RINGKASAN

Puding merah (Gruptophyllum pictum L Griff) merupakan tumbuhan perdu atau

pohon kecil yang banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai keperluan seperti
untuk obat berbagai penyakit dan pelembut kulit.
Dari uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak daun Puding merah (Graptophyllum
pictum L Griff) mengandung senyawa fenolik. Atas dasar pertimbangan ini maka dilakukan
isolasi dan penentuan struktur senyawa fenolik dari tumbuhan ini dan uji bioassay senyawa
tersebut terhadap larva Artemia salina.
Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Pemisahan
dan pemurnian lebih lanjut terhadap ekstrak etanol dilakukan dengan cara kromatografi
kolom dan diperoleh kristal sebanyak 37 mg.
Karakterisasi struktur dilakukan dengan spektroskopi IR dan 1H-NMR, Spektrum IR
senyawa hasil isolasi memperlihatkaan pita serapan pads angka gelombang 3431, 3121,
3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm-1. Spektrum 1H-NMR memperlihatkan
pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3 dan 7,6 ppm.
Berdasarkan uji fitokimia dan analisis spektrum 1R dan 1H-NMR maka disimpulkan
bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa fenolik yaitu suatu jenis senyawa flavonoid.
Uji bioassay senyawa hasil isolasi menunjukkan aktifitas biologis terhadap larva
Artemia salina yang memberikan harga LC50 sebesar 124,08 g/ml.

ii
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

DAFTAR ISI

Halaman
LEMBAR IDENTITAS DAN PENGESAHAN .................................................. i
RINGKASAN ......................................................................................................ii
KATA PENGANTAR ......................................................................................... iii
DAFTAR ISI ....................................................................................................... iv
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................v
I. PENDAHULUAN ............................................................................................1
II. TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................3
III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .................................................15
IV. METODE PENELITIAN ..............................................................................16
V. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................19
VI. KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................................21

DAFTAR PUSTAKA...22
LAMPIRAN ........................................................................................................23

iv
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Spektrum IR Senyawa Hasil Isolasi.. 23
Lampiran 2. Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi...........

24

v
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

1
I. PENDAHULUAN
Bahan-bahan hayati telah digunakan oleh manusia untuk memenuhi berbagai
keperluan hidup. Indonesia yang beriklim tropis memiliki sumber daya alam hayati yang
sangat beranekaragam yang memproduksi beraneka ragam senyawa kimia karbon alami.
Hutan tropik Indonesia terdapat tumbuh-tumbuhan yang peranannya dalam era
teknologi tidak kalah pentingnya dengan sumber daya alam lainnya seperti gas, batu bara,
mineral dan lain-lain. Dari segi kimia, sumber daya alam hayati ini merupakan
sumber-sumber senyawa kimia yang tak terbatas jenis maupun jumlahnya. Dengan demikian
keanekaragaman hayati dapat diartikan sebagai keanekaragaman kimiawi yang mampu
menghasilkan bahan-bahan kimia baik untuk kebutuhan manusia maupun untuk organisme
lain seperti untuk obat-obatan, insektisida, kosmetika dan sebagai bahan dasar sintesa
senyawa organik yang lebih bermanfaat.
Dalam pengobatan secara tradisional sebagian besar ramuan berasal dari
tumbuh-tumbuhan baik berupa akar, kulit batang, kayu, daun, bunga atau bijinya. Agar
pengobatan secara tradisional dapat dipertangggung jawabkan maka diperlukan penelitian
ilmiah seperti penelitian di bidang farmakologi, toksikologi, identifikasi dan isolasi zat kimia
aktif yang terdapat dalam tumbuhan.
Tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L griff) sering ditemukan tumbuh
liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Daun berkhasiat
sebagai peluruh kencing (diuretik), mempercepat pemasakan bisul, pencahar ringan dan
pelembut kulit dan bunganya sebagai pelancar haid. (Dalimartha, 1999).
Tumbuhan umumnya mengandung senyawa aktif dalam bentuk metabolit sekunder
seperti alkaloid, flavonoid, steroid, triterpenoid, kumarin dan lain-lain. Senyawa bioaktif
hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa
terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang
mempunyai bioaktifitas.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

2
Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah brine shrimp
(udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai sistem bioassay yaitu untuk
menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai, ananstetik, toksin
dinofagelata, senyawa yang berupa morfin, toksisitas pada dispersant minyak dan
kokarsinogenik ester phorbol. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metoda
brine shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik pada
ekstrak jamur. (Dharma. A,2001)
Kebanyakan kandungan kimia utama yang diisolasi dari tumbuhan akhir-akhir ini
aktifitas biologisnya belum terungkap karena belum diteliti. Potensi ini perlu untuk
didayagunakan untuk kemanusiaan dan juga untuk menjaga kelestarian tumbuhan tersebut
dengan menggali potensi bahan alam untuk bahan obat, untuk mengontrol hama tumbuhan
dan lain-lain.
Berdasarkan hal tersebut maka penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi
kandungan kimia utama Puding Merah (Graptophyllum pictum L griff) dan menentukan
bioaktifitasnya melalui uji brine shrimp.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

3
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tinjauan Botani Tumbuhan (Graptophyllum pictum L Griff)
Tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L griff) sering ditemukan tumbuh
liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau tanaman pagar. Tumbuhan ini
berupa perdu atau pohon kecil, tinggi 1,5 - 3 m, batang berkayu, kulit dan daun berlendir dan
buahnya kurang enak. Cabang bersudut tumpul, berbentuk galah dan beruas rapat. Daun
tunggal bertangkai pendek letaknya berhadapan bersilang, bulat telur sampai lanset, ujung
dan pangkal runcing, tepi bergelombang, pertulangan menyirip, panjang 8 - 20 cm, lebar
3 - 13 cm, permukaan atas warnanya ungu mengkilap. Perbungaan majemuk, keluar dari
ujung batang, tersusun dalam rangkaian berupa tandan yang panjangnya 3 12 cm, warna
merah keunguan. Buahnya buah kotak, bentuknya lonjong, warnanya ungu kecoklatan.
Daun berkhasiat sebagai peluruh kencing (diuretik), mempercepat pemasakan bisul,
pencahar ringan dan pelembut kulit dan bunganya sebagai pelancar haid. (Dalimartha, 1999)

2.2. Teknik Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder

Untuk mengisolasi suatu senyawa kimia yang berasal dari bahan alam hayati pada
dasarnya menggunakan metode yang sangat bervariasi, seperti yang diaplikasikan dalam
proses industri. Metode pengempaan digunakan pada senyawa katecin dari daun gambir juga
isolasi CPO dari buah kelapa sawit.
Metode ini umum digunakan karena senyawa organik yang diperoleh dengan
kuantitas yang cukup banyak. Tetapi berbeda dengan senyawa bahan alam hasil proses
metabolit sekunder lainnya yang pada umumnya dengan kandungan yang relatif kecil, maka
metode-metode dalam proses industri tersebut tidak dapat digunakan.
Berdasarkan hal diatas maka metode yang umum dalam isolasi senyawa metabolit
sekunder dapat digunakan. Metode standar laboratorium dengan kuantitas sampel terbatas
dan perlunya menentukan metode yang paling sesuai dengan maksud tersebut. (Darwis.D,
2000)
Dari identifikasi awal, maka dapat diamati kandungan senyawa dari tumbuhan
sehingga untuk isolasi dapat diarahkan pada suatu senyawa yang lebih dominan dan salah
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

4
satu usaha mengefektifkan isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan
pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih
mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam
pelarut non polar. (Harborne, 1987)

2.2.1. Identifikasi Kandungan Kimia

Sebelum melakukan isolasi terhadap suatu senyawa kimia yang diinginkan dalam
suatu tumbuhan maka perlu dilakukan identifikasi pendahuluan kandungan senyawa
metabolit sekunder yang ada pada masing-masing tumbuhan, sehingga dapat diketahui
kandungan senyawa yang ada secara kualitatif dan mungkin juga secara kuantitatif golongan
senyawa yang dikandung oleh tumbuhan tersebut. untuk tujuan tersebut maka diperlukan
metoda persiapan sampel dan metoda identifikasi pendahuluan dari senyawa metabolit
sekunder sebagai berikut (Darwis.D, 2000)
a. Senyawa Alkaloid
Metode yang cukup dikenal adalah metode identifikasi pandahuluan Culvenor Fitgerald
yaitu 4 gram sampel dipotong halus, digerus dengan lumpang dengan bantuan pasir yang
bersih dan dibasahi dengan 10 ml kloroform. ditambah dengan kloroforrn amoniak 0,05
M, digerus kembali dan disaring kedalam tabung reaksi, ditambah 0,5 ml asam sulfat 2 N,
kocok dan biarkan terjadi dua lapisan. Ambil lapisan asam sulfat dan masukkan kedalam
tabung` reaksi dan kemudian tambahkan satu tetes pereakksi meyer. Terbentuknya
endapan putih menandakan positif alkaloid.
b. Senyawa Terpenoid, steroid, fenolik, flavonoid dan saponin
4 gram sampel segar dirajang halus dan dididihkan dengan 25 ml etanol selama lebih
kurang 25 menit, disaring dalam keadaan panas, kemudian pelarut diuapkan sampai
kering. Ektrak dikocok kuat dengan kloroform lulu ditambahkan air suling, biarkan
sampai terbentuk dua lapisan.
- Lapisan kloroform diteteskan pada plat tetes dan biarkan kering, tambahkan beberapa
tetes asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann Burchard).
Terbentuknya warna merah atau pink menandakan positif untuk senyawa terpenoid dan
terbentuknya warna biru atau hijau positif untuk steroid.
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

5
- Lapisan air
* 1 ml lapisan air dikocok selama satu menit, terbentuknya busa yang tidak hilang selama 5
menit menandakan adanya saponin.
* Beberapa tetes ditempatkan dalam tabung reaksi ditambahkan besi (III) klorida, timbul
warna hijau sampai ungu menandakan positif fenolik
* Beberapa tetes ditempatkan dalam tabung reaksi, ditambahkan asam klorida pekat dan
serbuk magnesium dan timbulnya warna merah menunjukkan adanya flavonoid.

2.2.2. Ekstraksi dan Isolasi

Secara umum ekstraksi senyawa metabolit sekunder dari seluruh bagian tunbuhan
seperti bunga, buah, daun, kulit batang dan akar menggunakan sistem maserasi menggunakan
pelarut organik polar seperti metanol.
Beberapa metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum digunakan antara lain:
(Darwis. D,2000)
1. Maserasi
Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang

digunakan

pada temperatur ruangan. Proses ini sangat menguntungkan dalamisolasi senyawa bahan alam
karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi pemecahan dinding dan membran
sel akibat perbedaan tekanan antara didalam dan diluar sel sehingga metabolit sekunder yang
ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan
sempuma karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan pelarut untuk
proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan memperhatikan

kelarutan

senyawa bahan alam alam pelarut tersebut. Secara umum pelarut metanol merupakan pelarut
yang paling banyak digunakan dalam proses isolasi senyawa organik bahan alum, karena
dapat melarutkan seluruh golongan metabolit sekunder.
2. Perkolasi
Merupakan proses melewatkan pelarut organik pada sampel sehingga pelarut akan membawa
senyawa organik bersama-sama pelarut. Tetapi efektifitas dari proses ini hanya akan lebih
besar untuk senyawa organik yang sangat mudah larut dalam pelarut yang digunakan.
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

6
3. Sokletasi
Menggunakan soklet dengan pemanasan dan pelarut akan dapat dihemat karena terjadinya
sirkulasi pelarut yang selalu membasahi sampel. Proses ini sangat baik untuk senyawa yang
tidak terpengaruh oleh panas
4. Destilasi Uap
Proses destilasi lebih banyak digunakan untuk senyawa organik yang tahan pada suhu yang
cukup tinggi, yang lebih tinggi dari titik didih pelarut yang digunakan. Pada umumnya lebih
banyak digunakan untuk minyak atsiri.
5. Pengempaan
Metode ini lebih banyak digunakan dalam proses industri seperti pada isolasi CPO dari buah
kelapa sawit dan isolasi katecin dari daun gambir. Dimana pada proses ini tidakmenggunakan
pelarut.
Hasil yang diperoleh berupa ekstrak yang mana seluruh senyawa bahan alam yang
terlarut dalam pelarut yang digunakan akan berada pada ekstrak ini.
Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT)
dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan
komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk
memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan sebagai
fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang
diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi
sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT.

'F
Pemilihan eluen sebaiknya dimulai dari pelarut organik yang tidak polar seperti
heksana dan peningkatan kepolaran dengan etil asetat atau pelarut yang lebih polar lainnya
masing-masing pelarut (Harbone, 1987).

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

7
2.2.3 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur
Suatu senyawa bahan alam hasil isolasi akan diidentifikasi berdasarkan kimia, fisika
dan identifikasi dengan spektroskopi. Dari isolasi yang dengan menggunakan metoda standar
tidak semua senyawa akan secara utuh seperti yang terdapat dalam tumbuhan tersebut, karena
sebagian senyawa ada yang terlarut dan terpecah selama proses isolasi dan hasil terjadi seperti
putusnya ikatan glikosida membentuk aglikon dan gula dengan adanya air.
Identifikasi senyawa metabolit sekunder dan elusidasi struktur senyawa ditemukan
merupakan pekerjaan yang sangat menentukan dalam proses mengenal, mengetahui dan pada
akhirnya menetapkan rumus molekul yang aebenarnya dari senyawa tersebut.
Diantara metode identifikasi dan elusidasi struktur yang diperoleh dapat dilakukan
dengan metoda standar yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia dan termasuk
derivat-derivatnya antara lain : (Silverstein, 1991)
1. Metoda Spektroskopi
Metoda

spektroskopi

saat

ini

sudah

merupakan

metoda

standar

dalam

penentuan struktur senyawa organik pada umumnya dan senyawa metabolit

sekunder pada khususnya. Metoda tersebut terdiri dari beberapa peralatan dan
mempunyai hasil pengamatan yang berbeda, yaitu
a. Spektroskopi UV
Merupakan metoda yang akan memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa
organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang
berkonjugasi dengan senyawa alifatik rantai jenuh.
b. Spektroskopi IR
Metoda yang dapat menentukan serta mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat
dalam senyawa organik, yang mana gugus fungsi dari senyawa organik akan dapat
ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang
spesifik.
c. Nuklir Magnetik Resunansi Proton Metoda ini akau mengetahui posisi atom-atom
karbon yang mempunyai proton atau tanpa proton. Disamping itu akan dikenal
atom-atom lainnya yang berkaitan dengan proton
d. Nuklir Magnetik Kesonansi Isotop Karbon 13
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

8
Digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom karbon
pada senyawa tersebut.
e. Spektroskopi massa
mengetahui berat molekul senyawa dan ditunjang dengan adanya fragmentasi ion
molekul yang menghasilkan pecahan-pecahan spesifik untuk suatu senyawa
berdasarkan m/z dari masing-masing fragmen yang terbentuk. Terbentuknya
fragmen-framen dengan terjadinya pemutusan ikatan apabila disusun kembali akan
dapat menentukan kerangka struktur senyawa yang diperiksa.
2. Kromatografi
Penggunaan kromatografi sangat membantu dalam pendeteksian senyawa metabolit
sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan berikutnya dalam
menentukan struktur senyawa.
Berbagai jenis kromatografi yang umum digunakan antara lain (Darwis.D,2000)
a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)
Merupakan salah satu metoda identifikasi awal untuk menentukan kemurnian

senyawa

yang ditemukan atau dapat menentukaan jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit
sekunder.. Cara ini sangat sederhana dan merupakan suatu pendeteksian awal dari basil
isolasi.
b. Kromatografi Kolom
Digunakan untuk pemisahan campuran beberapa senyawa yang diperoleh dari isolasi
tumbuhan. Dengan menggunakan fasa padat dan fasa cair maka fraksi-fraksi senyawa
akan menghasilkan kemurnian yang cukup tinggi.
c. Kromatografi Gas
Pemisahan

campuran

senyawa

yang

cukup

stabil

pada

pemanasan,

karena

sampelyangdigunakan akan dirobah menjadi fasa gas dan dengan adanya perbedaan
keterikatan senyawa pada fasa padat yang digunakan terhadap senyawa organik sehingga
terjadi pemisahan musing-musing senyawa dari campurannya.
d. Kromatografi Cair

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

9
Lebih dikenal dengan HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) dan lebih dari 75
% dari pemakaiaan HPLC menggunakan fasa padat ODS (Oktadesil Sifane) atau C-18
sedangkan fasa cair sebagai pefarut pembawa senyawa dapat diganti kepolarannya pada
saat digunakan dan kondisi seperti itu dikenal sebagai fasa gradien. Pada kondisi gradien,
senyawa non polar akan diadsorpsi lebih lemah oleh fasa padat dan akan dielusi dengan
pelarut non polar dan sebaliknya senyawa polar akan diadsorpsi lebih kuat dan
membutuhkan pelarut polar. Jika sampel mempunyai polaritas yang luas, pemisahan
harus dilakukan dengan merubah kepolaran pelarut yang digunakan. efisiensi penggunaan
HPLC ditentukan dengan pengaturan dan penggunaan peralatan sebagai pembantu dalam
pemakaian HPLC.
2.3. Uji Bioaktifitas Senyawa Metabolit Sekunder
Dipermukaan bumi ini terdapat ratusan ribu spesies yang masing-masing berpotensi
mengandung metabolit sekunder yang unik. Dengan demikian jumlah senyawa metabolit
sekunder pun menjadi sangat banyak. Di antaranya ada yang mempunyai aktifitas biologis
dan ada pula yang tidak aktif biologis.
Untuk penapisan senyawa berkhasiat dari sumber alam maupun dari bahansintetik
yang jumlahnya ribuan diperlukan suatu metode penapisan yang cepat dan akurat. Untuk
mempersempit jumlah bahan yang akan ditapis secara bioassay bisa juga dilakukan penapisan
etnofarmasi terlebih dahulu. Dalam hal ini bahan yang akan diuji hanyalah yang secara
tradisional digunakan oleh masyarakat sebagai obat.
Penemuan bahan berkhasiat dari bahan alam maupun dari perpustakaan senyawa yang
dihasilkan dari program "Combinatorial Chemistry" memerlukan teknologi penapisan
senyawa khasiat dan teknologi isolasi dengan tuntunan uji bioekatifitas. Bioassay bisa
dilakukan in vivo maupun in vitro. Tetapi untuk penapisan senyawa dengan aktifitas tertentu
diperlukan suatu bioassay yang sederhana dan cepat sehingga dapat menapis banyak senyawa
dalam waktu yang lama dan tidak memerlukan banyak biaya. Untuk penapisan bahan khasiat,
dilakukan dengan dua kelompok assay yaitu selular dan molekular assay. Uji bioaktifitas
selular menggunakan sel utuh dengan target random yaitu apa saja yang menghambat
pertumbuhan sel. Sedangkan uji bioaktifitas molekuler menggunakan sistem terisolasi seperti
enzim, reseptor, DNA dan lain-lain dengan target subseluler tunggal. (Dharma. A,2001)
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

10
Dalam hal ini bioassay terhadap senyawa bahan alam dilakukan dengan mengukur
daya hambat senyawa terhadap aktifitas enzim farnesil transperase. Prosedur bioassay dari
senyawa alam maupun sintetis sangat tergantung pada aktifitas biologis apa yang dicari atau
ditapis dari perpustakaan senyawa yang ada.
Bioassay sangat murah, mudah dan cepat merupakan pilihan untuk menapis senyawa
bahan alam, baik penapisan esktrak kasar maupun dalam penapisan fraksi-fraksi sewaktu
isolasi, diantaranya adalah : (Dharma. A,2001)
1. Aktivitas racun terhadap ikan (Piscidal Activity). Salah satu bioassay berdasarkan brine
shrimp bioassay. Tumbuhan yang mempunyai aktititas racun bagi ikan juga ditemukaan
mempunyai aktifitas lain seperti insektisida,

inhibitor pertumbuhan tumbuhan,

co-karsinogen atau irritant. Dalam hal ini, aktifitas piscidal merupakan marker yang
berguna untuk bioaktifitas lainnya.
2.Aktifitas untuk menghambat pertumbuhaaan mikroba seperti pada uji antimikroba dan anti
jamur. Bioassay untuk anti mikroba dapat dilakukan dengan menguji daya hambat
pertumbuhan mikroba dalam medium padat oleh senyawa yang diuji dan menguji daya
hambat senyawa uji terhadap enzim yang berfungsi dalam sintesis protein, DNA atau
dinding sel. Metoda yang paling sederhana adalah dengan melakukan uji daya hambat
senyawa uji terhadap pertumbuhan mikroba tersebut pada medium padat.
3. Uji Antifeedant untuk mendeteksi dan mengisolasi senyawa metabolit sekunder tumbuhan
yang bersifat aktif biologis terhadap Serangga. ekstrak tumbuhan yang diuji ditambahkan
kedalam makanan serangga, kemudian beberapa jenis serangga uji diberi makan dengan
diet yang telah dicampur dengan ekstrak uji dan kemudian serangga tersebut dianalisa.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

11
2.3.1. Uji Antimikroba
Pemakaian antibakteri yang berlebihan menyebabkan mikroba yang semula sensitif
terhadap antibiotik menjadi resisten. Oleh karena itu, senyawa antibakteri diperlukan untuk
mengatasi bakteri resisten tersebut. Disamping itu juga perlu pengembangan antiseptik dan
desinfektan baru yang lebih aman bagi kulit dan jaringan manusia. Umumnya antibiotik yang
ada sekarang adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme sedangkan
antibiotik dari tumbuhan tingkat tinggi masih dalam pencarian. Metode uji anti mikroba dari
tumbuhan:(Hostettmann. K, 1991)
1. Sampel (bagian tumbuhan) diekstrak dengan cara dan pelarut yang sesuai. Ektraksi bisa
dilakukan dengan perendaman, soklet dan lainnya. Pelarut yang digunakan akan bisa
bervariasi tergantung dengan senyawa target dan biasanya etanol. Ekstrak dipekatkan dan
dikeringkan.
2. Larutan stock (dalam air atau etanol 85 %) dengan konsentrasi 1000 mg/ml disiapkan.
Larutan stock adalah larutan ekstrak yang akan diuji bioaktifitasnya. Larutan ini nantinya
akan diencerkan dengan air hingga diperoleh konsentrasi yang diketahui.
3. Persiapan biakan bakteri atau jamur uji. Bakteri dibiakan pada medium nutrien agar slant
dan ragi/jamur pada sabouroud agar slant. Inolukasi ini dinkubasi pada 37C untuk bateri
dan 30C untuk jamur.
4. Persiapkan medium agar pada cawan petri untuk uji bioaktifitas
5. Uji bioaktifitas antibiotik dari esktrak dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu :
- Metode difusi.
Dengan metode difusi ini, ekstrak uji yang diserap dengan kertas saring dimasukkan ke
dalam silinder atau dimasukkan ke dalam lubang, dikontakkan dengan media yang telah
diinokulasi. Kemudian setelah diinkubasi, diameter daerah bening di sekitar reservior
diukur. Diameter daerah bening ini merupakan daerah inhibisi dari kestrak sampel
terhadap mikroba uji. Untuk menurunkan limit deteksi, sistem dibiarkan pada suhu
rendah selama beberapa jam sebelum diinokulasi, yaitu untuk memberikan kesempatan
kepada antibiotik untuk berdifusi sebelum mikroba tumbuh.
-Metoda Pengenceran
Pada metoda pengenceran, Sampel yang akan diuji dicampur dengan medium yang cocok
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

12
yang sebelumnya telah diinokulasi dengan mikroba uji. Setelah inkubasi, pertumbuhan
mikroba dapat ditentukan dengan cara visual atau dengan perbandingan turbidimetri dari
kultur uji dengan kultur kontrol. Kurtul kontrol adalah kultur yang tidak diberi sampel
yang akan diuji bioaktifitasnya.
-Metoda Bioautografi
Merupakan metoda untuk menentukan tempat (posisi) senyawa yang mempunyai aktifitas
mikroba pada kromatogram. Caranya adalah dengan memindahkan senyawa uji dari
kromatogram lapis tipis atau kertas ke medium agar yang sudah diinokulasi dengan
mikroba uji. Daerah inhibisi kemudian dilihat dengan cara yang sesuai.

2.3.2. Uji Brine Shrimp Lethality

Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi. Oleh karena itu daya bunuh in
vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak
tumbuhan yang mempunyai bioaktifitas dan juga untuk memonitor fraksi bioaktif selama
fraksinasi dan pemurnian . (Meyer, 1982).
Salah satu organisme yang sangat sesuai untuk hewan uji tersebut adalah brine shrimp
(udang laut). Brine shrimp test sudah digunakan untuk berbagai sistem bioassay yaitu untuk
menganalisa residu pestisida, mikotoksin, polutan pada air sungai, ananstetik, toksin
dinoflagelata senyawa yang berupa morfin, toksisitas pada dispersant minyak dan
kokarsinogenik ester phorbol. Dalam fraksinasi yang diarahkan dengan bioassay, metoda brine
shrimp telah digunakan untuk memonitor fraksi aktif mikotoksin dan antibiotik pada ekstrak
jamur. (Abdi,2001)
Metoda uji aktifitas brine shrimp adalah: (Hostettman, 1991)
1. Air laut dimasukkan kedalam tanki kecil dan masukkan telur udang ke dalam salah satu
bagian dari tanki, tutup bagian ini. Lampu yang terletak pada sisi lain dihidupkan untuk
rnenarik udang melalui lubang pembatas. Larva udang siap untuk digunakan setelah
berumur dua hari.
2. Setiap fraksi diuji pada konsentrasi 1000, 100, 10 l/ml. Setiap perlakuan dilakukan dengan
tiga kali ulangan.
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

13
3. Penyiapan sampel dapat dilakukan dengan salah satu dari dua cara berikut :
a. 20 mg sampel dilarutkan dengan 2 ml pelarut (20 mg/2 ml). Dengan menggunakan
syringe, larutan sampel dipindahkan ke dalam botol masing-masing 500, 50 dan 5 L.
Pelarut diuapkan di bawah nitrogen dengan vakum tinggi selama 12 jam.
b. Sampel dilarutkan dengan DMSO, maksimum 50 L DMSO per 5 ml larutan garam.
Konsentrasi DMSO yang lebih tinggi dari 50 L/5 ml berakibat toksik pada larva udang.
Untuk kontrol, larutan sampel diganti dengan pelarut saja.
4. Ke dalam masing-masing hotel yang sudah berisi larutan sampel dimasukkan 5 ml larutan
air garam dan 10 larva udang.
5. Setelah 24 jam kemudian, dihitung jumlah larva yang masih hidup. Kemudian tentukan
LC50 dari hewan uji.
2.3.3. Uji Aktifitas Terhadap Serangga
Kebanyakan metabolit sekunder tumbuhan dapat mempengaruhi tingkah laku,
pertumbuhan dan reproduksi serangga sehingga dapat digunakan untuk mengontrol serangga
hama. Cara uji aktifitas serangga adalah sebagai berikut : (Arbain.D,1995)
1. Pilih serangga uji dengan pertimbangan yaitu kepentingan ekonomis, kecenderungan
untuk bertelur atau membentuk koloni, sensitif terhadap banyak bahan kimia dan lainlain.
2. Ekstraksi tumbuhan dan uapkan pelarutnya. Siapkan 10 % larutan ekstrak dalam etanol
sebagai larutan contoh
3. Siapkan tiga wadah dan kctiganya dihubungkan dengan slang plastik. Dengan

hati-

hati tempatkan 12 ekor serangga uji dalam salah satu wadah. Pada wadah kedua
tempatkan kertas saring lembab dan pada wadah ketiga tempatkkan kertas saring yang
Lelah ditetesi sampel. Kemudian dikeringkan diudara sampai tidak tercium ball etanol.
Amati yang terjadi selang satu jam selama satu malam.
4. Jika semua serangga uji berkumpul pada wadah sampel dan masih hidup maka diduga
sampel mengandung senyawa yang bersifat penarik "atractant'" serangga., jika berada
pada wadah sampel tetapi mati maka diduga sampel mengandung senyawa yang bersifat
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

14
insektisida, jika tidak satupun berada pada wadah sampel maka diduga sampel
mengandung senyawa yang bersifat penolak "repellent" serangga. Jika tidak terlihat
perbedaan nyata dapat dikatakan bahwa sampel uji tidak aktif terhadap serangga.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

15
III. TUJUAN DAN MANFAAT
3.1. Tujuan Penelitian
Puding Merah (Graptophyllum pitum L griff) merupakan tumbuhan perdu atau pohon
keci! yang sering ditemukan tumbuh liar di pedesaan atau ditanam sebagai tanaman hias atau
tanaman pagar. Tumbuhan ini banyak dimanfaatkan oleh masyarakat untuk berbagai
keperluan terutama sebagai obat.
Oleh karena itu dalam penelitian ini dilakukan pemisahan komponen kimia utama
tumbuhan ini dan dilakukan uji bioassay terhadap larva Artemia salina untuk mengetahui
aktifitas biologisnya melalui metode uji brine shrimp
3.2. Manfaat Penelitian
Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi baru mengenai
kandungan kimia utama dan aktifitas biologis daun Purling Merah (Graptophyllum pictum L
grill) dan diharapkan dapat memberikan konstribusi dalam pengembangan kimia bahan alami

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

16
IV. METODE PENELITIAN
4.1. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam Jurusaan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara medan.
4.2. Bahan dan Alat yang Digunakan
4.2.1. Bahan-bahan
Bahan-Bahan yang digunakan adalah etanol, n-heksana, etil asetat, butanol, metanol, asam
klorida pekat, serbuk magnesium, asam sulfat, silika gel, plat kromatografi lapis tipis, larva
Artemia salina
4.2.2. Peralatan
Peralatan yang digunakan adalah bejana maserasi, rotary evaporator, kolom kromatografi,
tanki biakan larva dan peralatan gelas.

4.3. Prosedur Penelitian

Penelitian

ini

dimulai

dari

pengumpulan

daun

tumbuhan

puding

merah

(Graptophyllum pictum L Griff) dan determinasi. Kemudian dikeringkan dan digiling menjadi
serbuk kering, dilanjutkan dengan isolasi kandungan kimia utamanya dengan metoda ekstraksi
dengan cara maserasi menggunakan pelarut etanol. Pemisahan dilakukan dengan kromatografi
kolom.
4.3.1. Ekstraksi dan Pemisahan
a. Ekstraksi
Daun tumbuhan puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) yang telah dikeringkan
sebanyak 1 kg dihaluskan, kemudian sampel yang telah berbentuk serbuk tersebut dimaserasi
dengan menggunakan pelarut etanol selama dua hari sambil sekali-kali dikocok. Selanjutnya
sari etanol dipisahkan dengan cara penyaringan. Ekstrak etanol dipekatkan dengan rotary
evaporator, kemudian dilakukan skrining fitokimia untuk mengetahui kandungan kimia
utamanya. Kemudian ekstrak etanol di fraksinasi berturut-turut dengan n-heksana dan etil
asetat. Terhadap
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

17
masing-masing fraksi dilakukan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui jumlah komponen
senyawa kimia dalam fraksi tersebut. Fraksi yang memberikan kandungan senyawa kimia
paling banyak dilakukan . pemisahan komponennya lebih lanjut. Dimana pada daun puding
merah (Graptophyllum pictum L Griff) fraksi yang mempunyai kandungan kimia paling
banyak adalah fraksi etil asetat.
c. Pemisahan
Pemisahan kandungan kimia dari fraksi etanol dilakukaan dengan kromatografi kolom dengan
fasa diam silika gel 60. Silika gel yang telah disuspensikan dengan n-heksana dimasukkan
kedalarn kolom. Ekstrak etanol pekat dilarutkan dan ditambahkan silika gel dengan berat yang
sama dan diuapkan sampai kering. Hasil preabsorpsi dimasukkan kedalam kolom lalu dielusi
dengan n-heksana, kemudian kepolaran eluen ditingkatkan dengan menambahkan etil asetat
secara bertahap. Komposisi eluen yang digunakan adalah n-heksana - etil asetat (90: 10, 80:20,
70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70 dan 20:80) dengan volume masing-masing eluen tersebut
adalah 100 m1.
Fraksi yang keluar dari kolom ditampung dengan menggunakan botol vial dengan volume 10
ml dan dimonitor dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi dengan nilai Rf yang sama digabung
yaitu fraksi dengan nomor vial 124 - 131 dan diuapkan pelarutnya. Fraksi ini direkristalisasi
sehingga diperoleh kristal mumi.

4.3.2. Uji Bioaktifitas Larva Artemia salina

a. Penyiapan larva artemia salina
Larva udang disiapkan dengan cara menetaskan telur Artemia salina dua hari sebelum
dilakukan pengujian. Penetasan dilakukan dengan cara merendam telur udang tersebut
kedalam air laut buatan yang mengandung NaCl 2% (b/v) sebanyak 200 m1. Setelah 24 jam
perendaman, telur menetas dan menghasilkan larva Artemia salina

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

18
b. Penyiapan sampel
Sampel dengan berat 20 mg dilarutkan dengan 2 ml pelarut. Larutan sampel dipindahkan
masing-masing sebanyak 500, 50 dan 5 l ke dalam botol. Pelarut diuapkan sampai betul-betul
kering.
c. Pelaksanaan uji
Kedalam masing-masing botol yang telah berisi sampel dimasukkan air laut buatan dan 10
larva udang yang telah berumur 2 hari. Setelah 24 jam kemudian dihitung jumlah larva yang
mati.

4.3.3. Analisis data

Terhadap senyawa hasil isolasi dilakukan analisis spektroskopi IR dan 1H
NMR. Untuk analisis data uji hayati dilakukan dengan analisis probit (Koestoni, 1985) untuk
menghitung LC50. Barga LC50 dibawah 1000 g/ml dinyatakan sebagai sanyawa bioaktif,
apabila diatas 1000 g/ml dinyatakan sebagai senyawa tidak bioaktif.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

19
V. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Hasil Penelitian
Ekstraksi terhadap 1000 gram serbuk daun puding merah (graptophyllum pictum L
Griff) dengan menggunakan etanol diperoleh ekstrak kasar etanol. Setelah dilakukan uji
fitokimia dengan menambahkan serbuk magnesium dan asam klorida pekat maka ekstrak
tersebut menghasilkan Warna merah yang menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mengandung
senyawa flavonoid.
Dari hasil pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom diperoleh. kristal
sebanyak 37 mg dan dari kromatografi lapis tipis memberikan noda tunggal dengan berbagai
eluen.
Karakterisasi Inframerah senyawa spektrum (IR) hasil_isolasi memperlihatkan pita serapan
pada angka gelombang 3431, 3111, 3057, 1618, 1462, 1340, 1060, 970 dan 800 cm-1
(Iampiran 1) dan spektrum 1H-NMR memperlihatkan adanya pergeseran kimia pada 1,5 ; 6,3
dan 7,6 ppm (lampiran 2). Uji bioassay senyawa hasil isolasi menunjukkaan aktifitas biologis
terhadap larva Artemia salina yang memberikan LC50 sebesar 124,08 g/ml.

5.2. Pembahasan
Analisis spektrum Inframerah (IR) senyawa hasil isolasi (lampiran 1)memperlihatkan
adanya pita serapan pada angka gelombang 3431 cm-1 yang merupakan serapan dari regang
O-H dengan bentuk pita yang agak lebar. Pita serapan di atas 3000 cm-1 menunjukkan adanya
regang C-H aromatis dimana pada spektrum senyawa hasil isolasi muncul pada angka
gelombang 3111 dan 3057cm-1 Pita serapan pada angka gelombang 1618 cm-1 menunjukkan
adanya regang C=O dengan pita serapan yang kuat. Pita serapan pada angka gelombang 1475
1300 cm-1 merupakan lentur C-H alifatik dan pita serapan pada angka gelombang 1462 cm-1
menunjukkan absorpsi dari metil dan metilena.
Daerah pada angka gelombang 1000 - 650 cm-1 memberikan informasi tentang sifat
khas alkena dan posisi substitusi pada cincin aromatis dimana pada spektrum IR muncul pita
serapan pada angka gelombang 970 cm-1 yang menandakan adanya alkena dalam bentuk trans
dan pita serapan pada angka gelombang 800 cm-1 menandakan adanya aromatik meta.
Analisis spektrun 1H-NMR senyawa hasil isolasi (lampiran 2) terlihat adanya beberapa
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

20
kelompok proton dengan pergeseran kimia yang berbeda-beda. Pada pergeseran kimia 1,5
ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton alifatik atau proton OH yang
diperkuat oleh spektrum IR pada angka gelombang 3431 cm-1. Adanya sinyal multiplet pada
pergeseran kimia 6,3 ppm menunjukkaan adanya alkena disertai pembelahan jarak jauh. Pada
pergeseran kimia 7,6 ppm muncul sinyal multiplet yang menunjukkan proton-proton cincin
aromatik. Sinyal-sinyal yang muncul pada pergeseran kimia 6,0 - 8,0 ppm merupakan sinyal
untuk proton-proton aromatik.
Dari analisis spektrum IR dan 1H-NMR serta hasil uji fitokimia dengan menggunakan
perekasi serbuk magnesium dan asam klorida pekat yang menghasilkan warna merah maka
disimpuIkan bahwa senyawa hasil isolasi merupakan senyawa aromatis atau fenolik dan
diperkirakan merupakan suatu jenis senyawa flavonoid.
Uii bioassay senyawa hasil isolasi :
Jumlah larva yang mati tiap konsentrasi (g/ml)
Nomor vial
10

100

1000

kontrol

Jumlah kematian

14

22

Jumlah larva

30

30

30

30

% kematian

23,3

46,7

73,3

Log konsentrasi

Nilai probit

4,2710

4,9172

5,6219

i
'
r

Uji bioassay senyawa hasil isolasi dilakukan terhadap larva Artemia salina dan analisis data
uji dilakukan dengan analisis probit yang memberikan LC50 sebesar 124,08 g/ml.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

21
VI. KESIMPULAN DAN SARAN
6.1. Kesimpulan
Dari hasil penelitian dan pembahasan yang dilakukan maka dapat disimpulkan :
1. Isolasi terhadap 1000 gram daun puding merah (Graptophyllum pictum L Griff) diperoleh
kristal sebanyak 37 mg dan dari analisis spektrum IR dan 1H-NMR serta uji fitokimia maka
senyawa hasil isolasi diperkirakan merupakan senyawa aromatik atau fenolik yaitu suatu jenis
senyawa flavonoid.
2. Pengujian aktifitas biologis senyawa hasil isolasi terhadap larva Artemia salina
menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi termasuk senyawa bioaktif dengan LC50 sebesar
124,08 g/ml.

6.2. Saran
Untuk meperoleh informasi tentang jenis dan struktur senyawa flavonoid hasil isolasi
maka disarankan untuk melakukan analisis spektroskopi

13

C NMR dan MS serta analisis-

analisis lainnya.

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006

22
DAFTAR PUSTAKA
Arbain.D, 1995, Uji Bioaktifitas dan Penelitian Kimia Bahan Alam, Workshop Isolasi
Senyawa Aktif Biologis, FMIPA Universitas Andalas Padang
Dalimartha.S, 1999, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid I, Cetakan 1, Trubus
Jakarta

Agriwidya,

Darwis.D, 2000, Teknik Dasar Laboratorium Dalam Penelitian Senyawa Bahan Alam Hayati,
Workshop Pengembangan Sumber Daya Manusia Dalam Bidang Kimia Organik Bahan Alam
Hayati, FMIP A Universitas Andalas Padang
Dharma.A, 2001, Uji Bioaktifitas Metabolit Sekunder, Workshop Peningkatan Sumber Daya
Manusia Untuk Pemanfaatan Sumber Daya Alam Hayati dan Rekayasa Bioteknologi, FMIPA
Universitas Andalas Padang
HarborneJ.B, 1987, Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,
diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata., lTB Bandung
Heyne.K, 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid II, Badan Penelitian dan Pengembangan
Kehutanan, Departemen Kehutanan, Diterjemahkan oleh Badan Litbang Kehutanan, Jakarta
Hosettmann.K, 1991, Methods in Plant Biochemistry, Vol 6, Academic press, New York
Koestoni.T, 1985, Analisis probit, Kelompok Peneliti Hama, Balai Penelitian Hortikultura,
Lembang
Mc.Laughlin.J.L, 1991, The Unesco Regional Workshop on The Bioassay of Natural Product
with Special Emphasis on Anticancer Agents, Institute Advanced Studies, University of
Malaysia
Meyer.B.N, 1982, Brine Shrimp Agregaat Convenient General Bioassay For Active Plant
Constituens, Planta Med, 45,31-34
Silverstein.R.M, 1991, Spectrometric Identification of Organic Compounds, edisi ke-5, Jhon
Willey & Sons

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006

USU Repository2006