BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

A. Desain Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental. Penelitian
eksperimen adalah suatu penelitian dengan melakukan kegiatan percobaan
yang bertujuan untuk mengetahui gejala atau pengaruh yang timbul,
sebagai akibat dari adanya perlakuan tertentu atau eksperimen tersebut
(Notoatmodjo, 2010).
B. Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Lokasi Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Obat Tradisional Fakultas
Farmasi Institut Ilmu Kesehatan Kediri dan Laboratorium Bakteriologi
Fakultas Analis Kesehatan.
2. Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan bulan Maret sampai bulan Juni 2016.
C. Populasi, Sampel, dan Teknik Sampling
1. Populasi
Populasi adalah seluruh objek atau data dengan karakteristik
tertentu yang akan diteliti. Populasi penelitian adalah kulit buah
mangga (Mangifera indica L.) (Notoatmodjo, 2010).
2. Sampel Penelitian
Sampel adalah bagian dari populasi yang akan diteliti. Sampel
penelitian kulit buah mangga varietas podang urang (Mangifera indica
L.) (Notoatmodjo, 2010).
3. Teknik Sampling
Penelitian pengambilan sampel dilakukan secara acak atau random
sampling. Teknik random sampling digunakan apabila setiap unit
anggota populasi bersifat homogen atau diasumsikan homogen. Hal ini

35

36

berarti setiap anggota populasi mempunyai kesempatan yang sama

untuk diambil sebagai sampel (Notoatmodjo, 2010).
D. Variabel Penelitian
1. Variabel independent (bebas)
Variabel independent adalah variabel yang mempengaruhi variabel
dependent. Variabel independent dalam penelitian ini adalah ekstrak
kulit buah mangga podang urang (Mangifera indica L.) dengan
konsentrasi 10%, 25% dan 50% (Notoatmodjo, 2010).
2. Variabel dependent (terikat)
Variabel dependent adalah variabel yang dipengaruhi oleh variabel
independent. Variabel dependent dalam penelitian ini adalah daya
hambat antibakteri ekstrak kulit buah mangga podang urang
(Mangifera indica L.) (Notoatmodjo, 2010).
3. Variabel Confounding (Variabel Penggangu)
Variabel penggangu adalah variabel yang mengganggu terhadap
hubungan antara variabel bebas dan variabel terikat. Variabel
pengganggu dalam penelitian ini adalah kepekatan inokulum, waktu
penanaman kertas cakram, suhu inkubasi, waktu inkubasi, ukuran
lempeng, ketebalan media agar dan pengaturan jarak cakram
antimikroba, komposisi media, dan konsentrasi ekstrak kulit buah
mangga podang urang yang digunakan.
E. Definisi Operasional Variabel
No

Variabel

Ekstrak kulit
buah mangga
podang urang
(Mangifera
indica L.)

Tabel IV.1 Definisi Operasional Variabel

Definisi Operasional
Alat ukur
Skala
ukur
Kulit buah mangga
Timbangan
Rasio
yang telah diekstraksi
analitik
dengan cara maserasi

Hasil ukur
Jumlah
larutan
sesuai
konsentrasi

37

Zona hambatan
Staphylococcus
aureus

Daerah sekeliling
kertas cakram yang
bening/ tidak
ditemukan adanya
pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus

Jangka
sorong

Rasio

Diameter
zona
hambatan
(mm)

F. Instrumen Penelitian
1. Alat dan Bahan
a. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan
analitik, beaker glass, erlenmeyer, gelas ukur, cawan porselin,
pipet, spatel, tabung reaksi, cawan petri, jarum ose, pinset, bunsen,
oven, autoklaf, inkubator, kertas cakram kosong steril, jangka
sorong, inkase dan waterbath.
b. Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian antara lain ekstrak
kulit buah mangga podang urang (Mangifera indica L.). Bahan uji
yang digunakan meliputi: etanol 95%, etanol 70%, media NB
(Nutrient Broth), media MH (Mueller Hinton), Tetrasiklin cakram,
reagen Lieberman-Burchard, reagen Mayer, reagen Dragendroff,
aquades, HCl 2N, HCl, amilalkohol, FeCl 3, heksana, serbuk Mg,
PZ, kloroform, asam asetat, H2S04 pekat.
2. Bakteri uji
Bakteri yang digunakan adalah bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923.
G. Proses Pengumpulan Data
1. Prosedur penelitian
a. Identifikasi dan determinasi bahan awal
Determinasi tanaman mangga (Mangifera indica L.)
dilakukan di Institut Ilmu Kesehatan Bhakti Wiyata Kediri.

38

Determinasi bertujuan untuk mengetahui secara pasti tanaman

yang akan digunakan sebagai bahan uji.

b. Persiapan bahan awal

1) Pembuatan ekstrak kulit buah mangga
Buah mangga diperoleh di pasar lokal kota Kediri. Mangga
dicuci bersih, lalu dikupas kulitnya. Kulit buah mangga
dikeringkan dengan cara diangin-anginkan sampai kering. Kulit
buah yang telah kering dihaluskan dengan menggunakan
blender. Serbuk simplisia kulit buah mangga sebanyak 100
gram kemudian diekstraksi dengan menggunakan metode
maserasi dengan pelarut etanol 95% sebanyak 1000 ml.
Ekstraksi ini dilakukan pada suhu ruangan selama 3 hari.
Ekstrak kemudian disaring dengan kertas saring Whatman no.1.
Filtrat yang diperoleh lalu dipekatkan dengan menggunakan
waterbath pada suhu 40 (Doughari et al, 2008).
c. Uji Bebas Etanol
Uji bebas etanol ekstrak maserasi dilakukan dengan cara
esterifikasi etanol. Ekstrak ditambahkan dengan asam asetat dan
asm sulfat pekat kemudian dipanaskan, bila tidak ada bau ester
berarti ekstrak sudah tidak terdapat etanol (Depkes RI, 1987).
d. Identifikasi fitokimia
1) Saponin
Uji saponin dilakukan dengan metode Forth yaitu dengan
cara memasukkan 2 ml sampel kedalam tabung reaksi
kemudian ditambahkan 10 ml aquades lalu dikocok selama 10

39

detik, diamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa

yang mantap (tidak hilang selama 10 menit, setinggi 1-10 cm)
maka identifikasi menunjukkan adanya saponin (Simaremare,
2014).
2) Tanin
Larutan uji sebanyak 1 ml direaksikan dengan besi (III)
klorida (FeCl3) 1%, jika terjadi warna biru tua atau hitam
kehijauan menunjukkan adanya tanin (Robinson, 1995).
3) Senyawa fenolik
Sebanyak 2 ml ekstrak ditambahkan dengan 10 ml aquades
lalu dididihkan selama 10 menit dalam tangas air mendidih.
Larutan kemudian disaring dan filtratnya ditambahkan dengan
3 tetes FeCl3 1%. Terjadinya warna hijau, merah, ungu, biru
atau hitam kuat menunjukkan adanya fenolik (Harborne, 1987).
4) Flavonoid
Sampel sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung
reaksi kemudian ditambahkan 10 ml aquades panas dan
dididihkan selama 5 menit, setelah itu dimasukkan ke dalam
tabung reaksi lalu ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 1 ml HCl
pekat, dan 1 ml amilalkohol kemudian dikocok dengan kuat.
Uji positif flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna
merah, kuning, atau jingga pada lapisan amilalkohol (Marliana
et al, 2005).
5) Alkaloid
Larutan uji sebanyak 2 ml diuapkan di atas cawan porselin.
Residu yang dihasilkan kemudian dilarutkan dengan 5 ml HCl
2N. Larutan yang diperoleh dibagi ke dalam 3 tabung reaksi.

40

Tabung pertama ditambahkan 3 tetes HCl 2N yang berfungsi

sebagai blangko. Tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi
Dragendorff dan tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi
Mayer. Terbentuknya endapan jingga pada tabung kedua dan
endapan kuning pada tabung ketiga menunjukkan adanya
senyawa alkaloid (Padmasari et al, 2013).
6) Uji Terpenoid dan Steroid
Pemeriksaan terpenoid dan steroid dilakukan dengan reaksi
Liebermann-Burchard. Larutan uji sebanyak 2 ml diuapkan
dalam cawan porselin. Residu dilarutkan dengan 0,5 ml
kloroform, kemudian ditambahkan 0,5 ml asam asetat anhidrat.
Asam sulfat pekat sebanyak 2 ml ditambahkan melalui dinding
tabung. Terbentuk cincin berwarna kecoklatan atau violet pada
perbatasan

larutan

menunjukkan

adanya

triterpenoid,

sedangkan apabila terbentuk cincin berwarna biru kehijauan

pada

perbatasan

larutan

menunjukkan

adanya

steroid

(Padmasari et al, 2013).

7) Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Fenol
Sampel dilarutkan dalam pelarut etanol 95%. Plat KLT
diukur 1 cm dari bawah dan 0,5 cm dari atas dengan
menggunakan pensil dan diberi tanda. Pipa kapiler digunakan
untuk membuat spot pada plat. Plat tersebut diletakkan dalam
chamber dan ditutup, menjamin eluen berada dibawah spot.
Eluen yang digunakan adalah butanol: asam asetat: aquades

41

(4:1:1). Plat KLT kemudian divisualisasi dengan menggunakan

larutan FeCl3 2% dalam etanol, menunjukkan adanya senyawa
fenol dengan menampakkan noda berwarna biru tua (He et al,
2008).
2. Pengujian Aktivitas Antibakteri
a. Sterilisasi alat dan bahan
Alat-alat gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, gelas
ukur, spatel, pinset dibungkus dengan alumunium foil dahulu
kemudian disterilkan dalam oven pada suhu 150

selama 60

menit, sedangkan untuk bahan-bahan seperti MH (Mueller Hinton)

dan NB (Nutrient Broth) disterilkan dengan menggunakan autoklaf
pada suhu 121 C selama 1 jam.
b. Pembuatan media agar MH (Mueller Hinton)

1) Disterilkan cawan petri pada oven dengan suhu 150

selama 1 jam
2) Ditimbang MH (Mueller Hinton) sebanyak 3,8 gram, lalu
dimasukkan ke dalam erlenmeyer
3) Ditambahkan aquades, dilarutkan dengan aquades dalam 100
ml lalu dipanaskan di atas api bunsen sampai larut
4) Disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121 , tekanan 1,5
atm selama 1 jam
5) Dituangkan pada cawan petri yang sudah steril dan ditunggu
sampai padat

6) Didinginkan sampai suhu 40 50 (Difco, 1977).

c. Uji aktivitas antibakteri ekstrak kulit buah mangga podang urang
(Mangifera indica L.)
1) Hari pertama

42

Diambil satu ose bakteri Staphylococcus aureus kemudian

diinokulasikan pada media NB (Nutrient Broth) atau suspensi
saline dan diinkubasi pada inkubator dengan suhu 37
selama 24 jam (ICMR, 2009).
2) Hari kedua
a) NB (Nutrient Broth) yang sudah diinkubasi dilihat
kekeruhannya

dan

dibandingkan

dengan

tingkat

kekeruhannya dengan standar McFarland 0,5 (1,5 108

CFU/ml) (Sutton, 2011).
b) Media MH (Mueller Hinton) diswab dengan bakteri
Staphylococcus aureus sampai merata, didiamkan selama
15 menit agar bakteri terserap (Ortez, 2005)
c) Diambil disk blank dengan pinset steril kemudian direndam
dalam masing-masing konsentrasi ekstrak kulit buah
mangga podang urang yang sudah dilarutkan dengan
aquades selama 10-15 menit (Ismail, 2014)
d) Disk blank yang sudah terendam, diambil dengan pinset
steril kemudian diletakkan pada permukaan media MH
(Mueller Hinton) yang sudah diswab dengan inokulum
bakteri Staphylococcus aureus
e) Diinkubasi dalam inkubator selama 18-24 jam pada suhu 37
(Saraswati, 2015).

3) Hari ketiga
Diukur zona bening (zona hambat bakteri) pada media MH
(Mueller Hinton). Zona bening merupakan petunjuk kepekaan
bakteri terhadap bahan antibakteri yang digunakan sebagai

43

bahan uji dan dinyatakan dengan lebar diameter zona hambat.

Diameter zona hambat diukur dengan jangka sorong dalam
satuan milimeter (mm).
H. Pengolahan dan Analisa Data
Data-data yang diperoleh dari hasil penelitian diuji kenormalan
datanya menggunakan Shapiro-Wilk dan uji homogenitas dengan Levenes
test. Data yang terdistribusi normal dan homogen dilanjutkan dengan uji
One-Way Anova untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan bermakna antar
kelompok perlakuan. Uji dilanjutkan dengan uji Post Hoc untuk
mengetahui perbedaan antar kelompok perlakuan.
I. Kerangka Kerja
1. Alur penelitian
Dicuci, dikupas dan dikeringkan
Kulit buah manggaDimaserasi
podang urang
dengan etanol 95% selama 3 hari
Disaring, diuapkan pada waterbath
Ekstrak kental kulit buah mangga
podang urang

Skrining fitokimia

Uji bebas etanol

Uji aktivitas antibakteri terhadap

bakteri Staphylococcus aureus
Kontrol
Positif
Tetrasiklin
30g

Kontrol
Negatif
Aquades

Kadar
Ekstrak
10%

Kadar
Ekstrak
25%

Kadar
Ekstrak
50%

Hasil dan Analisa Data

Gambar IV.1 Alur Penelitian

Kesimpulan
2. Kerangka Kerja Uji Aktivitas
Antibakteri

Staphylococcus aureus
disuspensikan dalam
media NB (Nutrient
Broth)
Diinkubasi pada suhu
37 , selama 24

Persiapan uji aktivitas antibakteri

ekstrak kulit buah mangga podang
urang (Mangifera indica L.)
Larutan
ekstrak
Kontrol
negatif
dengan konsentrasi
Aquades
10%, 25%, 50%
Kertas
cakram
direndam dalam
Kertas cakram steril
aquades selama 15
direndam
dalam
menit
larutan
ekstrak
selama 15 menit

Kontrol
positif
Tetrasiklin 30 g
Kertas
cakram
diletakkan diatas
plate

44

Disesuaikan
dengan
standar Mc Farland 0,5
(1,5 108 CFU/ml)
Dikultur dalam media
agar Mueller Hinton
dengan swab steril

Kertas
cakram
diletakkan di atas
plate

Kertas
cakram
diletakkan di atas
plate

Plate diinkubasi dalam inkubator pada 37

dengan

selama 24 jam
Diamati zona bening yang ada pada plate setelah 24 jam, dan
diukur dengan jangka sorong (mm)
Gambar IV.2 Kerangka Kerja Uji Aktivitas Antibakteri