Anda di halaman 1dari 65

AnalisaVitamin

DEFINISI

Senyawa organik yang tidak termasuk dalam protein,


karbohidrat, lemak yang terdapat dalam jumlah kecil
dalam bahan makanan tapi sangat penting peranannya
bagi tubuh
Senyawa organik dengan berat molekul rendah yang
dibutuhkan oleh manusia dan organisme hidup lainnya
sebagai sumber nutrisi yang diperlukan dalam jumlah
kecil untuk metabolisme normalnya.
Manusia tidak dapat mensintesis sebagian besar vitamin
dan kebutuhan akan vitamin diperoleh dari makanan
dan suplemen.
Kekurangan vitamin defisiensi

Analisa Vitamin
Informasi komposisi vitamin makanan
diperlukan untuk menentukan intake guna
mengetahui kecukupan dan perbaikan
status gizi manusia.
Metode pengujian yang reliable (dapat
dipercaya/handal) sangat diperlukan untuk
menjamin akurasi food labeling

Yang Perlu diperhatikan


Akurasi dan presisi
Faktor ekonomis
Jumlah sampel/ketersediaan sampel
Metode yang dapat diaplikasikan
Kondisi seperti cahaya, oksigen, pH dan
panas supaya tidak merusak
Homogenisasi sampel

Kestabilan Vitamin
Vitamin pH 7 pH<7 pH>7 O2 Sinar Panas %SM
Vit A
Vit C
Biotin
Karoten
Kolin
B-12
Vit D
As.folat

S
T
S
S
S
S
S
T

T
S
S
T
S
S
T

S
T
S
S
S
S
T
S

T
T
S
T
T
T
T
T

T
T
S
T
S
T
T
T

T
T
T
T
S
S
T
T

40
100
60
30
5
10
40
100

Kestabilan Vitamin
Vitamin

pH 7

pH<7

pH>7

O2

Sinar Panas %SM

Vit K
Niasin
As.Pant
otenat

S
S
S

T
S
T

T
S
T

S
S
S

T
S
S

S
S
T

5
75
50

A p-A
benzoat

B-6
B-2
B-1
Vit E

S
S
T
S

S
S
S
S

S
T
T
S

S
T
T
S

T
T
S
T

T
T
T
T

40
75
80
55

keterangan
S
= stabil
T
= tidak stabil
SM = Susut akibat dimasak

Ekstraksi

Kecuali bioassay, analisa vitamin sebagian besar


melibatkan ekstraksi untuk memisahkan vitamin dari
matriks biologisnya
Secara umum meliputi satu atau beberapa perlakuan
seperti panas, asam, alkali, pelarut dan enzim.
Prosedur ekstraksi spesifik untuk setiap vitamin dan
didisain untuk menstabilkan vitamin.
Prosedur ekstraksi dapat diaplikasikan untuk beberapa
vitamin. Misalnya untuk tiamin dan riboflavin dan
beberapa vitamin larut lemak.

Contoh
Asam

askorbat : ekstraksi dingin dengan asam


metafosforat/asam asetat
V. B1 dan B2 pemanasan dalam asam +
perlakuan enzim
Niasin autoklaving dalam asam (Non cereal)
atau dalam alkali (cereal)
Vitamin A, E dan D Pelarut organik,
saponofikasi, dan reekstraksi dengan pelarut
organik.
Untuk vitamin-vitamin yang tidak stabil (A, E, D),
perlu ditambahkan antioksidan untuk menghambat
oksidasi

Analisa Vitamin
Bioassay manusia dan hewan
Microbiological assay bakteri, yeast
dan jamur
Physicochemical assay
spektrofotometri, fluorometri, kromatografi,
enzimatis, immunologi dan radiometri

Bioassay
Sampai saat ini baru digunakan untuk
vitamin D dan B12
Vitamin D Menggunakan Metode
standard dari AOAC yang dikenal
dengan Metode Line Test yang
didasarkan pada pengapuran tulang.
Karena menggunakan pengapuran
tulang hanya terbatas pada uji
hewan coba saja tidak pada manusia

Prosedur Bioassay Vitamin D

Preparasi sampel AOAC


Periode deplesi (Penghabisan) pemberian diet
Rachitogenic selama 18-25 hari. Tikus yang digunakan
berumur 30 hari dengan berat badan 44 g tetapi 60
g
Pengujian mulai hari terakhir deplesi sampai 8 atau
11 hari setelah deplesi. Selama pengujian, tikus
terdeplesi diberi vitamin D dengan jumlah diketahui
(standard) dan tidak diketahui (sampel)
Jumlah vitamin dalam sampel ditentukan oleh Line Test
dari warna tulang tibia (tulang kering) proximal paling
akhir atau tulang radius atau ulna distal paling akhir.

Mikrobiological assay
Terbatas pada vitamin yang larut air
Sangat sensitif dan spesifik untuk tiap
vitamin
Memakan waktu dan harus patuh pada
prosedur analisa untuk hasil yang
akurat

PRINSIP
Pertumbuhan

mikroba sebanding dengan


kebutuhan akan vitamin.
Microbiological assay menguji pertumbuhan
mikroba dalam ekstrak sampel yang
mengandung vitamin dibandingkan dengan
pertumbuhan mikroba dalam vitamin dengan
jumlah yang diketahui.
Bakteri, yeast dan jamur digunakan sebagai
organisme uji
Pertumbuhan diukur dengan turbiditas
(kekeruhan), produksi asam, gravimetri dan
respirasi

Niasin

Bakteri L.plantarum
Preparasi stok kultur inokulasi freeze dried
culture pada agar bacto-lactobacili dan
diinkubasi pada 37 C selama 24 jam.
Secara umum pertumbuhan diukur dengan
turbiditas, namun jika menggunakan
laktobacillus maka dapat diukur dengan
asidimeter

Tahap analisa
Preparasi sampel
Timbang sampel (kira-kira mengandung 0,1 mg niasin)
dan tambahkan NH2SO4, autoklaf selama 1 jam dan
dinginkan. Atur pH sampai 6,8 dan encerkan sampai
volume (konsetrasi 0,1 g niasin/ml), campur dan saring
Preparasi tabung pengujian
Pengulangan sedikitnya menggunakan 0.0, 0.5, 1.0, 2.0,
3.0, 4.0 dan 5.0 ml sampel kemudian tambahkan air
sampai mencapai 5 ml. Tambahkan 5 ml Difco Basal
Medium untuk niasin ke dalam masing-masing tabung,
autoklaf selama 10 menit pada suhu 121 C dan
dinginkan
Preparasi standar
Sama dengan cara preparasi tabung pengujian.
Standar larutan yang mengandung 0,1 l/ml Niasin

Inokulasi

dan inkubasi (37 C, 16-18 jam)

Tambahkan 1 tetes inokulum ke masing-masing


tabung, tutup tabung dan inkubasi pada suhu 37 C
selama 16-18 jam sampai kekeruhan maksimum
pada tabung dengan konsentrasi niasin paling
tinggi.

Pengukuran

Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540660 nm

Folat

Terdiri dari tiga komponen yang terikat


Gugusan

pteridina
Asam para amino benzoat
Asam glutamat

Sedikit larut dalam air, mudah teroksidasi


dalam asam dan cahaya dan hilang ketika
pemasakan
Karena instabil dan beragam bentuk
menyulitkan dalam analisanya
Untuk menghitung bioavailabilitas folat dalam
fortifikasi dan dalam makanan telah dibuat
DFE (Dietary Folate Equivalent)

Berdasarkan hasil penelitian dilaporkan


bahwa
folat 85% bioavailable
Folat dalam makanan 50% bioavailable
Asam folat dalam produk fortifikasi 1,7 kali lebih
bioavailable dibanding dengan folat dalam
makanan
Asam

g DFE = g food folate + (1.7x g asam


folat).
Perhitungan g DFE untuk beberapa
makanan memerlukan jumlah asam folat
sebagai bagian yang terpisah dari folat
makanan.

Saat ini, metode kromatografi cair sangat


penting untuk memastikan jumlah asam folat
dan bentuk ragam folat dalam makanan
Baru-baru ini, kolaborasi prosedur mikrobiologi
yang berdasarkan ektraksi trienzim dapat
menghitung hanya total folat dan tidak dapat
membedakan antara folat fortifikasi dan folat
makanan.

Folat

Prinsip :
Folat

dalam sampel diekstraksi dalam buffer pada


suhu 100 C (air mendidih).
Hasil esktraksi didigesti dengan -amilase dan
protease (untuk membebaskan ikatan folat dengan
makromolekul) dan konjugase (untuk memecahkan
poly--glutamyl folat menjadi PteGln3 atau yang lebih
kecil).
Pertumbuhan mikroba uji diukur dengan %
transmitan. Transmitan berpengaruh pada
konsentrasi folat.

Yang perlu diperhatikan

Harus dilakukan upaya untuk melindungi folat


yang labil dari oksidasi dan degradasi fotokimia.
Pengurangan senyawa-senyawa termasuk asam
askorbat, -mercaptoetanol dan ditiotreitol
adalah cara efektif dalam mencegah oksidasi.
Patuh pada prosedur analisa adalah penting
untuk menguji folat dengan tepat.

PROSEDUR

Preparasi sampel
1,2-2

g sampel ditambahkan 50 ml buffer,


dihomogenkan, dan didigesti (sampel tinggi lemak
harus diekstrak dengan heksan dan semua sampel
harus dihindarkan dari cahaya dan udara)

Pemecahan trienzim
Panaskan

sampel selama 5 menit, dinginkan pada


suhu ruang, digesti sampel dengan -amilase,
protease dan cojugase. Inaktifasi enzim dengan
pemanasan selama 5 menit, dinginkan, filter dan
encerkan dengan aquades sampai konsentrasi 0,15
ng/ml

Preparasi kurva standar dan tabung


blanko
Buat

8 titik kurva standard dengan


menggunakan larutan folat. Tambahkan 5 ml
L.casei ke dalam masing-masing tabung.
Siapkan blanko tanpa inokulasi dan blanko
inokulasi dan dinolkan (spektrofotometer) dan
enzim blanko untuk mengetahui kontribusi
enzim dalam pertumbuhan mikroba

Pengujian
Asam

folat diuji berdasarkan pertumbuhan


L.rhamnosus (AOAC). Tabung sampel, kurva
standard, blanko inokulasi, blanko uninokulasi
dan blangko enzim diautoklaf pada suhu 121
C selama 5 menit, kemudian diinokulasi
dengan 1 tetes inokulum L.rhamnosus per
tabung. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37 C
selama 20-24 jam, pertumbuhan mikroba
dinyatakan dalam % transmitan pada 550 nm

Kimiawi
Vitamin A
Vitamin E
Vitamin C
Vitamin B1
Vitamin B2

Vitamin A

Sensitif terhadap cahaya (UV), udara (beberapa


prooksidan), suhu tinggi dan kelembaban
Perlu tahap-tahap untuk menghindari perubahan
yang merugikan seperti pengaruh dari
penggunaan barang pecah belah, nitrogen dan
vakum sebagaimana pengaruh dari suhu tinggi.
Direkomendasikan untuk menambahkan
antioksidan di awal prosedur
HPLC metode yang dapat diterima dalam
pengukuran Vitamin A (karena akurat)

PRINSIP

Sampel disaponofikasi, vitamin A akan


terekstrak ke dalam larutan organik dan
terkonsentrasi. Semua trans-retinol dan
13-cis-retinol ditentukan dengan HPLC
dengan kolom silika.

Yang perlu diperhatikan


Semua pekerjaan harus dilakukan
dalam cahaya dengan intesitas rendah
Harus menjaga terjadinya oksidasi
retinol selama analisa
Evaporasi larutan harus menyeluruh di
bawah aliran nitrogen dan heksadekan
ditambahkan untuk mencegah destruksi
selama evaporasi

Prosedur

Preparasi Sampel
Transfer

sampel (makanan formula atau susu


cair) ke dalam tabung digesti 100 ml,
tambahkan 10 ml etanolik pirogallol (2%
pirogallol dalam 95% etanol) dan sabunkan
dengan etanolik KOH (10% KOH dalam 90%
etanol) pada suhu ruang selama 18 jam atau
pada suhu 70 C dengan menggunakan reflux
vessel.

Ekstraksi
Pipet

3 ml sampel yang telah terdigesti ke dalam


tabung sentrifus 15 ml dan tambahkan 2 ml air.
Ekstrak dengan 7 ml heksan-dietileter (85:15).
Ulangi ekstraksi sebanyak 2 x. Masukkan sampel
terekstrak ke dalam tabung volumetrik 25 ml.
Tambahkan 1 ml heksadekan (heksadekan (1) +
hexan (100)) dan encerkan sampai 25 ml dengan
heksan. Pipet 15 ml ekstrak yang sudah
diencerkan ke dalam tabung sentrifus dan uapkan
dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5 ml
heptan

Parameter Kromatografi
Kolom 15 cm x 4.5 mm dipadati
dengan 3 mm silika (Apex m silika)
Fase mobil Isokratik, heptane dan
isopropanol (1-5%)
Deteksi UV , 340 nm
Flow rate 1-2 ml/menit

Perhitungan
Semua trans retinol (mg/ml) =
(At/Ast x Wt x DF)/V
Ket :
At = area puncak sampel
Ast= area puncak standar
Wt = berat sampel
V = volume sampel
DF = faktor pengenceran

Vitamin E

Dalam bentuk 8 komponen yang berbeda dalam


makanan dan semuanya adalah 6hidroksikroman
Famili vitamin E terdiri dari -,-,- dan tokoferol
Cirinya sebuah rantai cabang jenuh dari 3
unit isopren dan berikatan dengan tokotrienol
tidak jenuh.
Tahan panas dan asam, karena bersifat
antioksidan maka Vitamin E akan mudah
teroksidasi terutama bila dalam minyak tengik,
timah dan garam besi
Mudah rusak oleh sinar UV

Prinsip

Untuk produk makanan umumnya sampel


disabunkan dengan reflux, diekstrak dengan
heksan dan diinjeksi ke dalam fase normal
kolom HPLC yang disambungkan pada detektor
fluoresensi
Untuk Margarin dan Minyak nabati sampel
dilarutkan dalam heksan, MgSO4 ditambahkan
untuk mengganti air kemudian difilter dan diuji
dengan HPLC
Untuk minyak dilarutkan dalam heksan dan
diinjeksi secara langsung ke dalam kolom HPLC

Yang perlu diperhatikan


Vitamin E adalah subyek oksidasi
Penyabunan dilakukan dengan reflux
yang sudah ditambah antioksidan
pirogallol dengan reaksi vessel yang
terlindung dari cahaya

Prosedur

Produk makanan umum


Tambahkan

10 ml dari 6 % (w/v) pirogallol dalam


etanol ke sampel , campur dan aliri dengan N .
Panaskan pada suhu 70 C selama 10 menit dengan
sonikasi. Tambahkan 2 ml 60 % KOH, campur dan
aliri dengan N2. Hancurkan selama 30 menit pada
suhu 70 C. Sonikasi selama 5 menit, dinginkan pada
suhu ruang dan tambahkan NaCl dan air. Ekstrak
dengan heksan (0,1% BHT) 3 kali. Tambahkan 0,5 g
MgSO4 dan campur. Filter dan encerkan sampai
volume dengan heksan dan injeksi 20 l.
2

Margarin dan minyak nabati


Tambahkan

40 ml heksan (0,1% BHT) ke


dalam 10 g sampel dan campur. Tambahkan
3 g MgSO4 dan campur, biarkan 2 jam.
Filter dan encerkan sampai volume dengan
heksan. Injeksi 20 l.

Parameter Kromatografi
Kolom Hibar RT, Lichrosorb Si60 5m,
25 cmx4.6 mm
Fase mobil 0,9% isopropanol dalam
heksan
Flow 1 ml/menit
Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em =
330 nm

Vitamin C

Berbentuk asam L-askorbat dan asam Ldehidroaskorbat


Mudah teroksidasi terutama oleh tingginya pH
dan adanya katalisator seperti Fe dan ion Cu.
Sehingga perlu prosedur yang didisain rendah
pH dan adanya chelating agent.
Oksidasi ringan asam askorbat menghasilkan
asam dehidroaskorbat dan bersifat reversibel
dengan adanya perlakuan dengan reducing
agents ( -mercaptoetanol dan ditioreitol)

Vitamin C
Metode Titrasi 2,6 dicloroindophenol
Prinsip

L-asam

askorbat dioksidasi menjadi L-asam


dehidroaskorbat. Pada akhir titrasi akan
menunjukkan warna merah muda.
Perhitungan :

mg asam askorbat/ml sampel =


Standard (mg/ml) x volume titrasi sampel x
(FP/berat sampel)

Prosedur

Preparasi sampel
Timbang

dan ekstrak sampel dalam asam


metafosforat-asam asetat (15 g HPO4 dan 40 ml
HOAc dalam 500 ml air), filter dengan sentrifus dan
encerkan sampai konsentrasi 10-100 mg asam
askorbat/100 ml.

Preparasi standard
Timbang

50 mg asam askorbat dan encerkan sampai


100 ml dengan asam metafosforat-asam asetat

Titrasi
Titrasi

sampel dan standard (3 ulangan) dengan


dikloroindophenol sampai berwarna merah muda
sedikitnya 10 detik

Metode Mikroflourometrik

Prinsip
Metode

ini mengukur asam askorbat dan


asam dehidroaskorbat
Asam askorbat dioksidasi membentuk asam
dehiroaskorbat dan direaksikan dengan ophenilenediamin membentuk komponen
fluoresen quinoxalin

Prosedur

Preparasi Sampel
Sama

dengan metode titrasi, jumlahnya 100


ml untuk standard dan sampel, tambahkan 2
asam Norit, gojog dan saring

Preparasi blanko
Transfer

5 ml filtrate ke dalam tabung


volumetrik 100 ml yang mengandung 5 ml
H3BO3- NaOAc, biarkan selama 15 menit,
kocok. Transfer 2 ml larutan ke dalam 3
tabung

Penentuan Sampel
Transfer

5 ml standard dan sampel ke dalam


tabung volumetrik yang mengandung 5ml dari
50% NaOAc trihidrid dan 27 ml air. Encerkan
sampai volume dengan air kemudian transfer 2 ml
standard dan sampel ke dalam tabung fluoresen

Pembentukan Quinoxalin
Tambahkan

2 ml dari 20 % larutan ofenilenediamin-aquades ke tiap tabung. Kocok


dengan vortex dan biarkan selama 35 menit pada
suhu ruang

Pengukuran
Ukur

nm

fluoresen pada Ex = 356 nm dan Em= 440

Tiamin (B1)

Prinsip
Ekstraksi

dan hidrolisis enzimatis dari esterester tiamin fosfat dan pembersihan


Metode ini didasarkan pada pengukuran
fluoresensi dari bentuk oksidasi tiamin
(tiokrom)

Yang Perlu diperhatikan


Tiokrom sensitif pada cahaya harus
mengurangi cahaya pada semua prosedur
Tiamin sensitif panas terutama pada
suasana basa tahap analisa dengan
cara oksidasi tiamin harus dilakukan
dengan cepat dan teliti berdasarkan
prosedur yang ada

Prosedur

Preparasi Sampel
Timbang

sampel yang mengandung 10-20g tiamin,


tambahkan HCl, campur, autoklaf selama 15 menit
pada 121 C, atur pH sampai 4,5-5,0 dengan HCl,

Hidrolisis Enzim
Tambahkan

larutan enzim dan inkubasi selama 3 hari


pada suhu 45-50 C, dinginkan sampel atur pH sampai
3,5, encerkan sampai volume dengan air, campur dan
saring. Larutan standard diperlakukan dengan enzim
yang sama.

Pembersihan Ekstrak sampel


Masukkan

ekstrak sampel ke dalam kolom


ion-exchange, cuci kolom dengan air panas
kemudian larutkan tiamin dengan larutan
asam KCl panas, diinginkan. Encerkan
sampai volume dengan larutan asam-KCl,
lakukan juga pada standard .

Pembentukan Tiokrom
Konversi

tiamin ke tiokrom menggunakan


K2Fe(CN)6, tambahkan isobutil alkohol, kocok,
dan sentrifus.Tuangkan fraksi isobutil alkohol
ke dalam tabung baca fluoresen dan baca
pada 365 nm/435nm. Begitu juga standard
dan buat kurva standard untuk menghitung
tiamin sampel

Ribovlafin (B2)
Struktur mirip gula ribosa
Larut air dan memberi warna fluoresens
kuning kehijauan
Mudah rusak oleh cahaya dan sinar UV
Tahan panas, oksidator, asam namun
sensitif pada suasana basa

Prinsip
Ektraksi,

pembersihan dan kompensasi


adanya substansi pengganggu
Ditentukan dengan fluorometer

Titik Kritis
Karena

sensitif pada UV maka semua


prosedur dilakukan pada ruang minim
cahaya.
Adanya proses oksidasi permanganat perlu
diperhatikan untuk hasil yang reliable

Prosedur

Preparasi Sampel
Timbang

sampel homogen, tambahkan 0,1N


HCl campur kemudian autoklaf selama 30
menit pada suhu 121 C dan dinginkan.
Endapkan substansi pengganggu dengan
mengatur pH 6 dan segera diikuti pengaturan
pH 4,5, encerkan sampai volume dengan air
dan saring

Oksidasi Materi pengganggu


Tempatkan

filtrat ke dalam 4 tabung, 2 tabung


tambahkan 1 ml air dan tambahkan 1 ml
larutan standard (0,5g/ml riboflavin) ke
dalam 2 tabung lainnya. Untuk tiap tabung
(satu persatu) Tambahkan 1 ml asam asetat
glasial, diikuti 0,5 ml KMnO4 3 % biarkan
selama 2 menit kemudian tambahkan 0,5 ml
H2O2 3%, kocok.

Pengukuran Fluoresen
Panjang

gelombang 440 nm/565 nm


Pertama baca ekstrak sampel yang
mengandung air kemudian tambahkan 20 mg
Na2S2O4 campur dan baca ulang, setelah itu
baca standard

Perbandingan

Setiap metode mempunyai kelebihan dan


kelemahan.
Perlu memperhatikan faktor-faktor berikut dalam
memilih metode
Akurasi

dan presisi metode


Untuk keperluan apa? informasi bioavailabilitas atau
kandungan
waktu dan alat
Personel
Jenis bahan yang akan dianalisa
Jumlah sampel
Aturan/prosedur yang diguanakan

Keuntungan dan Kelemahan


Bioassay

Keuntungan
Tidak

butuh preparasi sampel


Mengurangi potensi perubahan senyawa yang
tidak diinginkan selama preparasi

Kelemahan
Memakan

waktu
Terbatas pada hewan

Mikrobiologis dan cara kimia


memerlukan ekstraksi
Cara kimia Informasi yang diperoleh
hanya total vitamin dalam makanan tidak
sampai biovailabilitas vitamin
Mikrobiologis terbatas pada vitamin yang
larut air dan memakan waktu tetapi
memerlukan sedikit sampel

Cara kimia dengan HPLC lebih disukai


karena sederhana, akurat dan teliti.
Namun yang terpenting ketika memilih
metode analisa, setidaknya metode
tersebut telah diujikan di laboratorium dan
telah dipublikasikan oleh organisasi
seperti AOAC (American of Official
Analytical Chemist)

Latihan Soal
Berat sampel 100 g diencerkan menjadi
500 ml
Jumlah sampel yang dititrasi : 25 ml
Jumlah titrat yang digunakan: 9,1 ml
Konsentrasi asam askorbat dalam titrat
0,175 mg/ml