Puji dan Syukur kami panjatkan ke Hadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat
limpahan Rahmat dan Karunia-nya sehingga kami dapat menyusun makalah ini dengan baik
dan tepat pada waktunya. Dalam makalah ini kami menyajikan tentang alat-alat instrument
seperti FTIR, GC, GC-MS, dan HPLC.
Makalah ini dibuat dari berbaga sumber dan beberapa bantuan dari berbagai pihak
untuk membantu menyelesaikan tantangan dan hambatan selama mengerjakan makalah ini.
Oleh karena itu, kami mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada semua pihak
yang telah membantu dalam penyusunan makalah ini.
Kami menyadari bahwa masih banyak kekurangan yang mendasar pada makalah ini.
Oleh karena itu kami mengundang pembaca untuk memberikan saran serta kritik yang dapat
membangun kami. Kritik konstruktif dari pembaca sangat kami harapkan untuk
penyempurnaan makalah selanjutnya.
Akhir kata kami berharap semoga makalah ini dapat memberikan manfaat maupun
inpirasi terhadap pembaca.
Bogor,
July 2016
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR......................................................................................... 1
DAFTAR ISI.................................................................................................... 2
PENDAHULUAN............................................................................................. 4
FTIR (FOURIER TRANSFORM INFRA RED).......................................................5
PENDAHULUAN.......................................................................................... 5
PRINSIP...................................................................................................... 5
Makalah Analisis Instrument PKT-59
INSTRUMENTASI......................................................................................... 7
JENIS SAMPEL........................................................................................... 11
METODE PREPARASI SAMPEL....................................................................11
METODE ANALISIS.................................................................................... 12
METODE PENGOLAHAN DATA HASIL ANALISIS...........................................14
GC (GAS CHROMATOGRAPHY)......................................................................16
PENDAHULUAN........................................................................................ 16
PRINSIP.................................................................................................... 17
INSTRUMENTASI....................................................................................... 18
JENIS SAMPEL........................................................................................... 26
METODE PREPARASI SAMPEL....................................................................27
METODE ANALISIS.................................................................................... 29
METODE PENGOLAHAN DATA HASIL ANALISIS...........................................30
GC-MS......................................................................................................... 32
PENDAHULUAN........................................................................................ 32
PRINSIP.................................................................................................... 32
INSTRUMENTASI....................................................................................... 33
JENIS SAMPEL........................................................................................... 37
METODE PREPARASI SAMPEL....................................................................37
METODE ANALISIS.................................................................................... 38
METODE PENGOLAHAN DATA HASIL ANALISIS...........................................38
HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)..............................41
PENDAHULUAN........................................................................................ 41
PRINSIP.................................................................................................... 43
Prinsip dasar HPLC.................................................................................... 43
Prinsip kerja HPLC.................................................................................... 43
INSTRUMENTASI....................................................................................... 44
JENIS SAMPEL........................................................................................... 48
METODE PREPARASI SAMPEL....................................................................48
METODE ANALISIS.................................................................................... 49
METODE PENGOLAHAN DATA HASIL ANALISIS...........................................50
DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 53
PENDAHULUAN
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul)
yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang
merupakan fase diam.Tswett adalah penemu kromatografi pada tahun 1903. Perkembangan
kromatografi antara lain:
a. kromatografi cair-padat (KCP).
b. Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini mulai
berkembang. Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh Izmailov.
c. Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada
tahun 1958. Karya Martin dan Synge
yang pada tahun 1041
membuahkan
hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga secara
umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas dan kromatografi
kertas.
d. Pada tahun 1952, Martindan James mempublikasikan makalah pertamanya
mengenaim kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an
kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang canggih.
e. Hal ini menjadi dasar ditemukannya kromatografi yang canggih yaitu kromatografi
cair kinerja tinggi (High Perfomance Liquid Chromatografi).
Kromatografi dibedakan menjadi 2 jenis yaitu:
Kromatografi cair (Liquid Chromatography) merupakan teknik yang tepat untuk
memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Terdapat beberapa jenis
kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid
Chromatography (HPLC), size
exclusion
chromatography,
serta supercritical
fluid
chromatography.
PRINSIP
Spectroscopy FTIR menggunakan sistem optik dengan laser yang berfungsi sebagai
sumber radiasi yang kemudian diinterferensikan oleh radiasi inframerah agar sinyal radiasi
yang diterima oleh detektor memiliki kualitas yang baik dan bersifat utuh (Giwangkara,2006).
Prinsip kerja FTIR berupa infrared yang melewati celah kesampel, dimana celah tersebut
berfungsi mengontrol jumlah energi ysng disampaikan kepada sampel. Kemudian beberapa
infrared diserap oleh sampel dan yang lainnya ditransmisikan melalui permukaan sampel
sehingga sinar infrared lolos ke detektor dan sinyal yang terukur kemudian dikirim
kekomputer seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3 dibawah ini (Thermo, 2001)
Prinsip kerja spektroskopi FTIR adalah adanya interaksi energi dengan materi.Fourier
mengemukakan deret persamaan gelombang elektronik sebagai :
f(t) = a0 + a1 cos w0t + a2 cos 2w0t + + b1 cos w0t + b2 cos 2w0t
dimana :
- a dan b merupakan suatu tetapan
- t adalah waktu
- adalah frekwensi sudut (radian per detik)
( = 2 f dan f adalah frekwensi dalam Hertz)
Atom-atom dalam suatu molekul tidak diam melainkan bervibrasi. Bila radiasi infra
merah yang kisaran energinya sesuai dengan frekuensi vibrasi rentangan (stretching) dan
Makalah Analisis Instrument PKT-59
vibrasi bengkokan (bending) dari ikatan kovalen dalam kebanyakan molekul dilewatkan
dalam suatu cuplikan, maka molektul-molekul akan menyerap energi tersebut dan terjadi
transisi diantara tingkat energi vibrasidasar dan tingkat vibrasi tereksitasi (Hendayana, dkk.,
1994). Namun demikian tidak semua ikatan dalam molekul dapat menyerap energi infra
merah meskipun mempunyai frekuensi radiasi sesuai dengan gerakan ikatan. Hanya ikatan
yang mempunyai momen dipol dapat menyerap radiasi infra merah (Sastrohamidjojo, 1992).
Umumnya daerah radiasi infra merah (IR) terbagi dalam daerah IR dekat (14290-4000 cm -1),
IR jauh (700-200 cm-1) dan IR tengah (4000-666 cm-1). Daerah yang paling banyak digunakan
untuk keperluan penyidikan terbatas pada daerah IR tengah. Hukum Hooke dapat
memperkirakan daerah dimana vibrasi terjadi.
1 K (m1 +m2)
=
2 c
m 1 m2
atau
=4,12
Dimana:
m1+ m
m m
= 1 2
Posisi relatif suatu atom dengan atom lainnya dalam suatu molekul selalu berubah-ubah
akibat dari gerakan vibrasi. Untuk molekul dwiatom atau tri-atom, vibrasi berhubungan dengan
energi absorpsi, namun untuk poliatom vibrasi tidak mudah diperkirakan karena banyaknya
pusat vibrasi yang berinteraksi. Adapun cara vibrasi untuk molekul poliatom dapat
dikelompokkan untuk molekul linier dan molekul non linier. Vibrasi fundamental untuk
molekul linier = 3n 5, sedangkan untuk molekul non linier = 3n 6, dengan n = banyaknya
atom.
kelebihan utama
a Dapat digunakan pada semua frekuensi dari sumber cahaya secara simultan, sehingga
analisis dapat dilakukan lebih cepat dari pada menggunakan cara scanning.
b Sensitivitas FTIR adalah 80-200 kali lebih tinggi dari instrumentasi dispersi standar karena
resolusinya lebih tinggi (Razi, 2012). Sensitifitas dari metoda Spektrofotometri FTIR lebih
besar dari pada cara dispersi, sebab radiasi yang masuk ke sistim detektor lebih banyak
karena tanpa harus melalui celah (slitless) (Giwangkara S, 2012).
c Pada FTIR, mekanik optik lebih sederhana dengan sedikit komponen yang bergerak
dibanding spektroskopi infra merah lainnya, dapat mengidentifikasi meterial yang belum
diketahui, serta dapat menentukan kualitas dan jumlah komponen sebuah sampel (Hamdila,
2012).
INSTRUMENTASI
1
2
Keterangan :
1.
2.
Beam splitter
3.
4.
5. Sampel
6
6.
Beam Splitter
Beam splitter digunakan untuk memecah dan menyatukan kembali berkas
sinar karena sifatnya dapat meneruskan (transmisi) dan memantulkan (refleksi) sinar
yang mengenainya. Berkas sinar hasil penggambungan dan 2 berkas yang telah
dipecah akan terjadi interferensi dengan menvariasi jarak tempuh berkas dengan
mengubah posisi cermin 2 menjauh dan mendekat.
Cermin Datar
Cermin datar berjumlah 2 buah digunakan untuk memantulkan dari beam
splitter kembali ke beam splitter lagi untuk digabung agar terjadi proses interferensi
gelombang cahaya. Salah satu cermin (cermin 1) dapat digerakkan mendekati atau
menjauhi beam splitter, sedangkan cermin yang lain (cermin 2) dibuat tetap. Ukuran
cermin ini disesuaikan dengan lebar cahaya yang terbentuk yaitu dengan bentuk
lingkaran dengan diameter sekitar 5 cm.
Sumber
Interferome
Samp
Detektor
IR
Komput
er FFT
Spektru
Sumber radiasi
Prinsip dari sumber radiasi IR adalah dipancarkannya sinar oleh padatan lembam yang
dipanaskan sampai pijar dengan aliran listrik. Ada 3 macam sumber radiasi yaitu :
-
Globar source : tabung silica carbida dengan ukuran diameter 5mm dan panjang 5cm
Pada sistim optik FTIR digunakan radiasi LASER (Light Amplification by Stimulated
Emmission of Radiation) yang berfungsi sebagai radiasi yang diinterferensikan dengan
radiasi infra merah agar sinyal radiasi infra merah yang diterima oleh detektor secara
utuh dan lebih baik.
Sampel kompartemen.
Cuplikan atau sampel yang dianalisis dapat berupa cairan, padatan atau pun gas.
Karena energi vibrasi tidak terlalu besar sampel dapat diletakan langsung berhadapan
dengan sumber radiasi IR. Karena gelas kuarsa atau mortar yang terbuat dari porselene
dapat memberikan kontaminasi yang menyerap radiasi IR, maka pemakaian alat tersebut
harus dihindari. Preparasi cuplikan harus menggunakan mortar yang terbuat dari batu
agate dan pengempaan dilakukan dengan menggunakan logam monel.
Monokromator
Monokromator merupakan suatu alat yang berfungsi untuk mendispersikan sinar dari
sinar polikromatik menjadi sinar monokromatik. Ada dua macam tipe monokromator
yaitu monokromator prisma dan monokromator gratting (kisi difraksi).
Detektor
Detektor berfungsi mengubah sinyal radiasi IR menjadi sinyal listrik. Selain itu
detektor dapat mendeteksi adanya perubahan panas yang terjadi karena adanya
pergerakan molekul. Detektor spelktrofotometer yang bersifat menggandakan elektron
tidak dapat dipakai pada spektrofotometer IR sebab radiasi IR sanngat lemah dan tidak
dapat melepaskan elektron dari katoda yang ada pada system detektor. Ada tiga tipe
detektor yang dapat digunakan pada spektrofotometer IR, yaitu :
Thermal transducer
Terdiri dari dua logam bercabang dimana suhu tergantung pada potensialnya.
Intrumen yang menggunakan detektor ini harus disimpan pada tempat yang ber-AC
atau bersuhu konstan karena dapat dipengaruhi oleh suhu sehingga dapat terjadi
kesalahan dalam mendeteksi suatu senyawa. Responnya lambat sehingga jarang
digunakan.
Pyroelectric transducer
Berupa kristal cairan dari triglisin sulfat (TGS) dimana temperatur dipengaruhi
oleh polaritas senyawa. Memiliki respon yang cepat dalam menganalisis suatu
senyawa
Photoconducting transducer
Terbuat dari bahan semikonduktor seperti timbal sulfida, eaksa telurida, dan
cadmium telurida, indium antimonida. Harus menggunakan pendingin gas nitrogen
sehingga responnya cepat.
Perangkat optik spektroskopi FTIR berupa interferometer pada box posisi terbuka
Sensor IR
Cermin
geser
Sumber
Beam
splitter
Penahan
Cermin
Tetap
Tempat/box
Hasil interferogram menggunakan laser He-Ne. Pola-pola interferensi untuk laju pergeseran
cermin sebesar 24 m/s. (a) kondisi awal, (b) kondisi saat beda lintasan optis sebesar kira-kira
4,0 mm.
Makalah Analisis Instrument PKT-59
Untuk menguji kualitas interferogram yang dihasilkan, sumber IR diganti dengan laser
He-Ne (panjang gelombang 632,8 nm). Semua komponen optik diatur sehingga posisi awal
diperoleh pola interferensi maksimal. Kemudian, cermin geser digerakkan sampai kondisi
akhir berjarak sekitar 4,0 mm dari posisi awal. Gambar di atas menampilkan kondisi awal dan
akhir dari interferogram menggunakan laser He-Ne.
Dari gambar tersebut dapat disimpulkan bahwa kondisi interferogram berhasil dengan
baik, meskipun pola interferensi tidak berupa lingkaran konsentris sempurna. Jarak pergeseran
cermin yang maksimum 4,0 mm menghasilkan resolusi spektrum kira-kira sebesar 2,5 cm -1.
Meskipun resolusi spektrometer FTIR pada umumnya terletak antara 0,01 cm -1 sampai 2 cm-1 .
JENIS SAMPEL
Senyawa organik yang memiliki gugus fungsional yang pokok yaitu C=O, O-H, N-H,
C-O, C=C, CC, CN, dan NO2.
Gas
Sampel berbentuk gas dimasukkan ke dalam sel gas, sel ini menghadap
langsung pada berkas sinar. Dalam bentuk yang dimodifikasi, cermin internal yang
digunakan dapat memantulkan berkas sinar berulang kali melalui sampel untuk
menaikkan sensitivitas. Sejumlah kecil senyawa-senyawa organik dapat ditentukan
dalam bentuk gas, bahkan dalam sel-sel yang dipanaskan.
Cairan
Sampel berbentuk cairan ditempatkan pada sel sebagai film yang tipis di
antara dua lapis NaCl yang transparan terhadap inframerah. Karena digunakan NaCl
maka setelah selesai harus segera dibersihkan dengan mencuci menggunakan pelarut-
pelarut seperti toluene, kloroform, dan sebagainya. NaCl harus dijaga tetap kering dan
selalu dipegang pada ujung-ujungnya. Untuk spektra di bawah 250 cm-1, maka
digunakan CsI, untuk sampel yang mengandung air dapat digunakan CaF2. Sampel
cairan dapat juga ditentukan dalam larutan.
Padatan
Wujud sampel padat dapat bermacam-macam di antaranya kristal, amorf,
serbuk, gel dan lain-lain. Padatan juga dapat ditentukan dalam larutan tetapi spektra
larutan mungkin memberikan kenampakan yang berbeda dari spektra bentuk padat,
karena gaya-gaya intermolekul akan berubah. Bermacam metoda telah dikembangkan
untuk penyediaan sampel padat hingga dapat langsung diukur. Ada beberapa cara yang
umum untuk penyiapan sampel bentuk padatan :
o Pelet KBr, dibuat dengan menumbuk sampel (0,12,0%) dengan KBr
kemudian ditekan hingga diperoleh pellet KBr, campuran harus kering dan
akan baik bila penumbukan dilakukan dibawah lampu inframerah untuk
mencegah terjadinya kondensasi uap dari atmosfer yang akan memberikan
serapan lebar pada 3500 cm-1.
o Mull atau pasta, dibuat dengan mencampursampel dengan setetes minyak,
pasta kemudian dilapiskan di antara dua keeping NaCl yang transparan. Bahan
pasta harus transparan terhadap inframerah, tetapi hal ini tidak pernah ada dan
struktur yang dihasilkan selalu menunjukkan serapan yang berasal dari bahan
pasta adalah parafin cair.
o Lapisan tipis padatan, dilapiskan pada keping-keping NaCl dengan cara
meneteskan larutan dalam pelarut yang mudah menguap pada permukaan
kepingan NaCl dan dibiarkan hingga pelarut menguap. Polimer-polimer
berbagai lilin atau bahan-bahan lemak sering memberikan hasil yang baik,
tetapi ada juga yang membentuk kristal yang tajam hingga tidak memberikan
serapan.
o Larutan, sampel dilarutkan dalam pelarut seperti karbon tetraklorida, karbon
disulfide atau kloroform, dan spektrum dari larutan ini dicatat. Larutan
(biasanya 15%) ditempatkan dalam sel larutan yang terdiri dari bahan
transparan. Sel yang kedua berisi pelarut murni yang ditempatkan pada berkas
sinar standari, sehingga serapan dari pelarut dapat dihilangkan dan spektrum
yang dicatat merupakan senyawanya sendiri. Meskipun demikian untuk
meyakinkan bahwa serapan dari pelarut tidak mengganggu spektrum dari
sampel, maka sebaiknya perlu dibuat spektrum dari pelarut yang digunakan
untuk mengetahui serapan-serapan yang diberikan.
METODE ANALISIS
FTIR digunakan untuk melakukan analisa kualitatif yaitu untuk mengetahui ikatan
kimia yang dapat ditentukan dari spektra vibrasi yang dihasilkan oleh suatu senyawa pada
panjang gelombang tertentu. Analisis kualitatif yang dapat dilakukan adalah memperhatikan
ada tidaknya gugus fungsional yang pokok yaitu C=O, O-H, N-H, C-O, C=C, CC, CN, dan
NO2, kemudian menginterpretasikannya dengan menggunakan bagan korelasi dan tabel,
sehingga peak-peak yang ada dapat dianalisis. Selain itu digunakan juga untuk analisa
kuantitatif yaitu melakukan perhitungan tertentu dengan menggunakan intensitas
berdasarkan gugus Fungsi yang dimiliki oleh suatu sampel.
Dalam metode menganalisis suatu spektra yang tak diketahui, perhatian harus dipusatkan
pada penentuan ada atau tidaknya beberapa gugus fungsional utama seperti C=O, O-H, N-NH,
C-O, C=C, , dan NO2. Janganlah membuat analisis yang detail terhadap pita serapan CH dekat
Makalah Analisis Instrument PKT-59
3000 cm-1 (3,33 m). Hampir semua senyawa mempunyai pita serapan pada daerah tersebut.
Tidak perlu risau terhadap adanya suatu lingkungan yang tepat dari gugus fungsional yang
diperoleh. Berikut ini langkah umum untuk memeriksa pita-pita yang penting.
Gugus C=O terdapat pada daerah 1820 1600 cm-1 (5,6 6,1 m). Puncak ini biasanya
yang terkuat dengan lebar mediun dalam spektrum. Serapan tersebut sangat karakteristik.
1
Apakah
ada
OH?
Apakah
ada
NH?
Serapan medium didekat 3500 cm-1 (2,85 m) kadangkadang puncak rangkap, dengan perubahan yang sama.
Ester
Apakah
ada
C-OH
atau
C-OR?
Anhidrida
Aldehida
Apakah
ada
CH
aldehida?
Ujilah
untuk
OH
Ujilah
untuk
NH
Gugus Nitro
Dua serapan kuat pada 1600 1500 cm-1 (6,25 6,67) dan 1390 1300 cm-1
(7,2 m - 7,7 m).
Hidrokarbon
Serapan
utama
untuk
CH
didekat
3000
cm-1
(3,3
m).
Spektrumnya sangat sederhana, hanya terdapat serapan lain-lain didekat 1450 cm -1
(6,90 m) dan 1375 cm-1 (7,27 m).
Langkah-langkah pada waktu menginterpretasi data inframerah.
a) Kebanyakan senyawa dapat dicatat pada serapan di atas 1400 cm -1 dan dibawah 900
cm-1. (Daerah finger print, 900-1400 cm-1, mengandung banyak serapan yang tidak
dapat ditelaah).
b) Gugus/kelompok fungsional jauh lebih berguna dari pada pita-pita tunggal. Dengan
perkataan lain, gugus fungsional yang memberikan banyak serapan karakteristik
biasanya dapat diidentifikasi lebih tepat dari pada gugus fungsional yang memberikan
hanya satu serapan karakteristik. Jadi keton (C=O str) lebih sukar/diidentifikasi dari
pada ester (C=O str dan CO str) ester lebih sukar diidentifikasi dari pada amida (C=O
str, N H str, N H def, dan sebagainya).
c) Kerangka karbon harus diperhatikan paling awal : lihat apakah alkana, alkena,
alkuna atau aromatik. (Gunakan CH str, CH def dan berbagai frekuensi rentangan
ikatan karbon-karbon). Kenyataan bahwa spektrum NMR sangat membantu. Lihat
apakah ada C=O str, jika ada ia mungkin berhubungan dengan CH str dalam aldehida,
NH str dalam amida, C-O str dalam ester dan sebagainya. Carilah O-H str atau N-H
str demikian juga C=N str. Dalam senyawa belerang amati adanya S-H str, S=O str,
dan SO2 str; dalam senyawa fosfor lihat adanya PO str.
Jenis ikatan
3600-3000
3600-3300
2400-2000
1700-1500
1300-1000
1000-700
700-500
<500
O-H
N-H
Fenol, ikatan H
C=C stretching
C-O
C-C Vibrasi
C-H bending
Dianggap finger print
Jenis ikatan
N-H
Fenol, ikatan H
C=C stretching
C-H
C-N
C-C Vibrasi
C-H bending
Dianggap finger print
Dari data tersebut dapat dilihat perbedaan antara sepktra dari garam rangkap dan juga
garam kompleks. Salah satunya adalah gugus O-H yang terdapat pada garam rangkap tetapi
tidak terdapat pada garam kompleks. Selain itu ditemukan serapan C-O pada 1300 1000 cm1. Sedangkan pada garam kompleks, serapan 3600-3000 cm-1 bentuknya tidak lebar
melainkan meruncing yang diperkirakan adalah N-H. Garam kompleks memiliki harga serapan
1402,25 sedangkan pada garam rangkap 1400,32 pada serapan 1500-1250 cm-1. Adanya
beberapa perbedaan serapan antara garam rangkap dan juga garam kompleks dapat disebabkan
oleh adanya perbedaan interaksi yang terjadi antara atom pusat molekul ligan. Berdasarkan
spectra yang diperoleh ada serapan yang kurang sesuai yaitu gugus C-H, karena dalam
senyawa sampel yang digunakan tidak terdapat ikatan C-H. Hal ini mungkin dapat terjadi yang
disebabkan adanya ganguan dari luar ataupun saat pembuatan sampel yang kurang sempurna,
sehingga sampel yang terbentuk telah terkontaminasi yang mengakibatkan adanya pergeseran
spektra.
Hasil analisa FTIR hanya dapat digunakan untuk mengetahui ikatan yang terdapat
dalam suatu senyawa sampel. Hasil ini tidak dapat digunakan untuk menentukan bentuk
struktur dari sampel tersebut. Jadi untuk analisa suatu senyawa perlu didukung dengan analisa
lain seperti H-NMR, C-NMR, dan MS.
GC (GAS CHROMATOGRAPHY)
PENDAHULUAN
Berbagai teknik pemisahan campuran zat cair yang banyak digunakan diantaranya,
destilasi ( fraksionasi, destilasi uap) dan ekstraksi. Kromatografi merupakan teknik pemisahan
yang lebih baik dan lebih cepat dari kedua teknik tersebut di atas, teknik ini telah dikenal sejak
abad ke-19.
Dasar pemisahan pada kromatografi adalah pendistribusian sampel di antara dua fase,
yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan pemakaian fase gerak, kromatografi dapat dibagi
menjadi : Kromatografi Cair da Kromatografi Gas.
Kromatografi gas adalah teknik pemisahan yang didasarkan atas sampel di antara
suatu fase gerak yang bisa berupa gas dan fase diam yang juga bisa berupa caira ataupun suatu
padatan. Sedangkan kromatografi cair merupakan teknik pemisahan yang didasarkan atas
sampel di antara suatu fase gerak berupa cairan dan fase diam yang juga didasarkan atas
sampel di antara suatu fase gerak yang bisa berupa gas dan fase diam yang juga bisa berupa
caira ataupun suatu padatan. Hal ini dikarenakan adanya perbedaan polaritas dar fase diam dan
fase gerak.
Banyaknya macam-macam kromatografi yang salah satunya adalah kromatografi gas,
yang merupakan metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada zaman instrumen dan
elektronika. Kromatografi gas dapat dipakai untuk setiap campuran dimana semua
komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti, suhu tekanan uap yang dipakai untuk
proses pemisahan. Tekanan uap memungkinkan komponen menguap dan bergerak bersamasama dengan fase gerak berupa gas.
Kromatografi gas metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan camputan yang
sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik untuk campuran
sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen.
Metode ini sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti
Makalah Analisis Instrument PKT-59
hidrokarbon dan eter. Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel
dan cairan, dengan menggunakan fasecair standar yang diketahui efektif untuk berbagai
senyawa.
Kromatografi gas (GC) adalah jenis umum dari kromatografi yang digunakan
dalam kimia
analitikuntuk memisahkan dan
menganalisis
senyawa
yang
dapat menguap tanpa dekomposisi. GC dapat digunakan untuk pengujian kemurnian zat
tertentu, atau memisahkan komponen yang berbeda dari campuran (jumlah relatif komponen
tersebut juga dapat ditentukan). GC dapat digunakan dalam mengidentifikasi suatu senyawa.
Kromatografi gas, berdasarkan fasa gerak dan fasa diamnya merupakan kromatografi
gas-cair. Dimana fasa geraknya berupa gas yang bersifat inert, sedangkan fasa diamnya berupa
cairan yang inert pula, dapat berupa polimer ataupun larutan. Adapun gambaran umum dari
GC adalah sebagai berikut :
Kromatografi gas merupakan teknik pemisahan yang mana solut-solut yang mudah
menguap (dan stabil terhadap panas) bermigrasi melalui kolom yang mengandung fase diam
dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio distribusinya. Pemisahan pada
kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi
yang mungkin terjadi antara solute dengan fase diam. Selain itu juga penyebaran cuplikan
diantara dua fase. Salah satu fase ialah fase diam yang permukaannya nisbi luas dan fase yang
lain yaitu gas yang mengelusi fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solute
dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detector. Prinsip utama pemisahan dalam
kromatografi gas adalah berdasarkan perbedaan laju migrasi masing-masing komponen
dalam melalui kolom. Komponen-komponen yang terelusi dikenali (analisa kualitatif) dari
nilai waktu retensinya (Tr).
Gas pembawa (biasanya digunakan Helium, Argon atau Nitrogen) dengan tekanan
tertentu dialirkan secara konstan melalui kolom yang berisi fase diam. Selanjutnya sampel di
injeksikan kedalam injektor (Injection Port) yang suhunya dapat diatur. Komponen-komponen
dalam sampel akan segera menjadi uap dan akan dibawa oleh aliran gas pembawa menuju
kolom. Komponen- komponen akan teradopsi oleh fase diam pada kolom kemudian akan
merambat dengan kecepatan berbeda sesuai dengan nilai Kd masing- masing komponen
sehingga terjadi pemisahan.
Komponen yang terpisah menuju detektor dan akan terbakar menghasilkan sinyal
listrik yang besarnya proporsional dengan komponen tersebut. Sinyal lau diperkuat oleh
amplifier dan selanjutnya oleh pencatat (recorder) dituliskan sebagai kromatogram berupa
puncak. Puncak konsentrasi yang diperoleh menggambarkan arus detektor terhadap waktu.
Secara sederhana prinsip kromatografi gas adalah udara dilewatkan melalui nyala
hydrogen (hydrogen flame) selanjutnya uap organik tersebut akan terionisasi dan menginduksi
terjadinya aliran listrik pada detektor, kuantitas aliran listrik sebanding dengan ion.
INSTRUMENTASI
Sistem peralatan dari kromatografi gas terdiri dari 6 bagian utama diantaranya:
1
Kolom
Detektor
Rekorder (pencatat)
Cara pemisahan dari sistem ini sangat sederhana sekali, cuplikan yang akan dipisahkan
diinjeksikan kedalam injektor, aliran gas pembawa yang inert akan membawa uap cuplikan
kedalam kolom. Kolom akan memisahkan komponen-komponen cuplikan tersebut.
Komponen-komponen yang telah terpisah tadi dapat dideteksi oleh detektor sehingga
memberikan sinyal yang kemudian dicatat pada rekorder dan berupa puncak-puncak
(kromatogram).
1
Gas Pembawa
Gas pembawa ditempatkan dalam tabung bertekanan tinggi. Biasanya tekanan dari
silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat besar untuk digunakan secara Iansung.
Untuk memperkecil tekanan tersebut agar memenuhi kondisi pemisahan maka digunakan
drager yang dapat mengurangi tekanan dan mengalirkan gas dengan laju tetap. Aliran gas akan
mengelusi komponen-komponen dengan waktu yang karaterisitik terhadap komponen tersebut
(waktu retensi). Karena kecepatan gas tetap maka komponen juga mempunyai volume yang
karateristik untuk gas pembawa (volume retensi).
Adapun persyaratan-persyaratan yang harus dipenuhi oleh gas pembawa adalah :
1
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon dioksida dan
hidrogen.Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah terbakar, tetapi sangat mahal. H2
mudah terbakar, sehingga harus berhati-hati dalam pemakaiannya. Kadang-kadang digunakan
juga CO2.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh detektor yang digunakan.
Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan keluaran dan pengukur tekanan.
Sebelum masuk ke kromatografi, (harusnya) ada pengukur kecepatan aliran gas serta sistem
penapis molekuler untuk memisahkan air dan pengotor gas lainnya. Pada dasarnya kecepatan
alir gas diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu pengatur kasar (coarse) pada tabung
gas dan pengatur halus (fine) pada kromatograf. Tekanan gas masuk ke kromatograf (yaitu
tekanan dari tabung gas) diatur pada 10 s.d 50 psi (di atas tekanan ruangan) untuk
memungkinkan aliran gas 25 s.d 150 mL/menit pada kolom terpaket dan 1 s.d 25 mL/menit
untuk kolom kapiler.
Makalah Analisis Instrument PKT-59
Laju alir gas pembawa mempengaruhi resolusi. Laju alir yang minimum diperlukan untuk
resolusi maksimum. Namun, perlu diketahui bahwa pada laju alir yang sangat lambat
resolusinya secara dramatis menurun oleh karena faktor-faktor: packing tidak teratur, ukuran
partikel, diameter kolom, dan lain-lain.
Laju alir harus dikontrol dengan tepat. Tekanan dari silinder gas bertekanan pada gas
pembawa harus cukup untuk mendorong gas melewati kolom packing. Flow controller atau
needle valve harus ada pada sistem GC dan sering disatukan dalam bagian depan instrumen.
Laju alir harus dapat diatur secara hati-hati sehingga dapat diketahui berapa laju alir
optimumnya dan harus dapat disamakan dalam percobaan berikutnya. Berbagai flow meter
tersedia, dan kadang-kadang oleh pabrik pembuat instrumen disatukan di dalam instrumen
sehingga laju alir terpantau secara kontinyu dan dapat diatur lagi (bila perlu) dengan memutar
needle valve. Bila tidak ada flow meter maka flow meter gelembung sabun sering digunakan,
flow meter gelembung sabun tersusun dari pipet ukur (measuring pipet), tabung gelas (glass
tubing), dan pipet bulb. Dengan perangkat flow meter gelembung sabun, stop watch digunakan
untuk mengukur waktu pada gelembung yang bergerak di antara dua tanda garis, misalnya 02
ml. Dengan demikian laju alir gas pembawa (ml/menit) dapat dihitung.
2
Tempat Injeksi
Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Gas dan uap
dapatdimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan dan
padatan. Hingga dengan demikian senyawa yang berbentuk cairan dan padatan pertama-tama
harus diuapkan. Ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom. Panas itu terdapat
pada tempat injeksi seperti pada gambar 9. bagan injektor.
Tempat injeksi dari alat GLC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu dari tempat
injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini adalah bahwa suhu tempat
injeksi sekitar 50C lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang mempunyai titik
didih yang paling tinggi. Bila kita tidak mengetahui titik didih komponen dari cuplikan maka
kita harus mencoba-coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika
puncak-puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan pertama terlalu
rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan
akan terjadi perubahan karena panas atau penguraian dari senyawa yang akan dianalisa.
Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak, karena
GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kita mengadakan
analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan.
Ketepatan volum injeksi menjadi sangat penting untuk analisa kuantitatif di mana jumlah
analit yang diukur oleh detektor tergantung pada konsentrasi analit dalam cuplikan. Apabila
prosedur dikehendaki hanya untuk identifikasi (analisis kualitatif), maka ketepatan volum
injeksi menjadi kurang penting.
Untuk mengisi alat injeksi dapat dipakai teknik sebagai berikut:
- Alat injeksi dibersihkan.
- Alat injeksi dikuras dengan menghisap cuplikan beberapa kali (dan mengeluarkan isinya di
luar tempat cuplikan).
- Jumlah cuplikan yang diperlukan dihisap. Cara untuk mengeluarkan gelembung-gelembung
udara yang masih tertinggal pada tabung injeksi adalah dengan jalan menekan torak injeksi
secepatnya beberapa kali dan ujung jarum harus selalu berada di dalam cairan.
- Udara 1/10 dari volum maksimum dihisap lagi.
- Jarum bagian luar dibersihkan dengan kain yang tidak mudah lepas serat- seratnya.
- Cuplikan diinjeksikan dengan menusukkan jarum menembus septum, dan menekan
penghisap sampai ujungnya dengan gerakan yang cepat dan tidak terputus-putus, kemudian
tarik jarum keluar dari septum.
- Torak injeksi ditarik kembali sedikit dan lihat berapa banyak cairan yang masih tertinggal.
- Diameter kolom yang digunakan tetap diperhatikan dalam melakukan pemisahan agar sesuai
dengan batasan volum penyuntikan. Tabel berikut memperlihatkan hal itu.
Tabel : Batasan Volum Penyuntikan
Volum Injeksi
Diameter Kolom
Maksimum
100 l
20 l
0,1 l
Kolom
Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Bentuk dari kolom dapat lurus,
bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral. Biasanya bentuk dari kolom adalah
kumparan. Kolom ini dapat terbuat dari :
a
Alumunium
Gelas
Ada 2 jenis kolom tubuler terbuka, yaitu WCOT (Wall Coated Open Tubular Columns)
dan SCOT (Support Coated Open Tubular Columns).
Detektor
Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan dari
kolom secara terus-menerus, cepat, akurat, dan dapat melakukan pada suhu yang lebih tinggi.
Detektor harus dapat dipercaya dan mudah digunakan. Fungsi umumnya mengubah sifat-sifat
molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik kemudian arus listrik tersebut diteruskan ke
rekorder untuk menghasilkan kromatogram. Detektor yang diinginkan adalah detektor yang
mempunyai sensitifitas yang tinggi, noisenya rendah, responnya linear, dapat memberikan
respon dengan setiap senyawa, tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan
aliran dan juga tidak mahal harganya.
Detektor dalam GC digunakan untuk memunculkan sinyal listrik hasil elusi gas pembawa
dari kolom. Berbagai jenis detektor dibuat untuk melakukan deteksi. Tidak hanya berupa
variasi disain, tapi juga variasi sensitivitas dan selektivitas. Sensitivitas mengacu pada
kuantitas terkecil komponen campuran di mana sensitivitas menghasilkan sinyal yang masih
teramati. Sementara, selektivitas mengacu pada jenis senyawa di mana sinyalnya dapat
dimunculkan.
Detektor yang peka terhadap senyawa organik yang mengandung fosfor adalah FID, ECD,
dan FPD. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector ECD). Pada penetapan
ini, digunakan detektor penangkap elektron. Detektor ini merupakan modifikasi dari FID yaitu
pada bagian tabung ionisasi. Dasar dari ECD ialah terjadinya absorbsi e- oleh senyawa yang
mempunyai afinitas terhadap e- bebas (senyawa-senyawa elektronegatif). Dalam detektor gas
terionisasi oleh partikel yang dihasilkan dari 3H atau 63Ni. Detektor ini mengukur kehilangan
sinyal ketika analit terelusi dari kolom kromatografi. Detektor ini peka terhadap senyawa
halogen, karbonil terkoyugasi, nitril, nitro, dan organo logam, namun tidak peka terhadap
hidrokarbon, ketone, dan alkohol.
Tabel : Beberapa jenis detektor GC
Detectable compounds
Minimum detectable
(Selektivitas)
amount (Sensitivitas)
Jenis Detector
Thermal
Conductivity
10 ppm
Detector (TCD)
carrier gas
(10 ng)
Organic compounds
Ppm
(FID)
(0.1 ng)
Ppb
(ECD)
(0.1 pg)
1ppb (1 pg)
Flame
Thermionic
Detector (FTD)
Organic
phosphorous
organic sulfur
10 ppb
compounds
Flame
Photometric
Detector (FPD)
Inorganic,
compounds
(10 pg)
Inorganic,
organic
phosphorous compounds
Surface
Detector (SID)
Ionization
Polycyclic aromatics
1 ppb (1 pg)
Recorder (pencatat)
Recorder berfungsi sebagai pengubah sinyal dari detektor yang diperkuat melalui
elektrometer menjadi bentuk kromatogram. Dari kromatogram yang diperoleh dapat dilakukan
analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dengan cara membandingkan waktu retensi
sampel dengan standar. Analisis kuantitatif dengan menghitung luas area data. Sebuah rekorder
bekerja dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. di atas kertas tersebut
dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran detektor sehingga posisinya akan
berubah-ubah sesuai dengan dinamika keluaran penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah
sebuah kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi sampel dan
jenis detektor yang digunakan.
Rekorder biasanya dihubungkan dengan sebuah elektrometer yang dihubungkan dengan
sirkuit pengintregrasi yang bekerja dengan menghitung jumlah muatan atau jumlah energi
listrik yang dihasilkan oleh detektor. Elektrometer akan melengkapi pik-pik kromatogram
dengan data luas pik atau tinggi pik lengkap dengan biasnya.
Sistem data merupakan pengembangan lebih lanjut dari rekorder dan elektrometer dengan
melanjutkan sinyal dari rekorder dan elektrometer ke sebuah unit pengolah pusat
(CPU,Cent
ral
Procesing
Unit).
JENIS SAMPEL
Gas-liquid chromatography (GLC), atau sering disebut Gas Chromatography (GC) saja,
merupakan tipe umum kromatografi yang digunakan dalam kimia organik untuk memisahkan dan
menganalisa komponen yang bisa diuapkan (vaporised) tanpa terdekomposisi. GC dapat digunakan
untuk menentukan bahan non-halal dalam pangan serta untuk menganalisa toksik (zat racun) yang
dianggap sebagai bahan bukan-Toyyib.
Agar bisa sesuai untuk analisa GC, sebuah komponen harus cukup volatil dan stabil terhadap
panas. Jika semua atau sebagian molekul komponen berada pada fase gas pada 400-450 oC atau di
bawahnya, dan semuanya tidak terurai pada suhu tersebut, GC mungkin bisa dipakai untuk
menganalisa. Derivatisasi lipid dan asam lemak menjadi FAME, atau derivatisasi protein dengan
hidrolisis asam yang diikuti dengan esterifikasi (N-propyl esters) atau derivatisasi karbohidrat dengan
silytasi (silytation) untuk menghasilkan sampel volatil yang cocok untuk analisa GC.
GC biasa digunakan untuk menganalisa komposisi asam lemak. Lemak babi (lard) berbeda
dengan lemak sapi di dalam asam-asam lemak C20:0, C16:1, C18:3, dan C20:1, dan dengan ayam di
dalam asam-asam lemak C12:0, C18:3, C20:0, dan C20:1. Lemak babi dan ayam berbeda nyata dalam
hal komposisi disaturated dan triunsaturated triacylglycerols (TAGs). GC juga pernah digunakan
untuk melihat kontaminasi minyak sawit dengan enzymatically-randomized lard (ERLD).
METODE PREPARASI SAMPEL
DERIVATISASI
Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu senyawa menjadi senyawa lain
yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas
(menjadi lebih mudah menguap). Alasan dilakukannya derivatisasi:
Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa senyawa tidak
menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal puncak kromatogram saling tumpang
tindih) atau sampel yang dituju tidak terdeteksi, karenanya diperlukan derivatisasi sebelum
dilakukan analisis dengan GC.
Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama derivatisasi adalah untuk
meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatil).
Senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap karena
adanya gaya tarik-menarik inter molekuler antara gugus-gusug polar karenanya jika gugusgugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi akan mampu meningkatkan volatilitas
senyawa tersebut secara dramatis.
Inilah contoh derivatisasi yang digunakan untuk memperbaiki bentuk puncak pseudoefedrin:
Caranya:
Sirup dekongestan dibasakan dengan amonia dan diekstraksi ke dalam etil asetat sehingga akan
menjamin bahwa semua komponen yang terekstraksi berada dalam bentuk basa bebasnya daripada
bentuk garamnya. Bentuk basa inilah yang bertanggungjawab pada bagusnya bentuk puncak
kromatografi. Garam-garam atau basa-basa akan terurai karena adanya panas pada lubang suntik GC,
sehingga dengan adanya proses ini akan dapat menyebabkan terjadinya peruraian.
Jika ekstrak pada sirup dekongestan di lakukan kromatografi gas secara langsung maka
kromatogram yang dihasilkan seperti gambar dibawah. Basa bebas triprolidin dan dekstrometorfan
menunjukkan bentuk puncak yang bagus, akan tetapi pesudoefedrin yang merupakan basa yang lebih
kuat karena adanya gugus hidroksil dan gugus amin memberikan bentuk puncak yang kurang bagus.
Hal ini dapat diatasi dengan menutup gugus polar (gugus hidroksi dan amin) pada pseudoefedrin
dengan cara mereaksikannya menggunakan trifluoroasetat anhidrida (TFA). Perlakuan dengan TFA ini
tidak menghasilkan senyawa derivatif terhadap senyawa-senyawa basa tersier dalam ekstrak (sirup
dekongestan) ini. Reagen TFA ini sangat bermanfaat karena reagen ini sangat reaktif dan bertitik didih
rendah (400C) sehingga kelebihan reagen TFA ini mudah dihilangkan dengan cara evaporasi sebelum
dilakukan
kromatografi
gas.
Berikut ini merupakan kromatogram sebelum dilakukan derivatisasi :
METODE ANALISIS
Bila volum atau konsentrasi dari masing-masing komponen yang terpisah sudah tertentu, hal itu
disebut penentuan volumetrik (volumetric determination). GC didasarkan pada prinsip bahwa
komponen target yang terdeteksi adalah murni karena sudah dipisahkan dari komponen-komponen
lain dalam cuplikan. Bila pemisahan ini betul-betul sempurna, volumnya (konsentrasinya) dapat
ditentukan dengan tingkat keakuratan yang sangat tinggi.
Berikut 4 pokok metoda analisis (penentuan volumetrik) yang digunakan dalam GC:
1
Metoda pengaturan persentase luas permukaan (adjusted surface area percentage method)
Kelebihan
1
Dapat menggunakan kolom lebih panjang untuk menghasilkan efisiensi pemisahan yang
tinggi.
Kesetimbangan partisi antara gas dan cairan berlangsung cepat sehingga analisis relatif cepat
dan sensitifitasnya tinggi.
Pemakaian fase cair memungkinkan kita memilih dari sejumlah fase diam yang sangat
beragam yang akan memisahkan hampir segala macam campuran.
Kekurangan
1
Kromatografi gas tidak mudah dipakai untuk memisahkan campuran dalam jumlah besar.
Pemisahan pada tingkat [mg] mudah dilakukan, pemisahan pada tingkat [gram] mungkin
dilakukan, tetapi pemisahan dalam tingkat [pon] atau [ton] sukar dilakukan kecuali jika ada
metode lain.
Fase gas dibandingkan sebagian besar fase cair tidak bersifat reaktif terhadap fase diam dan
zat terlarut.
puncak sample dibagi luas standar internal pada ordinat dan bila ditarik garis sejajar absis memotong
garis regresi, selanjutnya ditarik garis sejajar ordinat maka akan memotong absis, pada titik potong
dengan absis inilah diketahui kadar sample.
Standar internal Syarat sebagai standar internal sama dengan syarat senyawa untuk dapat
dipakai sebagai standar eksternal. Cara kerja penetapan kadar menggunakan Standar internal adalah
sebagai berikut: Misalnya menambahkan standar internal (A) sebanyak 0,3786 gram kepada sample
(C) berat 0,5291 gram, campuran ini dilarutkan dalam pelarut yang sesuai hingga volume tertentu.
Kemudian 1 |il diinjeksikan dan dicatat luas puncak A dan C. Pada prinsipnya pada penetapan ini
adalah membandingkan dua senyawa berbeda. Satu diantaranya adalah diketahui beratnya. Respon
detektor akan berbeda untuk senyawa berbeda, jelasnya a gram senyawa A dan a gram senyawa B
tidak memberikan luas puncak yang sama. Oleh karena itu perlu adanya faktor koreksi. Perhitungan
faktor koreksi dapat dilihat pada Tabel berikut.
Senyawa
Berat
0,3786
Perbandinga
n Berat C/A
Luas Puncak
Berat C =
Perbandingan
Luas
1,345
0,962
4231
1,398
Perbandinga
n Luas
Puncak C/A
0,5291
5671
5671 x 0,3786
4231 x 0,962
= 0,5275
Ke dalam 2 (Dua) labu takar yang berisi sample ditambahkan metil salisilat murni (standar)
masing-masing 0,3 ml dan 0,6 ml.
Ke tiga labu ( berisi: sample, sample + 0,3ml metilsalisilat murni dan sample + 0,6 ml
metilsalisilat murni) diencerkan dengan isopropanol hingga tanda.
Selanjutnya dihitung kadar metil salisilat dalam sample dengan rumus dibawah ini. Dua kali
pengukuran, kadar dihitung rata-rata.
Cx =
hx .Cs
hx+ shx
Keterangan :
Cx = kadar (%vol sample)
Cs = % volume standar yang ditambahkan
hx = luas puncak sample
hx+s = luas puncak (sample + standar yang ditambahkan.
GC-MS
PENDAHULUAN
Gas Chromatography dan Gas Chromatography-Mass Spectrofotometric adalah dua alat yang
memliki detector yang berbeda, meskipun namanya berawalan Gas Chromatography. Detektor
yang berfungsi untuk mengubah sinyal-sinyal radiasi menjadi energy listrik yang kemudian dapat
dibaca oleh alat.
Untuk GC, menggunakan detektor Thermal Conductivity Detector (TCD) , TCD bekerja
dengan cara membandingkan konduktivitas panas dua aliran gas gas pembawa murni (rujukan) dan
sampel. Perubahan suhu pada kabel yang dipanaskan oleh listrik di dalam detektor dipengaruhi oleh
konduktivitas panas gas yang mengalir di sekelilingnya. Perubahan dalam konduktivitas panas ini
dideteksi sebagai perubahan resistansi listrik dan diukur. Yang hasil datanya berupa data kuantitatif.
Dan juga ada yang menggunakan detektor Flame Ionization Detector FID. FID biasanya
menggunakan api Hidrogen/Udara yang dilewati sampel untuk mengoksidasi molekul organik dan
menghasilkan partikel bermuatan listrik (ion). Ion dikumpulkan dan menghasilkan sinyal listrik yang
kemudian diukur. Yang hasilnya berupa data yang kuantitatif.
Sedangkan untuk alat GC-MS, menggunakan detektor berupa MS atau berkepanjangan Mass
Spectrometry. GC MS yang bekerja dengan menggabungkan 2 metode dari 2 alat. Yaitu, GC yang
secara umumnya berfungsi untuk memisahkan suatu senyawa dengan bantuan gas nitrogen, hidrogen,
dll. Sedangkan GC-MS kerjanya sama dengan GC, tetapi alat tersebut dilengkapi dengan pencacah
fragmen sehingga kita dapat mengetahui pemecahan ion fragmen senyawa dan dapat mengetahui
Berat Molekul senyawa yang di analisis. Misalnya H2O yang memiliki Berat Molekul = 18.Maka hasil
datanya adalah data kualitatif.
PRINSIP
GC-MS terdiri dari dua bagian yaitu gas chromatography (GC) dan mass spectrometry (MS)
yang masing-masing mempunyai fungsi berbeda. GC berfungsi untuk memisahkan senyawa-senyawa
dalam sampel. Pemisahan terjadi pada bagian kolom. Prinsip pemisahan berdasarkan perbedaan
tingkat volatilitas dari senyawa dan juga berdasarkan interaksi dengan fase diam (stationary phase).
Pada kolom diberlakukan gradien suhu danholding untuk mengoptimalkan proses pemisahan senyawa
tersebut.
Senyawa-senyawa yang sudah terpisah pada kolom GC, akan memasuki MS. MS terdiri dari
tiga bagian yaitu sumber ion, mass analyzer dan detektor. Senyawa yang masuk ke MS akan
mengalami ionisasi dan fragmentasi menjadi ion-ion fragmen. Ionisasi terjadi karena adanya elektron
yang berasal dari sumber ion.
Ion-ion fragmen akan memasuki mass analyzer dan akan dipisahkan berdasarkan nilai m/znya. Ion fragmen yang mempunyai nilai m/z kecil akan memasuki detektor lebih cepat dibandingkan
ion fragmen yang mempunyai nilai m/z besar. Output dari detektor berupa diagram hubungan antara
nilai m/z dengan intensitas relatif ion-ion fragmen dari suatu senyawa. Setiap senyawa mempunyai
pola m/z yang berbeda-beda, sehingga kita dapat mengidentifikasi suatu senyawa dengan
membandingkan dengan pola spektra yang ada pada library.
INSTRUMENTASI
1.
Gas Pengangkut
Gas pengangkut/ pemasok gas (carrier gas) ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi.
Biasanya tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat besar untuk digunakan
secara Iansung. Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
a. Harus inert, tidak bereaksi dengan cuplikan, cuplikan-pelarut, dan material dalam
kolom.
b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.
c. Sesuai/cocok untuk detektor.
d. Harus mengurangi difusi gas.
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon dioksida dan hidrogen.
Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah terbakar, tetapi sangat mahal. H 2 mudah terbakar,
sehingga harus berhati-hati dalam pemakaiannya. Kadang-kadang digunakan juga CO 2.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang digunakan. Tabung
gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan keluaran dan pengukur tekanan. Sebelum masuk ke
kromatografi, ada pengukur kecepatan aliran gas serta sistem penapis molekuler untuk memisahkan
air dan pengotor gas lainnya. Pada dasarnya kecepatan alir gas diatur melalui pengatur tekanan dua
tingkat yaitu pengatur kasar (coarse) pada tabung gas dan pengatur halus (fine) pada kromatografi.
Tekanan gas masuk ke kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur pada 10-50 psi (di atas
tekanan ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25-150 mL/menit pada kolom terpaket dan 1-25
mL/menit untuk kolom kapiler.
2.
Dalam kromatografi gas cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Gas dan uap dapat
dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan dan padatan.
Hingga dengan demikian senyawa yang berbentuk cairan dan padatan pertama-tama harus diuapkan.
Ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom.
Tempat injeksi dari alat GLC/KGC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu dari
tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini adalah batiwa suhu tempat
injeksi sekitar 50C lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang mempunyai titik didih
yang paling tinggi. Bila kita tidak mengetahui titik didih komponen dari cuplikan maka kita harus
mencoba-coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi dinaikkan. Jika puncak-puncak yang
diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan pertama terlalu rendah. Namun demikian suhu
tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi, sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau
penguraian dari senyawa yang akan dianalisa.
Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat injeksi.
Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang sering disebut "a gas tight syringe".
Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak, karena GC
sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kita mengadakan analisa 0,5
-50 ml untuk gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan seperti pada gambar di bawah.
3.
Kolom
Coulom, ada dua jenis kolom yang digunakan dalam GC. Yang pertama adalahkolom kemas,
yaitu berupa tabung yang terbuat dari gelas atau steinstless berisi suatu padatan inert yang dikemas
secara rapi. Kolom ini memiliki ukuran panjang 1,5-10 m dan diameter 2,2-4 nm.
Yang kedua adalah kolom kapiler, yang biasanya terbuat dari silica dengan lapisan
poliamida. Kolom jenis ini biasanya memiliki ukuran panjang 20-26 m dengan diameter yang sangant
kecil.
4.
Detektor
Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan dari
kolom secara terus-menerus, cepat, akurat, dan dapat melakukan pada suhu yang lebih tinggi. Fungsi
umumnya mengubah sifat-sifat molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik kemudian arus
listrik tersebut diteruskan ke rekorder untuk menghasilkan kromatogram. Detektor yang umum
digunakan:
a.
Detektor hantaran panas (Thermal Conductivity Detector_ TCD)
b.
Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector_ FID)
c.
Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector _ECD)
d.
Detektor fotometrik nyala (Falame Photomertic Detector _FPD)
e.
Detektor nyala alkali
f.
Detektor spektroskopi massa
Detector, yang paling umum digunakan dalam GC adalah detector ionisasi nyala (FID) dan
detector kondutivitas termal (TCD). Kedunya peka terhadap berbagai komponen dan dapat berfungsi
pada berbagai konsentrasi. Sementara TCD pada dasarnya universal dan dapat digunakan untuk
mendeteksi setiap komponen selain gas pembawa (selama konduktivitas mereka berbeda dari gas
pembawa, suhu detektor),dalam jumlah besar sensitif terutama untuk hidrokarbon. Sedangkan FID
tidak dapat mendeteksi air. TCD adalah detector non-destruktif, sedangkan FID adalah detector
destruktif. Biasanya detector ini akan dihubungkan dengan Spektrokopi Masa, sehingga akan menjadi
rangkaian alat GC-MS. Adapun salah satu bentuk dari FID adalah sebagai berikut :
5.
Oven kolom
Kolom terletak didalam sebuah oven dalam instrumen. Suhu oven harus diatur dan sedikit
dibawah titik didih sampel. Jika suhu diset terlalu tinggi, cairan fase diam bisa teruapkan, juga sedikit
sampel akan larut pada suhu tinggi dan bisa mengalir terlalu cepat dalam kolom sehingga menjadi
terpisah
.
6.
Recorder
Rekorder berfungsi sebagai pengubah sinyal dari detektor yang diperkuat melalui
elektrometer menjadi bentuk kromatogram. Dari kromatogram yang diperoleh dapat dilakukan
analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dengan cara membandingkan waktu retensi
sampel dengan standar. Analisis kuantitatif dengan menghitung luas area maupun tinggi dari
kromatogram. Sinyal analitik yang dihasilkan detektor disambungkan oleh rangkaian elektronik
agar bisa diolah oleh rekorder atau sistem data.
Sebuah rekorder bekerja dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. di atas
kertas tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran detektor sehingga posisinya
akan berubah-ubah sesuai dengan dinamika keluaran penguat sinyal detektor. Hasil rekorder adalah
sebuah kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang sesuai dengan kondisi sampel dan jenis
detektor yang digunakan.
Ada beberapa detektor yang dapat digunakan dalam kromatografi gas. Detektor yang berbeda
akan memberikan berbagai jenis selektivitas. Detektor non selektif merespon senyawa kecuali gas
pembawa, Detektor selektif meresponi berbagai senyawa dengan sifat fisik atau kimia umum dan
detektor khusus menanggapi suatu senyawa kimia tunggal. Detektor juga dapat dikelompokkan ke
dalam concentration dependant detectors and mass flow dependant detectors.
Sinyal dari concentration dependant detectors terkait dengan konsentrasi zat terlarut dalam
detektor, dan biasanya Pengenceran sampel akan menurunkan respon detektor. Mass flow dependant
detectors biasanya menghancurkan sampel, dan sinyal tersebut tergantung dengan laju di mana
molekul-molekul zat terlarut menuju ke detektor.
Ini meliputi alat untuk memasukan cuplikan, mikromanometer untuk menentukan jumlah
cuplikan yang masuk, alat (lubang molekul) pengukur cuplikan yang masuk ruang pengionan serta
sistem pemompaan. Pemasukan gas biasanya mudah, pemindahan dari dari tabung ke alat meter lalu
ke ruang pengionan. Cairan dimasukan dengan menyentuh pipet mikro ke piringan gelas sintered
atau lubang tertentu terbuat dari air raksa atau galium atau dengan suntikan jarum hipodermis. Tabung
berisi cupikan dipompa dengan es kering (dry ice), lalu dihangatkan untuk menguapkan cuplikan ke
sistem masukan (inlet). Sistem masukan yang dipanaskan dipakai untuk cairan secara langsung ke
ruang pengionan mengurangi batasa yang disebabkan oleh keatsirian dan kemantapan termal.
Teknik pemasukan langsung ini mengurangi derajat keatsirian yang diperluakn untuk analisis.
Karena pengionan berlangsung dalam keadaan uap, memang masih diperlukan sedikit derajat
keatsirian dan kemantapan termal tertentu. Pola pemecahan molekul terulang dapat dicapai bagi
berbagai senyawa berbobot molekul tinggi seperti terpenoid, steroid, polisakarida, peptida, dan
alkaloid. Bahkan dengan teknik-teknik khusus ini, senyawa harus mantap pada suhu tatkala tekanan
uapnya pada sekitar harga 10-7 hingga 10-6 Torr. Untuk cairan dan padatan berkisar dari harga berapa
miligram hingga kurang daripada saru mikrogram, tergantung pada cara pemasukan serta detektornya.
2.
Aliran gas dari lubang molekul masuk ke dalam ruang pengionan (berkerja pada tekanan 10-6
hingga 10-5 Torr) dan disini ditembaki pada arah tegak lurus oleh berkas elektron dari suatu filamen
panas. Ion-ion positif yang terbentuk karena antaraksi berkas elektron itu terdorong lewat lubang (slit)
pemercepat oleh suatu medan elektrostatik lemah antara penolak (repeller) dan lubang pemercepat
pertama tadi. Kemudian suatu medan elektrostatik kuat antara lubang pemercepat pertama dan kedua
tadi makin mempercepat laju layangan ion-ion tersebut. Diantara lubang-lubang mempercepat tadi
juga dialakukan pumpun tambahan.
Untuk memperoleh spektrum, medan magnet pada tabung penganalisis atau tegangan
pemercepat antara lubang pertama dan kedua diubah-ubah. Dengan demikian ion-ion secara berurutan
dipumpun ke lubang pengumpul sebagai fungsi massa. Pada kebanyakan radas, sapuan dari massa 12
sampai massa 500 dapat dialkukan hanya dalam waktu 1 hingga 4 menit. Meskipun demikian, laju
sapuan sampai beberapa detik saja digunakan untuk memperoleh spektra fraksi-fraksi kromatografi
gas.
3.
Pengumpul ion terdiri atas satu atau lebih lubang pengumpul (kolimasi) serta satu atau lebih
lubang pengumpul (kolimasi) serta suatu silinder Faraday, berkas ion menumbuk pengumpul dalam
arah tegak lurus, kemudian isyarat diperkuat oleh suatu pengganda elektron.
5.
Pencatat
Pencatat yang digunakan secara luas memakai lima buah galvanometer terpisah yang
mencatat serentak. Penentuan massa dari puncak-puncak catatan spektrum dapat menimbulkan
masalah pada ujung massa yang tertingi sapuannya. Yang biasa dilakukan ialah memulai seimakan
dari ujung massa yang rendah sapuannya, yang dapat ditepatkan letaknya secara teliti, lalu
menghitung puncak-puncak hingga puncak terakhir yang tercatat.
Hal ini acap kali dapat dilakukan dilakukan karena galvanometer yang paling peka akan
mencatat sedikit arus ion pada tiap satuan massa. Kadang-kadang puncak-puncak pada ujung setinggi
spektrum tampak melebar hingga tidak terbedakan dengan latar belakang, jika hal ini terjadi, senyawa
baku perlu ditambah ke dalam cuplikan. Beberapa radas dilengkapi dengan penanda massa otomatik
tetapi sering kurang terpercaya justru di daerah ujung tinggi spektrum yang sangat penting dan
diperlukan. Pen digit yang mencantumkan bilangan massa serta sekuat- kuat puncak nisbi di layar
merupakan peralatan tambahan yang amat berfaedah. Meskipun demikian dapat terjadi penyimpangan
yang menyebabkan berkurang dan berlebihnya satuan massa penuh dalam suatu sapuan hali ini tentu
mencek pendigit terhadap letak simpangan galvanometer
JENIS SAMPEL
Secara umum, penggunaan metode GCMS hanya terbatas untuk senyawa dengan tekanan uap
berkisar10 10 torr. Kebanyakan senyawa dengan tekanan lebih rendah hanya dapat dianalisis jika
senyawa tersebut merupakan senyawa turunan (contoh , trimetilsili eter). Penentuan penentuan gugus
fungsional pada cincin aromatic masih sulit. Untuk senyawa isomer tidak dapat dibedakan oleh
spketometer (sebagai contoh : naftalena vs azulena), tapi dapat dipisahkan dengan kromatograpi.
METODE PREPARASI SAMPEL
Keadaan sampel harus dalam keadaan larutan untuk diijeksikan ke dalam kromatografi.
Pelarut harus bersifat volatile dan organic (sebagai contoh heksana atau dikllorometana). Jumlah
sampel bergantung pada metode ionisasi yang dilakukan, biasanya yang sering digunakan untuk
analisis sensivitas adalah sebesar 1 100 pg per komponen.
METODE ANALISIS
GCMS digunakan untuk identifikasi kualitatif dan pengukuran kuantitatif dari komponen
individual dalam senyawa campuran kompleks. Terdapat perbedaan strategi analisis data untuk
aplikasi keduanya.
METODE PENGOLAHAN DATA HASIL ANALISIS
Derivatisasi dan Analisis Asam Amino dengan GC-MS
(Katherine K. Stenerson, Reporter US Volume 25,3)
Biasanya, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) digunakan untuk analisis asam amino.
Namun, GC juga dapat digunakan, dan dalam beberapa kasus ketersediaan instrumentasi atau operasi
biaya dapat membuat pilihan yang lebih baik. Sifat polar asam amino memerlukan derivatisasi
sebelum analisis GC. Tujuan dari derivatisasi adalah untuk membuat suatu analit lebih tidak stabil,
kurang reaktif, dan dengan demikian meningkatkan perilaku kromatografi nya. Dalam kasus asam
amino, derivatisasi menggantikan hidrogen aktif di OH, NH2, dan kelompok-kelompok fungsional
polar SH dengan bagian nonpolar.
Sililasi adalah teknik derivatisasi yang sangat umum, dan berguna untuk berbagai senyawa.
Kerugian utama dari metode ini adalah kepekaan terhadap kelembaban. Kehadiran hasil kelembaban
dalam hasil reaksi yang buruk dan ketidakstabilan analit diderivatisasi. Untuk studi ini, kami
mengevaluasi penggunaan sililasi reagen N-tert-butyldimethylsilyl- N-methyltrifluoroacetamide
(MTBSTFA) untuk derivatisasi asam amino. MTBSTFA, membentuk tert-butyl dimethylsilyl
(TBDMS) derivatif ketika direaksikan dengan kelompok fungsional polar yang mengandung hidrogen
aktif:
Eksperimental
Sebuah alikuot 50 uL larutan yang mengandung campuran asam L-amino pada 91 ug / mL di 0,1
N HCl dikeringkan, dan 100 uL rapi MTBSTFA, diikuti oleh 100 uL asetonitril, ditambahkan.
Campuran dipanaskan pada 100 C selama 4 jam. Sampel kemudian dinetralkan dengan natrium
bikarbonat dan sasaran analisis GC-MS pada nomor pembayar 20 m x 0,18 mm x 0,18 m SLB
-5ms kolom kapiler.
Hasil
Sebuah kromatogram derivatif TBDMS dari asam amino disajikan pada Gambar 2. Data spektral
diperoleh dari puncak membantu dalam identifikasi turunan asam amino. Penggantian dari hidrogen
aktif dengan kelompok TBDMS menambah 114 dengan berat molekul. Elektron dampak spektrum (2)
dari derivatif ini mengandung fragmen khas sesuai dengan berat molekul yang kurang CH3 derivatif
(M-15), C4H9 (M-57), C4H9 + CO (M-85), dan CO-O-TBDMS (M-159). Gambar 3 menunjukkan
contoh pola fragmentasi ini dalam spektrum TBDMS-valin.
Gambar 3. Mass Spectrum dari TBDMS Derivatif dari valine (MW dari turunan = 345)
Pada kondisi reaksi yang digunakan, sebagian besar asam amino menghasilkan satu turunan,
dengan hidrogen aktif di hidroksil, amina, dan kelompok tiol (dalam kasus sistein) digantikan oleh
TBDMS. Beberapa asam amino yang dihasilkan beberapa derivatif, khususnya asparagin, glutamin,
dan triptofan. Dalam kasus asam amino, modifikasi dalam kondisi reaksi, seperti, menurunkan suhu
atau mengubah waktu reaksi, dapat mencegah hal ini (3) terjadi. Misalnya, meningkatkan waktu
reaksi dari 2 sampai 4 jam mengakibatkan respon peningkatan bentuk sepenuhnya diderivatisasi
triptofan.
Sementara TBDMS derivatif yang lebih stabil dari turunan TMS tradisional, berat molekul
yang lebih tinggi mengakibatkan waktu elusi lagi selama analisis GC. Untuk menyeimbangkan ini,
pemisahan dilakukan pada, kolom kapiler yang sempit bore singkat. Suhu mulai tidak lebih tinggi dari
100 C diperlukan untuk menjaga resolusi glisin puncak turunan dari pelarut. Sebuah jalan cepat
untuk 360 C setelah elusi turunan sistin dilakukan untuk memastikan kolom bersih untuk analisis
selanjutnya.
Kesimpulan
Studi ini menunjukkan bahwa dengan penggunaan yang tepat dari reagen derivatisasi seperti
MTBSTFA, asam amino dapat dianalisis dengan GC-MS. Kondisi reaksi mungkin harus "tweak"
untuk menghasilkan respon maksimum turunan dari bunga. Derivatif menghasilkan fragmen
karakteristik, yang memungkinkan untuk memudahkan identifikasi oleh MS. Untuk mengurangi
waktu analisis GC keseluruhan derivatif ini, pendek, sempit kolom bore seperti nomor pembayar 20 m
x 0,18 mm x 0,18 m SLB-5ms dianjurkan
Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom
dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan
fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan
alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat
sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.
b. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara
kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah
hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilan atau oktasilana.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan
larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat
krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau
protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase
diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
c. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion
dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun
f.
Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat
spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap
sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada
sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran
yang sangat kompleks.
PRINSIP
Prinsip dasar HPLC
Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Adapun
prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom
maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit )
sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
(spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias) pada panjang gelombang tertentu, hasil yang
muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan
menggunakan integrator atau menggunakan personal computer (PC) yang terhubung online dengan
alat HPLC tersebut.
.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan
area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian yang
berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
INSTRUMENTASI
Instrumentasi HPLC terdiri dari fase gerak, pompa, injektor, kolom, detektor dan pengolah data.
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase
gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut
yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi
dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel
kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan
analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau
dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan
pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi
campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase erak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase
normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan
pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase
normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik
Fase gerak (eluen) berupa zat cair. Fase gerak selain sebagai pembawa senyawa campuran menuju
detektor, fase gerak juga dapat berinteraksi dengan solut-solut. Beberapa persyaratan HPLC antara
lain :
Harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan dianalisis
Zat cair harus murni dan jernih untuk menghindari kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatogram dan menghindarkan penyumbatan kolom
Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
Memiliki viskositas rendah
Sesuai dengan detektor yang digunakan
Pompa dianalogikan sebagai jantung, berfungsi mengalirkan fase gerak cair melalui
kolom.
1.2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk
pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya
mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase
gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan
konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
1.3. Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir
di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat
dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu
mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks
bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan
mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
Stabil dalam pengopersiannya.
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran
dinamis linier).
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor
seperti berikut :
Detektor
Sensitifitas
(g/ml)
Kisaran
linier
Karakteristik
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometerphoto-diode array
5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10
104
105
105
Fluoresensi
10-12
104
Indeks bias
5 x 10-7
104
Elektrokimia
Konduktimetri
10-8
104
Amperometri
10-12
105
JENIS SAMPEL
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industry farmasi dan pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan
dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
Prosedur Kerja
Metanol disaring dengan PTFE dan air disaring dengan selulosa nitrat. Lalu dicampur masing-masing
dengan perbandingan 75:25 dengan volume total sebanyak 500 mL.
Selain itu, baik dalam pembuatan larutan induk parasetamol, larutan standar parasetamol maupun
sampel harus dihomogenkan, supaya larutan benar-benar bercampur sempurna (merata). Larutan
standar dan sampel juga harus didegassing untuk menghilangkan gas-gas yang kemungkinan ada
dalam larutan tersebut. Hal itu dilakukan karena gas dapat mengganggu baseline pada kromatogram,
sehingga peak yang dihasilkan tidak sesuai.
Akibat perbedaan interaksi antara solut dengan fasa gerak dan fasa diam yang terjadi mulai dari
kolom sampai terdeteksi oleh detektor, maka hasil yang diperoleh adalah dalam bentuk kromatogram
yang diperlihatkan oleh rekorder. Deret larutan standar yang dibuat mulai dari konsentrasi 25, 50, 75,
100 dan 125 ppm
Luas Area
Waktu
retensi
25
2488335
1,51
50
4126411
1,50
75
6744285
1,51
100
8901360
1,51
125
10667748
1,51
Analisis terhadap cuplikan atau sampel obat dilakukan setelah semua deret larutan standar
telah dianalisis. Sampel diinjeksikan sebanyak 2 kali injeksi untuk memperoleh luas area rata-rata
yang nantinya akan digunakan untuk menghitung kadar parasetamol yang terdapat dalam sampel obat
tersebut.
Berikut tabel data sampel yang diperoleh:
Data Sampel
Penginjeksian 1
Area
Peak 1
1,51
7762424
Peak 2
2,31
13143
0,06
7100
Penginjeksian 2
Peak 1
Peak 2
0,26
57665
Peak 3
1,51
7777816
Peak 4
2,30
6844
DAFTAR PUSTAKA
http://nakhdiahsaisal.blogspot.co.id/2011/12/kromatografi-cair-kinerja-tinggi-hplc.html
http://www.omjarjit.xyz/2013/11/prinsip-dasar-dan-prinsip-kerja-hplc.html
https://arycho.wordpress.com/2012/04/08/53/
http://pustaka.unpad.ac.id/wp-content/uploads/2009/12/diktat_pelatihan_hplc_2007.pdf
http://noviechemist.blogspot.co.id/2013/01/laporan-praktikum-hplc.html
http://dhiajenglarasati.blogspot.co.id/2012/12/perbedaan-gc-dan-gc-ms.html
https://www.scribd.com/doc/211146191/Laporan-GCMS
http://fuadrofiqi.blogspot.co.id/2012/02/definisi-instrumentasi-prinsip-kerja.html
http://sonyaljazary.blogspot.co.id/2013/02/kromatografi-gas-spektrometer-massa-gc.html
Giwangkara S, EG. 2007. Spektroskopi Infra Merah
http://www.chem-is-try.org/
Giwangkara S, EG., 2006, Aplikasi Logika Syaraf Fuzzy Pada Analisis Sidik Jari Minyak Bumi
Menggunakan Spetrofotometer Infra Merah Transformasi Fourier (FT-IR), Sekolah Tinggi Energi
dan Mineral, Cepu Jawa Tengah
Hendayana, S, Kadarohman, A, Sumarna, AA, and Supriatna A. 1994.Kimia Analitik Instrument.IKIP
Semarang Press. Semarang.
Silverstein. 2002. Identification of Organic Compund, 3rd Edition. John Wiley & Sons Ltd. New
York.
http://www.id.wikipedia.org/
http://yayanakhyar.wordpress.com/spektroskopi-inframerah-dekat/
http://pikanurropiah88.mhs.unimus.ac.id/files/2012/07/kromatografi-gas1.pdf
http://eskrimsandwich.blogspot.com/2013/05/gas-kromatografi.html
http://www.sodiycxacun.web.id/2010/01/kromatografi-gas.html
http://yi2ncokiyute.blogspot.com/2010/12/kromatografi-gas.html
http://apryshinsetsuboy.blogspot.com/2010/12/kromatografi-gas-dan-aplikasinya-pada.html
http://ariffadholi.blogspot.com/2009/10/oleh-najiullah-2007-kromatografi-gas-i.html
http://sanagory.blogspot.com/2012/02/sejarah-kromatografi.html
http://kuliahitukeren.blogspot.com/2011/01/sejarah-penemuan-dan-perkembangan-alat.html
http://helnidanainggolan.blogspot.com/2012/12/v-behaviorurldefaultvmlo.html
http://www.sodiycxacun.web.id/2010/01/kromatografi-gas.html
http://asisulkimia.blogspot.com/p/kromatografi-gasasisul.html
https://www.academia.edu/4968980/KROMATOGRAFI_GAS_GAS_CHROMATOGRAPH Y_GC_
http://bisontampan.blogspot.com/2013/04/gas-kromatografi.html
http://rachmakimhunter.blogspot.com/p/kimia-analitik.html http://www.batan.go.id/ptbn/php/pdfpublikasi/Urania-Old-PDF/urania_23_24_pdf/1_PENGENALAN%20ALAT%20BAMBANG
%20W.pdf
http://echechemis308.blogspot.com/2012/02/makalah-analisis-instrumen.html
http://wocono.files.wordpress.com/2013/03/gc.jpg
http://1.bp.blogspot.com/_jKTWR6_fBgg/TRR0FrmsULI/AAAAAAAAABE/uQpeWNGQu
3w/s1600/kolom+packing.jpg http://www.chem-is-try.org/wp-content/uploads/2010/09/gambar18.4.jpg http://laskarvck.wordpress.com/kromatografi-gas/
http://www.scribd.com/doc/125576169/Kromatografi-Dan-Aplikasinya-Pada-Bidang- Lain#download
http://rachmakimhunter.blogspot.com/p/kimia-analitik.html
http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/april2001/mmiller.html http://mdn.mainichimsn.co.jp/national/news/20070109p2a00m0na026000c.html
http://www.tosohbioscience.com/biohome.html
http://www.metrohm-peak.com/ http://www1.dionex.com/en-us/index.html
http://www.krict.re.kr/english/e_equip/e_equ_a00.php