Jaringan Insinyur Kornea: Evolusi RAFT

Abstrak: kebutaan kornea mempengaruhi lebih dari 10 juta orang di seluruh dunia dan cara
pengobatan saat ini sering melibatkan penggantian lapisan rusak dengan jaringan sehat.
Karena kekurangan kornea donor di seluruh dunia dan tidak adanya perancah biologis yang
cocok, penelitian terbaru telah difokuskan pada pengembangan teknik rekayasa jaringan
untuk membuat terapi alternatif. Ulasan kali ini akan memaparkan secara detail teknik
rekayasa sederhana kompresi plastik kolagen untuk proses yang sekarang kita sebut
Arsitektur nyata untuk 3D Jaringan atau Real Arsitectur For 3D Tissue (RAFT). Proses
produksi RAFT telah disetujui, dan langkah-langkah berikutnya telah diambil untuk
mempertimbangkan Good Manufacturing Practic (GMP). Evolusi dari proses ini telah
memungkinkan kita untuk membuat epitel biomemetic dan setara jaringan endotel yang
cocok untuk transplantasi dan ideal untuk mempelajari interaksi-sel sel in vitro.
Kata kunci: kornea; epitel; endothelium; teknik jaringan; perbaikan; RAFT; kolagen; GMP

1. Kornea dan Limbus

Di depan mata kornea sebening kristal yang indah dirancang untuk menggabungkan dua
fungsi penting. kornea memberikan sebagian dari kekuatan fokus mata dan juga melindungi
mata, menolak penghinaan fisik dan mencegah masuknya kotoran dan infeksi. Untuk
melakukan peran ini kornea menggabungkan daya tahan dan kekuatan dengan transparansi
dan kelancaran kaca-seperti. Untuk menjaga kejelasan, kornea harus melawan peradangan,
vaskularisasi, dan invasi oleh sel-sel sekitarnya dan ini membutuhkan partisipasi aktif terus
menerus dari berbagai belahan membentuk struktur sederhana ini.
kornea terdiri dari lima lapisan; epitel berlapis menutupi permukaan kornea anterior
menghadapi

lingkungan

eksternal,

memberikan

penghalang

terhadap

infeksi

dan

memungkinkan aliran cairan dan nutrisi dari film air mata untuk tubuh utama dari kornea,
stroma atau substantia propria. Antara stroma dan epitel adalah membran Bowman, lapisan
protein ekstraseluler yang mengandung saraf sub-basal. Stroma itu sendiri adalah struktur
kolagen yang sangat memerintahkan, diproduksi oleh keratocytes, sel-sel penduduk stroma
dan transparansi tergantung pada keratocytes tersisa diam. Wajah posterior kornea dilapisi

dengan endothelium khusus yang mempertahankan tingkat stroma hidrasi dan dengan
demikian kejelasan dengan memompa cairan dari stroma ke dalam ruang anterior bila
diperlukan. endothelium duduk di Descemet Membran (DM) ini , lapisan matriks
ekstraselular lain yang terletak di antara stroma dan endothelium, itu disekresi oleh
endotelium dan penting untuk integritas endotel (Gambar 1).

Gambar 1. Haematoxylin dan eosin bagian bernoda kornea manusia terdiri dari lima lapisan.
Di pinggiran kornea di mana stroma menempel. Membran fibrosa putih sklera dan epitel
kornea jelas memberikan jalan bagi lender untuk mensekresi epitel konjungtiva, dan terdapat
persimpangan atau limbus corneoscleral, yaitu wilayah yang unik dengan sifat yang luar
biasa. Limbus menyediakan lingkungan yang kaya di mana sel-sel induk yang diperlukan
untuk omset normal dari epitel kornea dan sel dukungan mereka berada 1. Selain itu, sel punca
yang merupakan sel-sel prekursor untuk keratocytes stroma ditemukan di dekat limbus. 2
Limbus kaya akan pembuluh darah dan mengandung banyak saraf mielin, membuat limbus
berfungsi untuk membuat penghalang, seperti pada sisi kornea yang tidak ada pembuluh
darah atau saraf mielin. Limbal Epitel Stem Cells (LESCs) berada dalam suatu lingkungan
mikro 3D khusus, dilindungi secara fisik dari permukaan dengan berada jauh di dalam
struktur yang disebut Limbal Crypts (LC)3, yang merupakan lembah yang terbentuk antara
pegunungan stroma. Sebagian besar LC terletak di daerah superior dan inferior dari limbus di
mana sel-sel yang diberikan perlindungan tambahan dari kelopak mata4.
2. Defisiensi Stem Cell Limbal
Luka pada permukaan kecil kornea umumnya sembuh dengan baik di mata sehat. Dalam
kasus di mana LESCs terganggu atau hilang, namun, pertumbuhan epitel konjungtiva
melampaui penghalang limbal, menggantikan epitel kornea dengan lapisan buram yang tidak
teratur dan pendarahan berat, kondisi yang menyakitkan yang mengarah ke kehilangan

penglihatan. Limbal Epitel Stem Cell Deffisiensi (LESCD) dapat menjadi hasil dari
kerusakan mata akibat trauma fisik, terbakar atau trauma kimia, kelainan genetik, seperti
yang terlihat di aniridia umumnya disebabkan oleh hilangnya fungsi gen PAX6 5 atau penyakit
lain seperti autoimun sindrom Stevens-Johnson1,6
3. Perawatan untuk Defisiensi Stem Cell Limbal
Cangkokan dari LESCs dapat diterapkan ke permukaan kornea untuk mengobati pasien
dengan LESCD. Untuk mempersiapkan kornea sebelum menempatkan graft dan untuk
meningkatkan kemungkinan bertahan hidup graft, permukaan kornea harus diperbaiki oleh
penghapusan konjungtiva dari dasar luka kornea dan peradangan harus dikendalikan sebelum
melanjutkan LESCs. Stem sel donor kemudian melekat pada depan mata dan sel-sel dapat
diterapkan secara langsung sebagai cangkok jaringan atau setelah ekspansi in vitro. LESCs
dapat diterapkan selembar sel, atau disusun atas perancah yang dicangkokkan ke permukaan
mata dengan sel terpasang. Human Amnion Membran (HAM) dan fibrin keduanya biasa
digunakan sebagai perancah untuk memberikan LESCs ke permukaan kornea di klinik. 7,8
HAM dibuat dari jaringan disumbangkan setelah operasi caesar. Telah banyak digunakan
sebagai pembawa untuk cangkok sel induk limbal karena menyediakan perancah yang efisien
untuk pembenihan sel dan memiliki sifat biologis yang bermanfaat lainnya termasuk antiinflamasi, anti-mikroba, anti-fibrosis, anti-jaringan parut, dan imunogenisitas rendah, seperti
baik sifat mekanik baik.
4. Kerugian untuk Strategi Pengobatan sekarang
HAM adalah variabel yang sangat biologis9 dan sering terjadi dimana cangkok untuk
transplantasi pasien harus dibuang karena kurangnya pertumbuhan sel induk epitel limbal di
permukaan. HAM juga memiliki potensi untuk membawa infeksi, dan harus menjalani
skrining sebelum digunakan, dan, dengan demikian, adalah sub-optimal untuk terapi sel Good
Manufacturing Practice (GMP) kepatuhan. Sebuah pengganti biomimetik untuk HAM akan
mengatasi kebutuhan klinis belum terpenuhi dan meningkatkan ketersediaan pengobatan,
karena pasokan dari HAM sesuai diproses terbatas. gel fibrin menyediakan substrat alternatif
yang baik untuk pertumbuhan sel induk epitel limbal dan dapat digunakan sebagai pembawa
untuk sel cangkok. Namun, laju degradasi mereka harus dikontrol ketat dengan penambahan
anti-fibrinolitik.10

5. Persyaratan untuk Carrier Sel Sukses

Sifat penting dari pembawa sel termasuk epitel (human limbal epitel) budaya optimal dan
lampiran ke permukaan harus mampu melekat pada kornea dengan jahitan atau lem fibrin dan
sekali di mata itu baik harus diserap, meninggalkan sel-sel melekat dengan baik (fibrin) atau
menjadi transparan di situ (HAM). Yang paling penting, adalah penting bahwa pembawa
tidak melakukan reaksi inflamasi di permukaan kornea yang mungkin memicu jaringan parut
dan kabut asap di stroma. Lokasi dimana permukaan mata rusak, penggunaan perancah
seperti HAM dengan cukup kekuatan mekanik dapat membantu untuk menstabilkan
permukaan mata, serta bertindak sebagai kendaraan pengiriman untuk terapi sel induk. Sel
cangkok dapat dari asal limbal dan autologous atau alogenik. Autologus adalah lebih dan
mungkin jika satu mata yang sehat tetap tetapi sel alogenik diperlukan dari donor yang cocok
jika kerusakan bilateral tanpa meninggalkan limbus sehat untuk autograft. Selain itu, cangkok
sukses dibuat dari sumber sel induk lainnya, terutama dari epitel mukosa mulut.11
6. Sel Alternatif Carrier untuk Transplantasi
Selain HAM dan fibrin, banyak biomaterial dan polimer sintetik telah dikembangkan dengan
tujuan untuk membuat jaringan setara perancah untuk memberikan sel induk dan untuk
perbaikan permukaan di kornea. Ini termasuk keratin, serat sutra, hidrogel chitosan, 12 lensa
kontak siloxanehydrogel, thermo polimer reversibel 13 dan perancah nanofibre, baru-baru ini
ditinjau oleh Dia dan Yiu14 dan Feng et al.15 Selain alternatif ini, Extra Cellular Matrix (ECM)
berdasarkan rancahan dapat bertindak sebagai substrat yang cocok untuk teknik jaringan
karena sifat yang melekat mereka biokompatibilitas penguraian. Kolagen adalah protein
ECM paling berlimpah dalam tubuh manusia, memberikan dukungan struktural dan kekuatan
untuk berbagai jaringan. Secara khusus, tipe I kolagen adalah kolagen yang paling melimpah
dari kornea, dan ultrastruktur kolagen sangat terorganisir sangat penting dalam memberikan
dukungan struktural dan transparansi ke jaringan. Kolagen tipe I telah digunakan secara luas
dalam aplikasi teknik jaringan akibat kelimpahan, kemudahan ekstraksi dan kemampuan
beradaptasi untuk beberapa aplikasi.16 Kami jelaskan di sini upaya kami selama enam tahun
sebelumnya untuk mengembangkan berbasis kolagen jaringan pendekatan teknik baru yang
berlaku untuk pengobatan cacat kornea di kedua epitel dan endotel.

Scaffolds
Keratin

Silk fibroin

Siloxane
hydrogel

Advantages
good transparency;
good mechanical strength;
good availability
non-immunogenic;
degrades in vivo;
biocompatible;
good transparency;
good mechanical strength;
well characterised (already used as a suture material);
good surface for hLE cell expansion in vitro
good mechanical properties
good transparency
well characterised (already used as contact lenses)
good surface for hLE cell expansion in vitro
clinical data is encouraging

Disadvantages
limited elasticity;
no in vivo data;
no data regarding clinical efficacy;
cannot incorporate cells within

costly to produce;
no data regarding clinical efficacy;
cannot incorporate cells within

cannot incorporate cells within

Tabel 1. Ringkasan keuntungan dan kerugian dari berbagai perancah alternatif untuk
transplantasi.

Table 1. Cont.
Scaffolds

Fibrin

Advantages
good mechanical properties;
degrades in vivo;
good surface for hLE cell expansion in vitro;
clinical data is encouraging;
could potentially be an autologous therapy

Thermo
reversible
polymers

good surface for hLE cell expansion in vitro;

simple process to harvest hLE cell sheet

Nanofibre
scaffolds

good mechanical properties;

good transparency;
good surface for hLE cell expansion in vitro;
may degrade in vivo

Chitosan
hydrogels

well characterised (already used as wound dressing);

good mechanical properties

Disadvantages
reported transparencies vary;
risk of disease transmission;
cannot incorporate cells within;
some evidence to suggest that hLE
differentiation is promoted on fibrin
hLE must be transplanted as a sheet,
surgically complex;
cannot incorporate cells within
no data regarding clinical efficacy;
mechanical properties may change
throughout hLE culture period;
cannot incorporate cells within
limited transparency;
cannot incorporate cells within;
methods used to improve mechanical
properties may increase cytotoxicity

7. Compressed Collagen Plastic

Jenis seluler I kolagen hidrogel sebelumnya telah digunakan sebagai substrat 3D untuk kultur
sel dan penciptaan model kornea. Namun, karena mereka terdiri dari proporsi tinggi air
mereka secara intrinsik lemah kecuali dimodifikasi dengan silang kimia atau dicampur
dengan polimer lain untuk membuat komposit kolagen, mencegah penyemaian langsung dari
sel-sel di dalam perancah.17-19 Untuk mengatasi masalah ini, Brown dan rekannya
mengembangkan metode baru kompresi plastik kolagen tipe I hidrogel dengan menerapkan
teknik rekayasa sederhana seperti beban mekanis eksternal dan aliran fluida kapiler (Paten
nomor WO2012004564).20,21 Gel kolagen Hyperhydrated terdiri dari mesh fibril kolagen
mendukung volume besar cairan yang berlebihan (99%). Hidrogel diproduksi dengan
menetralkan campuran asam asetat berdasarkan jenis tikus-ekor I kolagen dan 10 menengah
pokok minimum (termasuk sebagai indikator pH dan untuk memastikan kekuatan ionik
fisiologis untuk kompatibilitas sel dan pembentukan fibril kolagen standar) dengan natrium
hidroksida. Cair kemudian dilemparkan ke dalam cetakan dan set / stabil pada 37 C. Dalam
metode mereka, hidrogel ini diuji dengan tekan bebas dengan menempatkan gel di atas
serangkaian nilon dan stainless steel jerat dan blotting kertas filter dengan penambahan beban
(Gambar 2A). Fitur utama dari proses ini adalah bahwa pengusiran cairan ini tidak kembali
pada penghapusan beban, maka hidrogel mengalami kompresi plastik (PC) secara bebas.
Salah satu keuntungan utama dari metode ini adalah bahwa sel-sel dapat diunggulkan ke
dalam tubuh hidrogel sebelum kompresi dan karena produksi unggulan scaffold sel
ultrarapid, mengambil hanya beberapa menit dan tanpa kehilangan viabilitas sel. Penggunaan
plastik dikompresi kolagen sebagai substrat / perancah telah diusulkan untuk aplikasi teknik
jaringan banyak, termasuk tulan22, kulit23, saraf24, kandung kemih25, dan mikrovaskuler
endothelium.26

Gambar 2. Evolusi prosedur RAFT rekayasa jaringan. (A) Skema diagram proses kompresi
plastik asli dengan penerapan beban untuk tekan bebas dan aliran fluida ke bawah; (B)
Terbatas kompresi dalam piring dengan baik dengan aliran ke atas pada penerapan beban; (C)
proses RAFT sekarang dengan wicking lembut cairan ke HPAs secara terbatas tanpa
penambahan beban yang signifikan.

Kami eksploitasi metode Brown untuk menghasilkan substrat baru untuk ekspansi sel hle dan
stratifikasi menjadi setara kornea epitel jaringan (TE). 27 Kolagen tipe I hidrogel menjadi
sasaran proses PC seperti yang terlihat pada Gambar 2A. Dalam rangka untuk menentukan
pentingnya ke lapisan epitel sel stroma terkait erat, kami membandingkan konstruksi acellular
dengan yang mengandung fibroblast limbal manusia (hLFs) dalam tubuh konstruk, meniru
HLF dihuni anterior stroma kornea. Sel-sel ini dicampur langsung ke dalam larutan hidrogel
kolagen sebelum menetapkan dan kompresi. sel hle kemudian unggulan ke permukaan
konstruksi dan memungkinkan untuk memperluas dan stratifikasi selama tiga minggu. Yang
dihasilkan epitel kornea TE ditampilkan banyak karakteristik dari epitel kornea manusia. Ini
termasuk organisasi morfologi khas sel basal cuboidal dengan tingkat tinggi penanda sel
induk diduga (p63) ekspresi, sel-sel superfisial skuamosa dengan tingkat tinggi ekspresi
CK3 dan ruang bawah tanah yang sesuai deposisi protein membran. The HLF mengandung
konstruksi yang ditampilkan biomimicity meningkat menunjukkan interaksi antara HLF dan
hle sel. Tes yang dihasilkan memberikan model ideal untuk mempelajari interaksi-sel sel

dalam kornea anterior dan membuat langkah-langkah menuju pengembangan alternatif yang
cocok untuk HAM untuk transplantasi sel hle untuk perbaikan permukaan mata.
Meskipun teknik ini dipenuhi banyak kriteria untuk substrat alternatif yang sukses untuk
HAM termasuk kemudahan dan kecepatan persiapan dan transparansi relatif ada kelemahan
utama yang terkait dengan metode ini karena sifat unconfined dari proses kompresi. Ini
berarti bahwa kehilangan cairan tidak terkendali dan, dengan demikian, prosedur praktis
berantakan dan, dengan demikian, tidak mematuhi standar GMP ketat diperlukan untuk
produksi terapi sel. Kedua, dalam format ini metode ini sulit untuk meningkatkan untuk
memudahkan produksi beberapa konstruksi, oleh karena itu, kami pergi ke memodifikasi
proses untuk membuat langkah-langkah menuju kepatuhan GMP dan skalabilitas.
8. Proses Awal RAFT
Bekerja sama dengan UKM (usaha kecil dan menengah; TAP Biosystems), kami
mengembangkan apa yang sekarang kita sebut sebagai Arsitektur Nyata Untuk 3D Jaringan
(RAFT) proses modifikasi ekstensif proses PC asli dari metode penelitian buatan tangan
variabel20 ke, proses diulang ditingkatkan cocok untuk aplikasi klinis. 28 Perbedaan antara tiga
literasi dari proses dirangkum dalam Tabel 2. Proses asli unconfined compression (UC) tidak
dikontrol ketat dan karena itu tidak kompatibel untuk digunakan dalam fasilitas bersih GMP.
Secara khusus, proses ini memiliki potensi yang lebih besar untuk produksi aerosol dan
partikulat, yang tidak ideal untuk GMP pendekatan compliant. Selain itu, produk akhir
memiliki dimensi yang tidak konsisten karena kehilangan cairan dalam berbagai arah. Untuk
mengatasi masalah ini, campuran hidrogel kolagen dilemparkan, menetapkan dan dikompresi
dengan cara terbatas menggunakan kaset custom-made atau format piring 12-baik (Gambar
3A, B). modifikasi yang terlibat perubahan ke arah penghapusan cairan ke salah satu aliran ke
atas menggunakan filter kertas penyerap digulung dan elemen blotting lainnya ditempatkan
pada permukaan atas hidrogel kolagen selama 15 menit pada suhu kamar (Gambar 2B dan
Tabel 2). Sebagai berat diterapkan, hidrogel masih menjalani kompresi tapi kali ini adalah
confined compression (CC), yang mengurangi risiko aerosol dan partikulat produksi. Berikut
kompresi, RAFT Tes siap dalam format kepingan atau kaset individu untuk analisis langsung
atau budaya sel berikutnya. Ini mengurangi risiko TES RAFT yang rusak selama penanganan
atau transfer dari satu kapal ke yang lain seperti yang diperlukan untuk metode PC asli.

Tabel 2. Ringkasan tiga iterasi protokol rekayasa jaringan kami.

Compression with load

Compression with load

Fluid removal
direction
Downward
Upward

Confined or
unconfined
Unconfined
Confined

Absorption

Upward

Confined

Iterations

Fluid removal method

Plastic compression
Early RAFT
Late RAFT

Absorbent material
Filter paper
Filter paper
Hydrophilic porous absorber

Gambar 3. Evolusi dari perangkat keras proses RAFT. (A) kaset individu untuk metode
kompresi ke atas terbatas; (B) gulungan kertas dan bobot yang digunakan untuk 12 piring
dengan baik metode kompresi terbatas menggunakan aliran ke atas; (C) yang tersedia secara
komersial RAFT kit termasuk reagen, piring dan piring pemanas (gambar dicetak ulang
dengan izin dari TAP Biosystems); piring array (D) 24-sumur HPAs.
Kami menyelidiki apakah modifikasi ini (dari UC ke CC) mempengaruhi sifat TES RAFT
dan kemampuan mereka untuk bertindak sebagai substrat untuk budaya sel hle. 28
Perbandingan Tes RAFT siap dengan baik UC atau CC mengungkapkan tidak ada perbedaan
morfologi sel hle atau fenotipe. sel hle tetap kecil dalam ukuran dengan karakteristik batu
morfologi dan dinyatakan diduga p63 stem cell marker dan dibedakan penanda sel epitel
CK15. Sel juga menyatakan fitur yang mirip dengan matang epitel kornea manusia (CK3).
Tidak ada perbedaan signifikan dalam sifat transmisi cahaya, penanganan dan viabilitas sel
TES RAFT diproduksi menggunakan UC dan proses CC. Ketebalan TES RAFT adalah satusatunya parameter yang berbeda, dengan substrat tebal yang dihasilkan oleh proses UC.
Namun, perubahan dalam properti ini tidak mempengaruhi fungsi dari RAFT TES sebagai
substrat untuk kultur sel hle dan dianggap karena kekuatan wicking meningkat dalam proses
CC mengakibatkan kehilangan cairan lebih besar dan TE tipis. Yang penting, ketebalan TES
RAFT diproduksi dengan CC konsisten, tidak seperti HAM, yang bervariasi mulai 20-130
m.29-31

Kami juga dijelaskan penggunaan pertama dari tes RAFT, disusun dengan menggunakan CC,
berhasil mendukung budaya sel primer manusia kornea endotel (hCECs) selain jalur sel
endotel kornea.32 Kebutaan kornea yang disebabkan oleh lapisan endotel disfungsional
sebelumnya dirawat oleh operasi penggantian kornea ketebalan penuh tetapi kemajuan
terbaru dalam teknik bedah memungkinkan penggantian hanya lapisan endotel yang terkena.
Salah satu contohnya adalah pengganti dari endothelium yang rusak dengan Descemet
Membran Endotel Keratoplasty (DMEK) graft ini, teknik yang memberikan lapisan sel
endotel yang sehat melekat hanya pada lapisan DM halus diperoleh dari kornea donor.33
Namun, saat ini ada kekurangan donor di seluruh dunia dari kornea kualitas klinis yang
sangat meningkatkan pasien menunggu waktu untuk prosedur tersebut dan ini telah
menyebabkan minat yang besar dalam pengembangan pendekatan-pendekatan teknik jaringan
alternatif untuk mengobati cacat kornea seperti. 34 hCECs dikultur pada TES RAFT
mempertahankan karakteristik endotel mereka, yang tersisa kecil dan dengan batu morfologi
dan menyatakan ZO-1 dan Na + / K + ATPase; spidol biasanya digunakan untuk identifikasi
hCECs. Mereka juga mudah untuk menangani dan menunjukkan kekuatan mekanik yang
cukup untuk pengiriman ke ruang anterior dari ex vivo babi mata, menunjukkan kesesuaian
untuk transplantasi. Pendekatan ini memiliki potensi besar untuk meningkatkan praktek klinis
karena hanya satu kornea donor manusia diperlukan untuk mendapatkan jumlah yang
memadai hCECs untuk mengobati beberapa pasien, tidak seperti ketebalan atau DMEK
penuh cangkok dijelaskan sebelumnya bahwa memerlukan satu donor per penerima.
Keuntungan dari proses RAFT CC termasuk sederhana, produksi cepat beberapa tes dengan
variasi yang terbatas, serta membuat kemajuan yang cukup terhadap kepatuhan GMP.
Penggunaan kaset individu adalah ideal untuk persiapan cangkok pasien untuk transplantasi
karena ketiga unsur manufaktur, kultur sel, dan transportasi TE ke teater dilakukan dalam
kapal yang sama. Penggunaan tersedia secara komersial piring multi-baik untuk melakukan
proses RAFT membuat pendekatan yang menarik untuk pengujian farmakologi zat pada
beberapa tes. Hal ini juga memungkinkan proses untuk ditingkatkan menjadi 24-baik dan 96baik format piring, lebih lanjut mengurangi waktu persiapan tanpa mengorbankan reproduksi.

9. Peningkatan Good Manufacturing Practice Kompatibilitas dari RAFT

produk terapi sel harus diproduksi dalam laboratorium Cleanroom khusus sesuai dengan
GMP.35 Pertimbangan tertentu di sekitar desain peralatan dan proses yang digunakan dalam
GMP memproduksi antara lain meliputi; proses manufaktur harus direproduksi, waktu
efektif, menghasilkan produk akhir yang konsisten dan menggunakan peralatan yang
kompatibel dengan penggunaan Cleanroom dan metode pembersihan. Proses ini juga harus
mencakup

langkah-langkah

untuk

mencegah

kontaminasi

mikroorganisme,

seperti

penggunaan sekali pakai reagen, bahan shedding permukaan halus dan rendah partikel, dan
tidak harus risiko hadir untuk pasien melalui transmisi agen adventif. 35,36 Oleh karena itu,
proses RAFT kami sebelumnya bahkan lebih dimodifikasi ke bentuk yang tersedia secara
komersial saat ini dengan pertimbangan GMP atas dalam pikiran.
Yang tersedia secara komersial RAFT kit dilengkapi dengan protokol divalidasi yang mudah
digunakan dan 37 C piring pemanas untuk pengaturan hidrogel standar dan pembentukan
TE (Gambar 3C). Seluruh proses ini kuat, direproduksi dan memungkinkan untuk pembuatan
beberapa TES RAFT konsisten. Proses ini cepat; dari awal set-up ke generasi RAFT TE
mengambil sesedikit 90 menit yang merupakan atribut menguntungkan untuk pembuatan
GMP. Hal ini karena untuk mematuhi pedoman kesehatan dan keselamatan, operator yang
ditunjuk waktu proses maksimum. Selain itu, manufaktur GMP kelas secara inheren mahal
sehingga setiap pengurangan biaya fasilitas adalah lebih baik.
Casting hidrogel kolagen di piring juga tersedia secara komersial tetap konsisten dengan
iterasi sebelumnya dari metode ini. Namun, alih-alih proses CC, proses wicking lembut
digunakan dimana air diserap melalui aksi aliran kapiler ke atas ke peredam berpori hidrofilik
(HPAs) (Angka 2C, 3D dan Tabel 2). Oleh karena itu, proses ini tidak lagi salah satu
kompresi karena tidak ada beban yang signifikan ditambahkan, hanya berat minimal HPA itu
sendiri; cairan yang hilang melalui penyerapan lembut saja. Ini penahanan meminimalkan
lanjut risiko kontaminasi cairan sesuai dengan persyaratan GMP. Selain itu, penyederhanaan
prosedur yang diberikan oleh penggunaan HPAs pakai dan penghapusan re-useable bobot,
lebih tepat untuk pengolahan di lingkungan GMP.
The HPAs yang diproduksi dari polimer disinter berpori dan mengandung ukuran pori standar
dioptimalkan untuk secara efisien menyerap cairan. Selain itu, HPA bahan polimer yang nonpartikel karena penumpahan meminimalkan risiko kontaminasi potensial. Proses pencetakan
menghasilkan HPAs dari ukuran standar (kompatibel dengan 24-baik dan 96-baik piring) dan

memungkinkan untuk direproduksi RAFT ukuran TE setiap aplikasi (Gambar 3D). The HPAs
dipasok steril dan dikemas secara individual untuk memberikan fleksibilitas dalam
memproduksi jumlah TES diperlukan tanpa pemborosan bahan. The RAFT piring pemanas
telah dirancang dengan footprint kecil untuk muat melalui menetas Cleanroom dan di dalam
lemari keamanan hayati, dan juga mengandung permukaan yang halus untuk memungkinkan
pembersihan efisien. Format piring 96-baik, tersedia dalam varietas yang jelas dan hitam
dipercaya, memungkinkan untuk berbagai aplikasi dan produksi beberapa TES RAFT per sesi
manufaktur. reagen yang disediakan untuk aplikasi seperti itu, misalnya, kolagen tipe I,
menetralkan solusi dan 10X MEM, dirancang untuk "sekali pakai" hanya untuk mencegah
risiko kontaminasi potensial yang ditimbulkan melalui manipulasi aliquoting dan
penyimpanan. Pertimbangan penting dalam pengembangan reagen RAFT adalah untuk
memastikan kepatuhan terhadap undang-undang Uni Eropa pada penggunaan bahan hewani
yang diturunkan selama GMP pembuatan.35,36 Bahan biologis bersumber mungkin berisiko
melalui transfer agen adventif seperti bakteri, virus atau prion, karena undang-undang
menyatakan bahwa bahan-bahan tersebut harus hati-hati risiko-dinilai termasuk bagaimana
mereka menunjukkan kepatuhan dengan kontrol yang ditentukan. Jenis RAFT I kolagen telah
mengalami penilaian risiko tersebut dan telah diklasifikasikan "Menular ensefalopati
spongiform (TSE) compliant", di mana risiko penularan agen TSE penyebab diabaikan
karena sumber hewan dari ternak tertutup dan dari negara dengan Bovine diabaikan
ensefalopati spongiform (BSE) risiko. Sehubungan dengan kekhawatiran kontaminasi virus
dan bakteri yang potensial, kawanan disaring, bersertifikat bebas dari penyakit menular dan
diklasifikasikan layak untuk dikonsumsi manusia. reagen kolagen sendiri dilengkapi dengan
dokumentasi mutu untuk menunjukkan negara hewan asal, kepatuhan TSE dan spesifikasi
produk, yang semuanya dokumentasi yang diperlukan untuk bahan yang terlibat dalam
pembuatan GMP. Setiap bagian komponen dari proses RAFT telah dinilai dan kriteria GMP
penting telah dipertimbangkan pada setiap tahap perkembangan.
10. Menciptakan Limbal Epitel Stem Cell Niche Menggunakan RAFT
Kami sebelumnya telah menggunakan sistem RAFT untuk membuat TES kornea sentral
relatif sederhana tetapi fleksibilitas dari sistem HPA memungkinkan kita untuk juga membuat
beberapa fitur dari hLESC niche kompleks. Kemampuan untuk merancang dan insinyur
relung sel induk buatan telah memungkinkan peneliti untuk menyederhanakan unsur
lingkungan yang kompleks untuk studi in vitro dan juga untuk memaksimalkan potensi terapi
sel induk untuk strategi perbaikan. Seperti dijelaskan sebelumnya, LESCs berada di dasar

dari LC dalam posisi dilindungi secara fisik terutama di daerah superior dan inferior dari
limbus3 dan jadi kami berhipotesis bahwa kultur sel-sel dalam rekreasi yang lingkungan fisik
bisa meningkatkan potensi hLESC . Dengan mempelajari LC asli di kornea manusia, kita
dapat menentukan dimensi rata-rata dari LESC diisi struktur stroma, yang sekitar 110 m dan
lebar 70 m yang mendalam. Metode pencetakan pembuatan HPAs memungkinkan topografi
permukaan yang akan dimasukkan ke dalam permukaan HPA yang akan menghubungi gel
kolagen. Kami menciptakan HPAs bergerigi (RHPAs) dengan mikro-punggung dari berbagai
lebar dan kedalaman (100-250 m; Gambar 4A) untuk menentukan ukuran yang paling cocok
untuk membuat fitur di RAFT TE permukaan yang akan meniru LC asli. Kami menetapkan
bahwa RHPAs dengan 175 m mikro-punggung akan membuat diabadikan buatan limbal
(BLCs) dari dimensi yang diinginkan dan menciptakan HPAs dengan pegunungan di seluruh
permukaan (Gambar 4B). The BLCs tetap stabil dalam budaya (Gambar 4C) dan di hadapan
hLFs di bagian stroma dari RAFT TE dan dengan hLECs pada permukaan. 37 Sel garis kornea
manusia dihuni BLCs (Gambar 4D) dan hLECs juga berlapis-lapis untuk mengisi BLCs
dengan sel di dasar mengekspresikan penanda LESC diduga serta protein membran basement
yang tepat. Menariknya, hLFs di bagian stroma dari RAFT TE selaras dan memanjang
sepanjang panjang BLCs (observasi tidak dipublikasikan), yang meniru susunan sel-sel
stroma di wilayah ini dekat dengan LC asli.

Gambar 4. Penciptaan diabadikan limbal buatan menggunakan RAFT. (A) SEM citra dasar
dari RHPA menunjukkan microridges; (B) Base HPA (kiri) dan RHPA (kanan); (C) BLCs
dibuat di permukaan RAFT TE diisi dengan mikrosfer neon; (D) Manusia kornea sel garis sel
epitel diwarnai dengan hematoksilin dan eosin mengisi BLC di RAFT TE. Skala bar: (A, C),
100 m; (D), 50 m.
Menggunakan sistem RAFT kita dapat dengan cepat dan andal menciptakan struktur fisik 3D
dari niche LESC hanya dalam 90 menit, perbaikan pada pendekatan lebih panjang lainnya. 38,39
Meniru unsur niche, akan memungkinkan peneliti untuk mempelajari sel-sel dan interaksi sel-

matriks di lingkungan yang lebih biomimetic dan berpotensi meningkatkan peluang

keberhasilan terapi berdasarkan sel dengan pemeliharaan populasi sel induk kritis.
11. Aplikasi Klinis dari RAFT
Tujuan utama dari penelitian kami adalah untuk mengobati pasien yang menderita LESCD.
Sementara ini selalu menjadi pertimbangan selama pengembangan proses RAFT, agar
berlaku secara klinis, pertimbangan lebih lanjut harus dilakukan. "Standar emas" substrat saat
untuk transplantasi LESC adalah HAM,40-42 meskipun kerugian diuraikan sebelumnya. Tes
RAFT yang direproduksi, cepat untuk memproduksi, tidak memerlukan pemeriksaan yang
mahal diperlukan untuk jaringan manusia dan andal mendukung pertumbuhan sel hle in
vitro,27,37 semua bukti yang mendukung penggunaan TES RAFT lebih HAM untuk perbaikan
permukaan mata.
Selama proses pengembangan RAFT, fokus awal adalah untuk mengoptimalkan pertumbuhan
sel hle pada permukaan kolagen, sebagai lawan untuk mengakhiri kebutuhan pengguna
seperti ketebalan, transparansi dan kekuatan. Ketebalan substrat penting agar tidak
menyebabkan ketidaknyamanan kepada penerima atau mempersulit prosedur bedah.
Demikian pula, transmisi cahaya penting untuk menyediakan penerima dengan sebaik
mungkin ketajaman visual pasca transplantasi. Meskipun Tes RAFT kolagen dapat
mengalami beberapa tingkat degradasi pasca transplantasi, saat ini kami tidak memiliki data
in vivo untuk mendukung ini, transparansi sehingga optimal dari awal yang diinginkan.
Akhirnya, tes RAFT harus memiliki kekuatan mekanik yang cukup untuk menahan
penanganan dan lampiran ke mata menggunakan lem fibrin atau serupa.
Satu keuntungan besar dari RAFT proses produksi TE adalah bahwa hal itu mudah
digunakan. Karena konsentrasi dan volume kolagen digunakan untuk menghasilkan hidrogel
dapat bervariasi, RAFT tes dengan berbagai sifat dapat diproduksi setelah penyerapan cairan
menggunakan HPAs. Tes RAFT dapat diproduksi yang memiliki ketebalan mulai dari sekitar
50 pM untuk lebih dari 400 m. transmisi cahaya pada 550 nm (tengah rentang panjang
gelombang terlihat) melalui TES RAFT dapat melebihi 80%. Sementara di bawah
ketegangan, RAFT TE istirahat tekanan yang sebanding dengan HAM. HAM sudah
ditetapkan sebagai substrat, meskipun sub-optimal, untuk transplantasi LESC dan kami telah
menunjukkan bahwa tes RAFT ketebalan sebanding, transparansi dan kekuatan dapat
diproduksi, tetapi dengan keuntungan tambahan seperti diuraikan di atas. Selain itu, tidak

seperti HAM, tes RAFT menampilkan bentuk memori, yang dapat memudahkan pengiriman
bedah ke permukaan mata.
Seiring dengan RAFT TE substrat, sel-sel itu sendiri harus sesuai dengan tujuan. Advanced
Terapi Produk Obat (ATMP), ini biasanya ditentukan dengan menggunakan standar acuan
atau uji potensi. Sebuah standar acuan menyediakan pembanding dengan yang semua batch
yang diproduksi dapat dibandingkan untuk mengkonfirmasi bahwa proses manufaktur adalah
melanjutkan sebagaimana dimaksud / diperlukan. Untuk tes RAFT, kami telah menunjukkan
bahwa ukuran hle sel, morfologi, diduga penanda sel induk ekspresi (p63) dan kemampuan
untuk membentuk epitel berlapis dapat digunakan sebagai bagian dari standar acuan. 43
Sebuah korelasi antara ekspresi p63 dan hasil klinis juga telah disarankan oleh orang lain, 44
lanjut mendukung penggunaan ekspresi p63 sebagai bagian dari standar acuan. Ketika
memproduksi pengobatan autologus, ini dapat menjadi kompleks karena hanya jumlah
terbatas dari sel yang tersedia, tetapi dengan mengamati sel hle selama budaya menggunakan
mikroskop cahaya, kemajuan dapat dinilai dengan menggunakan metode non-destruktif
sederhana. Sepanjang periode kultur budaya individu pada RAFT TES dapat dibandingkan
dengan gambar mikroskop cahaya dari standar acuan untuk penilaian confluency. Di luar ini,
alat tes potensi menyediakan sarana menguji fungsi dari ATMP. sel hle pada RAFT harus
berfungsi untuk melindungi stroma yang mendasari dengan mempertahankan penghalang
terus menerus. Untuk menguji fungsi sel hle, kami menggunakan dua rezim melukai: remover
Algerbrush II cincin kornea karat untuk menghasilkan 1 mm stripe cacat; 43 dan kertas cakram
Heptanol-direndam untuk menghasilkan lebih besar 20 mm2 melingkar cacat. 45 Kami
menemukan bahwa sel-sel hle di RAFT yang andal mampu menutup cacat stripe, meskipun
ekspresi p63 menurun berikut melukai.43 Hal ini penting karena ini memberikan bukti
bahwa sel-sel hle yang cukup ampuh untuk secara klinis berguna. Kami juga menilai dampak
dari kehadiran hLFs pada fungsi sel hle dan juga dampak menerbangkan menggunakan
Heptanol melukai rezim. Kami menemukan bahwa hLFs tidak meningkatkan potensi sel hle
sehubungan dengan melukai (meskipun hLFs jangan memberikan manfaat lain untuk
melapisi lapisan sel hle seperti yang dijelaskan sebelumnya). Namun, kami menemukan
bahwa sel-sel hle dalam epitel berlapis ditampilkan fungsi sel berkurang dibandingkan
dengan sel-sel di lapisan tunggal, membawa kita untuk percaya bahwa transplantasi dari
monolayer sel hle pada TES RAFT akan menjadi pendekatan optimal.45

12. Ringkasan
penyakit kornea dan gangguan adalah penyebab kebutaan pada lebih dari 10 juta orang di
seluruh dunia. Kurangnya jaringan donor yang cocok telah menyebabkan meningkatnya
minat dalam pengembangan strategi rekayasa jaringan untuk membangun jaringan lapisan
setara kornea untuk menggantikan daerah yang rusak. Di sini kita telah menggambarkan
perkembangan proses rekayasa jaringan RAFT kami yang bertujuan untuk mengatasi masalah
ini sangat. Proses RAFT akhir kami sangat jauh dari proses kompresi plastik asli, yang
diperlukan enam komponen. Setelah modifikasi dari metode penghapusan aliran, arah,
penahanan, dan material penyerap proses tersebut sekarang hanya membutuhkan satu
komponen, HPA, untuk mengubah hidrogel kolagen hyperhydrated menjadi substrat mekanis
stabil untuk pertumbuhan sel. Penyederhanaan ini metode berarti bahwa kita mampu untuk
mengambil langkah-langkah yang cukup terhadap kepatuhan GMP dan penerapan klinis.
Kami telah menunjukkan bahwa metode ini cocok untuk produksi kedua kornea epitel dan
endotel TES yang mungkin cocok untuk transplantasi. Selanjutnya, sifat merdu dari metode
produksi HPA memungkinkan kita untuk membuat topografi permukaan di tes dengan cepat
dan andal menciptakan LESC fitur niche, LC kornea. Hal ini akan memungkinkan para
peneliti untuk mempelajari sel sel dan sel-matriks interaksi dari niche LESC menggunakan
biomimetic lebih dalam model vitro. Kami telah mengambil proses penelitian dasar dan
disempurnakan untuk digunakan translasi sehingga memiliki potensi untuk disampaikan
kepada pasien untuk mengobati gagal permukaan mata dalam dua tahun ke depan.