Tugas Makalah Kesmavet

Flusing Gas N2 Mengatasi Hilangnya Keanekaragaman

Bakteri dan Menghambat Psychotropic Pseudomonas
Selama Penyimpanan Dingin Susu Sapi Segar

Oleh :
Zainul Alim

061513143008

Phanjat Mukti Utomo

061513143118

Tutuk Wahyuningtyas

061513143069

Ulvi Hudriyah

061513143052

Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Airlangga
2016
BAB I
PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Kualitas mikrobiologi susu segar dan produk susu terutama ditentukan oleh tingkat
awal dan komposisi populasi bakteri yang ada dalam susu segar. Peraturan perundangundangan nasional dan internasional saat ini sudah memiliki aturan per batas susu sapi
segar dari segi kualitas mikrobiologi yang diterima sebagai "total" jumlah bakteri per ml
dalam tangki di peternakan dan pada tingkat silo susu, pada 105 ml, masing-masing,
ketika sampel susu biakan di piring standar Count Agar (PCA) selama 3 hari pada suhu
30 C di bawah kondisi aerobik tingkat bakteri ini sesuai dengan rata-rata geometrik
berjalan selama dua - periode bulan, dengan setidaknya dua sampel per bulan
Untuk menjaga kualitas mikrobiologis susu segar yang dihasilkan di sebuah
peternakan, undang-undang saat di negara maju membutuhkan penyimpanan bahan baku
susu pada suhu 6 C atau kurang (biasanya pada 2 sampai 4 C) segera setelah
pemerahan. Dinginnya rantai penyimpanan susu segar dan transportasi bergantung pada
transfer susu dari peternakan tangki bulk ke tangki pada transfer truk ke silo susu di mana
susu akan diproses lebih lanjut. Selama penyimpanan dingin pada suhu 4 C, "total"
jumlah bakteri susu mentah sapi segar dapat dijaga konstan selama kurang lebih dua hari,
setelah itu psychrotrophs (didefinisikan sebagai orang mikroba mampu tumbuh pada 7
C), yang terutama pseudomonas , meningkat pesat dan akan datang penduduk dominan di
antara mikroba baku susu .Numerous telah meneliti efek dari penyimpanan dingin pada
komposisi komunitas mikroba menggunakan pendekatan berbasis budidaya tradisional
atau molekul metode berdasarkan ekstraksi DNA langsung dari sampel susu.
Menggunakan budidaya - berbasis metode, kami sebelumnya mengamati bahwa
pembilasan terus menerus dengan gas N2 murni menunjukkan beberapa potensi untuk
mengurangi usia jarahan bakteri dari susu segar di laboratorium dan di skala pilot plant
karena pertumbuhan mesophiles, psychrotrophs, lipase dan protease produsen terhambat ,
tapi anaerob, bakteri asam laktat, atau bakteri entero tidak disukai. Dengan demikian,
pengobatan tersebut bisa memberikan kemungkinan untuk menjaga kualitas mikrobiologi
dan sifat organoleptik susu segar, dan juga bisa berfungsi untuk memperpanjang waktu
dingin penyimpanan susu segar sebelum pengolahan susu. Namun sejauh ini, hanya
budidaya - berbasis pendekatan telah digunakan untuk menyelidiki konsekuensi dari
pengobatan N2 pada keragaman bakteri, yang tidak memungkinkan untuk kesimpulan
yang bisa ditarik tentang efek pengobatan pada keragaman bakteri secara keseluruhan.
Akibatnya, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggambarkan keragaman bakteri
dari sampel susu sapi segar menggunakan pendekatan barcode molekul langsung tanpa
2

budidaya sebelum dan untuk menyelidiki apakah pembilasan terus menerus gas N2 dari
penyimpanan

draw milk dapat memodifikasi struktur komunitas bakteri. Seperti

beberapa penelitian telah menunjukkan, DNA - berbasis pendekatan mungkin bias seperti
DNA dapat bertahan selama beberapa waktu bahkan setelah bakteri bawaan telah
meninggal. Kami menggunakan rRNA sebagai target untuk menganalisis komposisi
komunitas bakteri. Lebih jauh, bagi banyak bakteri isi rRNA juga terkait dengan aktivitas
mereka, yang mungkin merupakan parameter tambahan penting ketika dampak pada susu
pembusukan dipertimbangkan.
B. RUMUSAN MASALAH
1. Bagaimana flusing gas N2 dapat mengatasi hilangnya keanekaragaman bakteri dan
menghambat psychotropic pseudomonas selama penyimpanan dingin susu sapi segar?
C. TUJUAN MAKALAH
1. Untuk mengetahui flusing gas N2 dapat mengatasi hilangnya keanekaragaman
bakteri dan menghambat psychotropic pseudomonas selama penyimpanan dingin susu
sapi segar.
D. MANFAAT MAKALAH
1. Agar mengetahui flusing gas N2 dapat mengatasi hilangnya keanekaragaman bakteri
dan menghambat psychotropic pseudomonas selama penyimpanan dingin susu sapi
segar?

BAB 2
MATERIAL DAN METODE

2.1Sampel susu segar dan analisa mikrobiologi

Menggunakan 3 sampel susu sapi segaryang berbeda (L1,L2 dan L3). Sampel mewakili
susu yang diambil dari comingled milks yang dikirim ke The helsinki diary Ltd
(Finlandia) pada bulan Mei, Juni dan Agustus 2014.
Konstruksi peralatan yang digunakan untuk pengaliran nitrogen (gambar 1) diketakkan
pada ruangan dingin dengan suhu 66C. 2 buah labu masing-masing terhubung dengan flow
3

meter yang telah terpasang 0,2-m filter steril. Gas N2 yang digunakan adalah N2 murni
99,999%. Tingkat aliran yang digunakan yaitu 120 ml/menit. headspace labu sekitar 120 ml
secara terus menerus akan dibersihkan dengan N 2 segar. Gas N2 steril yang telah melewati
filter steril akan masuk ke masing-masing labu dimana yang mengandung 100 ml susu segar.
Suasana murni adalah atmosfer dari N2 steril yang masuk dan akan dikeluarkan melalui outlet
tube. Susu segaryang tidak diberi perlakuan (sampel C) diletakkan di kondisi yang sama
dengan dipasang inlet dan outlet tube yang telah terpasang filter steril 0,2-m. ketiga labu
diletakkan pada multi-place magnetic stirrer dan sebagian terendam pada waterbath yang
didinginkan oleh 99,5% ethanol sebagai cooling agent. Susu segarpada setiap labu diaduk
dengan kecepatan 220 rpm.

Gambar 1. Diagram susunan rangkaian peralatan

Pada saat pengambilan sampel susu di encerkan dengan menggunakan larutan saline
0,85%. total jumlah bakteri aerobic akan ditentukan dari hasil penanaman sample pada
plate rangkap tiga PCA (Plate Count Agar) dan kemudian diinkubasi selama 72 jam 30OC.

2.2 Ekstraksi RNA dan squencing amplikon

Setelah menerima susu segaryang telah disimpan selama 3,4,6 atau 7 hari penyimpanan
dingin, diambil 1,5 ml sampel susu segardari masing- masing botol. RNA secara langsung
akan di ekstraksi dengan menggunakan Rneasy kit (Qiagen, Sweden). The Sensi FAST TM
cDNA synthesis kit digunakan untuk mensintesis cDNA. Kontrol PCR ditargetkan 0,7 kb
fragmen dari gen 16S rRNA yang dilakukan dengan primer WO1 dan WO12, hal ini

dilakukan untuk memastikan tidak ada DNA bakteri dan sintesis cDNA dari ektrak RNA
dapat berjalan dengan baik.
Amplicon Next-generating sequencing (NGS) ditunjukkan pada Miseq Illumina. Primer
universal eubacterial 27f dan 357r melindungi daerah hipervariable V1 dan V2 dari gen 16S
rRNA untuk mencocokkan ideks primer Illumina. Squensing PCR terdiri atas proses
denaturasi awal 98oC 5 menit, diikuti dengan 25 siklus denaturasi 98 oC 10 detik, annealing
60oC 30 detik, elongation 72oC 30 detik dan final extention 72oC 5 menit. Setiap 25l
mengandung 1x NebNext High Fidelity Mastermix (New England biolabs, germany), 0,5
mM primer dan 1 ng template DNA. Produk dari PCR akan di visualisasikan dengan
menggunakan jel agarose 1%. Setelah mengukur ukuran fragmen dan konsentrasi dengan
menggunakan Bioanalyzer 2100 (agilent, Germany) indeks PCR dilakukan dengan ketentutan
sbagai berikut : 98oC selama 5 menit, diikuti oleh 8 siklus dari 98C selama 10 detik, 55C
selama 30 detik dan 72C selama 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72C selama 5 menit.
Setiap 25-l mengandung 1x NebNext High Fidelity Mastermix (New England biolabs,
germany), indek primer 1 (N7xx) dan indek primer 2 (S5xx). Semua sampel dimurnikan
menggunakan AMPure beads XP (Beckman Coulter, Germany), divalidasi dengan
Bioanalyzer 2100 device on a High-Sensitivity DNA chip (Agilent,Germany) dan dihitung
menggunakan Quant-iT Pico Green dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Germany). Setelah itu
data dikumpulkan untuk selanjutnya dilakukan squencing.

2.3 Analisis data squencing

Untuk mengurangi error squencing, data squencing mentah diproses menggunakan
MOTHUR v.1.33.3. Pertama barkode dan primer dihilangkan untuk membentuk urutan yang
kontinu, lalu urutan diperiksa chimera dengan penyelarasan ke database SILVA yang
disediakan MOTHUR, yang berasal dari koleksi Genom online database. Squens
diklasifikasikan menggunakan dataset Ribosomal Project di MOTHUR. Setalah menghapus
squens mitokondria dan chloroplastic, jarak matrik dihitung mulai dari squens dengan
kualitas yang tinggi, sehingga operating taxonomical units (OTUs) didapatkan dari
alogaritma pengelompokan hubungan kekerabatan terjauh. Untuk menganalisis filogenetik
Pseudomonas, dimana dia merupakan genus yang memiliki respon yang tinggi terhadap
5

kondisi penyimpanan susu, perwakiran squens dari masing-masing OTU dikelompokkan di

MOTHUR pada tingkat kemiripan 97% dan disesuaikan dengan database SILVA
menggunakan ARB. Urutan nukleotida Data yang diperoleh dalam penelitian ini telah
disetorkan ke NCBI dengan Urutan Baca Arsip bawah nomor SRR2481188, SRR2481213,
SRR2481233,SRR2481257, SRR2481271, SRR2481286, SRR2481304, SRR2481319,
SRR2481331,SRR2481345, SRR2481360, SRR2481370, SRR2481383, SRR2481397 and
SRR2481507.

2.4 Analisis statistika

Jarak matriks didsasarkan pada OTUs yang didefinisikan oleh 97% kesamaan
digunakan untuk menghitung kurva rarefaction, OTU richness dan indeks keanekaragaman.
Analisis filogenik juga dilakukan pada tingkat kemiripan 97%. Perbedaan yang signifikan
kondisi penyimpanan susu akan dianalisis dengan program R v3.1.2 (http://www.Rproject.org/) menggunakan multivariate analysis of variance (fungsi Adonis) berdasarkan
indeks perbedaan Yue Clayton dan jarak Euclidean. Untuk

Pseudomonas, kekerabatan

maksimum di hitung dari hasil squensing yang hampir sama pada ARB dengan default
setting.

BAB 3
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 HASIL
3.1.1 Analisis berdasarkan biakan bakteri dari susu sapi segar
Jumlah bakteri awal pada agar PCA diperkirakan berjumlah 104 cfu/ml (4 log-unit)
untuk semua sampel susu segar (L1, L2, dan L3). Untuk agar kontrol, pertumbuhan
terjadi melewati batas waktu seperti yang diharapkan. Untuk L1 dan L2 jumlah bakteri
belebih 106cfu/ml (6 log-unit) setelah 4 hari di pendingin. Tetapi pada L3 masih dibawah
5.5 log-unit pada hari ke-3.Setelah 6-7 hari jumlah bakteri antara 8 dan 9 log-unit dan
6

meningkat menjadi 104-105 dibandingkan jumlah awal. Sebaliknya, pertambahan jumlah

bateri konstan selama hari ke 3 atau 4 pada susu yang dialiri N 2, tanpa adanya
peningkatan setelah hari ke 6 pada sampel L3 dan sdikit peningkatan setelah hari ke 7
pada sampel L1 dan L2. Bagaimanapun jumlah keseluruhan bakteri masih berada di
bawah standar batas kadar mikrobiologi yang diterima (3x10 5 cfu/ml, setara 5.5 log-unit)
pada susu yang di aliri N2.

3.1.2 Analisis keragaman bakteri pada susu sapi segar

Seluruh cDNA yang disintesa dari subsample (L10, L1C4, L1N4, L1C7, L1N7; L20,
L2C4, L2N4, L2C7, L2N7; L30, L3C3, L3N3, L3C6, L3N6)menghasilkan 16S rRNAPCR dari ukuran yang diharapkan.tapi PCR gagal menghasilkan perbanyakan dari
ekstrak RNA yang sesuai, yang menunjukkan bahwa tidak ada DNA tetap dalam sampel
(data tidak ditampilkan). Analisis kurva penghalusan menunjukkan bahwa kedalaman
pengambilan sampel ini cukup untuk analisis lebih lanjut dari sampel pada tingkat OTU
97 karena semua sampel mencapai batas minimal yang ditentukan.Secara keseluruhan,
keragaman bakteri tertinggi di susu mentah awal (L10, L20, L30), mulai 486-756 Otus.
Dalam semua sampel lainnya, keragaman bakteri berkurang dan jumlah OTU berkisar
dari 89 (L3C6) ke 288 (L2N7) per sampel. Satu-satunya pengecualian adalah L3N3
yang tingkat keragaman sebanding dengan baku susu awal sampel terdeteksi.

Secara kebetulan, keragaman bakteri yang dihitung menggunakan Shannon Index,

kerataan bakteri tertinggi pada sampel baku susu awal (3,47 dan 0,55, masing-masing)
dan terendah di sampel dingin disimpan (1,29 dan 0,25, masing-masing). Dengan
pendinginan saja, total OTU menurun dari 1392 menjadi 467 setelah penyimpanan 3-4
hari (66,5% berkurang) dan 337 setelah 6-7 hari (75,8% berkurang). Setelah 6-7 hari
7

sampel yang disimpan dingin hanya menunjukkan 128 OUT (37.9%) dengan susu segar
awal.
Penyimpanan dingin yang dikombinasi dengan pengaliran gas N 2 mengurangi jumlah
OTU setelah 3-4 hari dan 6-7 hari, masing-masing 999 dan 651 OUT yang masih dapat
terdeteksi setara dengan berkurang hanya 28,2% dan 53,2%. Setelah hari ke 6-7 sampel
masih menunjukkan 287 OUT (44,1%) dibandingkan susu segar awal.

Secara total, ada 13 filum bakteri yang terdeteksi: Acidobacteria, Actinobacteria,

Armatimonadetes, Bacteroidetes, Deinococcus-Thermus, Fibrobacteres, Fusobacteria,
Gemmatimonadetes, Planctomycetes, Proteobacteria, spirochaetes, Tenericutes dan
Firmicutes. Lebih dari 80% jumlah yang tidak diberi catatan dikelompokkan menjadi
tiga filum utama, Bacteroidetes, Proteobacteria dan Firmicutes, dengan urutan
Firmicutes> Proteobacteri = Bacteroidetes di awal susu segar, Proteobacteria >>
Bacteroidetes = Firmicutes di dalam susu yang disimpan dingin, dan Proteobacteria>
Firmicutes> Bacteroidetes dalam sampel yang disimpan dingin dan dialiri N2
rRNA terkait Bacteroidetes didominasi oleh anggota Bacteroidia. sementara jumlah
10,2% dari total yang terbaca dalam sampel baku susu awal. Secara total, tujuh keluarga
Bacteroidetes

terdeteksi.

Dalam

sampel

baku

susu

awal,

Flavobacteriaceae,

Porphyromonadaceae dan Rikenellaceae terdistribusi merata, dengan jumlah 1,8-2,3%

dari sampel yang terbaca, tetapi hanya Flavobacteriaceae tetap konstan selama
penyimpanan susu sementara yang lain menurun.
Bacillus dan Clostridia adalah grup yang aling dominan dari Firmicutes. Dua kelas
tersebut adalah yang paling nampak pada sampel susu segar, terhitung 12.1% dan 17.7%
dari total keseluruhan yang terbaca. Sementara rRNA hanya berkurang sementara setelah
3-4 hari pada penyimpanan dingin, rRNA Clostridia berkurang signifikan selama masa
penyimpanan dengan efek pendinginan yang lebih dominan tanpa perlakuan N2.
Bakteri Bacillus, 13 famili terdeteksi. Pada sampel susu segar ,Aerococcaceae (3.3%),
Staphylococcaceae (2.7%), Carnobacteriaceae (1.6%) and Streptococcaceae (1.2%)
merupakan family utama dari bacillus.

Pembacaan jela menunjukkan bakteri yang

menghasilkan asam laktat yang menarik bagi perusahaan susu (Lactobacillus,

Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc) berada pada komposisi yang rendah 1,6-2,3%

dari hasil terbaca.
Clostridia dikelompokkan menjadi sembilan keluarga dengan Ruminococcaceae dan
Lachnospiraceae mendominasi. Keduanya menurun secara signifikan dari 6,1% dan
3,4% di awal sampel susu mentah 0,0% dan 0,2% (untuk susu disimpan dingin) dan
1,1% dan 0,6% (untuk susu yang disimpan dingin dan dialiri N 2) setelah 6-7 hari.
Ruminococcaceae genus Oscillibacter, yang menyumbang 0,8% dari semua hasil dalam
sampel susu mentah awal, tidak bisa terdeteksi setelah 6 sampai 7 hari penyimpanan
dingin. 53.3-79.8% dari proporsi Clostridia tidak dapat diklasifikasikan sampai level
genus.
Proteobacteria didominasi oleh Gammaproteobacteria, 18,2% dari total hasil dalam
sampel susu segar awal. Selama penyimpanan, Gammaproteobacteria meningkat secara
dramatis menjadi 76,2% (dalam penyimpanan dingin) dan 55,6% (untuk penyimpanan
dingin dan di aliri N2). Secara total, 13 keluarga yang terdeteksi dengan
Pseudomonadaceae>Enterobacteriaceae = Moraxellaceae, yang terdiri dari total 65,685,2% dari semua Gammaproteobacteria. Sedangkan >70% dari Enterobacteriaceae
tidak dapat diklasifikasikan ke genus menggunakan database referensi SILVA, anggota
Pseudomonas
Moraxellaceae;

dan

Acinetobacter

hingga

99,8% dari

jelas

didominasi

Pseudomonadaceae

Pseudomonadaceae

dan

dan

74,3-91,1% dari

Moraxellaceae dapat diklasifikasikan ke dalam genus masing-masing. Selain itu, genus

tersebut secara signifikan dipengaruhi oleh kondisi penyimpanan susu. Setelah
penyimpanan dingin saja selama 3-4 hari, rRNA yang berhubungan dengan
Pseudomonas meningkat signifikan dari 3.7% menjadi 29.7%. Anehnya, kelimpahan
rRNA yang berhubungan dengan Pseudomonas menurun setelah 6-7 hari (17,6%) dan
secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan susu yang disimpan dingin saja di
waktu sampling yang sama. Terlepas dari sampel atau perlakuan, rRNA berhubungan
dengan Pseudomonas didominasi (61-97%) dengan urutan erat dengan P. veronii. Genus
lain dari Proteobacteria menyimpan strain dengan potensi patogen (Yersinia, Serratia,
Hafnia, Delftia, Campylobacter, Escherichia-Shigella) hanya menyumbang 2,0-7,2%
dari seluruh total hasil pembacaan.Secara keseluruhan, tidak ada bakteri yang terkait
dengan pembusukan atau bersifat patogen pada manusia, atau anaerob dirangsang oleh
perlakuan gas N2.
Level taxa OTU<1% muncul pada semua sampel, terlepas dari kondisi sampling atau
waktu pengambilan sampel. Mereka membentuk lebih dari 20% OTU dari susu sampel
awal. Seiring waktu, terlepas dari kondisi penyimpanan, level taxa menurun pada jumlah
9

relative 5-10% pada susu yang hanya disimpan dingin. Sebaliknya, hasil sampel dari
penyimpanan dingin dan dialiri gas N2 dengan satu pengecualian (L2N4)(<1%) lebih
tinggi kelimpahan (sekitar 20%) dibandingkan dengan kontrol yang sesuai mereka,
dan setara dengan tingkat awal mereka (L10, L20 dan L30)

3.2 PEMBAHASAN
Susu segarmengandung banyak mikroba, terutama bakteri yang mungkin merugikan
dan berkaitan dengan kesehatan manusia. Sampel susu segaryang digunakan dalam penelitian
ini memiliki kualitas mikrobiologi yang baik dengan hasil perhitungan awal 10 4 cfu/ml. Dari
hasil awal pembiakan menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri pada susu segarterhambat
pada suhu 60C oleh flushing gas N2. Seperti penelitian sebelumnya.

Data kami, yang diperoleh dari 16S rRNA berkode bakteri, dikonfirmasi hasil dari
penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa susu yang disimpan dalam freezer memicu
perubahan populasi bakteri. Flushing

menggunakan gas N2selektif terhadap phylotypes

bakteri yang berbeda dibandingkan dengan kontrol. Dan keseragaman bakteri secara
menyeluruh menurun pada sampel yang mendapatkan perlakuan freezing dan flushing gas N2.
Dibandingkan dengan yang hanya dilakukan freezing.Terutama rare taxa menunjukkan angka
yang lebih baik dengan flushing gas N2 dibandingkan dengan susu yang dibekukan saja.
Mengingat bahwa sampel susu segarawal telah dibekukan selama dua hari di berbagai
tanki farm sebelum pengumpulan dan bahwa tiga sampel susu segarmewakili campuran susu
yang diproduksi di bulan yang berbeda, memiliki nilai keragaman relatif kelompok utama
sangat konsisten (Tabel S1). Sampel susu segarawal didominasi oleh urutan rRNA terkait

10

dengan Firmicutes, yang konsisten dengan penelitian sebelumnya, meskipun kelimpahan

relatif dari Firmicutes lebih rendah dalam penelitian ini.
Sampel susu segarawal pada penelitian kami menunjukkan bahwa sekitar 1% dari
yang terlihatmerupakan genus Jeotgalicoccus (Gambar 5, Tabel 2, Tabel S1). J.
psychrophilus, yang tumbuh antara 4C sampai 34 C, ditemukan di saluran ambing sapi, dan
dianggapspesies halophilic atipikal dalam susu kambing. Terkait dengan bakteri dari
genusOscillibacter juga ditemukan dalam sampel susu segarawal (Gambar 4H dan 5, Tabel 2,
Tabel S1).Oscillibacter adalah bakteri anaerobik, mesofilik, tidak membentuk spora
yangditemukan dalam usus babi. Baru-baru ini, kasus bakteremiadisebabkan oleh O.
ruminatium. BakteriOscillibacterseperti pada grafik juga dilaporkan terdapat dalam sampel
susu untuk manusia. Secara keseluruhan, baik genus Oscillibacteratau Jeotgalicoccus
terdeteksi dalam sampel susu segaryang disimpan selama 6 sampai 7 hari, terlepas dari
pengobatan. Bakteri milik Bacteroidetes juga negatifdipengaruhi oleh kedua kondisi
penyimpanan diuji. Dalam penelitian ini, bakteri dari genusAlistipes dan Chryseobacterium
didominasi dalam sampel raw milk awal. Bakteri Alistipes terdeteksi dalam tinja sapi dan
bakteri Chryseobacteriumsebelumnya diisolasi dari susu sapi. Penelitian kami menunjukkan
bahwabeberapa

taksa,

terutama

bakteri

milik

Firmicutes

seperti

Jeotgalicoccus,

Oscillibacter,Lachnospiraceae, Clostridiales dan juga untuk Bacteroidetes (Bacteroidales)

sangat sensitifpada keadaan beku. Karakteristik ini dapat digunakan sebagai indikator dari
"kesegaran" dari susu segaryang dibekukan.
Flushing N2 memiliki dampak negatif yang penting pada Acinetobacter karena
anggota

genus

ini

diketahui

terbentuk

dari

beberapa

gen

antibiotik,

isolat

multiresistenAcinetobacter juga ditemukan dalam susu segar. Genus Pseudomonas sangat

heterogen dan di mana-mana di alam; itu terdiri dari banyakpsychrotrophs yang memiliki
kemampuan menghasilkan enzim tahan panas (protease, lipase, fosfolipase) yang dapat
mengubah atau merusak produk makanan. Keragaman pseudomonasdalam susu segarjuga
digambarkan dalam penelitian ini sebagai kelompok yang terdapat jumlah terbesar dari OTU.
Namun, 248 dari OTU ini berafiliasi dengan rare taxa pada tingkat di bawah 1 %.
Nilai OTU dari sembilan golongan Pseudomonas, tampak pada tingkat di atas 1 %
yang berafiliasi dengan P. veronii , P. nitroreducens , P. Alcaligenes , P. Fragi , P. putida , P.
lundensis , dan P. Panipatensis. Meskipun beberapa spesies seperti P. Fragi , P. putida atau
P. lundensis yang secara umum terdapat pada susu segar, karena mereka ditemukan pada susu
11

yang mengalami pembusukan, tidak adanya P. fluorescens mengejutkan mengingat

banyaknya laporan yang menggambarkan psychrotolerantP. fluorescens sebagai spesies kunci
yang aktif dalam proses pembusukan susu. P. putida juga dilaporkan akan sering ditemukan
dalam susu segardan juga terkenal sebagai spoiler susu umum bersama dengan P.fluorescens.
Anehnya, sebuah OTU tunggal yang filogenetis paling dekat dengan P. veronii
danberkisar di relative abundanced lebih dari 97%, ditemukan tersebar luas di semuasampel
(Tabel 3). Spesiesawalnya diisolasi dari air mineral alami, adalah lipase- danphospholipasenegatif, menghasilkan pigmen fluorescent pada media KB, mampu tumbuh pada suhu 4 C,
dan pameran fleksibilitas fisiologis selama periode anoksia [45, 46]. Beberapa laporan
menyoroti peran penting air sebagai sumber utama kontaminasi pseudomonas susu [5, 4749]. Semua pengamatan sebelumnya bisa menjelaskan mengapa OTU 0001 sama-sama
dominan dalam tahap awal analisis, tetapi juga dalam susu dingin disimpan di mana
ketegangan O2 lebih rendah karena pertumbuhan bakteri yang berlebihan, atau susu N2memerah di mana O2 tidak ada. studi berbasis budaya-dan keterbatasan yang melekat dari
sistem identifikasi fenotipe, yang secara luas diterapkan untuk menyelidiki sebelumnya baku
susu-memanjakan Pseudomonas, bisa menjelaskan perbedaan denganpenelitian ini.
Secara keseluruhan, penelitian kami didasarkan pada analisis rRNA dan tidak pada
DNA. Dengan demikian dalam penelitian kami, terutama bakteri dengan kandungan rRNA
tinggi (sebagai akibat dari aktivitas tinggi) menjadi sasaran. Sebaliknya, kandungan DNA
dari sel-sel yang lebih seragam, meskipun perbedaan dalam jumlah operon rRNA telah
dilaporkan. Selanjutnya, RNA terdegradasi selama peluruhan sel, tetapi DNA dapat tetap
stabil selama beberapa minggu atau bulan, tergantung pada matriks. DNA bakteri, muncul
setelah kematian sel, dapat menyebabkan kesimpulan kesalahan jika bakteri ditargetkan oleh
pendekatan barcode berbasis DNA. Namun, bias terbesar diperkenalkan selama barcode
bakteri berasal dari prosedur ekstraksi asam nukleat (terutama dari prosedur lisis sel) dan
PCR. Selanjutnya, karena semua primer, diasumsikan universal, menimbulkan bias ke mana
tidak diketahui. Akhirnya, kondisi penyimpanan sampelsebelum nukleat ekstraksi asam kuat
mengganggu barcode diperoleh; sebagai contoh,sampel prosedur beku-mencair mungkin
menyebabkan pergeseran besar dalam struktur komunitas bakteri,seperti yang telah
ditunjukkan dalam sampel tinja; titik ini mungkin bisa menjelaskan mengapa kelompok
bakteri anaerobik seperti Bacteroidales, Ruminococcaceae, Clostridiales, Lachnospiraceaea
ditemukan dalam penelitian ini.
12

KESIMPULAN
Data kami menunjukkan bahwa keragaman bakteri lebih baik diawetkan dalam susu
segardengan tambahan flusing menggunakan gas N2 dibandingkan dengan ruangan dingin
dengan suhu 66 C. Penelitian yang mengungkapkan bahwa tidak adanya patogen pada
manusia, milk spoiler, atau anaerob jelas sangat disukai pada perlakuan flushing N2
menunjukkan potensi lebih tinggi untuk flushing gas N2 sebagai pengobatan tambahan untuk
menjaga kualitas dan keamanan selama susu segar penyimpanan dingin dan rantai
transportasi.
Dari hasil pengamatan sebelumnya, berdasarkan metode culture-dependent,penelitian
ini menegaskan bahwa flushing gas N2 dipengaruhi oleh pseudomonas, namun jenis
penyimpanan tidak mengubah pola keragaman genus ini. Dalam semua sampel, OTUs terkait
dengan pseudomonas spesies veronii yang dominan. Beberapa kelompok anaeroob, bakteri
usus besar yang khas dan juga kelompok bakteri utama yang ditemukan di awal sampel susu
segar, namun mereka sensitif pada kondisi penyimpanan dingin.
Data ini sangat menjanjikan karena para produsen susu mendapat keragaman bakteri
baik yang lebih tinggi dalam produk mereka, dan hasil yang disajikan di sini memungkinkan
untuk perpanjangan waktu penyimpanan dinginsusu segartanpa adanya dampak negatif pada
kualitas mikrobiologi.

13

DAFTAR PUSTAKA

Gislene B.O, Luciana F, Rosa H.L, McIntosi D (2015). Psychrotrophic bacteria in milk: How
much do we really know?. Brazilian Journal of Microbiology. 46, 2, 313-321
Gschwendtner S, Alatossava T, Kublik S, Fuka MM, Schloter M, Munsch-Alatossava P
(2016)
Munsch-Alatossava P, Gursoy O, Alatossava T. Potential of nitrogen gas (N2) to control
psychrotrophsand mesophiles in raw milk. Microbiol Res. 2010; 165: 122132. doi:
10.1016/j.micres.2009.02.002PMID: 19398315
Munsch-Alatossava P,QuintynR,De Man I,AlatossavaTandGauchiJ-P (2016) Efficiencyof N2
Gas Flushing Compared to the Lactoperoxidase System at Controlling Bacterial
Growth in Bovine Raw Milk Stored at Mild Temperatures. Front. Microbiol.7:839. doi:
10.3389/fmicb.2016.00839
N2 Gas Flushing Alleviates the Loss of Bacterial Diversity and Inhibits Psychrotrophic
Pseudomonas during the Cold Storage of Bovine Raw Milk. PLoS ONE 11(1):
e0146015. doi:10.1371/journal. pone.0146015

14

15