I.

- INTRODUCCIN
La centrifugacin es un mtodo de separacin usado normalmente en
los laboratorios, el cual presenta una gama de posibilidades de
separacin, segn la clase o tipo de aparato de centrifugacin.
Es as que, en la centrifugacin es posible separar desde clulas hasta
pequeos componentes como organelas, tal es la capacidad
desarrollada que incluso es posible aislar varias clases de virus (Voet,
2006).
La centrifugacin funciona debido a la variabilidad de densidades que
presentan los diversos componentes de una muestra, es as que al
aplicar una fuerza rotativa se produce la sedimentacin de las partculas
ms densas y las dems partculas se distribuyen segn su densidad.
Tambin, para partculas con densidades muy similares, se emplean
medios donde existe una gradiente de densidad, lo cual tambin permite
una conveniente distribucin de las partculas segn su densidad (Voet,
2006).
Para el proceso de centrifugacin, existe toda una clase de aparatos,
tenemos:
o
o
o
o

De ngulo fijo
De ngulo variable
Analticas
Preparativas

En la mayora de los laboratorios los colorantes ms empleados para la

tincin hematolgica se basan en el de Romanowsky, constituido
fundamentalmente con la mezcla de eosina (cido) y azul de metileno
(bsico). La tincin Wright esta dentro del grupo de colorante tipo
Romanowsky, siendo uno de los ms utilizados .
La diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por el
colorante permite clasificar a los leucocitos polimorfonucleares en 3
grupos (Gartner, 2011):

Granulocitos eosinfilos, en los que la granulacin especfica

contiene sustancias de carcter bsicos que fijan los colorantes
cidos y se tien de color rojo-naranja.

Granulocitos basfilos, en los que la granulacin especfica posee

sustancias de carcter cido que fijan los colorantes bsicos y se
tien de color azul oscuro.

Granulocitos neutrfilos, en los que la granulacin especfica

posee compuestos de carcter neutro por lo que fijan ambos
colorantes simultneamente, de ah que se tien de color pardo.

II.- OBJETIVOS:

Demostrar la efectividad de la centrifugacin en el aislamiento de

grupos celulares a partir de sangre perifrica.

III.- PROCEDIMIENTO:
PARTE 1:
1. Limpiar la zona de brazo donde se colocara la aguja con algodn
previamente humedecido con alcohol, poner la liga, colocar la aguja y luego
presionar el tubo con anticoagulante para tomar la muestra de sangre,
retirar el tubo e invertirlo por 5 veces. Luego soltar la liga y colocar el
algodn limpio, presionar unos segundos y luego doblar el brazo.
2. Identificar el eppendorf que contiene 700 ul Ficoll-diatrizoato.
3. Diluir 500 ul de sangre, la sangre obtenida con 500 ul de PBS ph 7.2 en un
eppendorf diferente
4. Con mucho cuidado adicionar lentamente los 800 ul de la sangre diluida
sobre el Ficoll-diatrizoato ( Se debe formar una capa definida, no mezclar).
5. Centrifugar a 400 xg durante 20 minutos, a temperatura ambiente.
6. Con cuidado de no mezclar las fases, retirar el tubo de la centrfuga y aspirar
el plasma (capa superior) con una pipeta Pasteur, tratar de no mover el
anillo blanquecino de clulas en la interfase.
7. Aspirar el anillo de clulas, evitando contaminarlo con plasma ni Ficolldiatrizoato. Colocar las clulas en un tubo limpio.
8. Lavar las clulas agregando 4 volmenes de PBS Ph 7.2
9. Centrifugar a 100 xg por 5 min. Eliminar el sobrenadante por inversin
rpida de eppendorf (las clulas se quedan adheridas al fondo, formando un
botn) y repetir el lavado.
10. Despus del segundo lavado, las clulas pueden ser resuspendidos
suavemente en PBS pH 7.2
11. Para comprobar el porcentaje de viabilidad celular, mezclar partes iguales
de la suspensin de clulas y de azul tripan, 50 ul + 50 ul, y cargar una
cmara de recuento clulas tambin llamada cmara de Newbauer.

12. Observar inmediatamente al microscopio y contar las clulas viables

(claras), distinguindolas de las daadas (azules). Calcular la concentracin
de clulas en la suspensin original.
13. Tomar 20 ul del resuspendido de clulas, colocarlo sobre una lmina
portaobjetos, hacer la extensin, dejarlo secar.
14. Hacer la tincin de Wright, para ello adicionar 5 minutos de la solucin
Wright que cubra toda la lmina, luego adicionar agua destilada (con
cuidado) incubar por 10 minutos, luego descartar el exceso y enjuagar con
agua de cao con baja presin. Dejar secar y luego observar
inmediatamente al microscopio 100 X con aceite de inmersin.

PARTE 2:
1. Identificar el eppendorf que contiene 400 ul de sacarosa.
2. Tomar el eppendorf que contiene 500 ul de sacarosa 1X y retirar 400 ul de
sacarosa 1X y colocarlo lentamente sobre el eppendorf que contiene sucrosa
2X.
3. Diluir 500 ul de sangre, la sangre obtenida con 500 ul de PBS pH 7.2 en un
eppendorf diferente.
4. Con mucho cuidado adicionar lentamente los 400 ul de la sangre diluda
sobre el eppendorf que ya tiene las dos fases de sucrosa formada. (Cuidar
de no mezclar las fases).
5. Centrifugar 400 xg durante 20 minutos, a temperatura ambiente.
6. Con cuidado de no mezclar las fases, retirar el tubo de centrfuga y aspirar el
plasma, aspirar con una pipeta Pasteur el anillo blanquecino de clulas en la
interfase. Colocar las clulas en un tubo limpio.
7. Lavar las clulas agregando 4 volmenes de PBD Ph 7.2
8. Centrifugar a 100 xg por 5 min. Eliminar el sobrenadante por inversin
rpida del eppendorf (las clulas se quedan adheridas al fondo, formando un
botn) y repetir el lavado.
9. Despus del segundo lavado, las clulas pueden ser resuspendidos
suavemente en PBS pH 7.2.
10. Para comprobar el porcentaje de viabilidad celular, mezclar partes iguales
de la suspensin de clulas y de azul tripn, 50 ul + 50ul, y cargar una
cmara de recuento clulas tambin llamada de newbauer.
11. Observar inmediatamente al microscopio y contar las clulas viables
(claras), distinguindolas de las daadas (azules). Calcular la concentracin
de clulas en la suspensin original.

12. Tomar 20 ul del resuspendido de clulas, colocarlo sobre una lmina

portaobjetos, hacer la extensin, dejarlo secar.
13. Hacer la tincin de Wright, para ello adicionar 5 minutos de la solucin
Wright que cubra toda la lmina, luego adicionar agua destilada (con
cuidado) incubar x 10 minutos, luego descartar el exceso y enjuagar con
agua de cao con baja presin. Dejar secar, y luego observar
inmediatamente al microscopio 100X con aceite de inmersin.

V.- DISCUSIN:
En la tabla 1 observamos la cantidad de clulas viables y no viables
obtenidas a partir de la separacin de la sangre con gradientes de
densidad Ficoll diatrizoato y Sacarosa. La cantidad obtenida con Ficolldiatrizoato es 289 y 87 de clulas viables y clulas no viables
respectivamente, mientras que con Sacarosa se obtuvo 40 clulas
viables y 89 clulas no viables. Ambos mtodos nos permiten separar las
clulas por densidades. . Los glbulos rojos y los granulocitos se
sedimentaron en el fondo del tubo quedando debajo del paquete Ficolldiatrizoato, este proceso ocurri porque sus densidades aumentaron al
entrar en contacto con el medio Ficoll diatrizoato, lo mismo se observ
con el medio sacarosa. Lo podemos comprobar con sus densidades
correspondientes3:
Las densidades son:

Ficoll- diatrizoato : 1.077 + 0.001 g/ml.

Sacarosa 1X: 0.2 g/ml
Sacarosa 2X: 0.4g/ml
Globulos rojos y granulocitos: ~ 1.3 g/ml
Linfocitos, monocitos y plaquetas: valores muy bajos.

Los linfocitos, monocitos y plaquetas no son lo suficientemente densos

como para penetrar en la capa de Ficoll-diatrizoato y el gradiente de
sacarosa, por lo tanto queda como una banda concentrada en la interfaz
entre la sangre original y el paquete Ficoll, permitiendo que se pueda
recuperar los linfocitos con alto rendimiento4. La suspensin celular
resultante contiene linfocitos y monocitos altamente purificados y
viables. Las plaquetas fueron eliminadas cuando se hiso el lavado y la
centrifugacin. La diferencia en la cantidad de clulas viables se debe a
que el Ficoll tiene mayor xito de separacin, ya que se utiliza junto con
diatroziato de sodio, lo cual tiene como funcin proporcionar la densidad
ptima y la osmolaridad necesaria para la separacin eficiente de
linfocitos de otras clulas del plasma sanguneo, en cambio, la gradiente
de sacarosa es una solucin con densidades altas pero con alta
osmolaridad, confiriendo a las clulas un medio hipertnico 5. La clula
sufre el fenmeno de crenacin como consecuencia de la salida de agua
de la clula ("arrugandose").
En la tabla 2 tenemos el porcentaje de viabilidad con cada gradiente de
densidad, por lo explicado anteriormente esperaramos obtener mayor
porcentaje con Ficoll-diatrizoato, lo cual fue as, se obtuvo el 86% de
clulas viables. No se logr obtener el 100% quizs porque al momento
de hacer la mezcla por inversin rpida lo hicimos bruscamente
favoreciendo a la lisis de las clulas. Con respecto al porcentaje de
viabilidad con sacarosa se obtuvo el 31% ratificando el dato con el
fundamento explicada anteriormente.
La tincin Wright es un tipo de tincin usada en histologa para facilitar
la diferenciacin de los tipos de clulas de la sangre para luego poder
ser examinadas al microscopio2. En la imagen 1 que pertenece a una
gota de sangre observamos a un neutrfilo, esta granulacin posee
compuestos de carcter neutro, que no llegan a teirse con los
colorantes cidos ni bsicos de la tincin, por lo que su citoplasma se
observa de color rosa suave. Con respecto a su morfologa se encuentra
intacta.
La imagen 2 pertenece al frotis de linfocitos y monocitos extrados
utilizando Ficoll-diatrizoato para su separacin, se puede observar que
no permanecieron con su morfologa original, lo cual es propio de clulas
que han sufrido el proceso de lisis. Tenemos que rescatar que no se
observ un cambio de tamao en las clulas observadas, esto nos indica
que no hubo un cambio de osmolaridad, refutando con la teora
explicada inicialmente. La mayor cantidad de clulas estn teidas de

color rosado ligero y en menor cantidad se encuentran teidas de color

purpura.
La imagen 3 pertenece al frotis de linfocitos y monocitos extrados con
el gradiente de densidad sacarosa, la morfologa que presenta estas
clulas son arrugadas y pequeas, pone en evidencia que la clulas
sufrieron cremacin por encontrarse en un medio hipertnico6.

IV.- CONCLUSIONES:

La centrifugacin funciona debido a la diferencia de densidades en

cada componente del sistema.
La obtencin de diversos componentes por centrifugacin se basa
tambin en generar un medio con una gradiente de densidades.
El gradiente Ficoll-diatrizoato presenta dentro de sus propiedades
la cualidad de no alterar la presin osmtica del medio en la que
se halla, por lo cual no solo permite tener un alto rendimiento, sino
que adems una alta calidad en la muestra observada.

PREGUNTA 1 :

Qu contiene el Ficoll para mantener la viabilidad de las clulas?

Ficoll es un compuesto sinttico de alto peso molecular que proviene del
polmero de sacarosa y epiclorhidrina, que es fcilmente soluble en
agua. Tiene
baja viscosidad intrnseca
en comparacin con
polisacridos lineales del mismo peso molecular. El Diatrizoato de sodio
es un compuesto muy conveniente a utilizar con el Ficoll, puesto que
forman soluciones de baja viscosidad con alta densidad, este compuesto
es el que proporciona la densidad ptima y la osmolaridad necesaria
para mantener a los linfocitos viables y poder separarlos eficientemente
de las otras clulas5.

BIBLIOGRAFA:
1. Voet D. Voet J. Bioqumica. 3 Edicion. Editorial Medica Panamericana, 2006.
2. GARTNER, L. P. y J. L. HIATT. Histologa bsica. Ed. Elsevier, 2011
3. Generalidades de la sangre: http://www.fac.org.ar/ccvc/llave/tl094/tl094.pdf.
4. Isolation of leucocytes from human blood - further observations. (Paper II).
Byum, A.
Scand J Clin Lab Invest 21 Suppl, 97, 3150 (1968).
5. The Isopaque-Ficoll method. Hokland, P., Heron, I. Scand J Immunol, 11, 353
356 (1980).
6. Purification of lymphocytes and platelets by gradient centrifugation. Perper,
R.J., Zee, T.W.,
Mickelson, M.M. J Lab Clin Med, 72, 842848 (1968).