Discusin

Se obtuvo una muestra de la cepa W3350 de E. coli y se centrifug para

separar del cultivo de caldo L. El sobrenadante se suspendi en TE pH
7.8 para eliminar los restos de clulas muertas. Se centrifugo de nuevo y
se eliminaron los restos celulares, se resuspendi en TE, agitndose en
vortex para separar todas las clulas y asi aumentar la superficie de
contacto, la solucin de TE pH 7.8 tambien sirve para proteger a las
RNAsas que se agregaran en el siguiente paso, ya que le porporcionan al
medio las condiciones adecuadas para que estas acten sobre el RNA y
se permita la purificacin del DNA.
Despus de agregar RNAsa se dejo incubar para que esta actuara sobre
el RNA que hay fuera de las clulas, posteriormente se agrego lisozima y
SDS para romper la pared celular y la membrana respectivamente. La
lisozima actua rompiendo el enlace 14 Glucosdico de la pared
celular, mientras que el SDS solubiliza los lpidos de la membrana, y asi
con ambos compuestos se lleva a cabo la lisis celular.
En este paso hubo un aumento en la viscosidad de la solucin, debido a
que se lisaron las clulas y el material gentico quedo expuesto y una de
las caractersticas de DNA es que presenta una alta viscosidad debido a
que se trata de una molcula muy larga y rgida.
Posteriormente se agrego TE con una concentracin menor a la inicial ya
que este se utiliz para solubilizar al DNA y facilitar su extraccin.
Tambin se agrego cloruro de sodio, este con la finalidad de
desproteinizar la muestra.
Posterior a esto se agrega fenol a la solucin y se agita por inversin
para formar una emulsin, debe de intentar homogenizarse muy bien
antes de que se centrifugue, ya que la finalidad es que ambas partes
interacten y se puedan asi separar en la interfase todas las protenas
ya desnaturalizadas. Se utiliza fenol ya que las protenas no son solubles
en el, adems de que el fenol no solo separa las protenas, sino que las
desnaturaliza.
Se realizaron dos lavados con fenol para eliminar la mayor cantidad de
protenas posibles. Posteriormente se agrego una mezcla de cloroformo:
alcohol isoamlico 24:1, este se agrega para precipitar todo lo que es
soluble en cloroformo, como protenas restantes, lpidos de las
membranas, y el fenol residual. Es importante extraer todo el fenol de la
solucin, ya que este nos puede interferir en estudios posteriores que se
quieran realizar en la muestra de DNA.

Una vez centrifugado lo anterior se extrae la parte acuosa y a esta se le

agrega alcohol absoluto, con la finalidad de precipitar al DNA y poder
obtenerlo mas puro, Se continuara deshidratando con etanol al 70%,
esto para que el agua que se encuentra en la solucin de etanol
solubilice los restos de cloruro de sodio y estos creen una esfera de
solvatacin que ayude a precipitar la mayor cantidad de DNA.
Finalmente la muestra se dej secar, y se le agreg 10 L de agua
inyectable para su posterior lectura en el espectrofotmetro nanodrop,
donde se requiere solo una pequea cantidad de la muestra para
analizar.