Dokumen - Tips - Tugas Bioproses Enzim Deaktivasi Termal Enzim
Dokumen - Tips - Tugas Bioproses Enzim Deaktivasi Termal Enzim
Suatu kriteria penting untuk kinetika enzim adalah enzim stabil atau
steady state sepanjang waktunya dimana aktivitasnya diuji. Dimana laju suatu
reaksi sesuai dengan hukum Arnhenius dengan laju reaksi meningkat dengan
meningkatnya temperatur, sedangkan aktivitas enzimatik berkurang pada paparan
sampai ke temperatur yang lebih tinggi untuk suatu periode waktu yang
berlangsung lama. Hilangnya aktivitas enzimatik menunjukkan perubahan dalam
konformasi enzim dimana ikatan disulfida dan interaksi antara domain hidrofobik
yang terganggu, dan enzim telah mengalami denaturasi.
Ilmu tentang mekanisme deaktivasi protein telah dipelajari melalui ilmu
rekayasa protein. Meskipun semua hukum ataupun aturan mengenai protein
folding belum sepenuhnya dipahami, kestabilan atau ketunakan protein dengan
functions yang ada dapat direkayasa (Branden and Tooze 1991). Sebagai contoh,
kestabilan oxidatif subtilisin, suatu protease alkalin yang diperoleh dari Bacilluss
spp yang dapat digunakan aditif detergen untuk menghilangkan ikatan protein dari
pakaian telah dikembangkan melalui rekayasa protein. Subtilisin Bacillus
amyloliquefaciens asli adalah suatu protease yang terdiri dari 275 asam amino
dengan serin pada sisi aktifnya (active site). Rekayasa protein telah digunakan
untuk menggantikan metionin dengan leucine pada posisi asam amino 222. Varian
leucine 222 telah ditemukan akan stabil dengan adanya 0,3% H 2O2 dimana
subtilisin asli dengan metionin 222 sangat sensitif pada kondisi yang sama
(Gambar 1)
Gambar 1. Stabilitas oksidatif subtilisin dengan perbandingan antara wild type dan
leu-22. Wild type subtilisin dicampur dengan 0,3% H2O2 Tris buffer
(pH 8,60. Sampel diambil untuk diindikasi pada berbagai waktu dan
diperiksa untuk aktivitas enzimnya
Hanya terdapat perbedaan kecil dalam total energi antara struktur lipatan
protein dan sejumlah besar yang perbedaan, struktur cepat antar lipatan
mengkonversi (Branden dan Tooze 1991). Branden dan Tooze menyajikan sebuah
studi kasus untuk lysozyme dari bakteriofag T4, di mana teknik rekayasa protein
oleh Brian Mathews dan Eugene dari Universitas Oregon, mengungkapkan
beberapa faktor yang penting untuk stabilitas protein. Entropi dari struktur yang
tidak terlipat disukai karena jumlah yang besar struktur.
Oleh karena itu, bagian yang terlipat harus mengimbangi ini
melalui berbagai jenis interaksi kimia dan fisik, termasuk interaksi hidrofobik
yang membawa rantai samping hidrofobik dari pelarut untuk interior
dari protein, ikatan spesifik hidrogen, interaksi elektrostatik, dan crosslink kovalen
melalui ikatan S - S. Seperti ringkasan oleh Branden dan Tooze (1991,
p. 256): Pengamatan
perbedaan yang kecil, sekitar 5 sampai 15 kkal / mol, antara energi total lipatan
dan bagian yang tak terlipat, yang masing-masing berada di urutan 10 juta kkal /
mol. Oleh karena itu,
perhitungan dari prinsip first order, yang membutuhkan tidak hanya energi yang
struktur yang mungkin dari keduanya dalam bentuk terlipat dan tidak terlipat
pada rantai polipeptida. "Perbedaan ini dapat diukur dengan penelitian
kalorimetrik untuk menentukan perbedaan energi, dan dichroism sircular untuk
mengikuti perubahan konformasi protein ketika protein dipanaskan atau terkena
agen denaturasi dan pada titik leleh. Perbedaan dari 1 0C dalam suhu titik leleh
sesuai dengan perbedaan dalam stabilitas energi sekitar 0,5 kkal / mol.
pers. 7.7
= time konstan
Hal ini ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim pada pH tertentu, setelah
enzim telah terpapar atau terekspos pada temperaur yang dipilih. Sebuah
gambaran umum kurva deaktivasi diilustrasikan untuk -glukosidase pada
Gambar. 7.15. Basis pada plot ini, pengujian enzim dilakukan pada temperatur 50
0
C.
Waktu paruh (half-life) adalah waktu yang telah berlalu sesuai dengan
Dimana
t 0, 5
0,69315
t 0,5
0,69315
atau
pers 7.8
Dalam
pers 7.9
Dimana k1 dan k2 adalah waktu konstan deaktivasi (min -1), 1 = E1/E dan
2 = E2/E (Barclay et al 1990;. Henley dan Sandana 1984, 1985, 1986). E, E1, dan
E2 mewakili tiga bentuk aktivitas enzimatik mana aktivitas intrinsik dari ketiganya
mengikuti bentuk E>E1>E2 dan kemungkinan menggambarkan pemisahan
tetramer menjadi monomer sebagai adanya peningkatan pH dari pH 4,0 sampai
pH 7,0.
Keseluruhan aktivitas fraksional yang tersisa, = E+ (t)/E, hasil dari ketiga
bentuk enzim dimana ditunjukkan sebagai berikut:
E+ = E(t)+E1(t)+E2(t)
pers. 7.10
1 k1
k
k1
E (t )
( 1 2 )e ( k1t )
1
2 2 e ( k1t ) 2
E
k
k
k
k
k
k
2
1
2
1
2
1
pers 7.11
Jika E2 mewakili inaktif enzim (2 = 0), maka aktivitas fraksional a adalah:
1 k1
k
k1
( 1 2 )e ( k 2t )
2 2 e ( k1t )
k
k
k
k
k
k
2
1
2
1
2
1
pers 7.12
E (t )
e ( k1t )
E
pers 7.13
1 e ( k1t ) 1
pers 7.14
Kembali ke contoh