Anda di halaman 1dari 10

Aplikasi Flow Cytometer di Laboratorium Klinik

Abstrak
Flow cytometer merupakan alat yang mampu membedakan sel atau partikel berdasarkan scattering
sinar dan mengukur beberapa karakteristik sel secara simultan. Perkembangan pada instrumentasi,
fluorochrome chemistry, antibodi monoklonal dan perangkat keras/ lunak komputer menciptakan
clinical flow cytometer.
Prinsip kerja alat ini menggunakan teknik flow cytometry yaitu penggunaan scatter sinar dari sel yang
dialirkan satu persatu melalui sinar laser yang kernudian diamplifikasi dan dikonversikan menjadi
signal digital serta dapat diplot membentuk scattergram. Selain itu sel atau partikel lain dapat pula
dianalisis menggunakan teknik fluoresensi yang dihasilkan dari sel yang terlabel fluorokrom.
Aplikasi klinik di bidang imunologi meliputi penghitungan sel CD4 dan CD8 pada pasien HIV,
diagnosis dan monitoring pasien imunodefisiensi primer maupun sekunder. Di bidang hematologi flow
cytometerberperan dalam immunophenotyping leukemia dan limfoma, deteksi antibodi anti netrofil,
analisis set-sel eritrosit, retikulosit dan trombosit. Aplikasi klinik lain yang dapat dilakukan meliputi
analisis DNA siklus sel, virologi dan bakteriologi, transplantasi maupun pengukuran kemampuan
fungsional sel.
Perkembangan aplikasi flow cytometer di bidang klinik memberikan harapan sekaligus tantangan
untuk penelitian maupun pelayanan kepada pasien.
Pendahuluan
Cytometry dapat didefinisikan sebagai pengukuran sifat fisika dan kimiawi sel. Pengukuran ini
biasanya dilakukan menggunakan sinar atau mikroskop fluoresens. Flowcytometry adalah pengukuran
karakteristik fisika dan atau kimiawi sel pada saat mengalir satu persatu melewati suatu perangkat
pengukuran. l Pada tahun 1953 Crossland-Taylor mengemukakan suatu teknik yang bisa mengalirkan
sel ke suatu pusat aliran secara satu persatu. Teknologi ini banyak dikenal sebagai laminar sheath flow
atau hydrodynamic focusing dan merupakan dasar dari sebagian besar cytometer yang ada sekarang.
Pada 1965 telah diperkenalkan suatu flow cytometer yang mampu membedakan sel berdasarkan

scattering sinar dan pengukuran beberapa karakteristik pada satu sel secara simultan. Teknologi
tersebut kemudian berkembang lebih lanjut dengan diperkenalkannya alat pertama yang mampu
memisahkan dan memllih sel.
Fluoresens-activated cell sorter (FACS) diperkenalkan sekitar awal 70-an untuk mempelajari
Imunologi sel yang diisolasi.l Kompleksitas dan mahalnya fluoresence-activated cell sorter membuat
alat ini tidak praktis digunakan secara rutin di laboratorium khnik sehingga aplikasi klinis secara
serius tidak' nampak sampai tahun 80-an. Perkembangan secara bersamaan pada Instrumentasi,
florochrome chemistry, antibodi monoklonal dan hardware/software komputer menciptakan clinical
fIow cytometer.2
Flow Cytometry merupakan teknologi yang menganalisis berbagai karakteristik sel (fisik dan kimiawi)
secara tndividual dan cepat.1-3
Penggunaan flow Cytometry memungkinkan kita melakukan karakterisasi multiparameter secara
kuantitatif' pada populasl sel yang heterogen sehingga dapat mengidentifikasi subpopulasi spesifik.
Teknologi flow cytometry telah menghasiIkan infrmasi diagnostik dan prognostik yang signifikan
serta mempunyai pengaruh yang besar terhadap imunologi dan hematologi.3
Pada awalnya fIow cytometer hanya digunakan di rumh sakit pusat pendidikan yang besar tetapi
sekarang memungkinkan penggunaan teknologi tersebut secara luas. Flow cytometer sekarang
berukuran lebih kecil, tidak terlalu mahal, leblh mudah bagi pengguna dan dirancang bisa untuk
sampel dalam jumlah yang besar.3
Antibodi terkonjugasi FITC (fluorescein isothiocyanate) untuk immunophenotyping limfoma dan
leukemia serta adanya berbagai cat dengan tingkatan afinitas bervariasi terhadap DNA kemudian
diperkenalkan. Demikian juga adanya penemuan bahwa penghitungan sel CD4+ dan CD8+ penting
untuk diagnosis dan monitoring pasien HIV/ AIDS mengakibatkan penggunaan fIow cytometer
menjadi meningkat.2,3

Dalam makalah ini dibahas prinsip kerja flow cytometer, aplikasi klinis dan perkembangan mendatang.
Dengan membahas hal tersebut diharapkan menambah wawasan di kalangan klinisi dan praktisi
kesehatan akan manfaat alat tersebut, karena dalam tahun 2004 ini Fakultas Kedokteran UGM telah
mendapat bantuan OECF berupa alat flow cytometer Pada akhirnya diharapkan pula terjadlnya
interaksi dan kerjasama yang baik antara klinisi dan praktisi kesehatan dengan laboratorium klinik
dalam pemanfaatan alat tersebut guna peningkatan pelayanan di RS Dr Sardjito serta penelitian yang
terkait.
Pembahasan
Prinsip Kcrja
Flow cytometer secara umum mempunyal 4 komponen dasar yaitu, (1) fluidic system untuk membawa
suspensi sel tunggal dari tube sampel ke dalam quartz flow cell yang berisi sheath fluid; (2) sumber
sinar biasanya laser ion argon dengan energi eksitasi 488 nm, (3) filter dan photodetector untuk
mengumpulkan sinar scatter dan sinar emisi dari sel yang terlabel fluoresens serta prosesor untuk
mengubah signal sinar menjadi arus listrik analog dan kemudlan menjadi signal digital; (4) sistem
komputer untuk mengumpulkan, menyimpan dan menganalisis data.2
Di dalam flow cytometer suspensi sel dibuat menjadi suatu aliran yang dibentuk dengan surrounding
sheath of isotonic fluid yang membentuk laminar flow, memungkinkan sel melewati interogation point
satu persatu. Di interogation point, suatu sinar monokromatik biasanya dari laser menembus sel yang
berlabel flourokhrom. Sinar emisi kemudian di tangkap optik yang akan meneruskan sinar ke beberapa
filter dan cermin dichroic yang mengisolasi band dengan panjang gelombang tertentu. Signal sinar
dideteksi menggunakan photomultiplier tubes dan dilakukan digitalisasi untuk analisis komputer.3
Flow cytometer memiliki kapasitas analisis multiparameter sel atau partikel pada saat melewati sinar
laser. Komponen dasar analisis ini adalah penggunaan scatter sinar dari partikel untuk membantu
mengkarakterisasi. Meskipun sel menghasilkan scatter sinar laser ke semua arah tetapi pengukuran
scatter sinar secara rutin dilakukan pada 2 posisi-relatif terhadap sel saat melewati sinar laser.

Forward-angle light scatter (FALS) diukur searah dengan laser light path (2 -10 ) dan meningkat
sesuai ukuran sel. Orthogonal atau side scatter (SSC) diukur pada 70 -90 dari laser light path dan
meningkat sesuai kompleksitas inti dan sitoplasma. Signal scatter sinar kemudian diamplifikasi
menggunakan photomultiplier tubes (PMTs) dan dikonversikan dari signal analog kemudian menjadi
signal digital. Hasil FALS dan SSC dapat diplot membentuk scattergram dimana sebagai contoh pada
populasi lekosit dapat memisahkan granulosit, monosit dan limfosit dari whole blood ke dalam
beberapa kluster. Sel yang dikehendaki kemudian dapat secara elektronik diseleksi atau " gated tt untuk
Skematis FALS dan SSC dapat dilihat pada gambar l.
Selain menggunakan karakteristik scatter sinar, sel dan partikel lain dapat dianalisis juga terhadap ada
atau tidaknya fluoresens. Sel dilabel menggunakan probe spesifik (antibodi, ligand, probe molekuler)
yang terkonjugasi fluorokhrom yang akan berfluoresensi pada saat terkena sinar. Flow cytometer
mengukur intensitas fluoresens dari masing-masing sel dengan kecepatan yang sangat tinggi (ribuan
sel perdetik). Bergantung pada panjang gelombang sumber sinar, panjang gelombang fluorokhrom
serta jumlah probe yang dipergunakan maka sel dapat dianalisis terhadap ada atau tidaknya berbagai
antigen permukaan Cluster of Differentiation (CD), reseptor, enzim dan molekul lain. Permeabilitas
membran sel dapat dinaikkan dengan pemberian detergen atau fiksasi kimiawi sehingga
memungkinkan pengecatan komponen internal sel (sitoplasma/nukleus). 2
Flow Cytometry mengukur karakteristik optikal dan fluoresensi sel tunggal (atau partikel Iain,
termasuk nukleus, mikroorganisrne, preparasi kromosome dan latex beads). Karakteristik fisik seperti
ukuran (tercermin oleh FALS) dan kompleksitas internal (tercermin Oleh right-angle scatter) dapat
membedakan populasi sel tertentu. Cat fluorescens dapat mengikat atau intercalate dengan komponen
seluler misalnya DNA atau RNA. Demikian juga antibodi yang dikonjugasikan ke cat fluorescens
dapat mengikat protein spesifik pada membran atau di dalam sel. Pada saat sel yang sudah dilabel
melewati sumber sinar, molekul fluorescens akan tereksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi. Begitu
kembali ke tingkat energi semula maka fluorokrom memancarkan energi sinar dengan panjang
gelombang lebih tinggi. Penggunaan fluorokhrom lebih dari satu (multiple) masing-masing dengan
panjang gelombang eksitasi yang sama serta panjang gelombang emisi yang berbeda (atau "warna" )

memungkinkan beberapa karakteristik sel dapat diukur secara simultan. Beberapa cat yang biasa
digunakan misalnya propidium Iodide, phycoerythrin dan fluorescein.3

Gambar l. Skcmatis FALS dan SSC p,'lda cytomeler


Aplikasi di bidang Hematologi
Sistem hemopoetik yang asal usulnya beragam memungkinkan untuk analisis flow Cytometry.
Berbagai protein permukaan dan glikoprotein pada eritosit, lekosit, dan trombosit telah dipelajari
dengan sangat rinci. Ketersediaan antibodi monokIonal terhadap protein permukaan ini
memungkinkan analisis flow Cytometry eritrosit, lekosit dan trombosit. Antibodi terhadap protein
Intraseluler seperti myeloperok sidase dan terminal deoxynucleotiyl transferase Juga tersedia dan
memungkinkan analisis marker intraseluler. 3
a. Immunophenotyping leukemia/ limfoma
Dalam 2 dekade terakhir tampak bahwa immunophenotyping sel hematologi abnormal sangat berguna
untuk diagnosis, klasifikasi, evaluasi prognostik dan deteksi penyakit residu pada pasien dengan
keganasan hematologi.1 Immunophenotyping sebagai bagian dari diagnostic work up keganasan
hematologik merupakan cara yang cepat dan efektif untuk diagnosis. Kemampuan untuk menganalisis
karaktenstik seluler yang multiple sejalan dengan antibodi baru dan strategi gating, secara substansial
meningkatkan kegunaan flow cytometer dalam diagnosis leukemia dan limfoma. 3

Immunophenotyping leukemia dan limfoma dengan antibodi monoklonal adalah aplikasi klinik flow
cytometer yang pertama kali. Tetapi, tidak seperti uji diagnostik laboratorium yang lain, hasil
phenotyping memerlukan interpretasi spesifik. Hal ini disebabkan oleh variabilitas ekspresi dan
densitas permukaan relatif dari marker sel, kecuali untuk CD3 pada limfosit T, antigen permukaan
yang tendentifikasi oleh antibodi monoklonal pada sel leukemia dan limfoma adalah tidak spesifik
untuk jalur sel tertentu. Sel-sel tersebut biasanya tidak mengekspresikan marker fenotipik tunggal
yang khas untuk diagnosis penyakit, oleh karena ltu diperlukan interpretasi pola dan intensitas relatif
pengecatan dengan panel antibodi untuk mengidentifikasi jalur sel secara akurat dari sel leukemia dan
limfma yang terdiferensiasi jelek.2
Leukemia dan limfoma yang berbeda sering mempunyai perbedaan profil antigen yang tidak kentara
sehingga ideal untuk dianalisis dengan flow cytometer. Interpretasi diagnosis tergantung pada
kombinasi pola antigen dan intensitas fluoresen. Flow cytometer sangat efektif untuk membedakan
jalur myeloid dan limfoid pada leukemia akut dan leukemia yang terdiferensiasi minimal. Infiltrasi
sumsum tulang oleh sel imatur (blast) lebih mudah dikenal CD45/ Side scatter gating daripada dengan
forward scatter/ side scatter gating. Flow cytometry juga dapat digunakan untuk mcngidentifikasi
leukemia yang resisten terhadap terapi. Pada acute Lymphocytic Leukemia (ALL), fenotipe
menunjukan korelasi kuat dengan hasil terapi. Hasil-hasil flow cytometer harus dikorelasikan dengan
morflogi dan gambaran klinik untuk diagnosis klinik.1,12
Pemakaian antibodi yang bervariasi memungkinkan klinisi untuk membuat diagnosis yang spesifik
berdasar pola ekspresi antigen. Tidak hanya ada atau tidak adanya antigen yang berguna dalam
membuat diagnosis spesifik, kekuatan ekspresi antigen Juga dapat membantu diagnosis. Satu contoh
adalah ekspresi lemah dari CD20 dan imunoglobulin rantai ringan biasanya tampak pada leukemia
limfositik kronik.
Keuntungan immunophenothyping flow cytometry dari pengecatan imunohistokimia meliputi (l )
kebutuhan sampel sedikit, (2) kemampuan mengidentifikasi berbagai marker sel pada sel yang sama;
(3) kemampuan menganalisis spesimen berupa suspensi sel dari darah, sumsum tulang, cairan tubuh,
tumor padat dan sebagainya, (4) disamping mampu membedakan seri sel lekosit juga dapat menilai

difrerensiasi maturasi seri tersebut, misalnya pre B-ALL dengan B-chronic lymphocytic leucemia (BCLL); (5) waktu yang dibutuhkan lebih cepat.2
Karena belum adanya kriteria standar diantara laboratorium bagaimana leukemia dan limfoma
seharusnya dianalisis dengan flow cytometry beberapa grup mengembangkan consensus guidelines
mengenai panel antibodi, strategi gating, interpretasi dan pelaporan data serta kualitas kontrol.2,9
b. Deteksi antibodi antinetrofl
Netropenia bisa disebabkan oleh proses imun atau non imun. Penegakan diagnosis sering memerlukan
pemeriksaan sumsum tulang. Netropenia imun bisa diakibatkan oleh autoantibodi spesifik terhadap
granulosit, alloantibodi spesifik granulosit, atau antibodl anti IILA yang berhubungan dengan
transfusi. Flow cytometer d'apat mengidentifikasi antibodi antinetrofil baik yang terikat maupun yang
bebas dalam plasma. Netropenia autoimun dapat terjadi pada pasien dengan penyakit autoimun seperti
SLE dan tiroiditis Hashimoto. Flow cytometer d'apat mendeteksi antibodi antinetrofil dan
mengkonfirmasi penyebab nctropenia sehingga mungkin bisa mengelimisasi perlunya pemerlksaan
Sum-sum tulang. Tidak adanya antibodi anti netrofil membatasi diferensial diagnosis kearah kausa
nonimun seperti kegagalan sumsum tulang, mielodisplasia, atau proses infiltratif sumsum tulang. 2
c. Analisis eritrosit
Flow cytometer untuk deteksi dan kuantifikasi eritrosit fetus dalam darah maternal telah meningkat
pada tahun-tahun terakhir ini. Antibodi yang dilabel fluoresen terhadap antigen rhesus (D) dapat
digunakan atau sekarang digunakan antibodi terlradap hemoglobin F.3
Pada bank darah flow cytometcr dapat digunakan untuk imunologi sel darah merah, termasuk
Imunoglobulin yang terikat pada eritrosit dan antigen eritrosit. Pada pasien yang mendapat transfusi
berulang, penentuan jenis golongan darah resipien bisa sangat sulit. Flow cytometer dapat
mengidentifikasi secara akurat fenotipe entrosit resipien. Flow cytometer juga dapat digunakan untuk
menilai kontaminasi lekosit dalam produk darah.3
Analisis retikulosit

Retikulosit merupakan eritrosit muda yang mengandung residu ribosome, mitokondria dan sentriola
bersama dengan RNA dan DNA tetapi tidak mempunyai inti. Karena organela-organela tersebut tidak ada
pada eritrosit matur, keberadaannya pada darah tepi menunjukkan peningkatan eritropoesis.2
Hitung retikulosit didasarkan pada identifikasi residu ribosom dan RNA pada sel darah merah Imatur.
Secara tradisional apusan darah diwarnai dengan cat yang mempresipitasi asam nukleat dan sel-sel tersebut
dihitung secara manual. Metode ini subjektif, tidak tepat, perlu banyak tenaga dan membosankan.
Penghitungan retikulosit dengan Flow cytometer menggunakan pewarnaan fluoresen yang mengikat residu
RNA, seperti thiazole orange. Metode ini membedakan denga baik retikulosit dan eritrosit matur, dengan
presisi, sensitivitas dan reprodusibllitas yang lebih baik daripada metode tradisional. Karena Intensitas
fluoresen secara langsung proporsional dengan jumlah RNA dan berhubungan dengan imaturitas erltrosit,
Indcks maturitas rctikulosit tclah digunakan un tuk mem lai pencangkokan sumsum tulang dan aktlvltas
eritropoetik dan untuk membantu mengklasiflkasikan anemia.. 1,3
Keuntungan penting yang lain adalah dapat membedakan antara retikulosit awal dan lanjut. Retikulosit
muda biasanya dilepaskan selama episode hemolitik, mengandung lebih banyak RNA dan
menunjukkan intensitas yang lebih besar daripada retikulosit tua. Perbedaan intensitas fluoresen
memungkinkan perhitungan indeks maturasi lekosit atau fraksi retikulosit imatur. Fraksi retikulosit
imatur terbukti berguna dalam tidak hanya pada anemia hcmolitik, tetapi juga monitor transplantasl
sumsum tulang dan kemoterapi sebagai indikator awal pemulihan hemopoesis.3
e. Analisis Trombosit
Pemeriksaan Imunoglobulin yang bcrhubungan dengan trombosit dengan flow cytometer dapat
langsung atau tidak langsung seperti pada teknik Imunoasay. Cytometry merupakan metode yang
sangat baik untuk analisis langsung dari antibodi yang terikat tromboslt, dan juga memberikan
keuntungan dalam mendeteksi antibodi bebas dalam plasma. 3,14
Deteksi antibodi anti trombosit dengan flow cytometer berguna dalam membedakan berbagai tipe
trombositopeni seperti idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP), Thrombotic trombocytopenic
purpura (TTP), allosensitisasi transfusi, dan drug-induced thrombositopenia. Antibodi anti trombosit

dalam sirkulasi maupun yang terikat dapat dideteksi secara cepat dan dapat ditentukan jenis
antibodinya.
Untuk deteksi antibodi dalam sirkulasi, serum pasien direaksikan dengan trombosit dari donor sehat.
Antibodi antitrombosit berikatan dengan trombosit normal dan dideteksi dengan imunoglobulin (lg)
manusia (lgG, A, atau M) yang dilabel dengan FITC. Antibodi yang terikat trombosit dideteksi dengan
Ig manusia yang terkonjugasi dengan FITC. Pada kedua keadaan tersebut, adanya antibodi diukur
dengan flow cytometer dan dibandingkan dengan kontrol trombosit negatif. 2
Pemakaian thiazole orange, pewarnaan fluoresen yang mengikat RNA memungkinkan pengukuran
trombosit imatur, sehingga dapat digunakan untuk menentukan trombopoesis. Pengukuran ini dapat
memisahkan trombositopenia yang tidak' dapat dijelaskan menjadi trombositopenia dengan
peningkatan destruksi atau defek produksi trombosit
C. Aplikasi di bidang Onkologi
Analisis DNA siklus scl
Analisis DNA siklus sel dengan flow cytometer telah menjadl metode yang rutin untuk menilai
kandungan DNA (ploidy) tumor. Pengukuran kandungan seluler DNA menggunakan pewarnaan
fluoresen, seperti propidium iodid yang bet-interkalasi di dalam struktur heliks DNA. Signal fluoresen
proporsional dengan Jumlah DNA dalam nukleus dan dapat mengidentifikasi penambahan atau
hilangnya DNA. Pcngukuran ploidy dan proliferasi fase sintesis DNA dapat ditentukan dengan
penggunaan fluorokhrom DNA, yang bcrikatan secara kuantitatlf (lengan DNA sel. Tumor dapat
didcmonstrasikan menjadl (Jillillah kromosom normal) a tau a (J Il m lah k rom 0.80111 a Imo r mal)
yang l)lasanya men u nj u k'kan prognosis jclck a ta u kemungkinan kambuh lebih besar. DNA
aneuploidi biasanya berhubungan dengan keganasan, tetapi kondisi jinak tertentu mungkin menunj
ukkan aneuploid. DNA aneuploid berkorelasi dengan prognosis buruk pada berbagai jenis kanker
tetapi juga berhubungan dengan peningkatan survival pada rhabdomyosarkoma, neuroblastoma,
multiple myeloma dan ALL pada anak. Untuk berbagai keganasan hematologik, masih terdapat silang
pendapat mengenai nilai prognosis dari analisis kandungan DNA. Meskipun sitogenetik konvensional

dapat mcndcteksi pcrbedaan kandungan DNA, flow cytometer mcmungklllkan anal isis yang lebih
cepat dengan jumlah sel yang lebih banyak.
Biasanya tumor dengan fraksl sel fase S yang tinggi mempunyai prognosis lcl)ih but-uk daripada
tumor dcngan fraksl S yang rendah. Dislsi lain, sel lekemi/limfoma yang mengalami pembelahan
dengan cepat sermg lebih susceptible terhadap radiasi dan kemoterapi. Status ploidi dan fraksi fase S
harus d I gunakan bersama dengan faktor prognostik yang lain scperti ukuran tumor, stadium, derajat
sistologi, dan status reseptor hormon untuk memaksimalkan nilai prognostiknya. Analisis DNA siklus
sel sekarang banyak dilakukan pada tumor
kandung ken) lh meng'll(l I kasi kan n I lat prognostik.2

prostat d an