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PRACTICA DE BIOLOGIA MOLECULAR

INTRODUCCIN
Introduccin La invencin de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) por K. Mullis y sus colaboradores en 1985 ha revolucionado la
biologa molecular y la medicina molecular (Saiki et al., 1985). La
reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica in vitro utilizada
para amplificar enzimticamente una regin determinada de ADN
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras
que antes solo podan obtenerse cantidades mnimas de un gen
especfico,

ahora

incluso

un

nico

ejemplar

de

un

gen

puede

amplificarse con la PCR hasta un milln de ejemplares en tan solo unas


pocas horas. Las tcnicas de PCR se han hecho indispensables para
muchos procedimientos comunes, como la clonacin de fragmentos
especficos de ADN, la deteccin e identificacin de genes para
diagnstico y medicina legal, y en la investigacin de modelos de
expresin de los genes. Ms recientemente, la PCR ha permitido la
investigacin de nuevos campos, como el control de la autenticidad de
los alimentos, la presencia de ADN modificado genticamente y la
contaminacin microbiolgica. Para comprender los principios de la PCR
y sus aplicaciones, debe atenderse en primer lugar a la naturaleza de la
molcula del ADN, por lo que en la seccin siguiente se describen la
estructura y la replicacin del ADN.

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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA


(PCR)
OBJETIVOS:
Describir el proceso del PCR.
Detallar los componentes necesarios para llevar a cabo un PCR.
Preparar una PCR
INTRODUCCION:
La reaccin en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el
Doctor Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California. El
Dr. Mullis recibi en 1993 el Premio Nobel de Qumica por este
descubrimiento.
Se basa en la propiedad natural de los ADN polimerasas, partiendo de un
DNA
molde,
una
enzima
polimerasa
incorpora
nucletidos
complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la
unin de los cebadores al molde mediante esta tcnica es posible
generar muchas copias de un fragmento de DNA y distinguirlo del resto
del DNA total extrado.
Los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen
los pasos necesarios. El proceso se lleva a cabo en tres fases:
desnaturalizacin, hibridacin y elongacin.
En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que
las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como
desnaturalizacin y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor
de 94C. El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura
para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA
molde. Esta segunda fase se conoce como hibridacin. Temperaturas
habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60C. Por ltimo, en la fase de
elongacin o extensin, la enzima polimerasa incorpora nucletidos
complementarios a partir del extremo 3 libre de la regin en que han
hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta
fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq
polimerasa la temperatura de elongacin suele ser de 72C.
Los componentes necesarios para hacer un PCR son: El DNA a partir del
cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que
queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde.
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Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde:
una DNA polimerasa. La reaccin se lleva a cabo en un tampn
apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Adems,
como cofactores de la polimerasa se aaden cationes divalentes,
generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).
Iniciadores de la reaccin: Las enzimas DNA polimerasas nicamente
son capaces de aadir nucletidos al extremo 3 libre de una doble
cadena de DNA. Son necesarios por tanto molculas cortas (entre 10 y
30 bases) de DNA de cadena sencilla. Estas
molculas son los cebadores o primers de la
Reaccin, ellos son los que van a delimitar el
fragmento a amplificar. Nucletidos libres: las
enzimas DNA polimerasas van a crear una
cadena complementaria a la cadena molde
mediante la incorporacin de nucletidos al
extremo 3 libre del cebador que se ha unido a la
cadena molde. Los nucletidos se aaden en
forma de desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs). Estos cuatro
componentes son los elementos bsicos que es necesario incorporar a la
reaccin para que se complete una PCR.
MATERIALES:

dNTPs.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers).
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), (Mn2+)
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa (Taq).
ADN molde.
Termociclador.
Micropipetas
Tips o puntas plsticas.
Tubos

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PROCESO
METODOLOGICO
Cada ciclo
PCR consta

de
de

tres fases:
1. Desnaturalizacin: En esta el ADN blanco de doble cadena se
somete a una temperatura de 90 a 95 C durante 30 segundos;
permitiendo la separacin de las dos cadenas.
2. Hibridizacin: En esta la temperatura de la mezcla se
disminuye hasta alcanzar la temperatura adecuada para favorecer el
apareamiento de los primers con la secuencia blanco, lo cual
generalmente ocurre entre 45 a 55 C (dependiendo de la
temperatura de Fusin o Tm de los primers) durante 20 a 30 segundos
3. Elongacin o extensin: En este la temperatura de la mezcla se
eleva hasta
72 C para que la Taq polimerasa (DNA polimerasa) comience el proceso
de extensin en direccin 5 a 3 agregando los nucletidos
correspondientes, obtenindose la hebra complementaria de DNA o
AMPLICN.
En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reaccin, de
manera que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un
solo fragmento.

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Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo y constituyen un ciclo


completo de PCR, que se realiza en menos de dos minutos.
Tericamente, el ciclo de PCR se puede repetir sin lmite, pero la
polimerasa, los nucletidos y los cebadores suelen
Renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos
de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de ADN.
Consideraciones:
Al final del primer ciclo de la PCR, hay dos dobles hebras de ADN
idnticas a la original, cada nueva hebra producida se denomina
AMPLICN.
Este ciclo de tres pasos (desnaturalizacin, alineamiento y extensin)
puede ahora repetirse muchas veces. Conforme la PCR contina, se
crean primero dos, cuatro, ocho,.2n copias (n= nmero de ciclos),
obtenindose despus de 30 ciclos 1.073.741.824 copias. Este proceso
de la PCR tambin es llamado AMPLIFICACIN debido a que la
secuencia objetivo es copiada una y otra vez con el objeto de hacer
millones de copias. Ahora ya hay suficiente material gentico para
detectar la presencia y la cantidad del patgeno.
La temperatura de fusin o Tm a la cual se realiza el paso de
hibridizacin, representa la temperatura a la cul 50% de un
oligonucletido con una secuencia especfica se encuentra unido y la
otra mitad se encuentra desnaturalizado.
PROCEDIMIENTO:
El procedimiento que a continuacin se describe es utilizado para la
deteccin del gen
de
resistencia
a
amino
glucsidos en
cepas
de M. tuberculosis y/o se llevara a cabo la confirmacin de
gnero y especie mediante amplificacin multiplex. De acuerdo al
protocolo.
5.1 Extraccin del ADN por el mtodo de Boiling, de acuerdo a protocolo
del laboratorio de Biotecnologa.
5.2 Realizar la mezcla maestra de PCR (master mix), como se describe a
continuacin, encontrar el volumen para que la concentracin final

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quede como se indica, adicionando los Primers especficos y el ADN en


estudio.
1. Se toman 64 l de agua grado 1(milli Q).
2. calibramos las micro pipetas ya con los resultados
obtenidos:
3. procedemos a colocar en cada tubo empedeford los volmenes
calculados; colocando dicho tubos en una caja de ternopol con un
gel en su interior que permite que los compuestos se mantengan a
una temperatura estable.
4. una vez que todos los componentes estn convinados en el mix se
procede agregar la muestra de ADN molde; para despus ser
llevado al termocilcador y esperar de 1-2 horas para que
amplifique.

M. tuberculosis
Marcador: IS6110 (123pb), IS (89)
Procedimiento:
M1: control positivo
M2: control negativo
M3:.
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M4:.
M5:..
IS 6110
REACTANTES

VOLUMEN(ul {FINAL}
)

Agua destilada

25,6

5X buffer

10,0

1X

25 mM MgCl

3,0

1,5 mM

2,5 uM dNTPs

4,0

200uM

25 uM cebador

2,0

1uM

Enzima

0,2

1U/tubo

ADN

MIX (ul)

50ul
Condiciones de PCR:
Pre-denaturacion: 95C x 3
Denaturacion: 95C x 30
Hibridacin: 67C x 45
Extensin: 72C x 30

30
Ciclos

Post-extensin: 72C x 3
5.4 Visualizar el resultado en gel de agarosa de acuerdo al tamao del
producto amplificado en la siguiente clase
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Tabla 1. Secuencias de primers para la amplificacin de genes


especficos de una bacteria y de un gen de resistencia.
Secuencia de Oligonucletidos:
MARCADOR

SECUENCIA

IS6110

5-CCT GCG AGC GTA GCC GTC GG-3


5-CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG-3

IS 3

5-TTC GGA CCA CCA GCA CCT AA-3

IS 4

5-TCG GTG ACA AAG GCC AGG TA-3

Temperatura de metilacin:
T=4(G+C)+2(A+T) C

PARA IS6100: T=4(8+7)+2(2+3) C


=70 C

PARA IS 3 : T= 4(3+8)+2(6+3) C
=62 C

CONCLUSIONES
En conclusin, la PCR es una nueva herramienta de investigacin y
diagnstico de laboratorio muy potente que abre todo un nuevo
mundo de posibilidades. Su aplicacin ha de ser limitada a
aquellos casos o estudios que lo permitan y en ningn momento
su aplicacin ha de desmerecer y suplir la tcnica oficial de
deteccin y enumeracin de Legionella (ISO 11731)
RECOMENDACIONES:

Realizar los clculos para obtener el experimento deseado; de


lo contrario fallaremos en el intento y no se podr apreciar los
resultados.
Tener mucho cuidado y asepsia para que pueden obtenerse los
resultados deseados.

CUESTIONARIO
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1.
BIBLIOGRAFIA
-Revista Nature Protocolos Aos 2009-2013
-Articulo Bodas de Plata de la PCR Revista Nova UCMC. 2008.
Gladys Pinilla
-PCR protocols second edition Jhon M.S. BARLETT DAVID STIRLIN
HUMANA PRESS TOOWA NEW YERSEY. VOL 226 2003
-RAPID CICLE REAL TIME PCR METHODS AND APPLICATION
MICROBIOLOGY AND FOOD ANALISIS. SPRINGER
U. REISTHL
C.WITTWER F. TOTKERILL 2002.

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