Efek dari terapi oksitoksin pada jaringan eksplan,

plasma, dan peritoneum terhadap parameter MCP1,

TNF alpha, dan histopatological pada model tikus
dengan endometriosis
1. Pendahuluan
Endometriosis adalah penyakit ginekologi di mana jaringan yang secara histologis
mirip dengan endometrium tumbuh di luar rongga rahim . Etiopathogenesis pastinya masih
belum diketahui . Beberapa gejala klinis dari wanita yang terkena endometriosis adalah
infertilitas dan nyeri panggul. Mengingat bahwa menstruasi retrograde sering ditemui pada
wanita usia reproduksi, penelitian baru-baru ini telah mengungkapkan bahwa faktor hormonal ,
imunologi , genetika , dan lingkungan juga terlibat dalam patogenesis penyakit ini.
Angiogenesis dari endometrium ektopik merupakan langkah yang penting dalam
perkembangan endometriosis. Sebagai contoh: Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
menstimulasi proliferasi dan migrasi sel endotel, dan ditemukan peningkatan kadar VEGF dalam
cairan peritoneum wanita yang terkena endometriosis. Sementara itu sekresi VEGF oleh
makrofag peritoneal dan jaringan endometriosis ektopik diatur oleh hormon-hormon steroid
ovarium dan adanya hipoksia. Pada pemeriksaan cairan peritoneal dari perempuan yang terkena
endometriosis mengandung peningkatan konsentrasi makrofag yang aktif dengan gangguan
fungsi scavenger dan peningkatan kemampuan untuk melawan proses apoptosis . Kelangsungan
hidup makrofag ini dapat mempengaruhi kelangsungan hidup dan proliferasi jaringan
endometrium ektopik.
Penelitian penelitian yang ada telah menghubungkan berbagai sitokin dan kemokin
dengan terjadinya endometriosis . TNF - adalah sitokin utama yang memainkan peran penting
dalam berbagai proses inflamasi . Fungsi utamanya adalah untuk memulai kaskade sitokin dan
faktor inflamasi lainnya . Selain itu, TNF juga termasuk dalam patogenesis dan patofisiologi
endometriosis. Monocyte chemotactic protein ( MCP ) -1 adalah - kemokin yang secara khusus
menyebabkan kemotaksis dan aktivasi dari fagosit mononuclear. . Telah dilaporkan bahwa terjadi
peningkatan kadar kemokin ini dalam cairan peritoneum wanita yang terkena endometriosis

Oksitosin ( OT ) , hormon nanopeptida neurohypophysial dan neurotransmitter ,

disintesis di inti supraoptik dan paraventrikular dari hipotalamus. Reseptor oksitosin dilaporkan
terekspresi dalam sel otot polos dan sel epitel lesi endometriosis peritoneal dan kista ovarium
endometriosis. Meskipun efisiensi terapeutik atosiban , antagonis reseptor oksitosin ,
dikonfirmasi dalam laporan menggunakan model tikus , banyak penelitian telah melaporkan
peran regulasi OT selama respon imun dan inflamasi seperti pada penyembuhan luka dan sepsis
eksperimental. berdasarkan latar belakang ini , kami bertujuan untuk mengetahui pengaruh yang
mungkin dari oxytocin pada model tikus endometriosis . Kami mencoba untuk menilai efek
keseluruhan oksitosin pada endometriosis : apakah itu benar-benar memperburuk endometriosis
jika penyumbatan reseptor oksitosin dengan atosiban memiliki efisiensi terapeutik yang
signifikan , atau apakah itu melemahkan endometriosis dengan efek anti inflamasi nya ?
Menggunakan tikus Model endometriosis , kami meneliti efek pengobatan OT pada ukuran
eksplan endometrium ; cairan peritoneal dan tingkat plasma MCP - 1 , TNF - , dan VEGF ; dan
parameter histopatologi pada sel endometrium ektopik
2. Metode
Dua belas Tikus albino dewasa jenis Sprague Dawley dengan berat 180-260 g
digunakan pada penelitian ini . Hewan-hewan ini di beri makan ad libitum . Mereka
dikandangkan berpasang - pasangan di kandang baja yang dikontrol suhu nya dengan suhu 22
2 C dengan siklus terang gelap 12 jam. protokol yang digunakan dalam penelitian ini telah
disetujui oleh Institutional Hewan Perawatan dan Komite Etik dari Ege University. Siklus
esterogen dari tikus diperiksa dengan apusan vagina pada interval 6-12 jam . apusan Sampel
dievaluasi dengan prosedur pewarnaan Papanicolaou. Endometriosis di induksi dengan cara
pembedahan dengan kondisi aseptic seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Setelah 4 minggu , 12 tikus dieksplorasi dengan pembedahan untuk memvisualisasikan
eksplan endometriosis. Kehadiran fokus endometriosis peritoneal dikonfirmasi di semua subjek
penelitian . Volume dari setiap fokus dihitung dengan menggunakan rumus ellipsoid
konvensional : V ( mm3) = 0,524 x W x T x L , di mana W = lebar , T = ketebalan , dan L =
panjang ( semua dalam milimeter ). Jaringan difoto dengan kamera digital , dan pengukuran
dicatat.setelah operasi kedua , semua tikus diizinkan 3 hari istirahat, setelah itu mereka dibagi
secara acak menjadi 2 kelompok . Ukuran fokus endometriosis mirip sebelum pengobatan pada

kedua kelompok . Masing-masing kelompok dirawat selama 4 minggu . Kelompok 1 diberikan

larutan isotonik NaCl sebanyak 1 mL /kg/hari secara i.m. , dan kelompok 2 diberikan OT
( Pituisan1 , Ege Vet ) pada 160 g /kg/ hari secara intramuscular.
Pada akhir masa pengobatan , laparotomi yang ketiga dilakukan dengan anestesi untuk
mengukur ukuran eksplan dan mendapatkan lavage peritoneal , jaringan , dan sampel darah .
Proses ini diringkas dalam Gambar . 1. Ukuran eksplan diukur lagi dengan metode caliper yang
sama dengan investigator yang sama secara blind untuk pemeriksaan kelompok tersebut . Implan
ektopik dikonfirmasi dengan menggunakan pewarnaan untuk cytokeratin ( penanda sel epitel ) ,
CD10 ( seperti penanda stroma sel ) dan aktin otot polos ( penanda sel otot polos) . Implan difoto
dengan kamera digital. Lavage peritoneal dilakukan dengan 1 mL NaCl larutan isotonik . darah
sampel dikumpulkan ke tabung yang mengandung heparin dengan cara pengambilan tusukan di
jantung dengan jarum suntik 1mL . Implan dipotong dan difiksasi dengan formalin 10 % .
Semua tikus diterminasi pada akhir prosedur .

Fig. 1. A flow chart describing experimental endometriosis process and measurements.

Darah dan cairan peritoneal disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit pada suhu
kamar dan disimpan pada suhu -20 C sampai pengukuran sitokin . Sampel dari setiap hewan
yang diproses dalam rangkap sesuai dengan panduan produsen '. batas deteksi untuk kit ELISA
masing-masing adalah < 2 , < 15 , dan < 1,7 pg / mL ,. Jaringan yang telah dikeluarkan tersebut
difiksasi dalam formalin 10% ( Merck ) ,dibenamkan dalam parafin setelah dehidrasi rutin , dan
potongan dengan ketebalan 5 m disiapkan dengan mikrotom ( Leica RM 2145 ) .potongan
paraffin dari setiap autograft diwarnai dengan Periodic Acid Schiff (Metode PAS - Hotchkiss
McManus , Bio - Optica ) dan diperiksa dengan semikuantitatif di bawah mikroskop cahaya ,
seperti yang dijelaskan sebelumnya. Ketahanan sel epitel di implan endometrium poorly
preserved epithelium ; 2 , moderately preserved epithelium dengan infiltrasi leukosit; dan 3 ,
well-preserved epithelial layer..
Untuk imunohistokimia , potongan diinkubasi dengan

H 2 O2

( 10 % ) selama 30

menit untuk menghilangkan aktivitas peroksidase endogen dan kemudian diblok dengan 10 %
serum kambing yang normal ( Invitrogen ) selama 1 jam pada suhu kamar . Setelah itu ,potongan
diinkubasi di dalam antibodi primer ( VEGF , cytokeratin , CD10 , aktin otot polos , Santacruz
Bioteknologi ; 1/1000 ) selama 24 jam pada suhu 4 C .Deteksi antibody dilakukan dengan
Histostain -Plus kit ( Invitrogen ) terhadap IgG kelinci dan 3,30 diaminobenzidin ( DAB)
digunakan untuk memvisualisasikan produk akhir . Semua potongan dicuci di PBS dan difoto
dengan kamera digital Olympus C 5050 dipasang di mikroskop Olympus BX51 . Untuk
menghitung VEGF , cytokeratin , CD10 , aktin positif sel otot polos dihitung dengan perbesaran
40 di potongan acak . untuk masing-masing kelompok VEGF , cytokeratin , CD10 , sel otot
polos aktin positif dan aktin negatif dicatat dan kemudian rasio sel positif dihitung. Perubahan
apoptosis dievaluasi dengan Apoptag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit ( TUNEL ,
Chemicon - Millipore ) , seperti yang dijelaskan sebelumnya. untuk menghitung indeks apoptosis
, sel TUNEL positif dihitung di bawah 40 pembesaran di potongan acak . Jumlah positif dan Selsel negatif dicatat untuk masing-masing kelompok , dan rasio TUNEL sel positif dihitung.
Data dianalisis dengan SPSS untuk Windows , versi 15.0 . normalitas nilai distribusi
Volume lesi ditentukan dengan uji Shapiro - Wilk .variabel yang tidak - terdistribusi normal
dianalisis dengan Mann - Whitney U -test . t-test digunakan untuk mengevaluasi perbedaan
antarkelompok . Data disajikan dengan rata-rata standard deviasi. Perbedaan dianggap
signifikan secara statistik pada p < 0,05 .

3. Hasil
Pembentukan implan endometriosis ektopik dideteksi pada operasi kedua dalam semua
tikus . Tabel 1 melaporkan ukuran implan pra dan pasca perawatan, level sitokin dan hasil
imunohistokimia pada kelompok yang berbeda . Gambar . 2 menunjukkan Gambar perwakilan
dari regresi ukuran implan setelah Pengobatan OT . Pengobatan PL secara signifikan
menurunkan kadar VEGF , MCP 1 dan TNF - dalam plasma dan cairan peritoneal
dibandingkan dengan kontrol ( Tabel 1 ) .

Gambar . 3 mewakili konfirmasi imunohistokimia dari Implan ektopik oleh

cytokeratin , CD 10 dan aktin otot polos.Kedua cytokeratin dan CD 10 immunoreaktivitas dari
kelompok control pada immunoreaktivitas aktin otot polos antara dua kelompok . Lesi
endometriosis diberi skor sesuai dengan kriteria

Kriteria histologis untuk diagnosis

endometriosis , atas dasar adanya epitel kelenjar yang dikelilingi oleh jaringan stroma.
Gambar . 4a dan b menunjukkan potongan yang diwarnai dengan PAS dari OT- dan
saline treated implan endometriosis . Dibandingkan dengan kontrol , kelompok PL

menunjukkan lapisan poorly preserved epithelial. Oleh karena itu , skor histologis secara
signifikan lebih rendah pada kelompok OT( p = 0,007 ) ( Tabel 1 ). immunoreaktivitas VEGF
ditentukan dalam dan sel-sel kelenjar dari lesi endometriosis di semua tikus .
Gambar . 4c dan d menunjukkan perubahan dalam immunoexpression VEGF di salinetreated dan OT treated tikus . Dibandingkan dengan kontrol , kelompok OT menunjukkan
kurang signifikan immunekspresi VEGF ( p = 0,000 ) ( Tabel 1 ) . Perubahan apoptosis
dievaluasi oleh TUNEL imunohistokimia di implan endometriosis dari saline- dan OT-treated
tikus ( Gambar . 4e dan f ) . Indeks apoptosis dihitung dalam stroma , kelenjar , dan sel-sel
mononuklear pada kedua kelompok ( Tabel 1 ) .

4. Diskusi
Vincent du Vigneaud , yang pertama kali membuat dan memsintesis OT , Menjelaskan
bahwa hormon ini sebagai ' hormone utama dalam pengkontraksi uterus dan pengeluaran susu
dari posterior pituitary gland. Meskipun OT umumnya digunakan dalam praktek kebidanan
sehari-hari seperti yang dinyatakan oleh du Vigneaud , studi terbaru telah mengidentifikasi
banyak tambahan peran hormon tersebut , seperti inotropik negatif dan chronotropic ,aktivitas
anti - inflamasi , dan antioksidan dalam proses seperti natriuresis penurunan tekanan darah ,
penyembuhan luka , parasimpatis neuromodulation , dan respon imun. Studi sebelumnya telah
mengevaluasi hubungan antara OT dan endometriosis , namun laporan tersebut terbatas pada
menjelaskan baik kehadiran reseptor OT dalam lesi endometriosis peritoneal atau efek inhibisi
reseptor spesifik pada adenomiosis dan endometriosis. Mechsner et al . dan Guo et al .
melaporkan korelasi positif dengan dismenore dan ekspresi reseptor oksitosin pada wanita
dengan adenomiosis, tetapi tidak ada Data mengenai korelasi dengan dismenore dan ekspresi
reseptor oksitosin pada pasien dengan endometriosis . Simsek et al . melaporkan bahwa dalam
model tikus endometriosis , atosiban , sebuah antagonis reseptor oksitosin,telah menunjukkan
efisiensi terapetik bermakna pada endometriosis. Studi kami , bagaimanapun, menunjukkan
bahwa blokade reseptor oksitosin yang hadir dalam lesi endometriosis peritoneal tidak
mekanisme utama untuk mengobati endometriosis , karena oksitosin menurunkan ukuran ektopik
Ukuran implan endometrium daripada memperburuk endometriosis . untuk Pengetahuan kami,

ini adalah studi pertama yang menyelidiki efek langsung Pengobatan OT pada endometriosis ,
dan mekanisme yang mungkin akan disebutkan di bawah

Di sini , kami menunjukkan bahwa ukuran endometriosis ektopik implan menurun

dengan pengobatan OT dalam eksperimen endometriosis tikus percobaan . Penurunan ini juga
dikonfirmasi oleh pewarnaan imunohistokimia seperti yang disebutkan dalam literatur tersebut
yaitu dengan cytokeratin , CD10 dan aktin otot polos. Kami juga menemukan bahwa pengobatan
OT secara signifikan menurunkan kadar VEGF , MCP - 1 , dan TNF peritoneal dan plasma.
Pada kelompok kontrol, kadarnya lebih tinggi bermakna daripada kelompok normal yang yang
belum di induksi endometriosis . OT treated implan menunjukkan penurunan immunostaining
VEGF , yang menunjukkan potensi efek antiangiogenesis OT . Namun, efek terapi dari OT pada
endometriosis mungkin didukung oleh peningkatan apoptosis sel mononuklear. Karena POT
memiliki efek langsung dan tidak langsung yang signifikan pada tikus endometriosis percobaan ,
kita berspekulasi bahwa OT bisa berfungsi sebagai modalitas pengobatan yang potensial untuk
endometriosis.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa OT memberikan efek positif pada endometriosis
melalui efek anti inflamasi dan mengurangi ukuran implan endometriosis ektopik . Protein
reseptor dan mRNA OT telah diidentifikasi pada monosit dan makrofag manusia. Fagositosis
sperma oleh makrofag telah diusulkan sebagai mekanisme yang mungkin untuk endometriosis
terkait infertilitas. Pilihan pengobatan untuk endometriosis yang didasarkan pada penekanan
proses ovulasi , seperti medroksiprogesteron asetat , danazol , kontrasepsi oral , dan hormone
gonadotropin -releasing agonis , efektif mengurangi Ukuran lesi endometriosis dan nyeri panggul
, tetapi mereka tidak memberikan manfaat untuk endometriosis terkait infertilitas. Temuan
Penelitian ini menunjukkan bahwa peningkatan apoptosis pada makrofag dengan OT mungkin
menjadi pilihan pengobatan baru untuk infertilitas terkait endometriosis.
MCP - 1 adalah sitokin dan faktor kemotaktik utama yang merangsang migrasi dan
ketahanan hidup monosit dari darah perifer ke rongga peritoneum. MCP - 1 diproduksi oleh
sejumlah sel , termasuk sel-sel endothelial , fibroblas , monosit , limfosit , Sel-sel otot polos , dan

bahkan sel-sel tumor. TNF - diketahui dapat merangsang angiogenesis dan peradangan pada
Perempuan dengan endometriosis . Peningkatan kadar TNF - telah diamati di cairan peritoneum
wanita dengan endometriosis , yang berkorelasi dengan tingkat keparahan penyakit . Penelitian
terbaru telah melaporkan bahwa pengobatan dengan OT dapat mempengaruhi proses inflamasi
dengan mengurangi kadar MCP - 1 , TNF - , dan sitokin lainnya.

Lesi endometriosis sangat bervaskularisasi , dan angiogenesis diakui merupakan

langkah penting untuk pembentukan endometriosis. Mediator penting dari angiogenesis adalah
VEGF . Growth Factor ini merangsang proliferasi sel endotel dan migrasi , dan telah dilaporkan
peningkatan VEGF

dalam cairan peritoneal perempuan dengan endometriosis. Makrofag

peritoneum , sel-sel mesothelial peritoneal , dan jaringan endometriosis ektopik adalah sumber
utama dari VEGF di endometriosis. Studi terbaru berdasarkan tatalaksana endometriosis melalui
agen penekan ovarium tradisional atau sejumlah kandidat agen dalam model endometriosis
eksperimental menemukan hubungan di antara penurunan kadar VEGF dan pengecilan dari
jaringan endometriosis ektopik. Sekresi VEGF di atur oleh steroid ovarium dan hipoksia, dan
efek hipoksia juga menyediakan tahap pertumbuhan dan perlengketan dari autolog endometrium
pada endometriosis ektopik.
Meskipun ada data yang bertentangan tentang efek OT pada kadar VEGF , Kaczmarek
et al . melaporkan bahwa OT menurunkan kadar VEGF dalam sel stroma endometrium babi.
mereka mengklaim bahwa dosis tinggi OT efektif dalam penghambatan sekresi VEGF dan
ekspresi mRNA. Szeto et al . melaporkan bahwa OT melemahkan stres oksidatif pembuluh darah
dan peradangan. Ahmed et al . melaporkan bahwa efek perlindungan dari PL melibatkan
pemeliharaan kapasitas antioksidan dalam melindungi jaringan terhadap stres oksidatif. Selain
itu, telah ditunjukkan bahwa oksitosin menyebabkan pelepasan NO. efek antiangiogenic dan
antioksidan OT mungkin merupakan suatu mekanisme dari

efek hormone tersebut pada

endometriosis dalam tikus percobaan.

Kami menduga bahwa OT melemahkan endometriosis dengan memicu beberapa
mekanisme secara simultan seperti mengurangi kadar sitokin proinflamasi , mengurangi ukuran
jaringan endometriosis ektopik, dan meningkatkan apoptosis sel-sel mononuklear . Cassoni et al .
melaporkan bahwa , dalam percobaan in vitro , OT secara signifikan menghambat proliferasi sel
kanker endometrium manusia. Efek antiproliferatif dari OT dimediasi oleh intraseluler cAMP
dan protein kinase A , sistem transduksi sinyal yang berbeda dari Ca2 + + sistem inositol yang
terlibat dalam regulasi kontraksi miometrium dan sel mioepitel. banyak agen kandidat telah
diusulkan untuk pengobatan endometriosis berdasarkan pathogenesis endometriosis yang
didasari dari model eksperimental . Usaha yang mendasar telah dilakukan untuk menuju
penurunan ukuran lesi endometriosis ektopik dan penghambatan sitokin proinflamasi oleh
berbagai agen.

Meskipun studi ini adalah unik karena evaluasi efek OT pada model endometriosis ,
salah satu keterbatasan penelitian ini adalah sedikitnya jumlah hewan pada tiap kelompok . Uji
klinis prospective terkontrol diperlukan dengan jumlah lebih besar untuk menjelaskan topik .
Sebagai kesimpulan, kami berspekulasi bahwa OT mungkin merupakan sebuah
kandidat baru agen terapi untuk endometriosis . Karena pengobatan OT meningkatkan apoptosis
sel mononuklear , juga dapat menurunkan fagositosis sperma dan dapat memberikan kontribusi
untuk pengobatan endometriosis yang berhubungan dengan infertilitas . Penelitian lebih lanjut
diperlukan , untuk memvalidasi efektivitas pendekatan ini dalam praktek klinis .