LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK DASAR LABORATORIUM (TDL)

MIKROBIOLOGI
UJI HEMAGLUTINASI (HA)
UJI HEMAGLUTINASI INHIBITION (HI)
UJI ELISA

Oleh:

Makbruri
NPM. 1506805572

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA
JAKARTA
2016
PRAKTIKUM 1

Uji Hem-Aglutinasi (HA)

A. Waktu Pelaksanaan
Selasa, 15 Maret 2016, Pukul 11.00 WIB
B. Tujuan
Tujuan praktikum ini untuk mengukur titer HA sediaan virus yang akan
digunakan untuk uji Hambatan aglutinasi (HI).

C. Prinsip
Beberapa virus manusia mempunyai kemampuan untuk berikatan dengan
permukaan sel darah merah dari spesies berbeda. Adanya ikatan antara virus
(antigen) dengan sel darah merah (eritrosit) akan menyebabkan terjadi
hemaglutinasi.

Gambar 1: Reaksi Uji hemaglutinasi

D. Landasan teori
Virus adalah suatu genom yang tertutup dalam selubung protektif. 1 Virus
hanya mengandung salah satu asam nukleat saja (DNA atau RNA). Replikasi
virus memerlukan asam nukleat saja. Virus memerlukan host untuk bias
berkembang biak2. Pada luar hospes, virus terdapat sebagai partikel virus, yaitu
virion. Virion terdiri dari, atas: asam nukleat dan selubung protein yang disebut
kapsid. Partikel virus ini disebut nukleocapsid. Virus dapat merusak seluruh
kompleks sel dan menimbulkan kerusakan jaringan, bercak-bercak nekrosis dan
kepingan lisis. Umumnya hospes virus, yaitu: tumbuh-tumbuhan, hewan dan
mikroorganisme.3
Uji Hemaglutinasi (HA) atau Hemaglutination Test (HA Test) terjadi pada
virus yang memiliki hemaglutinin pada permukaan partikel virus, jika berikatan
dengan reseptor khusus pada eritrosit. Hasil dari uji HA dapat diperoleh dengan
cepat, hasil dari tes ini didasarkan ada/tidaknya ikatan hemaglutinasi eritrosit pada
partikel virus (virion). Terkadang dalam uji HA, ikatan hemaglutinasi dapat
dikacaukan oleh sifat elusi virus dikarenakan terdapat aktivitas enzim
neuraminidase dari virus yang dapat merusak ikatan antara eritrosit dengan virus 4.
Aktivitas hemaglutinasi dan neuraminidase diperankan oleh dua glikoprotein
utama pada permukaan virus, yaitu: hemaglutinin (HA) dan neuraminidase (NA)5.
Gen Hemaglutinin (HA), adalah molekul glikoprotein selubung virus yang

berfungsi untuk meningkatkan virus ke reseptor sel target dan mengawali

terjadinya infeksi. Gen neuraminidase (NA), adalah enzim yang dibutuhkan virus
untuk melepas hasil replikasi virus dari sel yang infeksi.6
Hemaglutinasi, adalah daya pengikatan antigen virus dengan eritrosit
hewan tertentu, karena virus diikat oleh reseptor eritrosit. Bila virus diikat oleh
eritrosit beberapa jenis virus, dan dilepaskan kembali secara spontan oleh eritrosit
yang mengikat virus sehingga terjadi elusi. Sesudah terjadi elusi, virus dilepaskan
dan virus masih bisa mengadakan hemaglutinasi dengan eritrosit lain, tetapi
eritrosit yang telah dilepaskan virus tidak bisa mengikat virus lain, sebab reseptor
eritrosit sudah rusak oleh virus yang pertama. Hemaglutinasi terjadi dalam tiga
tahap, yaitu: (1) absorpsi virus pada reseptor virus, (2) aglutinasi dari kompleks
virus eritrosit, (3) dan elusi virus secara spontan.7
Titer virus dapat diketahui dengan melihat well terakhir pada mikroplate,
pada pengenceran tertinggi (end point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi
positif. Hal itu ditandai dengan adanya agregat-agregat di dasar sumur.8 Uji HA
digunakan untuk mengetahui titer awal antigen yang akan digunakan dalam uji
hambatan hemaglutinasi (uji HI). Selain itu juga digunakan untuk re-titrasi
antigen dengan tujuan memastikan titer antigen yang digunakan. 7 Titer
hemaglutinasi HA, yaitu: pengenceran virus tertinggi yang dapat menyebabkan
hemaglutinasi total, semakin tinggi pengenceran virus maka akan semakin kecil
kekuatan virus untuk menyebabkan hemaglutinasi total.7
E. Alat dan bahan
1. Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu:
i.

Mikroplate (96 well) dengan dasar V

ii.

Mikropipet 25l dan 100l.

iii.

Yellow tip

iv.

Timer/jam

v.

Wadah pembuangan

2. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum adalah

i.

Sel darah merah (SDM) ayam

ii.

Suspensi virus H1N1

iii.

Larutan PBS/Phospate Buffer Saline

F. Cara kerja
1. Alat dan bahan yang akan digunakan disiapkan terlebih dahulu.
2. Menggunakan APD (Alat Pelindung Diri) dengan lengkap dan benar.
3. Ditambahkan 50l larutan PBS pada mikroplate well B1 s.d H1
4. Ditambahkan 50l larutan PBS pada mikroplate well B2 s.d H2
5. Ditambahkan 100l antigen pada mikroplate well A1 dan A2
6. Ditambahkan 50 l larutan PBS pada mikroplate well A3 dan A4 ( sebagai
kontrol)
7. Dilakukan pengenceran berseri pada suspensi virus H1N1, yaitu:
a. Dari mikroplate well A1 diambil 50l suspensi virus H1N1, kemudian
dipindahkan ke well B1 dihomogenkan; dari well B1 diambil 50l
suspensi virus H1N1, dan dipindahkan ke well C1 dihomogenkan, dan
pengenceran diatas dilakukan seterusnya sampai ke well H1, setelah
suspensi pada well H1 homogen, diambil 50l dan dibuang.
b. Dari mikroplate well A2 diambil 50l suspensi virus H1N1, kemudian
dipindahkan ke well B2 dihomogenkan; dari well B1 diambil 50l
suspensi virus H1N1, dan dipindahkan ke well C2 dihomogenkan, dan
pengenceran diatas dilakukan seterusnya sampai ke well H2, setelah
suspensi pada well H2 homogen, diambil 50l dan dibuang.
8. Mikroplate pada well A1 s.d H1; A2 s.d H2; dan A3 s.d A4 diisi dengan
50l SDM.
9. Mikroplate digoyang untuk mencampurkan semua campuran SDM dengan
suspensi H1N1
10. Mikroplate diinkubasi selama 30menit s.d 60menit, pada suhu ruang (22 0250C).
11. Mikroplate pada well kontrol diamati untuk melihat apakah SDM telah
mengendap semua
12. Diamati hasil reaksi pada semua well mikroplate, dan hasilnya dicatat
G. Hasil praktikum

1. Interpretasi hasil
Positif (+)

: Terjadi aglutinasi / SDM dalam bentuk terlarut (B)

Negatif (-)

: Terjadi pengendapan SDM (A)

Gambar 2: Interpretasi Hasil Uji HA

Titer HA virus dinyatakan sebagai nilai kebalikan dari pengenceran

tertinggi antigen (virus) yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi
(positif).
2. Hasil
Pada praktikum uji HA didapatkan hasil, sebagai berikut:

Gambar 3: Hasil praktikum uji HA

Kontrol

Dari gambar uji HA diatas (gambar 3), disajikan dalam bentuk tabel,
sebagai berikut:
Well
A (Pengenceran 1)
B (Pengenceran 1/2)
C (Pengenceran 1/4)
D (Pengenceran 1/8)
E (Pengenceran 1/16)
F (Pengenceran 1/32)
G (Pengenceran 1/64)
H (Pengenceran 1/128)
Hasil

Tabel 1. Hasil praktikum uji HA

1
2
Kontrol Kontrol
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
16HAU

16HAU

H. Pembahasan
Titer antibodi adalah pengenceran tertinggi yang menunjukkan aglutinasi
atau presipitasi, untuk menentukan titer antibodi dapat dibuat pengenceran
serial serum, dan selanjutnya ditambahkan sejumlah antigen yang konstan dan
campuran larutan tersebut diinkubasi dan diperiksa untuk aglutinasi atau
presipitasi.

Pada praktikum ini dilakukan uji hemaglutinasi pada suspensi antigen

(virus H1N1), tujuan dari uji HA ini adalah untuk mengukur titer HA sediaan
virus yang akan digunakan untuk uji hambatan aglutinasi (HI). Sebuah
suspensi virus dapat mengaglutinasi sel darah merah, sehingga mencegah
virus menetap dan keluar dari suspensi. Sisi partikel virus yang spesifik dapat
berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan
permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi
sel darah merah menjadi tampak.
Dari hasil pengamatan, diamati reaksi positif pada uji HA, dimana titer
dapat dinyatakan sebagai kebalikan dari pengencer tertinggi virus yang masih
menimbulkan reaksi aglutinasi (positif). Pada well A1 s.d E1, masih terdapat
aglutinasi, yang berarti pada pengenceran virus tertingggi, yaitu pada well E1
(1/16) virus masih mampu mengaglutinasi SDM, pada well A2 s.d E2 yang
berarti pada pengenceran virus tertingggi, yaitu pada well E2 (1/16) virus
masih mampu mengaglutinasi SDM, masih terdapat aglutinasi; dan well A3
dan A4 terbentuk endapan SDM, yang berarti tidak terdapat aglutinasi SDM,
karena tidak ada virus pada well A3 dan A4, dan perlu diingat, bahwa well A3
dan A4 merupakan kontrol negatif, yang berfungsi untuk mengkontrol
pengerjaan uji HA terhindar dari kesalahan dan kontaminasi, baik dari alat
dan bahan praktikum yang kita gunakan. Adapun faktor-faktor yang
mempengaruhi hasil uji HA adalah: ketelitian waktu, kontaminasi kimia dari
tabung, pipet atau bahan, kelainan dari sel darah merah dari individu tertentu,
kesalahan pengenceran atau pemipetan, atau pipet yang belum terkalibrasi.
Jadi hasil uji HA ini mendapatkan hasil, yaitu: 16HAU (Hem-Aglutinasi
Unit).
I. Kesimpulan
Hasil titer HA virus H1N1, adalah: 16 HAU.
PRAKTIKUM 2

Uji Hem-Aglutinasi Inhibition (HI)

A. Hari dan tanggal

Rabu, 16 Maret 2016, Pukul 11.00 WIB
B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan, untuk mengetahui tingkat kekebalan atau titer
antibodi terhadap virus influenza/H1N1.
C. Prinsip
Antibodi dari pasien akan mengikat virus dan akan menghambat
penempelan virus pada sel darah merah, sehingga aglutinasi tidak terbentuk.
Antigen (virus H1N1) + Antibodi spesifik Kompleks antigen-antibodi
Kompleks antigen-antibodi + SDM Pengendapan SDM

Gambar 4.Prinsip Uji HI

D. Landasan teori
Virion dari beberapa keluarga virus berikatan dengan sel darah dan
menyebabkan hemaglutinasi. Bila antibodi spesifik dan antigen virus
dicampur sebelum ditambahi sel darah merah, hemaglutinasi akan dihambat.
Uji penghambatan hemaglutinasi ternyata sensitif (kecuali untuk togavirus)
dan sangat spesifik, karena uji itu mengukur antibodi yang berikatan pada
protein permukaan yang mudah mengalami perubahan antigenik. Selain itu,
uji ini sederhana mengidentifikasi isolat dari virus yang menyebabkan
hemaglutinasi.8 Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah.
Kemampuan ini sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat
dihambat oleh antibodi tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat
berinteraksi dengan reseptor mukoprotein pada sel darah merah dan
permukaan sel lain. Interaksi dari sisi reseptor dan virion membuat aglutinasi
sel darah merah menjadi tampak. Enzim virus neuraminidase memecah ikatan

antara virus dan sel, dan melepas keduanya ke dalam larutan. Antigen adalah
bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen dari virus digunakan untuk
uji hemaglutinasi.9
Tes

aglutinasi dapat dimodifikasi untuk pemeriksaan antigen yang

terlarut, tes ini disebut hemaglutinasi inhibisi, disebut hemaglutinasi inhibisi

karena dapat mengukur kemampuan antigen yang terlarut untuk menghambat
aglutinasi antara antigen dengan eritrosit oleh antibodi. Jika sempel
mengandung antigen, antigen terlarut akan bersaing dengan eritrosit untuk
berikatan dengan antibodi, sehingga menghambat aglutinasi sel darah merah
dengan menipiskan atau mengencerkan sampel, anda dapat menghitung
jumlah antigen melalui titer pada sempel yang belum diketahui. Hemaglutinasi
inhibisi merupakan yang diinduksikan oleh virus sebagai prosedur
untuk mengidentifikasi hemaglutinasi oleh virus atau metode untuk mengukur
kensentrasi dari antigen terlarut dalam spesimen biologis, dimana spesimen
diinduksi dengan antibodi yang spesifik dan kemudian dengan eritrosit.10
Antibodi spesifik terhadap hemaglutinin virus dapat menghambat
terjadinya hemaglutinasi. Uji yang digunakan untuk melihat reaksi
penghambatan

ini

kemudian

disebut

uji

hambatan

hemaglutinasi

(Haemagglutination Inhibition, HI Test). Reaksi hambatan hemaglutinasi ini

dapat digunakan untuk membantu diagnosis laboratorium dalam melakukan
identifikasi virus serta dapat digunakan untuk mengukur titer antibodi dari
hasil vaksinasi.7
Secara bahasa haemagglutination inhibition dapat diartikan sebagai
hambatan

haemaglutinasi,

sedangkan

haemaglutinasi

merupakan

penggumpalan dari sel darah merah. Kemampuan mengaglutinasi tidak

dimiliki oleh semua virus atau bakteri yang menyerang ayam tetapi hanya
beberapa virus dan bakteri yang memiliki zat haemaglutinin, diantaranya:
paramyxovirus (ND), poxvirus (Pox), adenovirus (EDS), orthomyxovirus (AI),
bakteri Mycoplasma sp., Haemophilus paragallinarum, dan Salmonella
pullorum. Zat haemaglutinin yang terdapat dalam tubuh virus atau bakteri
tersebut bersifat antigenik yang dapat merangsang terbentuknya antibodi
spesifik. Antibodi yang terbentuk tersebut memiliki kemampuan mengambat

terjadinya aglutinasi darah yang disebabkan oleh haemaglutinin dari virus atau
bakteri.
Prinsip dari uji HI lambat, adalah mengetahui adanya antibodi yang
mampu menghambat proses hemaglutinasi oleh virus. Uji ini untuk
menentukan titik antibodi terhadap hemaglutinasi virus. Bila terdapat antibodi
dalam jumlah mencukupi untuk membentuk kompleks dengan virion,
hemaglutinasi dihambat, dan eritrosit mengendap. Sebaliknya bila antibodi
terdapat dalam jumlah yang tidak mencukupi maka eritrosit diaglutinasi oleh
virus dan membentuk endapan.11
Hemaglutinasi oleh virus dapat dihitung dan dibawah kondisi standar
dalam cairan dapat dilihat. Reaksi HA dapat dihambat oleh serum immune
(antibodi) yang spesifik. Beberapa strain virus dapat ditunjukkan virulensinya
dalam aktivitas HA dengan eritrosit mammalia dan dalam panas yang stabil.
Antigen yang tidak signifikan tidak dapat dilaporkan.12

E. Alat dan bahan

1. Peralatan yang digunakan pada praktikum adalah:
i.

Mikroplate dengan dasar V.

ii.

Mikropipet 25l dan 100l.

iii.

Yellow tip.

iv.

Timer/Jam

v.

Wadah pembuangan.

2. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum adalah:

i.

Sel darah merah (SDM) ayam.

ii.

Antibodi spesifik terhadap virus H1N1 (dari serum rabbit, yang

diinjeksi virus H1N1).

iii.

Antibodi normal (dari serum rabbit, yang tidak diinjeksi virus

H1N1).

iv.

Suspensi virus H1N1 (yang telah dilakukan pengenceran sesuai

dengan hasil uji HA yang sebelumnya dikerjakan).

v.

Larutan PBS/Phospate Buffer Saline.

F. Cara kerja
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan.
2. Menggunakan APD (Alat Pelindung Diri) dengan lengkap dan benar.
3. Pemeriksaan uji HI, yaitu:
a. Pada mikroplate well B1 s.d H1 dan B2 s.d H2 diisi dengan 25l
larutan PBS.
b. Pada mikroplate well B5 s.d H5 dan B6-H6 diisi dengan 25l larutan
PBS.
c. Pada mikroplate well A3 dan A4 diisi dengan 50l larutan PBS
(sebagai kontrol).
d. Ditambahkan 50l serum positif pada well A1 dan A2, serta 50l
serum negatif pada well A5 dan A6
e. Pengenceran bertingkat pada suspensi serum/antibodi positif, yaitu:
1. Dari

mikroplate

pada

well

A1

diambil

25l

suspensi

serum/antibodi positif, dan dipindahkan ke well B1 dihomogenkan;

dari well B1 diambil 25l suspensi serum/antibodi positif, dan
dipindahkan ke well C1 dihomogenkan, dan pengenceran diatas
dilakukan sampai ke well H1, setelah suspensi pada well H1
homogen, diambil 25l dan dibuang.
2. Dari

mikroplate

pada

well

A2

diambil

25l

suspensi

serum/antibodi positif, dan dipindahkan ke well B2 dihomogenkan;

dari well B2 diambil 25l suspensi serum/antibodi positif, dan
dipindahkan ke well C2 dihomogenkan, dan pengenceran diatas
dilakukan sampai ke well H2, setelah suspensi pada well H2
homogen, diambil 25l dan dibuang.
f. Pengenceran bertingkat pada suspensi serum/antibodi negatif, yaitu:
1. Dari

mikroplate

serum/antibodi

pada

well

A5

diambil

negatif,

dan

dipindahkan

25l
ke

suspensi
well

B5

dihomogenkan; dari well B5 diambil 25l suspensi serum/antibodi

negatif, dan dipindahkan ke well C5 dihomogenkan, dan
pengenceran diatas dilakukan sampai ke well H5, setelah suspensi
pada well H5 homogen, diambil 25l dan dibuang.

2. Dari

mikroplate

serum/antibodi

pada

well

A6

diambil

negatif,

dan

dipindahkan

25l
ke

suspensi
well

B6

dihomogenkan; dari well B6 diambil 25l suspensi serum/antibodi

negatif, dan dipindahkan ke well C6 dihomogenkan, dan
pengenceran diatas dilakukan sampai ke well H6, setelah suspensi
pada well H6 homogen, diambil 25l dan dibuang.
g. Mikroplate pada well A1-H1, A2-H2, A5-H5 dan A6-H6 ditambahkan
dengan 25l suspensi virus H1N1 8HAU; diinkubasi pada suhu ruang
(25oC), selama 30 menit.
h. Mikroplate pada well A1-H1, A2-H2, A3, A4, A5-H5 dan A6-H6,
ditambahkan dengan 50l SDM, kemudian dicampur dengan baik
i. Mikroplate diinkubasi selama 30menit s.d 60menit, pada suhu ruang
(250C).
j. Mikroplate diamati, dibaca hasil reaksi yang terbentuk pada waktu
inkubasi diatas/pada saat well kontrol sudah terbentuk endapan, dan
dicatat.
k. Membersihkan alat dan bahan yang digunakan pada praktikum.
G. Hasil praktikum
1. Interpretasi hasil
Positif (+)

: Tidak ada aglutinasi /terjadi pengendapan SDM/ hambatan

aglutinasi (C)

Negatif (-)

: Terdapat aglutinasi / tidak ada endapan SDM (B)

Gambar 5: Interpretasi Hasil Uji HI

Titer HI (antibodi spesifik) dinyatakan sebagai kebalikan dari

pengenceran tertinggi antibodi spesifik yang masih dapat mengikat
antigen/virus H1N1, sehingga terbentuk endapan SDM secara sempurna.
2. Hasil
Pada praktikum uji HI didapatkan hasil, sebagai berikut:

Gambar 6: Hasil praktikum uji HI

Dari uji HI diatas (gambar 6), disajikan dalam bentuk tabel, sebagai
berikut:
Well

A (Pengenceran 1)
B (Pengenceran 1/2)
C (Pengenceran 1/4)
D (Pengenceran 1/8)

Tabel 3. Hasil praktikum uji HI

4
1
2
3
Serum/Antibodi
Kontrol
Positif
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

5
6
Serum/Antibodi
negatif
-

E (Pengenceran 1/16)
F (Pengenceran 1/32)
G (Pengenceran 1/64)
H
(Pengenceran
1/128)
Hasil
I. Pembahasan

+
-

+
-

> 128

> 128

Prinsip HI adalah dengan uji ini diharapkan reaksi aglutinasi dari virus dan
SDM dapat dicegah dengan antibodi spesifik yang terdapat dalam serum. Pada
uji HI ini kita melihat reaksi antibodi terhadap hemaglutinasi virus, bila
terdapat antibodi dalam jumlah yang cukup untuk membentuk kompleks
dengan virion virus, hemaglutinasi SDM akan dihambat, sehingga terjadi
pengendapan SDM (Reaksi Positif), sebaliknya bila antibodi terdapat dalam
jumlah yang tidak cukup maka SDM akan diaglutinasi oleh virus dan tidak
terbentuk endapan (Reaksi negatif).
Dari hasil pengujian ini, diamati pada titer serum/antibodi positif pada uji
HI, dimana titer dapat dinyatakan sebagai kebalikan dari pengencer tertinggi
serum/antibodi positif yang masih dapat berikatan dengan virus H1N1,
sehingga akan terbentuk endapan SDM didasar well.
Hasil Positif didapatkan pada well A1 s.d E1dan A2 s.d E2 dimana
terdapat endapan SDM didasar well, yang berarti serum/antibodi spesifik
berikatan dengan virus H1N1. Hasil Positif juga terlihat pada well kontrol
(A3 dan A4), yang berisi SDM tanpa antigen dan antibodi, terjadi
pengendapan SDM .
Hasil negatif didapatkan pada well A5 s.d H5 dan A6 s.d H6 dimana tidak
terbentuk endapan SDM di dasar well, yang disebabkan karena adanya
aglutinasi SDM, karena terjadi ikatan antara SDM dan virus H1N1. Aglutinasi
ini terjadi disebabkan karena tidak ada/kurangnya antibodi spesifik terhadap
virus H1N1.
Pada pengerjaan praktikum ini, perlu diteruskan pengenceran berseri dari
serum/antibodi spesifik untuk mendapatkan hasil titer serum/antibodi spesifik
yang sebenarnya. Pada praktikum ini, pengerjaan uji HA dilakukan secara

duplo, hal ini untuk meningkatan ketelitian pengerjaan, sehingga hasil yang
didapatkan lebih akurat.
Pengencaran serum/antibodi spesifik perlu dilakukan untuk mendapatkan
hasil titer serum/antibodi spesifik yang sebenarnya. Pada praktikum ini
didapatkan hasil uji HI, yaitu: 16.
J. Kesimpulan
Hasil titer uji HI (antibodi spesifik terhadap virus H1N1), adalah: 16.

PRAKTIKUM 3

Uji Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA)

A. Waktu Pelaksanaan
Selasa s.d Rabu, 10 s.d 11 Maret 2015, Pukul 11.00 WIB s.d selesai
B. Tujuan
Praktikum ini bertujuan, untuk optimasi konsentrasi antibodi untuk
pengembangan sistem ELISA.
C. Prinsip
Coated antigen (protein M) + Antibodi spesifik protein M Inkubasi +
anti antibodi spedifik protein M berlabel biotin Inkubasi + Enzim
(Streptavidine-HRP) + subtract (O-phenylenediamine) terbentuk warna
diukur pada elisa reader dengan =490nm.

Gambar 7: Proses interaksi pada ELISA

D. Landasan teori
1. Pengertian
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), adalah suatu teknik
biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi
kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Dalam pengertian
sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu
permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut,
sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu
enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh
enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi.

Penggunaan ELISA, melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas

untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui
diimobilisasi pada suatu permukaan solid (biasanya berupa lempeng
mikroplate polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada
permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang
spesifik untuk antigen yang sama, disebut sandwich ELISA). Setelah antigen
diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan
antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat
dideteksi

secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan

enzim melalui biokonjugasi. Diantara tiap tahap, plate harus dicuci dengan
larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang
tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan
substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan
kuantitas antigen dalam sampel.
ELISA mempunyai kelebihan dan kekurangan dalam memeriksa suatu
sampel, yaitu:
kelebihan teknik ELISA, antara lain :
i.

Teknik pengerjaan relatif sederhana.

ii.

Relatif ekonomis (karena jenis antibodi yang digunakan hanya satu

saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis
antibodi).

iii.

Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.

iv.

Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen, meskipun

kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi
antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik).

v.

Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.

Kekurangan teknik ELISA, antara lain :

i.

Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini
hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu
antigen).

ii.

Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi

poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya
yang relatif mahal.

iii.

Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan

pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif
yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking, sehingga antibodi
sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut
enzim signal dan menimbulkan signal.

iv.

Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat,

sehingga

pembacaan

harus

dilakukan

dengan

cepat

(pada

perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan

untuk menghentikan reaksi).
2. Teknik-Teknik ELISA
Ada beberapa macam teknik ELISA yang relatif sering digunakan, antara
lain:13
i.

Direct ELISA
Teknik ini seringkali digunakan untuk mendeteksi dan mengukur
konsentrasi antigen pada sampel direct ELISA, menggunakan suatu
antibodi spesifik (monoklonal) untuk mendetaksi keberadaan antigen yang
diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada direct ELISA, pertama mikroplate diisi dengan sampel yang
mengandung antigen yang diinginkan, sehingga antigen tersebut dapat
menempel pada bagian dinding-dinding lubang mikroplate, lalu antibodi
yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubanglubang mikroplate, sehingga dapat berinteraksi dengan antigen yang
diinginkan. Kemudian, ke dalam lubang-lubang mikroplate tersebut
ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, sehingga
enzim yang tertaut dengan antibodi yang telah berinteraksi dengan antigen
yang diinginkan akan berinteraksi dengan substrat dan menimbulkan
signal dapat dideteksi.

Gambar 8: Direct ELISA

ii.

Indirect ELISA
Teknik indirect ELISA ini pada dasarnya juga merupakan teknik
ELISA yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik indirect ELISA
yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. indirect
ELISA menggunakan suatu antigen spesifik (monoklonal), serta antibodi
sekunder spesifik tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan
antibodi yang diinginkan pada sampel yang diuji.
Pada indirect ELISA, pertama mikroplate diisi dengan larutan yang
mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik tersebut dapal
menempel pada bagian dinding lubang mikroplate, kemudian larutan
sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikroplate, sehingga terjadi terjadi interaksi antara
antigen spesifik dengan antibodi yang dinginkan. Lalu ke dalam lubang
mikroplate dimasukkan larutan yang berisi antibody sekunder spesifik
tertaut enzim signal, sehingga pada lubang mikroplate tersebut terjadi
interaksi antara antibodi yang diinginkan, dengan antibodi sekunder
spesifik tertaut enzim signal. Pada tahap akhir indirect ELISA,
ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal, lalu
enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder speifik yang telah
berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi.

Gambar 9: Indirect ELISA

iii.

Sandwich ELISA
Sandwich ELISA, menggunakan antibodi primer spesifik untuk
menangkap antigen yang diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim
signal untuk mendeteksi keberadaan antigen yang diinginkan. Pada
dasarnya, prinsip kerja dari sandwich ELISA mirip dengan direct,
ELISA hanya saja pada direct,, larutan antigen yang diinginkan tidak
perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus
dapat berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder
spesifik tertaut enzim signal, maka teknik

direct, ini cenderung

dikhususkan pada antigen memiliki minimal dua sisi antigenik (sisi

interaksi dengan antibodi) atau antigen yang bersifat multivalent, seperti:
polisakarida atau protein. Pada sandwich ELISA, antibodi primer,
seringkali disebut sebagai antibodi penangkap, dan antibodi sekunder,
seringkali disebut sebagai antibodi deteksi.
Dalam

pengaplikasiannya,

sandwich

ELISA lebih

banyak

dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang

kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat kontaminasi
tinggi. Hal ini disebabkan sandwich ELISA memiliki tingkat sensitivitas
tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat keharusan dari antigen
tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.

Gambar 10: Sandwich ELISA

iv.

Competitive ELISA
Competitive ELISA, merupakan pengembangan teknik ELISA
terdahulu. Prinsip dasar dari teknik ini, adalah dengan menambahkan
suatu kompetitor ke dalam lubang mikroplate. Teknik ELISA kompetitif
ini dapat diaplikasikan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau
antibodi.

Gambar 11: Competitive ELISA

E. Alat dan bahan

1. Peralatan yang digunakan pada praktikum adalah:
i.

Mikroplate ELISA.

ii.

Adjustable mikropipet 100l.

iii.

ELISA reader

iv.

Inkubator

v.

Yellow tip.

vi.

Timer/Jam.

vii.

Pipet

viii.

Wadah pembuangan.

2. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum adalah:

i.

Coated- Antigen (protein M) 25g/mL (telah disiapkan sebelumnya)

ii.

Antibodi 1, yaitu:
a. Antibodi spesifik terhadap protein M
b.

Antibodi tidak spesifik terhadap protein M (kontrol),

iii.

Washing buffer (PBS Tween 0,05%).

iv.

Blocking solution (Skim milk 5%).

v.

Antibodi 2, yaitu: antibodi anti rabbit berlabel biotin 1/10000

vi.

Streptavidine-HRP (1/20000).

vii.

Substrate OPD (O-phenylenediamine).

viii.

Stop solution (H2SO4 2,5N)

ix.

Kertas tissue

F. Cara kerja

1. (Melabel well): Mikroplate diisi Coated- Antigen (protein M) pada well

uji A1-A12, B1-B12, C1-C12, D1-D12

dan well kontrol F1 dan F2

dengan konsentrasi 25 g/mL. Antigen dilarutkan dalam Carbonate

Coating Buffer, pH 9,6 (0,15 M sodium carbonat; 0,35 M sodium
bicarbonate; 0,03 M sodium azide). Mikroplate diinkubasi 37oC, selama 1
jam
2. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing
buffer.

3. (Blocking): Mikroplate diisi blocking solution sebanyak 70 L. Mikroplate

diinkubasi 37oC, selama 1 jam.
4. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing
buffer.
5. (Penambahan antibodi 1): 150 L diencerkan dengan 150 L dilution
buffer (0,1 skim milk dalam PBS). Selanjutnya antibodi diencerkan mulai
dari 1/2; 1/4; 1/8; dan seterusnya dengan pengencer PBS (pengenceran
berseri). 50 L antibodi berbagai konsentrasi ditambahkan ke dalam well.
Antibodi paska vaksinasi ditambahkan dalam dalam well A dan B,
sedangkan antibodi kontrol negatif dalam well C dan D. Mikroplate
diinkubasi dengan suhu 4oC, selama semalam.
6. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing
7.

buffer.
(Penambahan antibodi 2): 50 L antibodi anti rabbit berlabel biotin

1/1000 ditambahkan di setiap well uji

8. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing
buffer.
9. (Penambahan Streptavidine-HRP): 50 L Streptavidine-HRP (horseradish
peroksidase) dalam PBS 1/5000 ditambahkan ke setiap well uji.
Mikroplate diinkubasi 37oC, selama 1 jam.
10. (Pencucian): Mikroplate dicuci sebanyak dua kali menggunakan washing
11.

buffer.
(Penambahan

substrat

OPD):

50

Substrat

OPD

(O-

phenyldenediamine) ditambahkan ke well. OPD dibuat dengan melarutkan

10 mg OPD dalam 10 mL buffer substrat ditambah 240 L H2O2 3%.
Mikroplate diinkubasi dalam suhu ruangan sekitar 15 menit.
12. (Stop solution): 25 L H2SO4 2,5 M ditambahkan pada setiap well.
13. (Pembacaan hasil): Baca absorbansi larutan yang terbentuk dalam panjang
gelombang 490 nm.
14. (Analisis data): Berdasarkan hasil absorbansi, dibuat kurva setiap
pengenceran antigen dengan program excel. Sumbu X: pengenceran,
sumbu Y: antibodi
H. Hasil praktikum
Pada praktikum uji ELISA didapatkan hasil, sebagai berikut:

Gambar 12: Hasil praktikum uji ELISA

Setelah dibaca pada ELISA reader dengan = 490nm didapatkan hasil

absorbansi dari setiap well, hasilnya disajikan pada table berikut:

A
B
C
D
E
F
G
H

1
0.32
5
0.36
9
0.04
9
0.04
8
0.04
8
0.04
6
0.04
3
0.05
6

2
0.37
1
0.42
9
0.04
6
0.04
5
0.04
4
0.05
3
0.03
9
0.05
8

3
0.35
3
0.38
5
0.04
4
0.04
5
0.03
9
0.03
7
0.04
0.04
4

4
0.27
5
0.33
0.04
3
0.04
9
0.03
8
0.03
7
0.03
7
0.04

5
0.53
1
0.33
8
0.04
3
0.04
4
0.04
6
0.03
8
0.03
8
0.03
5

6
0.13
1
0.32
0.04
4
0.05
0.03
6
0.03
8
0.03
7
0.03
8

7
0.21
1
0.27
4
0.04
2
0.05
8
0.04
7
0.03
9
0.03
9

8
0.23
5
0.19
4
0.04
1
0.04
6
0.04
1
0.03
9

0.04

0.04

0.04

9
0.15
5
0.12
8
0.04
4
0.04
8
0.03
6
0.04
5
0.03
9
0.04
8

10
0.05
9
0.08
6
0.04
3
0.04
7
0.03
7
0.04
5
0.05
7
0.05
4

11
0.06
1
0.06
6
0.04
8
0.04
9
0.03
6
0.04
0.04
3
0.05
7

12
0.04
9
0.05
4
0.04
6
0.04
8
0.03
6
0.04
3
0.04
5
0.04
1

1:10
24
0.07
3
0.04
5
0.04
5

1:20
48
0.06
4
0.04
9
0.04
0

Tabel 4. Hasil pengukuran pada ELISA reader

positi
f
negat
if
kontr
ol

1:2
0.34
7
0.04
9
0.04
6

1:4
0.40
0
0.04
6
0.05
3

1:8
0.36
9
0.04
5
0.03
7

1:16
0.30
3
0.04
6
0.03
7

1:32
0.43
5
0.04
4
0.03
8

1:64
0.22
6
0.04
7
0.03
8

1:12
8
0.24
3
0.05
0
0.03
9

1:25
6
0.21
5
0.04
4
0.03
9

1:51
2
0.14
2
0.04
6
0.04
5

Tabel 5. Nilai Rata-rata Pembacaan dengan Mircoplate Reader

1:40
96
0.05
2
0.04
7
0.04
3

1/4

positi
f
0.2975
negat
if
-0.0005
Rata- Rata
kontrol

1/8
0.36
9
0.04
5

0.4
0.04
6

1/16
0.30
3
0.04
6

1/32
0.43
5
0.04
4

1/64
0.22
6
0.04
7

1/12
8
0.24
3
0.05

1/25
6
0.21
5
0.04
4

1/51
2
0.14
2
0.04
6

1/102
4

1/204
8

1/409
6

0.073

0.064

0.052

0.045

0.049

0.047

0.0495

Tabel 6. Hasil Pengurangan Nilai Rata-rata dengan Rata-rata Kontrol

Dari tabel diatas , disajikan dalam bentuk grafik, sebagai berikut:

Grafik ELISA
0.5
0.4
0.3

OD 490nm

0.2
0.1
0
-0.1

Pengenceran
positif

negatif

kontrol

Grafik 1: Absorbansi antibodi pada berbagai titer pengenceran

I. Pembahasan
Pada praktikum ini menggunakan teknik Indirect ELISA. Tujuan dari uji
ELISA ini adalah untuk mengukur titer antibodi yang paling tinggi yang dapat
berikatan dengan baik, sehingga dihasilkan reaksi warna yang paling baik
pada pengukuran pada ELISA reader, proses ini juga disebut optimasi ELISA.
Pengujian dilakukan menggunakan suspensi antigen/Protein M dari virus
H1N1, dengan serum yang mengandung antibodi spesifik antigen/Protein M

dari virus H1N1 (serum post vaksinasi) dan serum yang tidak mengandung
antibodi spesifik terhadap virus H1N1 (serum yang tidak divaksinasi).
Mikroplate pada well A1 s.d A12, B1 s.d B12, C1 s.d C12, D1 s.d D12, F1
dan F2 telah diisi dengan 60l larutan Coated- Antigen (protein M) 25g/mL,
dan

diinkubasi

37oC,

selama

60

menit.

Bahan

plate

polystyrene

memungkinkan untuk antigen dapat menempel dengan baik di dasar well

mikroplate.
Mikroplate kamudian dicuci sebanyak tiga kali menggunakan washing
buffer. Hal ini bertujuan untuk membersihkan Coated-Antigen (protein M)
yang tidak dapat menempel dengan baik didasar well dapat dihilangkan, dan
untuk menghilangkan gelembung yang terbentuk di dasar well yang dapat
mengganggu pembacaan hasil ELISA.
Tahapan berikutnya adalah penambahan blocking solution, yang bertujuan
untuk mengisi celah-celah yang tidak terdapat Coated- Antigen (protein M)
pada dasar well sehingga mencegah terjadinya ikatan yang tidak spesifik
antara antibody dan antigen.
Pada tahapan penambahan antibodi 1 (antibodi spesifik terhadap
antigen/protein M virus H1N1 dan antibodi tidak spesifik terhadap
antigen/protein M virus H1N1), bertujuan agar antibodi yang ditambahkan
dapat berikatan/berinteraksi dengan Coated-Antigen (protein M) yang
sebelumnya telah ditambahkan. Diharapkan terbentuk ikatan yang spesifik
antara antigen Protein M dengan antibody yang spesifik (berasal dari serum
yang telah divaksinasi sebelumnya). Diinkubasi pada suhu 37C selama 1 jam
agar terjadi reaksi yang optimal.
Pada tahapan penambahan antibodi 2 (yaitu: antibodi anti rabbit berlabel
biotin), bertujuan agar antibody 2 tersebut dapat berikatan secara spesifik
dengan antibodi pertama. Inkubasi agar dapat terjadi interaksi yang optimal.
Tahapan washing, setelah inkubasi bertujuan, membersihkan antibodi 2 yang
tidak berikatan dengan antibodi 1, selain itu tahapan washing juga harus
menghilangkan gelembung udara yang ada didasar well yang terjadi pada tiap
proses tahapan pengerjaan uji ELISA. Biotin yang menempel pada antibody 2
ini berfungsi sebagai tempat perlekatan dengan enzim yang nantinya akan

ditambahkan (Streptavidine-HRP). Enzim HRP (Horseradish Peroxidase)

yang berikatan dengan protein Streptavidine (dari Streptococcus avidin)
membentuk kompleks Streptavidine-HRP. Ikatan molekul biotin dan
streptavidine merupakan ikatan nonkovalen yang kuat dan spesifik,
sedangkan enzim HRP merupakan enzim yang akan mengkatalisis substrat,
dalam praktikum ini O-phenylenediamine, yang menghasilkan produk yang
menimbulkan kompleks warna (kuning). Pada penambahan substrat reaksi
warna segera terbentuk, sehingga harus segera ditambahkan stop solution
(H2SO4 2,5N), dengan tujuan agar reaksi katalis enzim terhadap subtrat dapat
dihentikan (mempengaruhi pH larutan, sehingga enzim tidak dapat bekerja),
jika tidak maka subtrat akan dikatalis sampai habis oleh subtrat, sehingga
warna yang terbentuk menjadi lebih rendah dari sebenarnya, yang akan
menyebabkan nilai absorbance pada pembacaan dengan elisa reader menjadi
juga rendah. Penggunaan asam kuat (H2SO4 2,5N), sebagai stop reaksi,
karena substrate O-phenylenediamine, yang digunakan bersifat basa, sehingga
dapat menetralkan reaksi tersebut. Intensitas warna yang terbentuk akan
sebanding dengan kadar antibodi dalam sampel yang diperiksa yang diukur
absorbansinya dengan Elisa reader pada panjang gelombang 490 nm.
Dari hasil pengamatan, terbentuk warna kuning tua pada well yang berisi
antibodi spesifik antigen/protein M dari virus H1N1 (well A1, B1) yang
semakin ke kanan (dari well A2-A12, dan B2-B12) terjadi gradasi warna lebih
cerah (dari kuning tua ke kuning cerah) seiring dengan penurunan titer
antibody spesifik (dari titer antibody 1/2 sampai 1/4096). Pada well dengan
antibody tidak spesifik (C1-C12, D1-D12) tidak terbentuk warna kuning, hal
ini dikarenakan antibody 1 tidak berikatan secara spesifik dengan antigen,
sehingga antibody 2 juga berikatan dengan antibody 1 dan subtrat tidak bisa
bereaksi dengan enzim sehingga tidak terbentuk kompleks warna. Hasil
negatif juga terjadi pada well kontrol (F1,F2) karena tidak terdapat antibodi.
Pada pembacaan dengan ELISA reader didapatkan nilai absorbansi yang
menurun sejalan dengan penurunan titer antibodi (Grafik.1 absorbansi
antibodi pada berbagai titer pengenceran). Titik dimana terjadi perbandingan
selisih maksimal antara absorbansi dari well yang berisi antibodi spesifik dan

tidak berisi antibodi spesifik menandakan titik optimasi. Pada praktikum ini
didapatkan pada titer pengenceran antibodi 1/4 ( Mean absorbansi antibodi
spesifik = 0,400 mean absorbansi antibodi nonspesifik 0.046, selisih = 0.354 ).
Dalam pengerjaan ELISA ini perlu memperhatikan beberapa hal agar
mendapatkan hasil yang valid, yaitu harus memperhatikan ketelitian pengerjaan,
teknik pipetting, suhu dan waktu yang tepat. Dalam praktikum ini dilakukan duplo
untuk mengurangi ketidaktelitian, akan tetapi masih terjadi beberapa kesalahan,
seperti pada well A5 yang nilai absorbasinya cenderung lebih tinggi dibandingkan
dengan well sebelumnya, dan nilainya sangat jauh berbeda dengan duplonya .
Kesalahan ini terjadi karna pada saat pengisian well duplo mungkin karena
ketidaktelitian dalam pengerjaan, pippeting ataupun karena mikropipet yang tidak
terkalibrasi. Kedepannya hal ini harus dibenahi.

J. Kesimpulan
Titer antibodi yang baik pada konsentrasi antigen 25g/mL adalah: 1/4.

DAFTAR PUSTAKA
1.

Campbell NA, Reece JB. Biology. 6th ed. San Fransisco: Pearson
Education Inc; 2002

2.

Becker WM, KleinsmithLJ, Hardin J. The World of The Cell. 4 th ed. San
Fransisco: Addison Wesley Longman, Inc; 2000

3.

Schlegel HG, and K Schmidt.Mikrobiologi Umum. Yogyakarta: Gajah

Mada University Press; 1994,

4.

Burleson FG, TM Chambers, and DL Wiedbrauk. Virology and Laboratory

Manual. San Diego: Harcourt Brace Jovanovich; 1992.

5.

Asmara W. Peran Biologi Molekuler Dalam Pengendalian Avian Influenza

dan Flu Burung [ Pidato Pengukuhan Guru Besar Fakultas Kedokteran
Hewan]. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada; 2007.

6.

Raharjo Y, dan Nidom CA. Avian Influenza; Pencegahan, Pengendalian

dan Pemberantasannya. Hasil Investigasi Kasus Lapangan. Jakarta: Gita
Pustaka; 2004.

7.

L Amaliani. Pemeriksaan Hemaglutinasi Virus Influenza [internet]. April

2011
[cited
26
maret
2016].
Avalaible
from:
http://lestariamaliani.blogspot.com/2011/11/pemeriksaan-hemaglutinasivirus.html.

8.

Fenner F. Virology Veteriner. 2nded. New York: Academic Press Inc; 1993.

9.

Stephen BH. Isolation and Identification of Avian Pathogen. Texas:

American Association of Avian Pathologist Departement of Veterinary
Microbiology; 1980.

10.

Mayer. Microbiology and Immunology on Line. Washington: University

of South Carolina School of Medicine: 2010.

11.

Allan W H, JE Lancaster, and B Toth. Their Production and Use of

Newcastle Disease Vaccin. FAO. 1978; 1-79.

12.

RM Aloisi. Principles of Immunodiagnostics. English: Mosby; 1979.

13.

Pandu. Test ELISA [internet]. Juni 2012 [cited 26 Maret 2016]. Available
from: http://pandudingin.blogspot.com/2012/04/elisa-test.html.