Chromatography

Chromatography
Kromatografi adalah suatu teknik analisis yang dapat
digunakan untuk keperluan :
Analisis kualitatif
Analisis kuantitatif
Pemisahan/Isolasi
Pemurnian

Principle of Chromatography
Pemisahan yang didasarkan atas
distribusi differensial komponenkomponen sampel diantara dua fasa
yaitu fasa diam dan fasa gerak.

Gerakan fasa gerak ini

mengakibatkan terjadinya migrasi
differensial komponen dalam
sampel.

Principle of Chromatography
Fasa Diam (stasionary phase)
Berupa zat padat atau zat cair yang terikat pada permukaan
padatan (kertas atau adsorben)

silika

plat klt

Fasa Gerak (mobile phase)

Dapat berupa cairan/ gas sebagai eluen atau pelarut

metanol

Chromatography

Chromatography

TLC
(Thin Layer Chromatography)
Salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi
dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan
perbedaan kepolaran
Tergolong kromatografi planar
Relatif sederhana dan murah

Principle of TLC
memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel
dengan pelarut yang digunakan
Komponen :
*Fasa gerak (Eluen) : Pelarut organik
Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya
merupakan campuran beberapa pelarut yang berbeda kepolaran
*Fasa diam (adsorben) : alumina / selulosa / silika gel

(POLAR)

Silika Gel

Proses TLC

Rf (Retention Factor)

Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar, berarti mempunyai kepolaran yang lebih rendah.
Senyawa yang mempunyai Rf lebih rendah, berarti mempunyai kepolaran yang lebih tinggi.
Hal ini karena

TLC Profile

P
UV 254 nm

UV 366 nm

Paper Chromatography
Metode analisis untuk memisahkan dan
mengidentifikasi senyawa berwarna yang
terdiri dari fasa diam dan fasa gerak

Prinsip :
Pergerakan komponen sampel pada laju
yang berbeda dan campuran dipisahkan
berdasarkan pada kepolaran dilihat dari
perbedaan bercak warna.
Fasa diam : kertas (selulosa)
Fasa gerak : pelarut organik

Procedure of PC

Profile of PC

Radial Chromatography
(Kromatotron)

Principle

Pemisahan berdasarkan kepolaran dengan aliran fase gerak yang

dipercepat oleh gaya sentrifugal.

Fasa gerak : pelarut organik

Fasa diam : silika

Kromatotron
Menggunakan
rotor
yang
dimiringkan, terdapat dalam ruang
tertutup oleh plat kaca kuarsa
Lapisan penyerapnya dilapisi oleh
silika gel
Plat dipasang pada motor listrik,
diputar dengan kecepatan 800
rpm.
Pelarut pengelusi dimasukkan ke
bagian tengah alat sehingga dapat
mengalir dan merambat karena
gaya sentrifugal.
Untuk mengetahui jalannya proses
elusi dimonitor dengan lampu UV
Pemasukan sampel itu diikuti dengan pengelusian menghasilkan pitapita komponen berupa lingkaran. Pada tepi plat, pita-pita akan
terputar keluar dengan gaya sentrifugal dan ditampung dalam botol.

Kromatotron

Kromatografi Planar

Kromatografi Kolom

Column Chromatography
Fasa diam:
Berupa adsorben yang tidak boleh larut
dalam fasa gerak, ukuran partikel fasa
diam harus seragam.
Contoh: alumunium, silica gel, arang,
bauksit, magnesium karbonat, talk, pati,
dan selulosa.
Fasa gerak:
Pelarut tunggal atau campuran beberapa
pelarut dengan komposisi tertentu.

Prinsip
Metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya
adsorbsi suatu adsorben (fasa diam) terhadap suatu
senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya.

HPLC
(High Performance Liquid Chromatography)

HPLC
Detektor

Pelarut
Monitorc

Kolom

Pompa

Principle of HPLC
Berdasarkan kepolaran , dan perbedaan kekuatan interaksi
antara sampel dengan fasa diam dan fasa gerak.
Semakin kuat interaksinya dengan fasa diam maka akan
keluar lebih lama
Semakin lemah interaksinya dengan fasa diam maka
akan keluar lebih cepat.

HPLC
Sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang
tinggi, memakai teknologi kolom, sistem pompa
tekanan tinggi, dan detektor yang sangat sensitif dan
beragam.
Menganalisis cuplikan secara kualitatif maupun
kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun
campuran.
Digunakan dalam analisis dan pemurnian senyawa
tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang
antara lain : farmasi, lingkungan, dan industri makanan.

HPLC
Keuntungan HPLC :
Analisis senyawa yang tidak mudah menguap
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran,
mudah, kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi.
Menetapkan kadar senyawa tertentu
Menghindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang
dianalisis.
Menggunakan bermacam-macam detektor.
Kolom dapat digunakan kembali.
Mudah melakukan recovery cuplikan.
Instrumennya memungkinkan untuk bekerja secara automatis
dan kuantitatif.
Waktu analisis singkat.

Instrumen HPLC

HPLC Column

Normal Phase

Reversed Phase

1. Kolom fasa normal (Normal Phase Chromatography)

fasa diam : polar
fasa gerak : nonpolar
fasa diam : silika
fasa gerak : n-heksan
2. Kolom fasa terbalik (Reversed Phase Chromatography)
fasa diam : nonpolar
fasa gerak : polar
fasa diam : silika C-18 fasa gerak : metanol, air, asetonitril

Sample Interaction

Mobile Phase
Fase gerak dapat dipompakan ke dalam kolom dengan tiga
cara :
Isokratik : aliran tetap (konstan), komposisi dari fase gerak
tetap berlaku.
Gradient Elution: aliran konstan dan perubahan komposisi
dari fase gerak terjadi.
Flow Program: aliran bervariasi dan ketetapan komposisi
dari fase gerak terjadi.

Chromatogram Analysis

Analisis kuantitatif didasarkan pada pengukuran luas/area puncak analit

dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area standar
Perhatikan waktu retensi (Retensi Time)

Chromatogram Analysis
Detektor UV-VIS
Isobavacalkon

Detektor MS

Isobavacalkon V m/z: 325 (M+H)

Standar

Isobavacalkon

Isobavacalkon V m/z: 325 (M+H)

Hasil Reaksi
Kuwanon V

Kuwanon V m/z: 647 (M+H)

Chromatogram Analysis

Chromatogram Analysis

Chromatogram Analysis

Phenol

Toluene
2

Min

Chromatogram Analysis
Puncak dan bercak.
Contoh

Campuran sebelum elusi

35

HPLC
Uji Kesesuaian Sistem
untuk mengetahui apakah alat, metode dan
sistem kromatografi cair kinerja tinggi yang
digunakan dapat memberikan hasil yang baik
dalam proses analisis.

Kromatogram

Analisis Kromatogram

Kromatogram Rubraxanton

Dari kurva linearitas, didapatkan persamaan regresi y=ax + b

Y= luas area
X= kadar

Parameter Uji
Parameter

Faktor Asimetri
Simpangan Baku Relatif (RSD)
Resolusi (Rs)
Ex :

Nilai

2.0
2.0 %
> 1.5

Akurasi
Seberapa dekat nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya.
Nilai akurasi ditunjukkan oleh nilai perolehan kembali (% recovery).

Syarat 98.0% - 102.0%

Selektivitas
kemampuan metode analisis untuk membedakan analit yang
akan ditetapkan terhadap senyawaan lain yang terdapat dalam
sampel.

Presisi
nilai kedekatan dari hasil analisis yang dapat diterima,
dengan tujuan mengetahui kesalahan akibat operator.

syarat 2.0%

Faktor Asimetri

Waktu Retensi

Jumlah Lempeng Teoritis (N)

Jumlah Lempeng Teoritis (N)

Faktor Pemisah

Kromatogram

Gel Filtration
Chromatography
or
Size Exclusion
Chromatography

Principle

Gel filtration chromatography separates molecules according to

their size and shape.
Uses porous particles in stationary phase to separate multiple
components in a sample on the basis of differences in their size

Mechanism
samples that contain few components or partially
purified by other chromatography techniques will give
the best result
Single buffer system, packed bed(chemically and
physically stable and inert), pore size in stationary
phase separates proteins according to their molecular
weight

Elution of Proteins: one buffer used for both loading

and elution of the sample

Mechanism

Mechanism

Chromatogram

Stationary Phase
The gels used as molecular sieves are cross linked
polymers.
They are uncharged and inert, dont bind or react
with the materials being analyzed.

Sephadex

Types of Gel (Stationary Phase)

1. Sephadex
used for separation of small peptides and globular proteins with small to average
molecular mass

2. Polyacrylamide
used for separation of small peptides and globular proteins with small to average
molecular mass

3. Agarose
Its useful for analysis or separation of large globular proteins or long linear
molecules such as DNA

Advantages
molecules do not bind to the medium so buffer composition
does not directly affect resolution
is well suited for biomolecules that may be sensitive to
changes in pH, conc. of metal ions or co-factors and harsh
environmental conditions
conditions can be varied to suit the type of sample or the
requirements for further purification, analysis or storage
without altering the separation
Can be used after any chrom. tech. bcz components of
any elution buffer will not affect the final separation

Prinsip Dasar Kromatografi

Kromatografi Penukar Ion

Asam Amino

Kation

Beda GF dengan IEC

Elektroforesis

Analisis Protein

Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu proses migrasi molekul bermuatan
di dalam suatu media yang bermuatan listrik, dimana kecepatan
migrasinya tergantung pada muatan, ukuran dan bentuk setiap
molekul yang terlibat
Pada saat arus listrik diberikan, molekul bermigrasi melalui media
(berupa gel), molekul yang kecil akan bermigrasi lebih cepat
daripada yang besar, sehingga akan terjadi pemisahan.
Pemisahan protein : gel polyacrylamide

Pemisahan DNA : gel agarose

Pemisahan dalam medan listrik

Elektroforesis SDS-PAGE
(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

Pemisahan protein (molekul bermuatan

berdasarkan muatan, ukuran, dan bentuk,
dalam medan listrik)
Protein didenaturasi dengan detergen anion

Elektroforesis SDS PAGE

Protein

Protein yang terdenaturasi

Fungsi SDS :
Mendenaturasi protein
Menjadikan protein bermuatan (-) negatif

Prinsip Pemisahan

Gel Elektrophoresis

Elektroforegram

DNA

Protein

Analisa Tingkat Kemurnian dengan SDS-PAGE

1.Ekstrak kasar
2.Pengendapan dengan garam
3.Kromatografi penukar ion
4.Kromatografi filtrasi gel
5.Kromatografi afinitas

Gel Elektrophoresis

????

Ekstraksi

Ekstraksi
Penyaringan

Maserasi