os grficos da linha encontramos o valor de 1388 m como mostra a figura 6.13.
Aps encontrado este valor e sabendo o valor do comprimento central do ponto mximo da
Gaussiana (Xc = 1116, 4 m), o seguinte clculo foi feito para encontrar o valor do comprimento do spot na regio central:
C = 2d

(6.1)

C = 2 271, 6 = 543, 2 m

(6.2)

onde d = 1388, 0 1116, 4 = 271, 6 m.

CAPTULO 6 RESULTADOS

35

Figura 6.6 Grfico da distribuio espacial da linha e coluna anterior a central.

Figura 6.7 Grfico da distribuio espacial da linha e coluna posterior a central.

Como este valor encontrado maior que 200 m, ento, conseguiu-se atender ao critrio inicial que permite visualizarmos as estruturas nanomtricas. Aps verificada as condies, foi
inserida na montagem a lente objetiva, transladador de 2 e de 3 eixos e a lente de ampliao
juntamente com a amostra metlica a ser analisada (figura 6.1). Um diagrama esquemtico das
ranhuras na amostra encontra-se na figura 6.14 com as especificaes de suas dimenses.

36

CAPTULO 6 RESULTADOS

In t. lin h a e c o lu n a c e n tr a l
3 0 0

In t. lin h a e c o lu n a c e n tr a l

2 5 0

2 0 0

1 5 0

1 0 0

5 0

0
0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

C o m p r im e n to ( M ic r o m e tr o s )

Figura 6.8 Grfico da linha central do spot de luz

In t. C o lu n a C e n tr a l
3 0 0

In te n s id a d e C o lu n a C e n tr a l

2 5 0

2 0 0

1 5 0

1 0 0

5 0

0
0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

2 5 0 0

C o m p r im e n to ( M ic r o m e tr o s )

Figura 6.9 Grfico da coluna central do spot de luz

Com a montagem completa e a amostra a ser analisada, uma varredura foi feita na mesma
para encontrar as ranhuras (estruturas nanomtricas) no filme, conforme mostra a figura 6.15.

In t. lin h a e c o lu n a c e n tr a l
G a u s s F ittin g

In t. lin h a e c o lu n a c e n tr a l

2 0 0

1 0 0

0
0

1 0 0 0

2 0 0 0

C o m p r im e n to ( M ic r o m e tr o s )

R e s id u a l o f In t. L in h a c e n tr a l

R e s id u a l o f In t. L in h a c e n tr a l

2 0

-2 0

1 0 0 0

2 0 0 0

In d e p e n d e n t V a r ia b le

Figura 6.10 Grficos de ajuste e erro residual da curva Gaussiana.

In t. lin h a e c o lu n a c e n tr a l

In t. lin h a e c o lu n a c e n tr a l
L o r e n tz F ittin g

2 0 0

1 0 0

1 0 0 0

2 0 0 0

C o m p r im e n to ( M ic r o m e tr o s )

R e s id u a l o f In t. L in h a c e n tr a l

R e s id u a l o f In t. L in h a c e n tr a l

2 0

-2 0

1 0 0 0

2 0 0 0

In d e p e n d e n t V a r ia b le

Figura 6.11 Grficos de ajuste e erro residual da curva Lorentziana.

Figura 6.12 Parmetro extrado do Origin circulado em vermelho

Figura 6.13 Grfico referente ao valor do comprimento da regio central

1 m

10 m

500 m

100 nm

25 m

25 m

Figura 6.14 Diagrama esquemtico das ranhuras e suas dimenses.

Figura 6.15 Imagens capturadas da amostra.

C APTULO 7

Concluses

Com base na montagem realizada, conclui-se que o objetivo de representar qualitativamente as imagens geradas pela cmera foi atingido. A montagem do microscpio confocal foi
capaz de criar imagens nanomtricas das ranhuras que se encontram no filme, uma vez que as
amostras empregadas possui estruturas nesta mesma ordem. Pelos resultados quantitativos, foi
estabelecido um padro de curva de ajuste para analisar a uniformidade da distribuio espacial do feixe, gerando assim um resultado mais preciso quanto ao padro de iluminao das
amostras.

41

C APTULO 8

Trabalhos futuros

Como visto no desenvolvimento deste trabalho, foi possvel montar uma estrutura que pudesse nos auxiliar na gerao de imagens de estruturas na ordem dos nanmetros. Os prximos
passos seriam de montar uma estrutura com uma capacidade de ampliao ainda maior e de
baixo custo, para analisar estruturas ainda menores, favorecendo estudos de outras estruturas e
aplicaes na rea medica utilizando a tcnica de microscopia confocal.

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A PNDICE A

Cdigo MATLAB

close all;
clear all;
clc;
%Fazendo a analise da uniformidade do feixe de luz incidente na
camera
Imagem1 = imread(Imagem_real.jpg);%importando uma imagem no formato
.jpg
Imshow(Imagem1);%mostrando uma imagem importada
figure;
imhist(Imagem1);%Histograma de tons de uma imagem em tom de cinza
figure;
Imagem1eq = histeq(Imagem1);%Equalizao do historgrama de forma
a tornar a imagem mais ntida
%Traando o grfico das linhas e colunas centrais da imagem capturada
pela camera
matrizImagem1 = Imagem1;%Armazenando os dados da Imagem1[matriz
de 8 bits] num vetor
%Observao: V em workSpace e d 2 cliques em matrizImagem1 ir
aparecer uma matriz A X B
%Selecionamos a linha (A/2) e a coluna (B/2)[Marcam a regio central
da imagem]
%Guardamos ambos em uma varivel auxiliar e por fim plotamos
[M,N] = size(matrizImagem1); % M e N sao o numero de linhas e colunas
da imagem
% Detectando o pixel de valor maximo da figura:
max_valor = max(max(matrizImagem1)); %"max_valor" o valor maximo
da matriz (pixel de maior intensidade)
% necessario chamar a funcao max() duas vezes porque a variavel
43

APNDICE A CDIGO MATLAB

44

"matrizImagem1" uma matriz. Por isso, o valor

% de retorno de max(matrizImagem1) um vetor contendo o valor maximo
da matriz, entao para se obter somente o valor maximo,
% devemos tomar max(max(matrizImagem1)).
[valor_max_linha,valor_max_coluna] = find(matrizImagem1==max_valor);
% valor_max_linha a linha do pixel de maior intensidade
% valor_max_coluna a coluna do pixel de maior intensidade
margem = 300 % Esse valor deve ser ajustado pelo usuario. Ele
usado a seguir como parmetro para cortarmos
% a imagem, a fim de retirar o excesso de area preta (sem informacao).
% O corte eh feito da seguinte forma: a imagem eh cortada de modo
a conter somente um quadrado de lado (2*margem + 1), centrado no
pixel de
% maior intensidade.
% Corte da imagem: vai ficar apenas aquele pedao luminoso da imagem
%A imagem, que era 980x1260, vai se reduzir a 601x601 (se margem
= 300) e centralizada no pixel de maior intensidade. O arquivo da
imagem no alterado.
%Vai ser criada uma nova matriz chamada im_crop
%Resumindo: O cdigo cria a matriz im_crop, que pega a parte luminosa
da imagem centralizada no pixel de maior intensidade, e plota a
linha central.
%do jeito como o cdigo t escrito, garantimos que a linha central
de im_crop SEMPRE vai conter o pixel de maior intensidade da imagem
%o nmero de linhas e colunas a em im_crop sempre mpar, no
par.
%Esse truque pode ser usado com a imagem estando cortada ou no.

%Filtragem Digital para matriz

h = fspecial(gaussian);
I2=imfilter(Imagem1,h);
imshow(I2);
figure
imshow(Imagem1);

im_crop = matrizImagem1(valor_max_linha-margem:valor_max_linha+margem,val
figure();
imshow(im_crop,[]);% a funcao imshow exibe imagens codificadas em

APNDICE A CDIGO MATLAB

45

8 bits
%Os colchetes so usados aqui para ajustar o formato e os limites
dos pixels (coloca-los entre 0 e 255).
[Mcrop,Ncrop] = size(im_crop);% Mcrop e Ncrop so o numero de linhas
e colunas, respectivamente, de im_crop.
% Como dito anteriormente, ambos sao iguais a (2*margem + 1).
%Algoritmo para encontrar a linha e a coluna central
aux1= (Mcrop + rem(Mcrop,2))/2;
aux2= (Ncrop + rem(Ncrop,2))/2;
linha_c = im_crop(aux1,:); % linha central
coluna_c = im_crop(aux2,:); % coluna central
% Obs: a funcao rem(a,b) retorna o resto da divisao de "a" por "b",
ou seja, equivale a (a mod b).
% Escrever y = x + rem(x,2) um "artifcio" para garantir que "y"
SEMPRE seja par, porque se x for impar rem(x,2) vai ser 1, e se
% x for par rem(x,2) vai ser zero. Esse "artifcio" foi usado acima
para evitar que se dividisse por 2 um numero impar.
% Obs2: verdade que nao era necessario utilizar esse "artifcio"
acima, porque da forma como o codigo foi escrito,
% Mcrop = Ncrop = (2*margem + 1) e portanto Mcrop e Ncrop sao sempre
impares. Bastava, entao, somar 1 antes de dividir por 2,
% sem ter que computar o resto da divisao por 2. No entanto, alem
desse calculo consumir pouco recurso de processamento,
% optou-se por manter o "artifcio" no codigo para consulta futura.
%Lgica para multiplicar os ndices que indicam a posio dos pixels
por 3.75 Micrometros
m=(0:length(linha_c)-1);
n=(0:length(coluna_c)-1);
%Criando um vetor linha e coluna para exportar para o Origin
L=3.75*m;
C=3.75*n;
plot(L,linha_c);
title(Grfico da linha central de im_crop);
xlabel(Comprimento em [Micrometros]);
ylabel(Intensidade);
figure;

APNDICE A CDIGO MATLAB

46

plot(C,coluna_c);
title(Grfico da coluna central de im_crop );
xlabel(Comprimento [Micrometros]);
ylabel(intensidade);
figure;
%linha e coluna anterior a central(caso em que o n de linhas e
colunas mpar)
linha_ant=im_crop((aux1-1),:); %Subtrai 1 da linha central e varre
todos os valores nas colunas para obter apenas os valores da linha
anterior fixada
coluna_ant=im_crop((aux2-1),:);%Subtrai 1 da coluna central e varre
todos os valores nas linhas para obter apenas os valores da coluna
anterior fixada
plot(3.75*m,linha_ant);
title(Grfico da linha anterior a linha central de im_crop);
xlabel(Comprimento [Micrometros]);
ylabel(Intensidade);
figure;
plot(3.75*n,coluna_ant);
title(Grfico da coluna anterior a coluna central de im_crop);
xlabel(Comprimento [Micrometros]);
ylabel(intensidade);
figure;
%linha e coluna posterior a central
linha_post=im_crop((aux1+1),:); %Soma 1 da linha central e varre
todos os valores nas colunas para obter apenas os valores da linha
posterior fixada
coluna_post=im_crop((aux2+1),:);%Soma 1 da coluna central e varre
todos os valores nas linhas para obter apenas os valores da coluna
posterior fixada
plot(3.75*m,linha_post);
title(Grfico da linha posterior a linha central de im_crop);
xlabel(Comprimento [Micrometros]);
ylabel(Intensidade);
figure;
plot(3.75*n,coluna_post);
title(Grfico da coluna posterior a coluna central de im_crop);

APNDICE A CDIGO MATLAB

xlabel(Comprimento [Micrometros]);
ylabel(intensidade);
figure;

47

A PNDICE B

Folha de Especificaes da CCD

48

Referncias Bibliogrficas

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Cambridge Philosophical Society, v. 5, p. 283291, 1835. Citado na pgina 4.
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research. Biology of the Cell, v. 95, p. 335342, 2003. Citado na pgina 2.
BOHREN, C. F. What Light Through Yonder Window Breaks?: More Experiments in
Atmospheric Physics (Dover Science Books). Dover Publications, 2013. Disponvel em:
<http://www.amazon.com/Light-Through-Yonder-Window-Breaks-ebook/dp/B00A73IVG0%
3FSubscriptionId%3D0JYN1NVW651KCA56C102%26tag%3Dtechkie-20%26linkCode%
3Dxm2%26camp%3D2025%26creative%3D165953%26creativeASIN%3DB00A73IVG0>.
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CHARTIER, G. Introduction to Optics (Advanced Texts in Physics). Springer, 2005. ISBN 0387403469. Disponvel em: <http://www.amazon.com/
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3D2025%26creative%3D165953%26creativeASIN%3D0387403469>. Citado 5 vezes nas
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Online Library, v. 10, n. 4, p. 128138, 1988. Citado 2 vezes nas pginas 18 e 19.
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49

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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ISBN 0-387-25921-X. Citado na pgina 18.
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em: <http://www.amazon.com/Field-Guide-Microscopy-SPIE-Vol/dp/0819472468%
3FSubscriptionId%3D0JYN1NVW651KCA56C102%26tag%3Dtechkie-20%26linkCode%
3Dxm2%26camp%3D2025%26creative%3D165953%26creativeASIN%3D0819472468>.
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TOLMAN, R. The principles of statistical mechanics. New York: Dover Publications, 1979.
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WANG, E.; BABBEY, C. M.; DUNN, K. W. Performance comparison between the high-speed
Yokogawa spinning disc confocal system and single-point scanning confocal systems. Journal
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WOLF, K. B. Geometry and dynamics in refracting systems. European Journal of Physics,
v. 16, p. 1420, 1995. Citado na pgina 7.