2013

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

ELABORARON:
DR. PEDRO GUTIERREZ AGUILAR
DR. VICTOR LAURO VALENCIA CABRERA
DR. MANUEL SAIZ CALDERN GOMEZ

Fecha de Actualizacin: Abril 2013

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGA

FACULTAD DE MEDICINA
MIGUEL ALEMAN VALDES
REGION VERACRUZ.

TRABAJO
MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

EXPERIENCIA EDUCATIVA
MICROBIOLOGA

FACILITADOR
DR. PEDRO GUTIRREZ AGUILAR

ALUMNO

FECHA ACTUALIZACIN
ABRIL 2013

Contenido

1. Introduccin3
2.

Medidas de laboratorio de Microbiologa...4

3.

Acciones a tomar en caso de accidentes. ........4

4. Practica 1. Conocimiento y manejo del microscopio. .5

5. Practica 2. Esterilizacin y muerte celular. ..7
6. Practica 3. Morfologa colonial y caractersticas fenotpicas de los microorganismos de
importancia mdica9
7. Practica 4. Identificacin de la forma y agrupamiento microscpico de las clulas bacterianas
mediante diversos procedimientos de tincin. 11
a. Tincin de Gram. Positivo, negativo y Ziehl Neelsen.
8. Practica 5. Aislamiento de microorganismos de importancia mdica mediante su cultivo. (Toma
de productos naturales. Proceso e interpretacin de muestras. .15
9. Practica 6. Antibiograma y deteccin de beta-lactamasa. ..20
10. Practica 7. Curva de Crecimiento bacteriano. ...23
11. Practica 8. Reacciones febriles. ..25
12. Practica 9. Prueba (presuntiva) (diagnstica) de tuberculosis.(reaccin de p. p. d.).
.27
13. Practica 10. Diagnostico serolgico de la sfilis. ...29
14. Apndice sobre preparacin de reactivos. 31
15. Apndice Tablas. ...32
16. Anexo I.- Bioseguridad y medidas: Procedimientos para realizar prcticas .33
a. En

el

laboratorio

de

ecologa

mdica..34
17. Anexo II.- Conocimiento del equipo y material de laboratorio.
35
18. Bibliografa...
37
19. Control de las Practicas. .39

INTRODUCCIN
El presente Manual de Prcticas de Laboratorio tiene como Objetivo la aplicacin
prctica de algunos de los conocimientos adquiridos durante el desarrollo de los
Programas del curso de Microbiologa
Esta Experiencia Educativa es de tipo terico-prctica, con un nmero de horas a la
semana de 6 de las cuales 4 horas son dedicadas a teora y 2 horas a laboratorio. Es
de carcter obligatorio y aporta 10 crditos.
I) OBJETIVO GENERAL.
Al finalizar el curso el
alumno comprender los fundamentos biolgicos del
comportamiento bacteriano y viral, conocer la morfologa, patologa, diagnstico y
prevencin de este tipo de diversidad etiolgica as como sus posibles repercusiones
clnicas.
I) OBJETIVOS ESPECFICOS.
Describir las caractersticas ms relevantes de las bacterias de inters mdico, as
como en forma general los principales cuadros clnicos producidos por ellas y las
medidas generales y especficas para el tratamiento y control de los padecimientos que
producen en el husped.
Desarrollar las habilidades necesarias para identificar los factores biolgicos, fsicos y
psicolgicos, que preservan la salud condicionan la enfermedad del ser humano.
Describir la importancia que tienen los fenmenos ocurridos a nivel gentico en los
microorganismos y su relacin con aspectos clnicos y epidemiolgicos.
Sealar el valor y la importancia que tiene el conocer las bases de los mecanismos de
accin de los agentes antimicrobianos, su empleo adecuado, los daos que pueden
causar su abuso, as como los mecanismos de resistencia a esos agentes que pueden
presentarse en los microorganismos patgenos.
Integrar los conocimientos para que el alumno identifique las entidades patolgicas
ms frecuentes en la poblacin y utilice los medios adecuados para su deteccin,
prevencin, tratamiento, control y rehabilitacin.

Medidas Seguridad Laboratorio de Microbiologa.

1.- El acceso al laboratorio cuando se realiza el manejo de microorganismos debe ser
limitado o restringido.
2.- Se recomienda el uso de batas de laboratorio, delantales o uniformes y si es
necesario guantes, cubre bocas y lentes de proteccin para prevenir la contaminacin
personal.
3.- La superficie de trabajo se descontaminar por lo menos una vez al da y siempre
que ocurra algn derrame de material biolgico, usando hipoclorito de sodio y fenol al
5%, por ejemplo.
4.- Todos los desechos lquidos o slidos, una vez recolectados en recipientes
adecuados deben descontaminarse antes de ser eliminados.
5.- No se debe pipetear con la boca, sino que deben usarse aparatos mecnicos
diseados para tal fin como propipetas, bulbos, pipeteadores automticos, etc.
6.- En el rea de trabajo no se debe comer, fumar o aplicarse cosmticos.
7.- Deben lavarse las manos despus de manipular material biolgico o animales, y
antes de salir del laboratorio.
8.- Las tcnicas deben realizarse cuidadosamente para disminuir la posibilidad de crear
aerosoles.
ACCIONES A TOMAR EN CASO DE ACCIDENTE
A.EN CASO DE CONTACTO CON ACIDOS, BASES O MATERIAL ORGANICO:
1. Lavar el area con abundante agua y jabn, para ello deben existir tarjas, regaderas y
lavaojos. Si el contaminate es un cido se puede lavar con solucin de bicarbonato
de sodio al 1% y si es un lcali emplear solucin de cido brico al 1% despus de
haber lavado previamente. Si el contaminante es un material orgnico emplear
etanol antes de lavar con agua y jabn.
2. En caso de ingestin de corrosivos NUNCA provocar vomito. Si es un cido ingerir
una solucin de bicarbonato de sodio ( dos cucharadas en 500 ml de agua). Si es
lcali ingerir un cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limn en agua Con otras
sustancias qumicas si puede provocarse el vomito.
3. Solicitar apoyo mdico incluyendo su traslado a un hospital.

Prctica No. 1 Conocimiento y manejo del microscopio.

I) OBJETIVO ESPECFICO.
Al finalizar la prctica el alumno conocer el fundamento y las partes bsicas del
microscopio compuesto y de otros tipos de microscopios as como de sus funciones.
Realizar
observaciones de
diferentes microorganismos empleando
adecuadamente el microscopio.
Aprender el manejo y los cuidados que se deben tener con el microscopio.
II) INTRODUCCIN.
a)
Historia del microscopio.
b)
Nombres y partes del microscopio.
El microscopio es un instrumento de precisin ptica constituido por tres sistemas
integrados que son:
SISTEMA PTICO DEL MICROSCOPIO.
Esta formado por varios juegos de lentes que incluyen objetivos, oculares y
condensador. Los oculares varan segn el tipo de microscopio pudiendo ser uno solo
(monocular) o dos (binocular). El aumento puede ser de 8X, 10X y 12X. Los objetivos
por lo general son tres y se encuentran montados en el revolver, cuyo movimiento
rotatorio permite el cambio para observar con diferentes aumentos, los cuales pueden
ser de 6X, 10X, 20X, 40X, 65X 100X. El objetivo de 100X se denomina de inmersin ya
que se emplea aceite de cedro para mejorar el poder de separacin (ndice de
resolucin) e igualar los ndices de refraccin de los diferentes medios.
SISTEMA MECNICO DEL MICROSCOPIO.
Constituye la base o soporte del aparato y consta de tubo, brazo, cremallera, revolver,
platina, pinzas y carro, diafragma, perillas del ajuste macromtrico, micromtrico y del
condensador. En la parte superior del tubo se encuentran montadas las lentes oculares
y en la parte inferior el revlver con los objetivos. El tornillo macromtrico mueve la
platina en direccin ascendente o descendente para permitir el enfoque grueso del
objeto observado; el tornillo micromtrico realiza la misma funcin, pero mediante
movimientos ms finos para efectuar un enfoque de precisin. La platina es la
plataforma horizontal en donde se fija la laminilla mediante una pinza que sujeta al
objeto, la cual esta ensamblada a un carro mvil, que permite desplazar la laminilla en
sentidos horizontal y vertical. Cuando el carro mvil esta graduado, se pueden localizar,
mediante las coordenadas respectivas, los campos especficos de inters para poder
observarlos o fotografiarlos despus.
SISTEMA DE ILUMINACIN.
Esta constituido de una fuente luminosa y su restato, con el que se grada la
intensidad de la luz; del condensador y el diafragma. El condensador es otro sistema de
lentes colocado por abajo de la platina, para condensar y dirigir los rayos de luz hacia el
objeto. El diafragma consta de una serie de laminillas imbricadas que permiten el paso
de mayor o menor cantidad de luz.
ENFOQUE DEL MICROSCOPIO.

Antes de colocar la preparacin sobre la platina debe tomarse la precaucin de levantar

el tubo del microscopio con la cremallera a una altura tal, que el objetivo de menor
aumento quede aproximadamente a 1 centmetro de la platina. Hecho esto, se centra la
preparacin, colocando la muestra en el centro de la abertura de la platina, se ponen
los ojos en los oculares y se hace bajar lentamente el tubo con el tornillo macromtrico
hasta que la imagen aparezca. En ese momento, se empieza a accionar el tornillo
micromtrico hasta obtener una imagen ntida de la muestra.
Accionando el revlver se pasa de la utilizacin de un objetivo a otro de mayor
aumento. Cuando el microscopio esta bien ajustado, basta con hacer girar el revlver y
modificar ligeramente el enfoque con el tornillo micromtrico para que la preparacin
que de enfocada.
La utilizacin de los objetivos de inmersin requiere, en primer lugar, que nos
aseguremos, con el objetivo de menor aumento, que lo que queremos observar se
encuentra en el centro del campo. Posteriormente, se selecciona el objetivo de
inmersin y antes de ponerlo en el eje ptico, se deposita una gota de aceite de
inmersin en el centro de la preparacin. Finalmente, se baja el objetivo de inmersin a
que quede en contacto con el aceite y se enfoca haciendo uso del tornillo micromtrico.
CUIDADOS QUE HAY QUE TENER CON EL MICROSCOPIO.
1.- Proteger de la humedad y el polvo.
2.- Al trasladarlo, debe sujetarse de su brazo y de la base o del soporte.
3.- Antes de emplearlo, cerciorarse de que las lentes accesibles objetivos, oculares y
condensador estn limpias, de no ser as proceder a limpiarlas con papel seda especial
para evitar daos o deterioros.
4.- Al terminar la observacin con el objetivo de inmersin, debe retirarse el aceite
empleando papel seda o un lienzo suave, limpio y seco. De no hacerlo el aceite se
reseca, dificultando la limpieza y deteriora la lente.
5.- Los elementos del sistema ptico estn ajustados de fabrica, por lo tanto no deben
ser desarmados por el observador.
6.- Los objetivos, el condensador y los oculares pueden limpiarse con agua destilada; el
objetivo de inmersin y la parte superior del condensador con xilol, pero con muy poca
cantidad, humedeciendo ligeramente un lienzo y pasndolo suavemente por la
superficie de las lentes.
7.- La superficie del microscopio se puede limpiar simplemente con un lienzo
humedecido con agua.
III) MATERIAL DE LABORATORIO.
1. Un microscopio compuesto por equipo
2.
3. Preparacin fija o montada.
4. Preparaciones en fresco.
5. Portaobjetos.
6. Cubreobjetos.
7. Aceite de inmersin
8. Papel seda o lienzo suave de algodn, no motas de algodn.
9. Alcohol o xilol
IV) DESARROLLO.
V) RESULTADOS.
7

Dibujar el microscopio y poner los nombres.

VI) DISCUSIN
Prctica No. 2 Esterilizacin y muerte celular.
I) OBJETIVO ESPECFICO. .
Conocer y comprender la importancia as como el fundamento de la teora sobre
esterilizacin, desinfeccin, asepsia y antisepsia.
II) INTRODUCCIN.
ESTERILIZACIN POR MEDIOS FSICOS.
CALOR
SECO
Flama directa
Cauterizacin
HUMEDO
Ebullicin
Autoclave
RADIACIN Ionizante
Rayos X
Rayos gamma
No ionizante Radiacin infrarroja
OTRO TIPO Filtracin
0.45 micrmetros para bacterias

Horno
Pasteurizacin y tindalizacin
Rayos csmicos
Radiacin ultravioleta
0.22 micrmetros para virus

ESTERILIZACIN POR MEDIOS QUMICOS:

Alcoholes
Aldehdos
Fenoles y derivados
Agentes tensoactivos
Colorantes
Sales de metales pesados

Elementos halgenos

ANTIBIOSIS (Antibiticos).
Antibacterianos
Inhiben crecimiento p. ej:
Detienen crecimiento p. ej:
Antivirales
Etapa del ciclo viral
Adsorcin
Fusin
Desnudamiento
Transcripcin
inversa

Integracin
Replicacin del
DNA
Transcripcin
Traduccin
Maduracin
Gemacin

Tipo de antiviral
Anticuerpos contra el receptor CD4, poli (sulfatos, sulfonatos,carboxilatos y oximetales,
p.ej. anfotericina B y Gossypol).
LLLLL
Lectinas de plantas, albminas succiniladas acotiniladas y derivados de cido betulnico.
Biciclamas e interfern.
Anlogos de didesoxinuclesidos y fosfonatos nucleosdicos cclicos (por competencia con
el sitio de unin del sustrato); derivados no nucleosdicos (por alostrismo con un sitio de
unin a un no sustrato). P.ej. Azidotimidina (AZT), didesoxicitidina (DDC), fosfonoformato (Foscarnet), HPA23, Suramina, Ansamicina.
No se ha descubierto
No se ha descubierto
Oligodesoxinuclesidos antisentido y antagonistas de Tat. Ribavirina.
Oligodesoxinuclesidos antisentido y ribozimas. P.ej. Interferones, D-penicinilasa.
Inhibidores de la proteasa, de la miristilacin y de la glicosilacin. P.ej. Castaoespermina,
Carricina, AS-101.
Para el ensamble y la liberacin. P.ej. Interferon, Dionas policiclco-aromticas.

Tomado de : De Clercq, E. Antiviral therapy for human immunodeficiency virus infections Clin Microbiol Rev 1995;
8:200-239.
Richman DD. Drug resistance in viruses. Trends Microbiol 1994; 2:401-407.

III) MATERIAL DE LABORATORIO EMPLEADO.

1 Tubo de caldo soya-tripticasa preinoculado con la bacteria Escherichia coli.
10 tubos con caldo soya-tripticasa esterilizados, por equipo.
1 lampara de luz ultravioleta.
1 vial de antibitico por grupo.
IV) DESARROLLO.
a)
Se preparan 10 tubos de ensayo con 20 ml de medio de cultivo agar soyatripticasa, y se esterilizan en autoclave, por cada equipo. En 7 de ellos se inoculara con
un precultivo de Escherichia coli previamente crecido por 12 o 24 horas, empleando el
asa bacteriolgica. Una vez inoculados, a 2 de los tubos se esterilizaran en el
autoclave; a otros 5 se agregaran 0.1 ml de una suspensin de antibitico en diferentes
concentraciones (1 vial de penicilina o ampicilina). A los 2 ltimos tubos primero se
vaciaran en una placa Petri estril. Despus de solidificar, se inocularn con 0.2 ml del
precultivo y posteriormente los dejaran expuestas bajo la luz ultravioleta durante
diferentes tiempos desde 10 minutos hasta 1 o 2 horas. El dcimo tubo se empleara
como testigo, por lo que quedar sin inocular. Al final, se dejaran todos los tubos y las
placas, debidamente marcados, en la incubadora por 18 o 24 horas. Al siguiente da se
procede a observar y registrar el crecimiento obtenido.
b)
Se describir como se debe preparar el material para esterilizacin.
c)
Se harn dibujos y se describir el fundamento de los aparatos empleados para
esterilizar.
d)
Se proceder a esterilizar en autoclave el material contaminado
V) RESULTADOS.

VI) DISCUSIN.

Prctica No. 3 Morfologa colonial y caractersticas fenotpicas de los

microorganismos de importancia mdica.
I) OBJETIVO ESPECFICO.
El alumno conocer las estructuras de las bacterias, as como otros aspectos de la
clasificacin e identificacin.
Definir la morfologa colonial de los microorganismos cultivados por sus caractersticas
de tamao, forma, color, produccin de pigmentos y de hemlisis mediante examen
visual.
II) INTRODUCCIN.
La evaluacin de las caractersticas macroscpicas de las colonias se lleva a cabo con
el examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar.
Se debe estudiar con cuidado cada placa debido a que las bacterias aisladas
inicialmente a partir de muestras clnicas, constituyen a menudo cultivos mixtos por lo
que puede haber una gran variedad de colonias de diversos tipos.
Las caractersticas coloniales empleadas en la identificacin preliminar de las bacterias
son :
Tamao:
Dimetro de la colonia en milmetros.
Forma:
Puntiformes, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme.
Elevacin:
Plana, elevada, convexa, monticular, umbeliforme, umbilicada.
Margen o borde:
Entero, ondulado, lobulado, aserrado, filamentoso, rizado.
Color:
Blanco, amarillo, negro, ante, naranja, etc.
Superficie con luz reflejada: Brillante, mate, etc.
Densidad de luz transmitida: Opaca, translucida, transparente, etc.
Consistencia:
Butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza.
Las reacciones en medios de agar especiales empleados en la identificacin son:
1.- Hemlisis en agar sangre. 2.- Produccin de pigmentos.
III) MATERIAL
1 microscopios por equipo. 1 asa bacteriolgica.
Placas de agar de diferentes medios de cultivo con crecimientos bacterianos de E. coli;
S. aureus; S. epidermidis; S. pyogenes; S. pneumonae; C. albicans; Bacillus spp; P.
aeruginosa; P. mirabilis. H. influenzae; etc.
Placas de agar de diferentes medios de cultivo sin inocular.
Tubos de agar con medios bioqumicos, (TSI, LIA, MIO, Bilis-Esculina; Citrato, plasma
para prueba de coagulasa, Peroxido de hidrgeno 30% para prueba de catalasa; etc.
Preparaciones de las colonias fijadas y teidas.
IV) DESARROLLO
Se inoculan diferentes medios de cultivo con cepas conocidas estriando en la superficie
de estos
Se observarn las placas de agar con los diferentes crecimientos microbianos.

10

De colonias seleccionadas, se realizarn inoculaciones en medios bioqumicos y se

realizarn preparaciones que sern fijadas y teidas, para observar bacilos o cocos.
Despus se pondrn en el microscopio para observarlas con objetivo de 100 x, y con
aceite de inmersin.
Se proceder a realizar los dibujos de lo que se observa en las placas y en el
microscopio diferenciando las formas.
V) RESULTADOS

VI) DISCUSIN.

11

Prctica No. 4 Identificacin de la forma y agrupamiento microscpico de las

clulas bacterianas mediante diversos procedimientos de tincin.
I) OBJETIVOS ESPECFICOS
Relacionar la forma y el agrupamiento de ciertos grupos bacterianos de importancia
mdica.
Identificar la importancia de algunos mtodos de coloracin para definir caractersticas
o propiedades bacterianas.
Conocer el fundamento bioqumico de las tinciones.
Conocer el desarrollo de las tinciones simple, de Gram, de BAAR, y de Fontana.
Conocer la naturaleza de las infecciones ocasionadas por microorganismos, sitios de
afectacin y criterios clnicos para su reconocimiento y su comportamiento biolgico.
II) INTRODUCCIN.
Las tinciones son procedimientos qumicos para proporcionar color a las diferentes
clulas bacterianas, permitiendo una mejor identificacin y estudio de la morfologa, en
base a la capacidad de retener los colorantes por las estructuras y organitos
bacterianos lo que permite la identificacin. .
Los colorantes empleados para teir bacterias pueden ser de tipo cido o bsico, esto
permite la combinacin con elementos de naturaleza contraria.
Otras propiedades de los colorantes permiten que se empleen como constituyentes de
medios de cultivos funcionando como indicadores de pH e inhibidores de cepas.
COLORACIN SIMPLE
La metacromacia es la propiedad que tiene el colorante, en este caso el azul de
metileno, para teir en diversos tonos de azul los diferentes organelos u organitos de la
clula; membrana, protoplasma y ncleo. Se observa que la membrana y ncleo son
de color azul intenso, los organitos y granulaciones celulares en azul medio y el
citoplasma en azul tenue.
TINCIN DE GRAM
Permite diferenciar las bacterias Gram (+) de las Gram (-), las primeras son las que
se tie con cristal violeta y las Gram (-)
con el colorante de fondo que puede ser
safranina o fuscina . Esta tincin permite una clasificacin mas general de las bacterias
que a manera de regla general es:
Gram (+), son todas las bacterias teidas de azul.
Gram (-), son todas los bacterias que se tien de rojo.
COLORACIN DE BACILOS ACIDO ALCOHOL RESISTENTES, BAAR,
( ZIEHLNEELSEN ).
Esta tincin nos sirve para reconocer bacterias que resisten una decoloracin mas
fuerte con el alcohol cido. Son dos los bacilos patgenos que son :
Micobacterium leprae (bacilo de Hanssen, productor de la lepra)
Micobacterium tuberculosis (bacilo de Koch, productor de la tuberculosis).

12

COLORACIN DE FONTANA TRIBONDEAU

Esta coloracin es adecuada para espiroquetas los cuales tiene una alta sensibilidad a
los agentes qumicos ms agresivos, pues se tien muy poco o nada con las tcnicas
corrientes, ests bacterias se tien de caf con este mtodo de impregnacin argntica.
La prueba se emple en el diagnstico mdico, para observar principalmente a la
espiroqueta de Shaudin o treponema plido, agente causante de la sfilis.
III) MATERIAL
Tincin de Gram.
1. Porta objetos
2. Soporte para tincin
3. Mechero bunsen
4. Isopo
5. Colorante de azul de metileno
6. Cristal violeta
7. Lugol
8. Safranina
9. Alcohol
10. Abatelenguas
11. Microscopio
12. Aceite de inmersin

Tincin de BAAR.
1. Mechero bunsen
2. Piceta
3. Varilla de vidrio con algodn
4. Colorante de fucsina
5. Colorante de azul de metileno
6. Alcohol cido
7. Agua
8. Asa de platino

Tincin de Fontana.
1. Varilla de vidrio con algodn
2. Colorante de tanino
3. Solucin de Rougen
4. Alcohol
5. Agua
6. Solucin argntica amoniacal
7. Asa de platino
8. Vaso de precipitado
9. Solucin de nitrato de plata
10. Hidrxido de amonio

IV) DESARROLLO.
PROCEDIMIENTO DE TINCIN SIMPLE
1. Hacer un frotis uniforme en una rea de 1 a 2 cm. cuadrados sobre el portaobjetos
de exudado farngeo
2. Fijarlo al calor, pasando el porta objetos 3 veces sobre la flama del mechero
3. Cubrir la preparacin con azul de metileno por un minuto
4. Lavar con agua
5. Secar al aire
6. Observar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO DE LA TINCIN DE GRAM
1. Hacer un extendido uniforme sobre el porta objetos,
2. Fijar al calor, pasando el porta objetos 3 veces sobre la flama
3. Cubrir por un minuto con colorante de cristal violeta
4. Lavar con agua corriente, ligeramente
5. Cubrir la preparacin con lugol por un minuto
6. Lavar con agua
7. Decolorar con la mezcla alcohol-acetona, 5 a 6 gotas,
8. Lavar con agua
9. Cubrir con colorante de safranina por 30 seg.
10. Lavar con agua
13

11. Secar al aire

12. Observar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO DE LA TINCIN DE B.A.A.R.
1. Hacer un extendido uniforme sobre el porta objetos y fijarlo al calor
2. Colocarlo en el soporte para tinciones y cubrirlo con colorante de fucsina durante 8
min. pasando el mechero por debajo de la preparacin sin que seque ni hierva,
solo a emitir vapores.
3. Lavar con alcohol cido 2 o 3 veces hasta que no salga colorante rojizo
4. Lavar con agua
5. Cubrir con azul de metileno por 30 seg.
6. Lavar con agua, y secar al aire
7. Observar al microscopio con objetivo de 100X y aceite de inmersin.
PROCEDIMIENTO DE LA TINCIN DE FONTANA.
1. Hacer un frotis de muestra obtenida del chancro mediante un asa de platino
estril
2. Fijarlo al calor con el mechero
3. Cubrir la preparacin con solucin de Rougen durante un minuto pasando el
mechero por debajo de la muestra.
4. Debajo de la muestra , quitar el exceso de colorante y la cual emitir vapores.
5. Cubrir con tanno, ( mordente ) durante un minuto y despus quitar exceso.
6. Lavar con alcohol y encender para quemar el resto de alcohol.
7. Cubrir con solucin argntica amoniacal durante un minuto.
8. Lavar con agua destilada y observar al microscopio con objetivo de 100X y aceite
de inmersin.
La solucin argntica amoniacal se prepara en el momento de efectuar la tincin.
En un vaso de precipitado colocar un mililitro de solucin de nitrato de plata ,
(agregar gota a gota hidrxido de amonio) , hasta aparecer un color sepia, seguir
agregando hidrxido, hasta la desaparicin del color sepia y en ese momento esta
lista la solucin argntica amoniacal.
CUADRO DE LAS DIFERENTES FORMAS DE LAS BACTERIAS
COCOS
Diplococos
Estreptococos
Estafilococos
Tetrada

BACILOS
Coco-bacilos
Estrepto-bacilos
Diplo-bacilos
Formas PLO

Formas Espirales
Vibriones
Spirillum
Borrelia
Treponema
Leptospira

V.- RESULTADOS:
Dibujar e identificar lo observado en el microscopio.
VI.- DISCUSIN.
INVESTIGACIN: Describir el fundamento de la tincin de Gram, de Ziehl-Neelsen y
Fontana.
Describir el procedimiento de la tincin flagelar empleada para Pseudomona aeruginosa y/o
Bordetella bronchiseptica.
14

Anexo practica 4. Cuadro de las principales tinciones empleadas en el examen de muestras clnicas.
Muestras
Faringe

Enfermedad sospechada
Difteria

Mtodos de observacin
Gram

Hallazgos positivos
Bacilos Gram positivos pleomrficos en letras
chinas.

Azul de metileno

Bacilos color azul claro con grnulos

metacromticos.

Gram

Cocos Gram positivos en cadena.

Cocos fluorescentes en cadena.

Neumonia bacteriana.

Tcnica directa de anticuerpos

fluorescentes.
Gram.
Campo obscuro
Gram

Tuberculosis.
Celulitis bacteriana

Ziehl-Neelsen
Gram

Bacilos cido-alcohol resistentes.

Varios tipos de bacterias de especies anaerobias.

Gangrena gaseosa
(mionecrosis)
Meningitis bacteriana

Gram

Bacilos Gram positivos, presuntivamente

Clostridium perfringes; no suelen verse esporas

Faringitis estreptoccica
agda.
lceras
orofarngeas
Esputo, aspirados
transtraqueales,
lavados
bronquiales.
Heridas cutneas
o drenaje
purulento de
senos
subcutneos.
Lquido cefalorraqudeo

Angina de Vincent

Gram

Antisueros tipo especficos

Gram
Orina
Secrecin uretral
o cervical
purulenta

Listeriosis
Infeccin bacteriana
Leptospirosis
Gonorrea
Infeccin clamidial

Conjuntivitis purulenta

Tcnica directa de anticuerpos

fluorescentes
Examen de secrecin del
chancro
Gram de secrecin de bubn
inguinal
Gram

Tracoma
Enterocolitis purulenta

Giemsa de raspado de cornea

Gram

Colera

Examen directo de heces

incubadas con agua peptonada
alcalina (1 a 3 h).
Wright o Giemsa y campo
obscuro
Gram

Ulcera pnica

Sifilis primaria

Aspirado de
bubn
Ojos

Chancroide

Heces

Sangre

Gram
Campo obscuro
Gram

Fiebre recurrente (Borrelia),

Tifoidea

15

Espiroquetas y bacilos Gram negativos.

Varios tipos de bacterias; y Streptococcus
pneumoniae capsulado.

Bacilos Gram negativos, pequeos, pleomrficos

(Haemophilus spp)
Diplococos Gram negativos (Neisseria meningitidis)
Diplococos Gram positivos (Streptococus
pneumoniae)
Cpsulas bacterianas hinchadas y translucidas
Bacilos Gram positivos delicados
Varios tipos de bacterias
Espiroquetas moviles estrechamente enrolladas
Diplococos Gram negativos intracelulares
Cuerpos elementales fluorescentes
Espiroquetas mviles enrolladas.
Bacilos Gram negativos pequeos intracelulares y
extracelulares
Variedad de especies bacterianas
Inclusiones intracelulares perinucleares
Neutrfilos y agregados de estafilococos
Bacilos con caracterstica movilidad de flecha

Espiroquetas con morfologa tpica

Bacilos Gram negativos

Prctica No. 5 Aislamiento de microorganismos de importancia mdica mediante

su cultivo.
(Toma de productos naturales. Proceso e interpretacin de muestras)
.

I) OBJETIVO ESPECFICO.
Aprender a cultivar e identificar a los microorganismos de importancia mdica aislados
a partir de las diferentes muestras clnicas o fluidos biolgicos del humano.
Conocer los procedimientos para procesar e interpretar los diferentes tipos de
muestras.
Obtener, procesar y vigilar el adecuado cultivo de las muestras.
Realizar la identificacin presuntiva de los microorganismos patgenos aislados de las
muestras.
II) INTRODUCCIN.
Los medios de cultivo son sustancias enriquecidas en sus componentes, con un pH
ptimo, que favorece ampliamente el desarrollo de la clula bacteriana .
El gran avance de la microbiologa se logr al cultivar los microorganismos en los
medios de cultivo sintticos que se utilizan para una gran variedad de propsitos en el
laboratorio, entre ellos la obtencin de cultivos puros (axnicos) del microorganismo
empleados para propagar bacterias, hongos, y algunos parsitos del humano. Un medio
no slo debe sostener el desarrollo de un microorganismo, sino que tambin debe
permitir la exhibicin de una morfologa colonial y microscpica tpica en el medio.
El diagnstico de ciertas enfermedades como las inflamaciones de tipo estreptococo
diftrico; del descubrimiento de focos de infeccin en escarlatina, fiebre reumtica,
glomerulonefritis, aguda en la deteccin de portadores de organismos como el
estreptococo beta hemoltico, estafilococo dorado, coagulasa positiva, bacilo diftrico y
haemophylus, se realizan a travs de un proceso establecido de la toma, cultivo e
interpretacin integral de los resultados. Se incluye en esta marcha la observacin
directa de frotis tomados del sitio u rgano afectado.
Casi todos los medios empleados en el laboratorio de microbiologa clnica pertenecen
a uno de los siguientes tipos: medios enriquecidos, de enriquecimiento, diferenciales,
selectivos o de un propsito y bioqumicos.
Tipos de muestras que se pueden colectar de diferentes sitios anatmicos.
1. Hemocultivo.
a) Muchos casos de bacteremia son detectados colectando tres muestras de sangre en tiempos
separados para hemocultivo.
b) El hemocultivo est indicado en: Sepsis aguda. Endocarditis agda y subagda. Fiebre de origen
desconocido. Tratamiento antimicrobiano una a dos semanas antes de la admisin. Catter endovenoso
o urinario permanente.
2. Muestras de lquido de sistema nervioso central.
a) Lquido cefalorraqudeo; Absceso cerebral; biopsias del SNC. En 90% de los abscesos cerebrales
crecen bacterias anaerobias.
3. Tracto gastrointestinal.
a) Incluye esfago, estmago, intestino delgado y coln. Muestras de heces. Hisopado rectal. Aspirado
gstrico. Biopsia y lavado gstrico. Sigmoidoscopa.

16

4. Muestras de tracto genital.

a) Femenino. Lquido amnitico. Glndulas de Bartholi. Cervix. Endometrio. Trompas de Falopio.
Uretra. Vagina. Vulva.
b) Masculino. Epiddimo. Pene. Uretra.
5. Muestras oculares. Conjuntiva. Cornea. Lquido intraocular.
6. Muestras de aparato respiratorio.
a) Tracto respiratorio bajo. Esputo. Traquea. Bronquial. Aspirado pulmonar.
b) Tracto respiratorio alto. Exudado o aspirado de faringe y nariz. Senos nasales.
7. Lquidos corporales normalmente estriles. Pleural. Pericrdico. Peritoneal. Sinovial.
8. Muestras de tejido subcutneo y piel.
a) Quemaduras. Heridas superficiales. lceras y ndulos.
9. Muestras diversas. De tejidos, huesos, heridas profundas, biopsias y aspirados.
10. Orina. Emisin espontnea. Catter vesical permanente. Puncin suprapbica. Cistoscopa. Sondeo
vesical.
III) MATERIAL:
Asa de platino
Algodn
Tubos para cultivo
Agitador
Cajas de Petri con
Mechero Bunsen
Incubadora
Balanza
Papel de estraza medio de cultivo
HHisopos estriles Autoclave
Esptula
Cinta testigo
Portaobjetos
Microscopio
Aceite de inmersin Colorantes de Gram
MEDIOS DE CULTIVO.
Caldo BHI
Agar Mac Conkey
Agar Tripticasa de soya Agar gelosa sangre
Caldo selenito
Agar EMB
Agar Muller-Hinton
Agar 110 y manitol.
Caldo tetrationato
Agar salmonella shigella Agar con gelatina
Agar gelosa chocolate
Agar sulfito de bismuto Agar TCBS
Agar Pseudosel
Agar Biggy
Agar verde brillante
Medio de Lowenstein-Jensen para micobacterias Agar dextrosa Sabouraud
Agar telurito de Tinsdale Medio Haemophylus
Medio micoplasmas
MATERIAL BIOLGICO.
Orina.
Heces.
Nasal
Faringeo
tico
Ocular
Uretral
Cervix-vagina
Lesiones (chancros, acne) Heridas y fstulas.
IV)
DESARROLLO.
Seguir los esquemas especficos para toma de diferentes muestras.
Hacer los frotis que sean necesarios para observarlos con objetivo de 100X, una vez
teidos por Gram.
TOMA DE MUESTRAS EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO
1.- Tomar un lpiz graso y marcar por detrs de la placa Petri que contiene la gelosa,
las lneas, como se indica en la figura 1. Deben quedar tres sectores, en el ms
pequeo se descargar la muestra que transporta el asa.
2.- Con un hisopo o el asa, tomar el exudado, raspado y/o secrecin de la regin
anatmica seleccionada.
3.- Con una mano levantar parcialmente la tapa de la placa, con la otra mano que
sostiene el asa sembrar sobre la superficie de la gelosa trazando una serie de lneas en
zig-zag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno.

17

4.- Despus de inocular la muestra, quemar el hisopo y desecharlo o flamear el asa

hasta que se ponga incandescente.
5.- Girar la placa 90 grados hasta que el sector dos este en posicin para ser inoculado.
6.- Con el asa trazar, tocar parte del rea del sector uno de manera de arrastrar parte
del material inoculado previamente para dispersarlo en zig-zag en el sector dos.
7.- Repetir los pasos 4, 5 y 6 para el sector faltante.
8.- Incubar las placas a 37oC durante 24 horas. Las cajas ya sembradas se colocarn
de manera invertida (tapa abajo y base arriba).
9.- Sellar alrededor de la placa con para-film y rotularla con los datos del paciente:
Nombre, fecha, y que tipo de cultivo es.
Observar el crecimiento a las 24, 48 y 72 hrs.
Figura 1.-

V) RESULTADOS

VI) DISCUSIN.

18

Figura 2.UROCULTIVO

Primera orina matutina,

colectar la porcin media
en un recipiente estril.

Sembrar con asa calibrada (0.01ml)

y por estra cerrada en :

Agar sangre, agar EMB y/o agar MacKonkey

Incubar 24 a 48 h a 37oC

Cuenta de colonias e identificacin.

EMB

Agar sangre

Lectura (-) colonias

incoloras
o ambarinas
Lectura (+)
colonias
obscuras
verdosas
y con brillo
metlico

De colonias lactosa (+) o

lactosa (-). Sembrar con
una sola colonia:
TSI, LIA, MIO, Citrato.

Incubar 24 h a 37oC
Lectura de pruebas bioqumicas e19
identificacin final

Morfologa colonial
Morfologa microscpica,
Tipo de hemlisis

Realizar pruebas para la

Identificacin de :
Staphylococcus,
Streptococcus,
Candida, etc.

Anexo practica 5. Cuadro de seleccin de medios primarios de aislamiento, para muestras de diferentes
sitios del organismo.

Fuente de la muestra
Farnge
Esputo
Aspirado transtraqueal

1
X
X
X

Orina

Heridas y abscesos

X
X

X
X

Heces

Uretra / Cervix
Lquido cefalorraqudeo

X
X

Ojos y oidos

Lquido sinovial

Bacterias patgenas potenciales

Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus
Klebsiella pneumoniae
Bacterias anaerobias
Escherichia coli
Klebsiella spp
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Estrptococos grupo D
Staphylococcus aureus
E. coli y otros bacilos entricos
Streptococcus pyogenes
B. fragilis, C. perfringes y otras
bacterias anaerobias
Estreptococos grupo D
Salmonella spp
Shigella spp
E.coli (enterotoxignica)
Staphylococcus aureus
Yersinia enterociltica
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneomoniae
Haemophilus influenzae
Neisseria gonorrhoeae
Haemophilus spp
Staphylococcus aureus
Streptococcus pyogenes
Pseudomonas aeruginosa
Moraxella spp
Neisseria gonorrhoeae
Staphylococcus aureus
E. coli y otras especies de
enterobacterias
Moraxella spp

Nota: 1. Agar sangre de carnero al 5%; 2. Agar chocolate; 3. Lester-Martn; 4. Agar de

MacConkey; 5. Agar entrico de Hektoen, XLD Xilosa-Lisina-Desoxicolato, SSA
Salmonella-Shigella agar; 6. Caldo selenito.

20

Prctica No. 6 Antibiograma y deteccin de -lactamasa.

I) OBJETIVO ESPECFICO.
Identificar el efecto antibacteriano de los frmacos en un cultivo de bacterias.
Demostrar la utilidad de la prueba de sensibilidad antimicrobiana por difusin en agar.
Identificar la utilidad de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en la clnica.
II) INTRODUCCIN.
Las pruebas de sensibilidad microbiana son indicadas: para aquellos organismos que
contribuyen al proceso infeccioso y cuya sensibilidad no puede ser predecida por su
identificacin bacteriolgica ( agentes reportados como resistentes asociados, por
ejemplo a infecciones intrahospitalarias); en infecciones crnicas o cuadros clnicos de
repeticin; y para seleccionar el antimicrobiano ms adecuado para pacientes con
problemas (edad, hipersensibilidad,etc.)
Es el estudio del laboratorio que determinar el grado de resistencia y susceptibilidad
bacteriana ante los antibiticos especficos.
Los discos de sensibilidad antibitica son especficos para Gram (-) o Gram (-),
tambin hay combinados, Gram (+ y -). Los antibiticos empleados en estas pruebas
representan a los principales antibiticos genricos que circulan en el mercado.
Representan la presin de seleccin, manipulada por el ser humano, a que estn
sujetas las bacterias.
III) MATERIAL DE LABORATORIO.
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Caja de Petri con medio de cultivo de Muller-Hilton

Isopo estril
Mechero de bunsen
Cinta testigo
Multidiscos combinados
Medio de cultivo con las cepas previamente sembradas.

IV) DESARROLLO.
Parte I.
1. Sembrar una caja de Petri que contiene medio de cultivo Muller-Hilton, cerca de la
flama del mechero y de manera masiva mediante un isopo
2. Colocar un multidisco combinado cuidando que los antibiticos queden adheridos
al medio de cultivo
3. Tapar la caja y sellar con cinta parafilm
4. Incubar en el horno a 37 c.
5. Observar el desarrollo a las 24 , 48 y 72 hrs.
6. Interpretar el antibiograma en un orden decreciente de actividad; para esto debe
medir con una regla, los dimetros de los halos de inhibicin, de esta manera se
determina si es sensible, poco sensible o resistente al antibitico
7. Reportar los resultados

21

Parte II.
Las pruebas directas en colonias de Estafilococos aureus, Haemophilus influenzae y
Neisseria gonorrhoae, se emplean para detectar la produccin de beta-lactamasa; son
mtodos rpidos y efectivos de deteccin de cepas reductoras de beta-lactamasa que
son resistentes a la penicilina y la ampicilina.
Mtodo acidimtrico rpido.
Agregar 2 ml de una solucin al 0.5% de rojo fenol a 16.6 ml de agua destilada estril e
inyectar la mezcla en una ampolla con 20x10 6 U de penicilina G para uso parenteral
(con buffer citrato). Transferir a un tubo de ensayo y aadir en gotitas NaOH 1M hasta
que el pH llegue aproximadamente a 8.5, lo que se aprecia de una coloracin violeta.
La solucin que no se emplea inmediatamente debe dividirse en alcuotas y congelarse
a 60 grados centgrados. Descartar la solucin cuando se ha puesto amarilla.
Colocar 0.05 a 0.1 ml del sustrato mencionado en una concavidad de una placa de
micro-dilucin o en un tubo pequeo. Preparar una suspensin densa con colonias de
un cultivo de 1:8 horas y mezclar con el sustrato formando una suspensin ms turbia
que el estndar No. 4 de McFarland. Si el cultivo produce beta-lactamasa, la solucin
se pone amarilla en 15 minutos (casi siempre en un minuto).
Mtodo yodomtrico rpido.
Para preparar el sustrato, disolver penicilina G en buffer fosfato 0.1M, pH 6.0, a una
concentracin de 6000 microgramos/ml (10,000 u/ml). Para preparar el reactivo del
almidn, aadir 1 gramo de almidn soluble a 100 ml de agua destilada y calentar a
bao mara hirviente hasta que se disuelva el almidn. Preparar el reactivo de yodo
disolviendo 2.03 g de yodo y 53.2 g de yoduro de potasio en un pequeo volumen de
agua destilada, y luego diluir hasta 100 ml. Guardar en un frasco marrn de vidrio a
temperatura ambiente.
Las soluciones de penicilina y almidn deben de ser recin preparadas. La solucin de
yoduro debe reemplazarse cuando forma exceso de precipitado.
Dispensar 0.1 ml de solucin de penicilina G en la concavidad de una placa de microdilucin o en un pequeo tubo de ensayo. Preparar una suspensin densa de
microorganismos y mezclarla con el sustrato, como se explico anteriormente. Dejar
reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Agregar 2 gotas de la solucin de
almidn y mezclar. Agregar una gota del reactivo de Yodo.
Aparece inmediatamente color azul a consecuencia de la reaccin del yodo y el
almidn. Agitar la mezcla durante 1 minuto a temperatura ambiente. La decoloracin en
menos de 10 minutos indica la produccin de beta-lactamasa. La persistencia del color
indica la ausencia de la enzima.
Mtodo en papel mtodo yodometrico.
Saturar tiras de papel filtro No. 3 de Whatman con una mezcla igual de solucin de
almidn al 1% y de penicilina G en agua. Las tiras se dejan secar a temperatura
ambiente. Las tiras secas pueden guardarse a 20 grados centgrados durante 1 ao,
por lo menos.
Colocar una tira seca en una caja de Petri y colocar una gota de solucin de yodo Gram
o lugol. Inmediatamente debe aparecer un color azul. Aplicar aproximadamente 10
colonias de una placa de agar con una asa de inoculacin en la tira. Los
microorganismos deben extenderse sobre un rea de aproximadamente 5 mm de
dimetro. La produccin de beta lactamasa se evidencia por un cambio del prpura
oscuro original o de un color parduzco al blanco en un minuto.
22

V) RESULTADOS.
Determinar la sensibilidad midiendo los dimetros y compararles con los reportados.

VI) DISCUSIN.

23

Practica No. 7 Curva de crecimiento bacteriano.

(Correlacin con el Nefelmetro de McFarland).
I) OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Comprender la cintica del crecimiento bacteriano.
Comprender conceptos como tiempo de generacin, nmero de generaciones, tasa de
crecimiento. curva de crecimiento.
II) INTRODUCCIN.
La velocidad de crecimiento de una bacteria o cualquier organismo sea virus, parsito,
hongo o clula; es la cantidad de tiempo requerido para que las colonias se vuelvan
visibles, sin magnificacin, en un medio de crecimiento slido. Por ejemplo, las
micobacterias que forman tales colonias dentro de los 7 das, se denominan de
crecimiento rpido, otras que requieren ms tiempo, de hasta 1 o 2 meses, se
denominan de crecimiento lento. Este parmetro ms objetivo, que generalmente se
desconoce o ignora, es de primordial importancia para establecer diagnsticos de
manera oportuna y pertinente. Tambin para comprender aspectos muy importantes de
la relacin parsito-hospedero es importante considerar el tiempo de generacin y el
periodo de incubacin, ver tabla siguiente.
Especie bacteriana
Bacillus micoides
Bacillus thermophylus
Escherichia coli
Lactobacillus acidophylus
Micobacterium tuberculosis
Rhizobium japonicum
Staphylococcus aureus
Streptococcus lactis
Treponema pallidum

Medio de
crecimiento..
Caldo
Caldo
Caldo
Leche
Leche
Sinttico
Levadura
Caldo
Caldo lactosa.
Leche
Testic. Conejo

Temperatura de
incubacin.
37oC
55oc
37oC
37oC
37oC
37oC
25oC
37oC
37oC
37oC
37oC

Tiempo de
generacin
28 m
18.3 m
17 m
12.5 m
66-87 m
792-932 m
344-461 m
27-30 m
48 m
46 m
1,980 m

Periodo (tiempo) Tiempo de aparide incubacin

cin de colonias.

III) MATERIAL.
15 tubos de ensayo con tapn de rosca, 15 pipetas de 1 ml, 10 pipetas de 5 y 10 ml,
fotocolormetro Klett-Summerson, 5 matraces nefelomtricos, 15 placas Petri estriles.
Soluciones de cloruro de bario y de cido sulfrico. Cultivos de cepas de E.coli, C.
albican y S. aureus. 300 ml de caldo de triptosa o de Luria. 300 ml de agar nutritivo.
IV) DESARROLLO.
Parte I.
En una gradilla disponer 10 tubos de ensayo grandes, del tamao de los empleados en
la dilucin de vacunas, y rotularlos de 1 a 10.
Aadir una solucin al 1% de cloruro de bario anhidro y una solucin fra al 1% (en
volumen) de cido sulfrico qumicamente puro, segn el cuadro.
Sellar los tubos y mantenerlos en refrigerador.

24

Cuando el fino precipitado blanco de sulfato de bario se sacude, cada tubo posee una
densidad diferente que corresponde aproximadamente a las suspensiones bacterianas
del cuadro.
Cuadro. Protocolo de los tubos para el nefelmetro de McFarland.
Tubo No. BaCl21% H2SO4 1% Bacterias/ml Tubo No. BaCl21% ml H2SO4 1%
ml
ml.
(x108)
ml
1
0.1
9.9
3
6
0.6
9.4
2
0.2
9.8
6
7
0.7
9.3
3
0.3
9.7
9
8
0.8
9.2
4
0.4
9.6
12
9
0.9
9.1
5
0.5
9.5
15
10
1.0
9.0

Bacterias/ml
(x108)
18
21
24
27
30

Parte II.
En cada matraz nefelomtrico se pondrn 50 ml de caldo de cultivo de triptosa o de
caldo Luria, y se esterilizaran. Despus de pasar la prueba de esterilidad, se inocularn
de 3 a 5 colonias bacterianas en cada matraz. Se pondrn a 37 oC en agitacin
moderada durante 18 a 24 horas. Cada 3 horas se leer la densidad ptica de cada
matraz en el fotocolorimetro. Se graficar la lectura de cada matraz en unidades Klett
contra el tiempo.
Con el mtodo de vaciado en placa se realizara el recuento de clulas viables, para lo
cual se toma con una pipeta un volumen conocido de 0.1 a 1.0 ml y se pasa a una caja
estril, despus se adiciona 20 ml de medio de agar nutritivo fundido, sobre la muestra,
y se mezcla bien mediante un suave movimiento giratorio de la placa sobre la superficie
de la mesa. Para este mtodo el organismo debe soportar brevemente la temperatura
del agar fundido a 45oC sin perder la viabilidad. Para obtener el nmero adecuado de
colonias, se debe diluir la muestra a contar. Es adecuado emplear varias diluciones
decimales. Es importante que se emple una pipeta diferente para cada dilucin.
Cada 12 horas se har vaciado en placa para contar el nmero de colonias.

V) RESULTADOS.

VI) DISCUSIN.

25

Prctica No. 8 Reacciones febriles

(Diagnstico serolgico de infecciones producidas por bacterias y rickettsias).
I) OBJETIVO ESPECFICO.
Demostrar que los examenes serolgicos (reacciones febriles) pueden ser un auxiliar
importante para el diagnstico de algunas enfermedades bacterianas, precisando que
es necesario ser cuidadoso en el empleo de estas pruebas indirectas.
II) INTRODUCCIN.
El propsito tradicional ha sido seleccionar casos sospechosos o portadores de fiebres
entricas de origen desconocido.
La prueba alcanz popularidad cuando las
metodologas de aislamiento y de identificacin estaban deficientemente desarrolladas.
La base de estas pruebas es el hecho de que cuando el organismo humano es invadido
por agentes infecciosos, el sistema inmune produce la respuesta inmune celular y la
humoral, en la segunda se generan diversos tipos de anticuerpos contra ellos. Los
anticuerpos aglutinantes que producen una reaccin inmunolgica macroscpica- se
manifiestan cuando se ponen en contacto con el antgeno especfico en los ensayos in
vitro.
Las reacciones serolgicas son de valor diagnstico de muchas enfermedades de
origen bacteriano: como fiebre tifoidea, paratifoidea, fiebre de malta, tifo y
enfermedades producidas por rickettsias, as como en las estreptoccicas, etc. Tambin
se indican en las enfermedades virales, micticas y parasitarias.
Para la deteccin de anticuerpos se usa el suero del paciente y antgenos purificados,
la reaccin inmunolgica se clasifica en las tres siguientes :
1.REACCIN DE WIDAL

2. REACCIN DE HUDDLESON
3. REACCIN DE WEILH-FELIX

Salmonella typhi o
Salmonella typhi h
Paratyphi (a)
Paratyphi (b)
Brucella abortus
Proteus ox-19
Tifo (rickettsias)

(somtico)
(flagelar)
(flagelar)
(flagelar)

III) MATERIAL BIOLOGICO Y DE LABORATORIO.

1.- Suero problema positivo; 2. Suero problema; equipo para reacciones febriles con 6
antgenos y 2 sueros testigo.
2.- Placa de vidrio y pipetas serolgicas; palillos; gradilla; agitador rotatorio; lupa; fuente
de luz directa.
IV) DESARROLLO.
MTODO RPIDO DE AGLUTINACIN MACROSCPICA EN PLACA.
a) Los antgenos deben estar a temperatura ambiente y agitarse ligeramente antes de
usarse
b) Marcar el lugar de cada antgeno en la placa y despus colocar sobre cada rea una
gota del suero problema.
c) Depositar una gota de antgeno en cada uno de los sueros, mezclar con un palillo, y
agitar la placa durante 2 min.
26

d) Hacer las lecturas frente a una buena fuente de luz indirecta observando la
aglutinacin macroscpica; si es necesario, auxiliarse con una lupa.
e) Valorar los resultados. Los resultados positivos se pueden semicuantificar
procediendo a hacer diluciones de los sueros.
V) RESULTADOS

VI) DISCUSIN.

27

Prctica No. 9 Prueba (presumptiva) (diagnstica) de tuberculosis.

(reaccion de p. p. d.)
I) OBJETIVO ESPECFICO.
Conocer como se detectan los ttulos de anticuerpos, contra un derivado purificado de
protena (P.P.D.), extrado del bacilo de la tuberculosis.
II) INTRODUCCIN.
Hay una variedad de pruebas inmunodiagnsticas para la tuberculosis que se basan en
el reconocimiento de la respuesta especfica del husped hacia el organismos
infectante. Histricamente la primera prueba fue la prueba cutnea de la tuberculina.
Los inconvenientes de esta prueba incluyen su incapacidad para detectar o para
distinguir la enfermedad activa, de una sensibilizacin sufrida tiempo atrs por lo que,
en este aspecto, tiene una agudeza predictiva no conocida.
En muchos individuos con tuberculosis pulmonar activa, se detectan ttulos altos de
anticuerpos, contra un derivado purificado de protena (P.P.D.), extrado del bacilo de la
tuberculosis por medio de la reaccin de Mantoux, de la prueba de elisa o por
reacciones de precipitina con polisacaridos.
El bacilo de Mycobacterium tuberculosis es un riesgo probado para cualquiera que se
expone a los aerosoles infecciosos que se producen en el laboratorio. La transmisin
nosocomial de los pacientes o de las muestras es de mucha importancia para el
personal de salud. Debido a la baja dosis infectiva para los humanos (Dosis infectiva al
50% es ; a 10 bacilos) y a que en algunos laboratorios la tasa de aislamiento de las
muestras clnicas es mayor al 10%, los esputos y las dems muestras clnicas
provenientes de los pacientes confirmados o con sospecha de ser infecciosos deben
ser considerados potencialmente infecciosos y por lo tanto manejados con
precauciones apropiadas.
MATERIAL Y MTODO.
1.
2.
3.
4.

Una jeringa de insulina

Torundas con alcohol
Una regla milimtrica
Vacuna de P.P.D.

TCNICA DE LA APLICACIN
1. Desinfectar la piel de la cara interna del antebrazo izquierdo con torunda y alcohol
2. Aplicar una dcima de tuberculina hasta que se formar el clsico botn con
apariencia de cscara de naranja.
3. Sacar la aguja desplazando previamente, el pliegue de la piel, para evitar la salida
de la vacuna. No se debe presionar el rea.
4. Marcar con un lapicero, el crculo donde se aplic la vacuna
5. Hacer la lectura a las 24, 48 y 72 horas empleando luz del da.
28

6. Medir con una regla milimtrica el dimetro de la zona enrojecida, si es mayor de 5

mm. la reaccin ser positiva y si es menor de 5 mm. la reaccin es negativa.
RESULTADOS

DISCUSIN.

29

Prctica No. 10 Diagnostico serolgico de la sfilis.

(Pruebas de VDRL y RPR reacciones luticas).
I) OBJETIVO ESPECFICO.
Que el alumno sepa que las pruebas no treponmicas empleadas para screening
tienen la ventaja de ampliamente disponibles, fciles, baratas, convenientes para
realizar en grandes nmeros de muestras y tiles para determinar la eficacia del
tratamiento. De igual manera que el alumno conozca sus limitaciones (falsos positivos)
y conocer las otras metodologas complementarias.
II) INTRODUCCIN.
El genero Treponema incluye cuatro patgenos humanos y al menos seis patgenos no
humanos. En los exudados de las lesiones sifilticas primarias o secundarias se
encuentran numerosos treponemas, por lo que la deteccin de los organismos con la
morfologa y motilidad caracterstica se considera an el nico medio definitivo del
diagnstico. La transmisin ocurre a travs del contacto directo con las lesiones activas.
Las pruebas para sfilis se agrupan en tres categoras: examen microscpico directo,
las pruebas no treponmicas empleadas para screening y las treponmicas las cuales
son confirmatorias. De igual manera el diagnstico se divide en : definitivo, presumptivo
y sugestivo.
Pruebas estandar para sifilis.
Tipo de prueba Nombre (abreviado) de la prueba.
No treponmica VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) en portaobjeto
USR (Reagina srica no calentada)
RPR (Reagina rpida en plasma), crculo de 18 mm en tarjeta.
TRUST (prueba de suero no calentado rojo toluidina
Treponmica
FTA-ABS (absorcin de anticuerpos treponmicos fluorescentes
FTA-ABS-DS (igual pero en tincin doble)
MHA-TP (Ensayo de microhemaglutinacin para anticuerpos de Treponema pallidum.
La tcnica de VDRL se debe realizar en el segundo perodo o, despus de la primera
infeccin. Todas las pruebas no treponmicas emplean antgeno compuesto de una
solucin alcohlica con cantidades determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina
suficientes para producir una reactividad estndar.
Estos antgenos son de origen no treponmico, detectan anticuerpos de clase IgM e
IgG , producidos contra material lipoideo liberado de las clulas daadas del paciente
durante la infeccin del treponma (conocidas como reaginas), as como tambin a
lpidos y lipoprotenas producidos por los treponemas.
III) MATERIAL BIOLOGICO Y DE LABORATORIO.
Tripie
Mechero Bunsen
Pipetas serolgicas
Gradilla
Vaso de precipitado
Placa escavada
Palillos
Jeringas de calibre 23 Agitador de Massini
Termometro Pipetas desechables
Tela de asbesto

30

Portaobjetos
Microscopio
Suero problema inactivado a 60C
durante 5 min y equipo comercial para
determinar VDRL.

INDICACIONES DE LA TCNICA PARA V.D.R.L.

La preparacin del antgeno se realiza segn el instructivo. Se debe mantener de 2C a
8C sin congelar, no deben estar caducados, y slo son para diagnstico in vitro.
Se emplea suero o plasma del paciente en ayunas (no lipmicos), sin inactivar, sin
hemlisis o contaminadas. S el anlisis no se realiza en el momento conservar la
muestra a 20C durante un mximo de 4 a 8 horas.
IV) DESARROLLO.
Sueros problema:
1. Colocar una gota de suero problema en un porta objetos o placa.
2. Aadir una gota de antgeno previamente agitado, no es preciso mezclar.
3. Rotar el porta objetos en el agitador circular (de Massini) durante 4 min.
Sueros controles:
4. Colocar sobre un portaobjetos, o una placa, 5
dcimas de suero positivo
inactivado y tambin de suero negativo, ms una gota de antgeno dosificado con
una jeringa con aguja calibre 23. Enseguida se mezcla en el agitador de Massini
durante 8 minutos.
5. Observar al microscopio:
a) Si las micelas del antgeno, que tienen forma de bastoncitos, aparecen repartidas
uniformemente en el campo , la reaccin es negativa .
b) Si floculan y hay formacin de grumos, la reaccin es positiva. Es conveniente
realizar la semi-cuantificacin repitiendo la prueba pero empleando diluciones
seriadas del suero. La prueba se reporta indicando la dilucin en la que ya no se
presenta la floculacin.
c) INTERPRETACIN.
a)
b)
c)

Agregados grandes o medianos suero reactivo

Agregados finos y dispersos - suero dbilmente reactivo
No se observan agregados suero no reactivo

Se pueden producir falsas reacciones positivas en pacientes con infecciones distintas a

la sfilis. Para confirmar los resultados presumptivos se recomienda realizar una
prueba treponmica.

V) RESULTADOS,
VI) DISCUSIN.

31

Apndice sobre preparacin de reactivos.

Agar urea de Christensen:
Peptona
1g
Glucosa
1g
NaCl
5g
Fosfato monopotsico
2g
Urea
20 g
Rojo de fenol
0.012 g
Agar
15 g
Reactivo de Iodo:
Iodo
2.03 g
Ioduro de potasio
53.2 g
Disolver en 100 ml de agua y conservar en frasco de color ambar.
Buffer de fosfatos 0.05 M, pH 5.8:
KH2PO4
6.25 g
K2HPO4
0.70 g
Disolver en un litro de agua destilada.
Caldo Luria, (Luria Broth).
Extracto de levadura
NaCl
Peptona de casena

10 g/L
5 g/L
10 g/L

Agar Luria, (Luria Agar).

Agar

13 g/L

32

Apndice Tablas.
Tabla 1. Mtodo para informar
0
1-2/300 campos
1-9/100 campos
1-9/10 campos
1-9/ campo
Ms de 9/campo

el nmero de B.A.A.R. observados en frotis teidos.

Negativo para AFB
(-)
No observado
(+ -)
No. promedio /100 campos
(1+)
No. Promedio/10 campos
(2+)
No. Promedio / campo
(3+)
Ms de 9/campo
(4+)

No. de AFB
observados
Mtodo de
informe
CDC

Se supone examen a 800X-1000X. Aumentos menores de 800X deben ser claramente establecidos.
La comparacin es relativa de especimenes mltiples.
Tabla 2. La clula bacteriana puede tener uno o ms flagelos dispuestos en distinta manera, en base a este se
clasifican:
Flagelo en un extremo del cuerpo celular
Polar
p. ej:
Flagelos en ambos extremos
Anftrica
p. ej:
Penacho de flagelos en un extremo
Lofotrica
p. ej:
Flagelos alrededor de la clula sin distribucin
Pertrica
p. ej:

Tabla 3. Definicin clnica de sepsis.

1. Bacteriemia gramnegativa sospechada o documentada.
2. Fiebre o hipotermia.
3. Taquicardia.
4. Taquipnea.
5. Hipotensin o por lo menos dos de los siguientes seis signos.
a) Acidosis metablica inexplicable.
b) Hipoxia arterial.
c) Insuficiencia renal aguda.
d) Anormalidades recientes de la coagulacin de tipo inexplicable, como incremento del tiempo de
protrombina, del tiempo de tromboplastina parcial o trombocitopenia.
e) Disminucin repentina de la agudeza mental.
f) Indice cardiaco elevado con resistencia vascular sistmica baja.

Tabla 4. Criterios modificados de Jones para el diagnstico de fiebre reumtica aguda.

Principales manifestaciones
Carditis.
Eritema marginado.
Poli-artritis.
Ndulos subcutneos.
Corea de Sydenham.

Manifestaciones menores.
Evidencia clnica
Evidencia de laboratorio.
Artralga.
Protena C reactiva elevada.
Fiebre.
Incremento de la tasa de
Fiebre reumtica previa
33edimentacin de eritrocitos.
33edimentac cardiaca reumtica.
Leucocitosis.
Intervalo P-R prolongado.

Para diagnosticar la fiebre reumtica aguda es preciso documentar dos manifestaciones importantes o una importante y dos
menores. Tambin es necesario que haya evidencia de una infeccin anterior por estreptococos del grupo hemoltico beta A, la cual
se establece mediante un cultivo farngeo positivo; evidencia del incremento del ttulo de anticuerpos para antgenos
estreptoccicos (ttulos de antiestreptolisina O, antihialuronidasa, anti-DNA-asa B y anti-NAD-asa) o evidencia de que el paciente
sufri fiebre escarlatina en fecha reciente.

Anexo I. Procedimientos para realizar prcticas en el laboratorio de ecologa mdica I .

33

La bioseguridad en el laboratorio.
I.
I) OBJETIVOS ESPECFICOS.
1.- Describir los riesgos del trabajo en un laboratorio de microbiologa.
2.- Expresar los lineamientos mnimos de bioseguridad, requeridos para el laboratorio
de microbiologa
3.- Exponer los riesgos del manejo de productos biolgicos y de cultivos bacterianos.
II.
Medidas de seguridad en el laboratorio.
El elemento ms importante de la seguridad en el laboratorio es el trabajo apegado a
buenas prcticas y tcnicas microbiolgicas, ya que la actividad que se realiza en el
laboratorio de microbiologa siempre implica riesgos.
El principal riesgo al trabajar con material biolgico patgeno es el de infectarse, y al no
actuar adecuadamente provocar la diseminacin de los microorganismos, pudiendo
alcanzar proporciones muy peligrosas la contaminacin del lugar de trabajo.
Se puede adquirir una infeccin por contaminacin de los ojos, la boca, soluciones de
continuidad de la piel o a travs de manos contaminadas.
En la poca actual, ms que nunca, es fundamental la implementacin de programas
de seguridad para el manejo de muestras y material biolgico, donde las principales
fuentes de riesgo para la contaminacin con productos biolgicos son:
1.- El incremento en el nmero de microorganismos posterior a su cultivo en el
laboratorio.
2.- los microorganismos presentes en sangre y lquidos corporales, principalmente virus
como los de la hepatitis y el de la inmunodeficiencia humana, los cuales constituyen un
peligro cuando se tiene contacto directo con el lquido.
III.
Bio-seguridad en el laboratorio de microorganismos.
La bioseguridad es el manejo tcnico adecuado en el laboratorio, cuya eficacia refleja la
responsabilidad del personal y adems significa la proteccin individual. Su observancia
repercute en la calidad del trabajo del laboratorio, evitando contaminaciones que
pueden falsear los resultados del trabajo bacteriolgico. Ningn equipo de seguridad o
procedimiento por s mismo garantiza la seguridad y las personas deben conocer las
implicaciones de lo que estn haciendo y usar adecuadamente tanto el equipo como los
procedimientos.
Niveles de Bioseguridad.

34

Dependiendo de los agentes especficos que se manejen en el laboratorio, se describen

cuatro niveles de bioseguridad que consisten en la combinacin de tcnicas y
conductas en el laboratorio, equipo de seguridad e instalaciones, que deben ser las
adecuadas para el riesgo que impliquen los microorganismos que se manejen
regularmente en dicho laboratorio y las funciones que en el mismo se desarrollen.
Nivel de bioseguridad I (BSL-1).
Son laboratorios para trabajar con agentes microbianos vivos bien caracterizados, que
se sabe que no causan enfermedad en adultos sanos. Son adecuados para enseanza.
Nivel de bioseguridad II (BSL-2).
Son laboratorios de trabajo clnico, de diagnstico o de enseanza, con un espectro
mayor de agentes infecciosos presentes en la comunidad y que se asocian a
enfermedades humanas de severidad diversa. Entre los agentes que se trabajan en
este nivel de seguridad estn virus, por ejemplo Hepatitis B, bacterias como Salmonella
y parsitos como Toxoplasma. Los principales riesgos en estos laboratorios son:
accidentes tales como autoinoculacin, ingestin o exposicin de mucosas o piel al
agente infeccioso. Deben evitarse todos los procedimientos que impliquen formacin de
aerosoles y debe utilizarse equipo de contencin adecuada.
Nivel de bioseguridad III (BSL-3).
Son laboratorios para trabajo clnico, de diagnstico, enseanza, investigacin o
produccin de agentes potencialmente ms riesgosos, como micobacterias, virus de la
encefaltis, Coxiella. La autoinoculacin y la ingestin de microorganismos son los
principales riesgos.
Nivel de bioseguridad IV (BSL-4).
Son laboratorios para trabajo con microorganismos peligrosos o desconocidos, que
impliquen alto riesgo de contraer enfermedades letales. Entre los microorganismos que
deben trabajarse en laboratorios de este nivel tenemos al VIH, virus de Ebola y
micobacterias multirresistentes entre otros.

Anexo No. II

Conocimiento del material de laboratorio.

35

I) OBJETIVO ESPECFICO.
Al finalizar la prctica el alumno conocer el manejo adecuado y el material
indispensable para el desarrollo de las prcticas de microbiologa.
II) INTRODUCCIN.
En las dos dcadas pasadas se ha producido una explosin de nuevas tecnologas en
los laboratorios de microbiologa clnica. Estos cambios exceden en varios ordenes de
magnitud cualquier evento que haya sucedido durante los primeros 100 aos de
existencia de esta disciplina. Cinco reas especficas han sufrido estos cambios.
La identificacin bacteriana se realiza ahora a travs de sistema de utilizacin de
sustratos de manera miniaturizada, muchos de los cuales estn instrumentalizados,
tenemos por ejemplo la deteccin de productos del metabolismo bacteriano a travs del
mtodos cromatogrficos para la identificacin de microorganismos. Las pruebas de
susceptibilidad a los antimicrobianos se realizan comercialmente mediante
microdiluciones en caldos. Los estados de bacteremia y fungemia se detectan por
sistemas de cultivo de sangre que esta asistido por instrumentos. La cuarta rea es el
advenimiento de los inmunoensayos para el diagnstico de las enfermedades
infecciosas, los cuales detectan los anticuerpos o los antgenos. Este campo ha recibido
un beneficio inmenso derivado del descubrimiento de los anticuerpos monoclonales.
Finalmente, la tecnologa de sondas de cidos nuclicos ha permitido la deteccin e
identificacin molecular de los microorganismos.
En esta poca, los sistemas de cultivos celulares se han convertido en una poderosa y
versatil herramienta de la ciencia y la tecnologa, que ha permitido reproducir y
experimentar muchos modelos de enfermedades. Hoy, los cultivos a gran escala
permiten a la industria producir grandes lotes de vacunas, factores de crecimiento,
anticuerpos monoclonales, etc. con variaciones mnimas. Los cultivos a menor escala
permiten a los laboratorios clnicos detectar virus, rickettsias, micoplasmas y clamidias,
as como toxinas bacterianas y de esta manera asistir en el diagnstico clnico de las
enfermedades infecciosas.
III) MATERIAL DE LABORATORIO.
1. Tubo de ensayo con tapn de rosca
14 Cubre objetos
25 Microscopio
2. Tubo para bacteriologa
15 Probeta
26 Agitador de Massini
3. Matraz Erlen-Meyer
16 Embudo
27 Horno incubadora
4. Matraz baln de fondo plano
17 Frasco gotero
28 Tripie de metal
5. Vaso de precipitado .
18 Gradilla de metal
29 Mechero buncen
6 Matraz volumtrico con tapn esmerilado 19 Asa de platino
30 Lmpara para alcohol
7 Caja de Petri desechable
20 Lupa
31 Tela de alambre con
8 Caja de Petri de vidrio
21 Pizeta
asbesto
9 Pipeta serolgica
22 Soporte para tincin
32 Cesta de alambre
10 Placa para reacciones febriles
23 Soporte
para
11 Termmetro
preparaciones
12 Varilla de vidrio
24 Autoclave
13 Portaobjetos
IV) DESARROLLO. Se describir en material con que se cuenta en el laboratorio.
V) RESULTADOS.
VI) DISCUSIN.

36

Se describirn los principios fundamentales y los atributos o propiedades funcionales de

las tcnicas enumeradas en la introduccin. Se trata de obtener un conocimiento de
cmo trabajan las diferentes tcnicas y que problemas deben de considerarse antes de
emplearlas. Se pueden proveer numerosos ejemplos de aplicacin de esas tecnologas.

BIBLIOGRAFA:
37

Bsicas:
o

Manual de prcticas de laboratorio de microbiologa 2013 de la facultad

de medicina. Autor: Dr. Pedro gutirrez aguilar

Complementarias:
Blanco Torrent J & Galiano Arlandis J. Atlas de Coprologa (Digestin
y parasitos) 1. ed. Ed. Garsi S.A. A.E.F.A. Madrid Esp. 1989.

Craig Faust & Chester B. Parasitologia Clnica . 3a ed. Ed MDM S.A.

Mxico 2003.

Lennette; Balows; Hausler & Shadomy. Manual de Microbiologa

Clnica. 4ta. ed. Ed. Editorial Medica Panamericana. 1408 pag. 2002

Murray; Baron; Pfaller; Tenover / Yolken. Manual of clinical

microbiology. Sixth ed. Ed. ASM Press. 1482 pag. Espaa 2000

Jawetz & Melnick y Adelberg Microbiologa mdica 17a ed. Ed

Manual moderno Mxico D,F 2002

Wiedbrank and Farkas. Molecular methods for virus detection.

Academic Press, 1995.

Universidad Veracruzana Fac. Medicina Manual de laboratorio de

Microbiologa , Veracruz Mex. 2002

Zaman . Atlas color de Parasitologa clnica 2. ed. Ed

Panamericana 1992.

Ley de salud . Diario de la federacin (normas de laboratorio

clnicos) Abril 2001

Paginas de Internet:

http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAH
UATL_RAMOS_MARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.pdf

http://www.joseacortes.com/practicas/

http://74.125.47.132/search?
q=cache:mDI6aCejWhQJ:www.uv.es/castillg/practicasnutricion.doc+practi
cas+de+laboratorio+de+microbiologia&cd=7&hl=es&ct=clnk&gl=mx
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE MEDICINA.

38

REGIN VERACRUZ.

CONTROL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA

Nombre de la practica
catedrtico

Fecha acreditada

Sello de laboratorio

PRACTICAS ACREDITADAS: __________________

PRACTICAS NO CONCLUIDAS: ________________

ACREDITACIN DEL CURSO:___________________

FIRMA DEL CATEDRTICO: _____________________

39

Firma