1.1.1. Material
o Cajas Petri
o Tubos de ensaye de 20 mL
o Matraces Erlenmeyer de 350ml y 100 mL
o Vaso de precipitados de 200ml
o Tubos eppendorf
o Charolas de peso seco
o Tubos falcon de 15ml
o Celdas para espectrofotometro
o Portaobjetos
o Jeringa de 20 ml
1.1.2. Equipos:
o Espectrofotometro
o Micropipetas (20-200L, 100-1000L)
o Bao de agua caliente
o Bao de agu a fra
o Microscopio ptico
o Autoclave (olla)
o Incubadora
o Balanza analtica
o Centrfuga
o Campana de flujo laminar
o Biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de 5L
1.1.3. Reactivos:
o Solucin salina istonica
o Reactivo de DNS
o Reactivo de Bradford
o Sacarosa
o Extracto de levadura
o KH2PO4
o (NH4)2SO4
o MgSO4
o Kit de Tincin de gram
1.2.
Metodologa
El presente trabajo se dividio en tres etapas experimentales:
1) Preparacin de medio, material para la realizacin de la prtica y
esterilizacin del reactor.
2) Inoculacin al biorreactor,
realizacin
de
cintica
peso
seco,
determinacin de pH
3) Determinacin de pH, Peso Seco, Azcares Reductores, Actividad
enzimtica , Bradford y tincin de Gram
1.2.1.Preparacin de material, reactivos, medio y esterilizacin
Para este procedimiento se prepar 3.5 L de medio para el biorreactor, en el cual
se mezclarn los siguientes compuestos: Sacarosa, 30g; Extracto de levadura, 1g;
KH2PO4:,5g; (NH4)2SO4, 2g; MgSO4 7H2O, 0.4g. La mezcla se mantuvo con
agitacin constante para homogeneizar, despus en matraces de 350mL se
separ medio tanto para el biorreactor como el inculo, los cuales fueron
debidamente etiquetados para su esterilizacin. El biorreactor se arm con sus
diferentes componentes para colocarlo en su lugar correspondiente y as poder
ubicar los sitios para toma de muestra. Se volvi a sacar el biorreactor para
colocar el volumen de medio corrspondinte y se arm nuevamente. Se prepar
para la esterilizacin en el cual se cubrieron las membranas con algodn y papel
aluminio,
las
mangueras
tenan
las
llaves
correpondintes
para
evitar
cerca de la toma de muestra para evitar contaminacin se abri la llave del puerto
de muestreo y se tom la muestra haciendo vaci con la jeringa, se regres el aire
de la jeringa se cerr la llave del puerto, se sac el tubo con suma precacuin
para evitar contaminacin, se flame con las lmparasy se coloc un segundo
tubo estril. Posteriormente se coloc el inculo; en un matraz erlenmeyer se
encontraba el inculo (200mL), se colocaron dos lmparas de alcohol cerca del
biorreactor para evitar contaminacin, con un embudo posteriormente esterilizado,
se coloc el inculo en un puerto del biorreactor. Despus se prendi la bomba
para hubiera aireacin. Se tom una muestra; con dos lmparas de alcohol, las
cuales se colocaron cerca de la toma de muestra para evitar contaminacin se
abri la llave del puerto de muestreo y se tom la muestra haciendo vaci con la
jeringa, se regres el aire de la jeringa se cerr la llave del puerto, se sac el tubo
con suma precacuin para evitar contaminacin, se flame con las lmparasy se
coloc un segundo tubo estril. Se etiquetaron los tubos, y en la campana laminar
para evitar contaminacin en los tubos eppendorf con una micropipeta de 1000L
se coloc 1 ml en cada tubo para realizar DNS, azcares reductores y
determinacin de protena, se tom 1 ml para determinar D.O (600nm) y cuenta.
Se fueron tomando muestras cada dos horas desde las 8:30am que tom la
primera hasta las 8:00pm, adems de se tom una muestra 77 horas despus.
Con cada muestra se determin el pH con tiras reactivas, adems de que se se
determin la absobancia de cada muestra. Todas las muestras se guardaron el
refrigerador para realizar las dems pruebas.
Para obtener el pH exacto de cada muestra se utiliz e potencimetro.
Posteriormente se separ 13 mL en tubos falcn y se centrifugaron las muestras,
se separ el sobrenadante en otro tubo falcn. La pastilla celular se suspendi en
1ml de solucin salina y se coloc en la charola anteiormente rotulada, esto se
realiz con cada muestra. Las charolas se llevarn a secar a 60C en la estufa, las
cuales se colocaron con pinzas para evitar tocarlas con las manos.