Pereaksi atau sering disebut juga reagensia adalah bahan yang berperan dalam suatu

reaksi kimia atau diterapkan untuk tujuan analisis. Validasi dilakukan mterhadap reagen
yang dipakai untuk mendapatkan hasil yang akurat. Validasi adalah suatu tindakan yang
membuktikan bahwa suatu proses atau metode dapat memberikan hasil yang konsisten
sesuai dengan spesifikasi yang telah ditetapkan, dan dilakukan bila ada perubahan
mempengaruhi produk seacra langsung, produk baru atau produk lama.
Dalam kegiatan praktikum transfusi darah pada khususnya terhadap beberapa reagen
yang umumnya pereaksi atau sering disebut juga reagensia adalah suatu yang berperan
dalam suatu reaksi kimia atau diterapkan untuk tujuan analisitik. Validasi dilakukan terhadap
reaggen yang dipakai untuk mendapatkan hasil yang akurat. Validasi adalah suatu tindakan
yang membuktikan bahwa suatu proses atau metode dapat memberikan hasil yang konsisten
sesuai dengan spesifikasi yang telah ditetapkan, dan dilakukan bila ada perubahan yang
mempengaruhi produk secara langsung, produk baru atau produk lama.
Dalam kegiatan praktikum tranfusi darah pada khususnya terdapat beberapa reagen yang
umumnya digunakan dan harus dilakukan validasi dalam jangka waktu berkala, dimana
reagen tersebut meliputi: Anti A, Anti B, Anti D, Tes Sel A standar, Tes Sel B standar, Tes
Sel D standar, Bovine AlBumin 22%, Coombs Serum (AHE), dan Coombs Control Cells
(CCC). Pada prinsipnya validasi reagen dalam kegiatan praktikum ini didasarkan pada reaksi
alutinasi antara reagen yang diuji validasinya, reaksi aglutinasi yang terjadi dikarenakan
adanya reaksi spesifik antara reagen yang diuji dengan anti-reagennya.
Uji validasi reagen yang termasuk golongan anti-bodi sel darah (Anti A, Anti B, dan Anti
D) yang terdapat dalam serum atau plasma dilakukan dengan cara mereaksikan reagen
dengan tes sel standar A, standar B, dan tes sel 0. Pada praktikum ini menggunakan tabung
reaksi (tube test) dimana konsentrasi yang digunakan yaitu 5%, dimana hal ini terkait
dengan luas bidang reaksi.

Uji Validasi Anti-A

Uji validasi pada reagen Anti A dilakukan dengan cara meneteskan 2 tetes reagen
Anti-A pada 3 buah tabung reaksi. Kemudian pada tabung A diteteskan 1 tetes suspensi
A 5%, tabung B diteteskan 1 tetes suspensi sel B 5%, dan tabung C diteteskan 1 tetes
suspensi sel O 5%. Dilakukan proses Centripugasi selama 15 detik dengan kecepatan
3800 rpm. Reagen Anti A yang valid akan menunjukkan adanya aglutinasi bila

disuspensikan dengan sel A 5% karena mengandung antigen A, sedangkan saat

direaksikan dengan suspensi sel B 5% dan O 5% tidak menunjukkan adanya aglutinasi.
Dari pengujian yang telah dilakukan terhadap antigen A didapatkan hasil yang valid
dimana ditunjukkan dengan adanya aglutinasi pada Anti-A dan tidak terjadi aglutinasi

pada suspense sel B5% dan O 5%.

Uji Validasi Anti-B
Uji validasi pada Anti-B dilakukan dengan cara menestakn 2 tetes reagen Anti-B
pada 3 buah tabung reaksi. Pada tabung A diteteskan suspense sel A 5%, tabung B
suspense sel B 5%, dan tabung O diteteskan 2 tetes suspensi sel O 5%. Dilakukan proses
centrifugasi dengan kecepatan 3800 rpm selmama 15 menit. reagen B yang valid akan
menunjukkan adanya aglutinasi bila direaksikan dengan suspensi B 5% karena
mengandung antigen B. berdasarkan hasil pemerikasaan diperoleh hasil yang valid yang
ditunjukkan dengan adanya aglutinasi pada Anti-B dan tidak adanya aglutinasi pada

suspensi sel A 5% dan O 5%.

Uji Validitas A-standar dan B-standar
Pengujian ini dilakukan denga prosedur penambahan 2 tetes Anti-A dan Anti-B
pada tabung yang berbeda, kemudian disusul dengan penambahan A-standar 5%
sebanyak 1 tetes pada masing-masing tabung. Begitu pula dengan B-standar dilakukan
prosedur yang sama dimana Anti-A dan Anti-B diteteskan pada tabung reaksi yang
berbeda dan ditambahkan dengan B-standar 5% sebanyak 1 tetes. Hasil pencampuran lalu
dicentrifuge selama 15 detik dengan kecepatan 3000 rpm.
Dari praktikum uji A-standar dan B-standar menunjukkan hasil yang valid dimana
hasil positif atau adanya aglutinasi dihasilkan oleh Anti-A dengan standar A 5% dan AntiB dengan standar B. hal ini menunjukkan bahwa reagen valid dan dapat digunakan.
Dalam praktikum ini, dilakukan uji validitas reagen, khususnya reagen yang
digunakan pada pemeriksaan golongan darah untuk tujuan transfusi darah. Uji kualitas
reagen harus dilakukan pada :
a.
b.
c.
d.

Setiap kali batch larutan kerja (working solution) dibuat.

Setiap minggu
Bila sudah mendekati masa daluwarsa.
Bila ditemukan / terlihat tanda-tanda kerusakan (timbul kekeruhan, perubahan

warna, timbul endapan)

e. Bila terdapat kecurigaan terhadap hasil pemeriksaan

Stabilitas reagen merupakan kemampuan suatu produk reagen untuk bertahan

dalam batas yang ditetapkan sepanjang periode penyimpanan dan penggunaan. Sifat dan
karakteristiknya sama dengan yang dimilikinya pada saat produk dibuat. Kestabilan
reagen dapat dilihat dari beberapa hal dengan suatu perubahan dalam penampilan fisik
seperti warnanya. Sedangkan dalam hal lain perubahan kimia dapat terjadi yang tidak
bisa dibuktikan sendiri dan hanya bisa dibuktikan melalui analisis kimia, sehingga uji
validasi reagen dilakukan.
1. Uji Validasi Reagen Anti-A, Anti-B dan Anti-D
Seraclone Anti-A (ABO1) dan Seraclone Anti-B (ABO2) sebagai komponen reaktif
mengandung antibodi monoclonal manusia dari imunoglobulin kelas IgM. Mereka
berasal dari jalur sel hibridoma yang dibuat dengan menggabungkan antibodi tikus
memproduksi limfosit B dengan sel myeloma tikus. Antibodi ini diencerkan dalam
larutan protein yang mengandung buffered albumin, etilendiamin tetraacetate (EDTA),
dan sebagai pewarna Paten Biru (Anti-A) atau Tartrazin (Anti-B) dan dengan pengawet
0,1% sodium azide.
Reaktivitas semua reagen harus dikonfirmasi oleh pengujian dengan sel darah
merah positif dan negatif pada setiap hari gunakan. Untuk mengkonfirmasi reaktivitas
atau spesifisitas Reagen Biotest monoklonal Darah (Anti-A dan Anti-B), masing-masing
harus diuji dengan antigen-positif dan antigen-negatif sel darah merah mereka masingmasing. Misalnya, untuk menguji reagen Anti-A, digunakan suspensi sel darah A (sebagai
antigen positif) dan digunakan juga suspensi sel darah B dan O (sebagai antigen negatif).
Masing-masing reagen yang baik untuk digunakan adalah reagen yang hanya bereaksi
dengan sel darah merah antigen-positif.
Dalam praktikum ini, validasi reagen Anti-A dilakukan
bloodgrouping plate, dengan formula sebagai berikut :

Sumur 1
Sumur 2
Sumur 3

: 2 tetes anti-A + 1 tetes suspensi sel A 10%

: 2 tetes anti-A + 1 tetes suspensi sel B 10%
: 2 tetes anti-A + 1 tetes suspensi sel O 10%

dengan metode

Validasi reagen Anti-B dilakukan

dengan metode bloodgrouping plate, dengan

formula sebagai berikut :

Sumur 1
Sumur 2
Sumur 3
Masing-masing plate

: 2 tetes anti-B + 1 tetes suspensi sel A 10%

: 2 tetes anti-B + 1 tetes suspensi sel B 10%
: 2 tetes anti-B + 1 tetes suspensi sel O 10%
lalu digoyangkan untuk menghomogenkan isinya. Setelah itu,

diamati aglutinasinya. Hasil validasi pada reagen Anti A adalah pada sumur 1 yang
berisi suspensi sel A 10% terjadi aglutinasi (Positif), pada sumur 2 yang berisi sel darah B
10% tidak terjadi aglutinasi (Negatif), dan sumur 3 yang berisi suspensi sel O 10% tidak
tejadi aglutinasi (Negatif).
Hasil validasi pada reagen Anti B adalah pada sumur 1 yang berisi suspensi sel A
10% tidak terjadi aglutinasi (Negatif), pada sumur 2 yang berisi sel darah B 10% terjadi
aglutinasi (Positif), dan sumur 3 yang berisi suspensi sel O 10% tidak tejadi aglutinasi
(Negatif).
Hasil uji kedua reagen ini (Anti-A dan Anti-B), dapat dikatakan valid, karena baik
Anti-A maupun Anti-B beraglutinasi dengan antigen yang sesuai, yaitu Anti-A dengan
aglutinogen A dan Anti-B dengan aglutinogen B. Prinsip yang digunakan dalam hal ini
adalah hemaglutinasi dimana Anti-A (ABO1) maupun Anti-B (ABO2) mengikat antigen
yang sesuai pada sel darah merah yang diuji dan menyebabkan reaksi antigen-antibodi
terlihat sebagai sel darah merah aglutinasi. Dari hal tersebut dapat dinyatakan bahwa
reagen Anti-A dan Anti-B layak untuk digunakan pemeriksaan.

Validasi Reagen Anti-D

Reagen Anti-D digunakan untuk menguji keberadaan atau tidak adanya antigen D.
Antigen D (RH1) adalah antigen yang penting setelah antigen sel darah merah A dan B.
Sel yang memiliki D (RH1) adalah antigen "Rh positif" sedangkan sel yang tidak
memiliki D (RH1) adalah antigen "Rh negatif".
Sebagai Seraclone komponen reaktif, Anti-D berisi antibodi monoklonal manusia dari
imunoglobulin kelas IgM. Antibodi ini berasal dari sel kultur supernatan dan
menunjukkan kekhususan dan karakteristik reproduktifitas untuk antibodi monoklonal.
Antibodi ini diencerkan dalam larutan garam isotonik yang mengandung buffer albumin
dan potensiator makromolekul.

Seperti halnya dengan uji validasi Anti-A dan Anti-B, untuk mengkonfirmasi
reaktivitas atau spesifisitas, reagen Anti-D harus diuji dengan antigen-positif

dan

antigen-negatif sel darah merah masing-masing. Reagen yang baik untuk digunakan
adalah reagen yang hanya bereaksi dengan sel darah merah antigen-positif.
Validasi reagen Anti-D dilakukan dengan metode bloodgrouping plate pula, dengan
formula sebagai berikut :

Sumur 1
Sumur 2
Sumur 3
Sumur 4

: 2 tetes anti-D IgM positif + 1 tetes suspensi sel A 10 %

: 2 tetes anti-D IgM positif + 1 tetes suspensi sel B 10 %
: 2 tetes BA 22% + 1 tetes suspensi sel A 10 %
: 2 tetes BA 22 % + 1 tetes suspensi sel A 10 %

Suspensi sel yang digunakan merupakan sel darah dengan rhesus positif. Hal ini
dilakukan karena sangat jarang terdapat sel darah dengan rhesus negatif. Bovine Albumin
22 % digunakan sebagai autocontrol untuk Anti-D yang menunjukkan apakah uji validasi
reagensia antiD yang dilakukan telah dikerjakan dengan benar atau tidak dimana
hasilnya

harus

selalu

negatif.

Masing-masing

plate

lalu

digoyangkan

untuk

menghomogenkan isinya. Setelah itu, diamati aglutinasinya.

Hasil validasi pada reagen Anti D adalah pada sumur 1 dan 2 terjadi aglutinasi
yang berarti positif. Prinsip yang digunakan dalam hal ini adalah hemaglutinasi dimana
Anti-D (RH1) mengikat antigen D pada sel darah merah dan menyebabkan terjadinya
reaksi antigen- antibodi yang terlihat sebagai aglutinasi sel darah merah. Sedangkan
pengujian 1 tetes suspensi sel A 10 % dengan 2 tetes Bovine Albumin 22 % pada sumur 3
dan 4 menunjukkan hasil negatif dimana digunakan sebagai autocontrol. Hal ini
menunjukkan bahwa reagen Anti-D valid karena Anti-D bereaksi dengan antigennya yang
sesuai yaitu sel darah A atau B yang rhesus positif. Sehingga reagen Anti-D layak untuk
digunakan pemeriksaan.
2. Uji Validasi Reagen pada Bovine Albumine 22 %, Anti Human Globulin, dan Coombs
Control Cell
Pada praktikum ini, uji validasi pada Bovine Albumine 22 %, Anti Human Globulin,
dan Coombs Control Cell, dijadikan satu rangkaian dengan metode tabung.

Hal pertama yang dilakukan adalah menguji Bovine Albumine 22 %. Dalam

pemeriksaan, Bovine Albumin 22 % ditambahkan ke suspensi sel untuk meningkatkan
kemampuan antibodi untuk dapat bergabung dengan antigen spesifik dimana reagen ini
tidak akan mempengaruhi tahap pertama haemagglutination (penyerapan antibodi) tetapi
akan meningkatkan tahap kedua (aglutinasi) dengan membiarkan sel darah merah yang
dilapisi antibodi berdekatan atau dengan kata lain, penambahan Bovine Albumin 22 %
berfungsi untuk meningkatkan sensitivitas test. Pengujian dilakukan dengan cara pada
tabung dibuat campuran berikut:
Tabung 1 : 1 tetes suspensi sel A 5% + 2 tetes BA 22%
Tabung 2 : 1 tetes suspensi sel B 5% + 2 tetes BA 22%
Tabung 3 : 1 tetes suspensi sel O 5% + 2 tetes BA 22%
Kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37C. Lalu, disentrifugasi dengan
kecepatan 3000 rpm selama 15 detik. Lalu, diamati aglutinasi yang terbentuk. Hasil yang
diperoleh adalah pada tabung 1, 2, dan 3 tidak terjadi aglutinasi (negatif). Karena semua
hasilnya adalah negatif, dapat dikatakan bahwa Bovine Albumine 22 % valid, maka
validasi dapat dilanjutkan ke pengujian reagen Anti Human Globulin.
Pengujian reagen Anti Human Globulin dilakukan dengan cara, pada ketiga tabung
yang menunjukkan hasil negatif tadi, dicuci 3 kali dengan menggunakan saline untuk
menghilangkan bovine albumin 22% yang sebelumnya masih terdapat pada ketiga tabung
tersebut. Selain itu pencucian ini juga berfungsi untuk menghilangkan antibodi bebas
karena Anti Human Globulin akan lebih memilih untuk bereaksi pertama dengan antibodi
bebas dan kemudian baru bereaksi dengan sel darah yang dilapisi antibodi. Antibodi
bebas ini akan menetralisir Anti Human Globulin sehingga tidak akan bereaksi dengan sel
darah merah yang terikat dengan antibodi dan menimbulkan hasil negatif palsu. Setelah
dicuci, masing- masing tabung ditambahkan dengan 2 tetes Anti Human Globulin.
Tabung dikocok perlahan lahan, kemudian diputar 3000 rpm selama 15 detik. Antibodi
di dalam Anti Human Globulin akan bereaksi dengan antibodi atau komplemen pada sel
darah merah, sehingga menyebabkan terjadinya aglutinasi. Namun dalam pengujian ini,
hasil yang diperoleh pada tabung 1, 2, dan 3 adalah tidak terjadi aglutinasi (negatif) yang
berarti tidak ada antibodi atau komplemen pada sel darah merah.
Untuk mengetahui valid atau tidaknya uji validitas reagen Coombs Serum yang
dilakukan, maka ketiga tabung tersebut yang memberikan hasil negatif ditambahkan
masing masing 1 tetes Coombs Control Cells (CCC). Tabung dikocok perlahan lahan,

kemudian diputar 3000 rpm selama 15 detik. CCC adalah sel yang dilapisi dengan
antibodi IgG dimana CCC ini akan bereaksi dengan antibodi dalam Anti Human Globulin
yang masih mengambang dalam tabung. Anti Human Globulin mengambang dalam
tabung karena tidak ada antibodi atau komplemen sel darah merah yang berikatan dengan
Anti Human Globulin. Sehingga Anti Human Globulin akan berikatan dengan CCC
(antibodi IgG) dan membentuk aglutinasi. Jadi, hasil yang diperoleh pada tabung 1, 2,
dan 3 adalah terjadi aglutinasi (positif). Karena semua hasilnya adalah positif, dapat
dikatakan bahwa pengujian reagen Anti Human Globulin yang memberikan hasil negatif
tadi adalah benar (reagen Anti Human Globulin valid). Hal ini sekaligus juga menguji
validitas reagen Coombs Controll Cell (CCC), sehingga reagen Coombs Controll Cell
(CCC) juga valid dan baik untuk digunakan dalam pemeriksaan.

Suantari,febi.2013.LAPORAN

PRAKTIKUM

IX

Validasi

https://www.scribd.com/doc/146884719/Laporan-Praktikum-Ix
2016.21:25 WITA)
Siskayani, savitri.2013.Uji

Validasi

Reagensia.[online].tersedia:
(diakses

Juni

Reagen.[online].tersedia:https://www.scribd.com/doc/

148455335/Uji-Validitas-Reagen (diakses 16 Juni 2016.21:35 WITA)

Ini dafus punya adi aja

16