Para ilustrar el valor de la trama de doble recproco en determinar Vmax y

Km, considere un ejemplo especfico que implica la enzima hexoquinasa,

como se ilustra en Figuras 6-12 y 6-13. Hexoquinasa es un importante
enzima en el metabolismo de la energa celular, ya que cataliza
la primera reaccin en la ruta glucoltica, que se discute en detalle en el
Captulo 9. Utilizacin de la hidrlisis de ATP como una fuente de tanto el
grupo fosfato y la energa libre necesaria para la reaccin, la hexoquinasa
cataliza la fosforilacin de la glucosa en el tomo de carbono 6

Para analizar esta reaccin cinticamente, debemos determinar la velocidad

inicial en cada una de varias concentraciones de sustrato

FIGURA 6-12 Procedimiento experimental para el estudio de la cintica de la

reaccin hexoquinasa. Tubos de ensayo que contienen concentraciones
graduadas de glucosa y una concentracin de saturacin de ATP se
incubaron con una cantidad estndar de la hexoquinasa. La a continuacin,
la tasa inicial de la apariencia del producto, v, se represent como una
funcin de la concentracin de sustrato [S]. La curva es hiperblica,
acercndose Vmax como la concentracin de sustrato se pone ms y ms
alto. Para la trama de doble recproco derivado de estos datos, ver Figura 613.
Cuando una enzima tiene dos sustratos, el enfoque habitual es variar la
concentracin de un sustrato en un momento mientras se mantiene la de la
otra constante a un nivel cerca de la saturacin para asegurarse de que no
se convierte en limitante de la velocidad. La determinacin de la velocidad
se debe hacer antes de que cualquiera de la concentracin de sustrato cae

sensiblemente o el producto se acumula hasta el punto que la reaccin

inversa se vuelve significativa.
En el enfoque experimental se muestra en la figura 6-12, la glucosa es el
sustrato de la variable, con el ATP presente en una concentracin de
saturacin en cada tubo. De la reaccin de nueve mezclas preparadas para
este experimento, un tubo es un control negativo designado el blanco de
reactivo (B) ya que no contiene glucosa. Los otros tubos contienen
concentraciones de glucosa comprendidas entre 0,05 y 0,40 mm. Con todos
los tubos preparados y mantenidos a alguna temperatura favorable (25 C
se utiliza a menudo), la reaccin en cada uno se inicia mediante la adicin
de una cantidad fija de hexoquinasa. La tasa de formacin de producto en
cada una de las mezclas de reaccin se puede determinar ya sea por
monitorizacin continua espectrofotomtrica de la mezcla de reaccin (a
condicin de que uno de los reactivos o productos absorbe luz de una
longitud de onda especfica) o al permitir que cada mezcla de reaccin a
incubar durante algn perodo corto, fijo de tiempo, seguido por ensayo
qumico, ya sea para el agotamiento del sustrato o acumulacin de producto
.
Como indica la figura 6-12, la velocidad inicial de la reaccin de consumo de
glucosa para los tubos 1-8 vari desde 2,5 hasta 7,3 mmol de glucosa
consumida por minuto, sin reaccin detectable en el blanco. Cuando estas
velocidades de reaccin se trazan como una funcin de la concentracin de
glucosa, los ocho puntos de datos generan la curva hiperblica
se muestra en la figura 6-12. Aunque los datos de la Figura 6-12 se idealizan
a ttulo ilustrativo, la mayora de los datos cinticos generados por este
enfoque no, de hecho, se ajustan a una hiperblica
curva a menos que la enzima tiene algunas propiedades especiales que
causan la salida de la cintica de Michaelis-Menten.
La curva hiperblica de la figura 6-12 ilustra la necesidad de algunos medios
de linealizar el anlisis porque ni Vmax ni Km se pueden determinar
fcilmente a partir de los valores como trazado. Esta necesidad es
satisfecha por la trama de doble recproco lineal que se muestra en la Figura
6-13. Para obtener los datos representados aqu, se calcularon los recprocos
para cada valor de [S] y v en la figura 6-12. Por lo tanto, los valores de [S]
de 0,05-0,40 mM generan recprocos de 20 a 2,5 mM-1, y los valores V del
2.5 a 7.3 mol / min dan lugar a recprocos de 0,4 a 0,14 min / mmol.
Debido a que estos son recprocos, el punto de datos que representa la
concentracin ms baja (tubo 1) est ms lejos del origen, y cada tubo
sucesivo se representa por un punto ms cercano al origen.
Cuando estos puntos de datos estn conectados por una lnea recta, la
interseccin y se encontr que 0,1 min / mmol, y la interseccin x es -6.7
mM-1. A partir de estas intercepciones, podemos calcular que Vmax 1 / 0,1
10 mmol / min y Km- (1 /- 6.7) 0,15 mM. Si ahora volvemos a la trama de
Michaelis-Menten de la figura 6-12, vemos que ambos valores son bastante
razonable, ya que podemos imaginar fcilmente que la trama est
aumentando hiperblicamente a un mximo de 10 mm / min. Tenga en
cuenta que el uso de tus ojos solos, es posible estimar el Vmax sea slo 8 o

9 mmol / min. Por otra parte, el grfico llega a la mitad de este valor a una
concentracin de sustrato de 0.15 mM. Por lo tanto, esta es la Km de la
hexoquinasa para la glucosa.
La enzima tambin tiene un valor de Km para el otro sustrato, ATP. La Km
para ATP se puede determinar mediante la variacin de la concentracin de
ATP mientras se mantiene la concentracin de glucosa en un nivel alto, fijo.
Curiosamente, la hexoquinasa no slo fosforila la glucosa, sino tambin
otras hexosas y tiene un valor Km distintiva para cada uno. La Km para la
fructosa, por ejemplo, es 1,5 mM, lo que significa que se tarda diez veces
ms fructosa que glucosa para mantener la reaccin a la mitad de su
velocidad mxima.

FIGURA 6-13 Parcela doble Recproca para la hexoquinasa datos de la Figura

6-12. Para cada tubo de ensayo en la figura 6-12, 1 / v y 1 / Se calcularon
[S], y luego 1 / v se representa como una funcin de 1 / [S]. La interseccin
de 0,1 corresponde a 1 / Vmax, por lo Vmax es de 10 mm / min. La
interseccin x de -6.7 corresponde a -1 / km, por lo que es de 0,15 Km mM.
(Algunos de los tubos representados en la figura 6-12 no se muestran aqu
por falta de espacio.)

Ley de Inhibidores de la Enzima De cualquier manera

irreversible o reversiblemente
Hasta el momento, hemos asumido que los sustratos son
las nicas sustancias en las clulas que afectan a las

actividades de las enzimas en las clulas. Sin embargo, las

enzimas tambin se ven influenciadas por los productos,
sustratos alternativos, anlogos de sustrato, drogas,
toxinas, y una clase muy importante de los reguladores
llamados efectores alostricos. La mayora de estas
sustancias tienen un efecto inhibidor sobre la actividad
enzimtica, la reduccin de la velocidad de reaccin con el
sustrato deseada o, a veces el bloqueo de la reaccin por
completo.
Esta inhibicin de la actividad de la enzima es importante
por varias razones. Primero y ante todo, la inhibicin de la
enzima juega un papel vital como un mecanismo de control
en las clulas. Muchas enzimas estn sujetas a la
regulacin de las pequeas molculas especficas distintas
de sus sustratos. A menudo, este es un medio de deteccin
de su entorno inmediato para responder a especficas
condiciones celulares. Inhibicin de la enzima es tambin
importante en la accin de los frmacos y venenos, que con
frecuencia ejercen sus efectos mediante la inhibicin de
enzimas especficas. Los inhibidores son tambin tiles para
los entomlogos como herramientas en sus estudios de los
mecanismos de reaccin y a los mdicos para el
tratamiento de la enfermedad. Inhibidores Especialmente
importantes son anlogos de sustrato y anlogos del estado
de transicin. Estos son compuestos que se asemejan a la
sustrato real o estado de transicin lo suficientemente
cerca para unirse al sitio activo, pero no pueden someterse
a reaccin para crear un producto funcional.
Anlogos de sustratos son herramientas importantes en la
lucha contra las enfermedades infecciosas, y muchos se
han desarrollado para inhibir enzimas especficas en
bacterias patgenas y virus, por lo general la orientacin
enzimas que nosotros los humanos no tienen. Por ejemplo,
a las sulfonamidas se asemejan al precursor de cido flico,
PABA. Ellos pueden unirse y bloquear el sitio activo de la
enzima bacteriana utiliza para sintetizar el cido flico, que
se requiere en la sntesis de ADN. Del mismo modo, la

azidotimidina (AZT), que es un medicamento antiviral, se

asemeja a la molcula de desoxitimidina normalmente
utilizado por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
para sintetizar ADN usando la transcriptasa inversa viral.
Sin embargo, despus de la unin a la sitio activo, AZT se
incorpora en una hebra creciente de ADN, sino que forma
una molcula de "punto muerto" de ADN que no puede ser
alargado Inhibidores pueden ser reversible o irreversible. Un
inhibidor irreversible se une covalentemente a la enzima,
provocando la prdida permanente de la actividad
cataltica. No es de extraar, inhibidores irreversibles son
generalmente txicos para las clulas. Los iones de metales
pesados son a menudo inhibidores irreversibles, como lo
son los venenos de gases nerviosos y algunos insecticidas.
Estas sustancias pueden unirse irreversiblemente a enzimas
como la acetilcolinesterasa, una enzima que es vital para la
transmisin de los impulsos nerviosos (ver Captulo 13). La
inhibicin de la actividad de la acetilcolinesterasa conduce
a la parlisis rpida de las funciones vitales y por lo tanto a
la muerte. Uno de tales inhibidor es fluorofosfato de
diisopropilo, un gas de nervio que se une covalentemente al
grupo hidroxilo de una serina crtico en el sitio activo de la
enzima, lo que hace de este modo la molcula de la enzima
inactiva permanentemente.
Algunos inhibidores irreversibles de enzimas se pueden
utilizar como agentes teraputicos. Por ejemplo, la aspirina
se une irreversiblemente a la enzima ciclooxigenasa-1
(COX-1), que produce prostaglandinas y otros productos
qumicos de sealizacin que causan la inflamacin, la
constriccin de los vasos sanguneos, y la agregacin
plaquetaria. Por lo tanto, la aspirina es eficaz en el alivio de
la inflamacin y el dolor de cabeza leve, y ha sido
recomendado en dosis bajas como un protector
cardiovascular. La penicilina es un antibitico irreversible
inhibidor de la enzima necesaria para la sntesis de la pared
celular bacteriana. La penicilina es por lo tanto eficaz en el
tratamiento de infecciones bacterianas, ya que evita que

las clulas bacterianas a partir de formacin de paredes

celulares, bloqueando as su crecimiento y divisin. Y
debido a que nuestras clulas carecen de pared celular (y la
enzima que sintetiza), la penicilina no es txico para los
seres humanos.
En contraste, un inhibidor reversible une a una enzima de
una manera no covalente, disociable, de tal manera que
existen las formas libre y unida del inhibidor en equilibrio
con el uno al otro. Podemos representar de unin tales
como

con E como la enzima activa libre, como el inhibidor, y la IE

como el complejo enzima-inhibidor inactivo. Claramente, la
fraccin de la enzima que est disponible a la clula en
forma activa depende de la concentracin del inhibidor y la
fuerza del complejo enzima-inhibidor. Las dos formas ms
comunes de inhibidores reversibles son llamados
inhibidores competitivos y los inhibidores no competitivos.
Un inhibidor competitivo se une al sitio activo de la enzima
y por lo tanto compite directamente con el sustrato
molculas para el mismo sitio en la enzima (Figura 6-14a).
Esto reduce la actividad enzimtica debido a que muchos
de los sitios activos de las molculas de enzima son
bloqueados por cota inhibidor de molculas y por lo tanto
no se puede unir molculas de sustrato en el sitio activo. Un
inhibidor no competitivo, por otro lado, se une a la
superficie de la enzima en un lugar distinto del sitio activo.
No bloquea la unin del sustrato directamente, sino que
inhibe la actividad de la enzima indirectamente al causar un
cambio en la conformacin de la protena que puede o bien
inhibir la unin del sustrato al sitio activo o reducir la
actividad cataltica en el sitio activo (Figura 6-14b) en gran
medida.
Se ha logrado un progreso considerable en el campo del
diseo de frmacos asistido por ordenador. En este
enfoque, se analiza la estructura tridimensional de un sitio

activo de la enzima para predecir lo que es probable que se

unen fuertemente a ella y actuar como inhibidores de tipos
de molculas. Entonces, los cientficos pueden disear una
serie de inhibidores hipotticos y poner a prueba su unin
utilizando modelos informticos complejos. De esta manera,
no tenemos que depender nicamente a aquellos
inhibidores que podemos descubrir en naturaleza. Cientos o
incluso miles de potenciales inhibidores pueden ser
diseados y probados, y slo los ms prometedores en
realidad estn sintetizados y evaluados experimentalmente.

FIGURA 6-14 Modos de accin de los inhibidores

competitivos y no competitivos. Tanto (a) competitivo y (b)
los inhibidores no competitivos se unen de forma reversible
a la enzima (E), inhibiendo as su actividad. Los dos tipos de
inhibidores difieren en la que el sitio en la enzima que se
unen a.
REGULACION DE LA ENZIMA
Para entender el papel de las enzimas en la funcin celular,
tenemos que reconocer que rara vez es en el mejor inters
de la clula para permitir una enzima para funcionar a una
tasa alta de manera indiscriminada. En lugar de ello, las
velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas se
deben ajustar continuamente para mantener finamente
sintonizado a las necesidades de la clula. Un aspecto
importante de que el ajuste se encuentra en la capacidad

de la clula para controlar las actividades de enzimas con

especificidad y precisin.
Ya hemos encontrado una variedad de mecanismos de
regulacin, incluyendo cambios en las concentraciones de
sustrato y de producto, alteraciones en la temperatura y el
pH, y la presencia y concentracin de los inhibidores.
Reglamento que depende directamente de las interacciones
de sustratos y productos con la enzima se llama a nivel de
sustrato regulacin. Como la ecuacin de Michaelis-Menten
deja claro, el aumento de la concentracin de sustrato
resultado en mayores velocidades de reaccin (ver Figura 68). Por el contrario, los aumentos en la concentracin de
producto reducen la velocidad a la que el sustrato se
convierte en producto. (Este efecto inhibidor de la
concentracin de producto es la razn por v necesita ser
identificado como la velocidad de reaccin inicial en la
ecuacin de Michaelis-Menten, como se da por la ecuacin
6-7.)
La regulacin a nivel de sustrato es un mecanismo de
control importante en las clulas, pero no es suficiente para
la regulacin de la mayora de las reacciones o secuencias
de reaccin. Para la mayora de las vas, las enzimas estn
reguladas por otros mecanismos tambin.
Dos de los ms importantes de stos son la regulacin
alostrica y modificacin covalente. Estos mecanismos
permiten a las clulas para activar o desactivar las enzimas
o para afinar sus velocidades de reaccin mediante la
modulacin de la actividad enzimtica adecuada. Casi
invariablemente, una enzima que est regulada por un
mecanismo tal cataliza el primer paso de una de mltiples
pasos secuencia. Al aumentar o reducir la velocidad a la
que las funciones escalonadas primero, toda la secuencia
est controlada efectivamente. Rutas que son regulados de
esta manera incluyen aquellos requerida para romper las
molculas grandes (tales como azcares, grasas, o
aminocidos) y las vas que conducen a la sntesis de las
sustancias necesarias por la clula (tales como aminocidos

y nucletidos). Por ahora, vamos a discutir la regulacin

alostrica y modificacin covalente a un nivel introductorio.
Volveremos a estos mecanismos como nos encontramos
con ejemplos especficos en los captulos posteriores.
Las enzimas Allosteric son reguladas por molculas
distintas de reactivos y productos
El mecanismo de control ms importante mediante el cual
se ajustan las velocidades de las reacciones catalizadas por
enzimas para satisfacer las necesidades celulares es la
regulacin alostrica. Para comprender este modo de
regulacin, considerar la va por la que una clula convierte
parte precursor A en algn producto P final a travs de una
serie de intermedios B, C, y D en una secuencia de
reacciones catalizadas por enzimas, respectivamente, E1,
E2, E3, y E4:

Producto P podra, por ejemplo, ser un aminocido que

necesita la clula para la sntesis de protenas, y A podra
ser algn componente celular comn que sirve como el
punto de partida para la secuencia de reaccin especfica
que conduce a P.
Inhibicin por Retroalimentacin. Si se permite que
proceda a una velocidad constante, sin restricciones, la va
se muestra en la secuencia de reaccin 6-15 puede
convertir grandes cantidades de A a P, con posibles efectos
adversos derivados de un agotamiento de A o una
acumulacin excesiva de P. Es evidente que se sirven los
mejores intereses de la clula cuando la va no est
funcionando a su velocidad mxima o incluso algn ritmo
constante, pero a un ritmo que se ajusta cuidadosamente a
la necesidad celular para P.
De alguna manera, las enzimas de esta va deben
responder a nivel celular del producto P en un poco de la
misma manera que un horno tiene que ser sensible a la

temperatura de las habitaciones que se destina a calentar.

En este ltimo caso, un termostato proporciona el enlace
regulador necesario entre el horno y su "producto" de calor.
Si hay demasiado calor, el termostato enciende el horno
apagado, la inhibicin de la produccin de calor. Si se
necesita calor, esta inhibicin se alivia debido a la falta de
calor. En nuestro enzima ejemplo, la regulacin deseada es
posible porque el producto P es un inhibidor especfico de
E1, la enzima que cataliza la primera reaccin en la
secuencia.
Este fenmeno se llama retroalimentacin (o producto final)
inhibicin y est representado por la flecha de trazos que
conecta el producto P a la enzima E1 en el siguiente
secuencia de reaccin:

La inhibicin de retroalimentacin es uno de los

mecanismos ms comunes utilizados por las clulas para
asegurar que las actividades de secuencias de reaccin se
ajustan a las necesidades celulares.