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UNIVERSIDAD DE ORIENTE - NCLEO BOLVAR

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICAS

MANUAL DE LABORATORIO
DE BIOQUMICA
Profesores:
Dr. Miguel Basanta

Bioanalista:

MSc. Bit Betancourt

Licda. Lexa Manrique

Dr. Jess Cedeo

Asistentes de

Licdo. Douglas Bermdez

Laboratorio Br. ricka

Licdo. Rafael Gonzlez P

Arias S.

Licda. Zulay Castillo

Br. Jess Alberto Palacios

Licda. Inaydes Salazar


Secretaria:

HORARIO
Das: LUNES a VIERNES
Hora: 9:00 a.m. a 12:00m
Lugar: Laboratorio de Bioqumica

Ciudad Bolvar, Junio 2016

MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

CONTENIDO
PRCTICA 1:
ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES INICAS DE LOS AMINOCIDOS. MTODOS DE
TITULACIN DE LOS GRUPOS FUNCIONALES.....................................................................3
PRCTICA 2:
SALADO" (SALTING OUT) DE PROTENAS, SU APLICACIN EN LA SEPARACIN
Y DETERMINACIN DE ALBMINA Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA
SANGUNEO.............................................................................................................................19
PRCTICA 3:
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA AMILASA SALIVAL................................ 28
PRCTICA 4:
ENZIMOLOGA: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE L-LACTATO: NAD+ OXIDOREDUCTASA EN MSCULO, HGADO Y CORAZN DE ANIMALES DE
EXPERIMENTACIN................................................................................................................42
PRCTICA 5:
METABOLISMO INTERMEDIARIO. EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DEL
GLUCGENO HPATICO........................................................................................................47
PRCTICA 6:
METABOLISMO INTERMEDIARIO. EFECTO DE DL-METIONINA Y DL-ETIONINA SOBRE
EL CONTENIDO DE TRIGLICERIDOS Y COLESTEROL EN HGADO DE RATAS...............56

MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

PRCTICA 1: ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES INICAS DE LOS


AMINOCIDOS. MTODOS DE TITULACIN DE LOS GRUPOS
FUNCIONALES
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el comportamiento cido-base de los aminocidos disueltos en solucin acuosa
mediante la tcnica de titulacin.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Titular un aminocido con una solucin de hidrxido de sodio.
2. Diferenciar un aminocido bsico, cido y neutro de acuerdo a sus pK.
3. Aplicar la ecuacin Henderson-Hasselbalch a los sistemas
amortiguadores fisiolgicos.
4. Explicar la funcin amortiguadora que poseen las protenas.
5. Definir las propiedades qumicas de los aminocidos.
6. Reconocer en los sistemas proteicos, los grupos ionizables responsables de generar
la mxima capacidad amortiguadora tomando como criterio su pK.
7. Analizar el comportamiento de los aminocidos en su pH o punto isoelctrico.

I.

INTRODUCCIN

Todos los aminocidos contienen grupos ionizables que son pares cido-bases
conjugados dbiles conjugados, cada uno con un valor caracterstico de constante de
ionizacin. Esta propiedad cido o base dbiles facilita que los aminocidos puedan ceder o
aceptar protones y as tratar de mantener el pH sin modificaciones significativas (Capacidad
amortiguadora). Dado que en el equilibrio coexisten las formas protonadas con las no
protonadas y debido a que estos grupos actan como amortiguadores, el pH de la solucin
puede calcularse de acuerdo con la ecuacin de Henderson y Hasselbalch (1).

=
+

(1)

Cuando la concentracin del cido (AH) es igual a la concentracin de su base


conjugada (A ), entonces, el pH = pK; siendo el pK, el log 10 negativo de la constante de
ionizacin del grupo ionizable.
El estudio de esta ecuacin permite entender el trmino pK. Cuando la forma protonada
se encuentra en una relacin equimolar con la forma no protonada, se produce la mxima
capacidad amortiguadora. Matemticamente, el pH de mxima amortiguacin va a ser igual
al valor de pK, ya que A-/AH=1; y el log de 1 = 0.

Consideremos como ejemplo la glicina, un aminocido con cadena lateral no polar


(Figura 1). Se observa que posee dos grupos ionizables. El grupo alfa-carboxilo y el grupo
alfa-amino, cuyos valores de pKa = 2,34 y pKb = 9,60, respectivamente.

Fig. 1 Equilibrios cidos-bsicos y formas inicas de los aminocidos en solucin


acuosa. Las especies catinicas (en gris) predominan a pH cido y las especies
aninicas (en azul) predominan a pH bsico (Lozano et al., 2005)

Ejemplo 1 : Disociacin de la glicina


COOH
+

H3N

OH

H
pH cido
Carga=
+1

COO

pKa= 2,34

H3N

OH

H
In
dipolar
Carga= 0

COO
H2N

pKb= 9,60

H
pH
alcalino
Carga= -1

La solucin acuosa de glicina, a pH= 6, existe en forma de In dipolar o Zwiterin, en el


que el grupo alfa-carboxilo no est protonado (COO ) en tanto que el grupo alfa-amino si lo
+
est (NH3 ). Al empezar a agregar cido fuerte a la solucin, el pH desciende rpidamente, y
luego el descenso ser gradual. La titulacin del grupo amino con una base fuerte muestra
un comportamiento similar en la regin alcalina.

A continuacin, durante el trabajo prctico se estudiarn las reacciones de los grupos


ionizables de algunos aminocidos. Se titular hacia la regin bsica y se observarn las
modificaciones del pH de la solucin con la adicin de bases fuertes.

Estos experimentos se realizarn con el objeto de identificar el o los aminocidos


desconocidos a partir de los pK y su pI extrapolados de las curvas de titulacin
correspondientes.
TABLA 1. Valores de los pK de los grupos ionizables de los aminocidos a 25 C
(McKee y McKee, 2013)
Aminocidos
Glicina
Alanina
Valina
Leucina
Isoleucina
Serina
Treonina
Metionina
Fenilalanina
Triptfano
Asparagina
Glutamina
Prolina
Cistena
Acido asprtico
cido glutmico
Histidina
Tirosina
Lisina
Arginina

II.

pK1(COOH)
2,34
2,34
2,32
2,36
2,36
2,21
2,63
2,28
1,83
2,83
2,02
2,17
1,99
1,71
2,09
2,19
1,82
2,20
2,18
2,17

+3

pK2(NH )
9,60
9,69
9,62
9,60
9,60
9,15
10,43
9,21
9,13
9,39
8,80
9,13
10,60
10,78
9,82
9,627
9,17
9,11
8,95
9,04

PKr

8,33
3,86
4,25
6,60
10,07
10,79
12,48

MATERIALES

Equipo general:

pH-metro
Bureta de 50 ml
Soporte para bureta
Piceta con agua
destilada
Papel secante

Reactivos por experimentos:

Solucin de aminocidos desconocidos


Hidrxido de Sodio (NaOH) 0,5 N
cido clorhdrico (HCl) 0,5 N

Embudo pequeo
Pipeta de 10 ml
Magneto
Agitador magntico
Barra pescadora de magneto

Material de vidrio por experimento:

Frascos de compota/1 pipeta de 10 ml

III.

PROCEDIMIENTO

Cada mesn tendr un frasco rotulado como Solucin A, Solucin B y "Solucin C,


con un aminocido distinto en cada una de ellas. Una de las soluciones contiene un
aminocido neutro, otra una aminocido alcalino y la otra un aminocido cido.
Se toman 40 ml de la solucin de aminocido a titular y se coloca en un frasco de
compota. Se toma el pH con el pH-metro previamente estandarizado. Se anota en la hoja de
protocolo. Este es el pH de la solucin del aminocido problema. Se pone a funcionar el
agitador magntico a velocidad moderada, cuidado de que el magneto no golpee el
electrodo. Con una pipeta de 10 ml se agrega lentamente gota a gota HCl 0,5N hasta que el
pH quede fijado en 1,7.
Sin dejar de funcionar la agitacin, se coloca el pH-metro en Stand by y se acerca la
bureta de manera tal que el NaOH 0,5 N (previamente enrazado) caiga gota a gota en la
solucin y NO sobre las paredes del recipiente ni sobre el electrodo.
Realice una tabla segn el modelo siguiente para recolectar los datos:
Tabla 2. Valores obtenidos al titular el Aminocido
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

VNaOH 0,5 N
(ml)

pH

N
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44

con NaOH 0,5 N


VNaOH 0,5 N
(ml)

pH

20
21
22
23
24
25

45
46
47
48
49
50

Se comienza en este momento la titulacin. Se agregan 0,5 ml de NaOH, se espera un


minuto a que reaccione y se lee el pH (liberando la perilla de stand by o presionando la de
lectura segn el modelo de pH-metro). Se anota el pH ledo y el volumen de NaOH 0,5 N
gastado en la hoja de protocolo.
Se repite esta operacin tantas veces como sea necesario hasta llegar a pH 12,0. Una
vez finalizada la titulacin debe dejar el aparato en Stand By y el electrodo perfectamente
lavado con agua destilada y secado con papel suave.

IV.

CLCULOS

1. Calcule los miliequivalentes (meq) de NaOH agregados por la siguiente frmula:


meq = N.V (ml)
2. Realice las grficas en una hoja de papel milimetrado.
3. Extrapole los valores de pK
4. Calcule el punto isoelctrico (pI) de los aminocidos en la actividad experimental
mediante la frmula:
pI= (pK1+ pK2)/2
Consideraciones:
Segn la forma de la grfica, la cual es caracterstica de cada tipo de aminocido y la
cantidad de especies inicas que posean protones reemplazables:
a) Si, es un aminocido neutro se usar su pKa y pKb para la determinacin del pI.
b) Si, es un aminocido cido se usar su pKa y pKr para la determinacin del pI.
c) Si, es un aminocido bsico se usar su pKr y pKb para la determinacin del pI.
5. Deduzca el aminocido probable comparando el pI obtenido con los tericos.
6. Realice las disociaciones de los aminocidos titulados indicando la carga neta de cada
especie inica (Fig.1).

Fig.2 Titulacin de un aminocido neutro con hidrxido de sodio 0,5 N

pH (adimensional)

Titulacin del Aminocido Glicina con NaOH 0,5 N


12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

Cantidad de alcali (meq NaOH)

Fuente: Datos obtenidos del Laboratorio de Bioqumica de la Universidad de Oriente del Ncleo de Bolvar

Fig.3 Titulacin de un aminocido cido con hidrxido de sodio 0,5 N

pH (adimensional)

Titulacin del Aminocido Glutamato con NaOH 0,5 N


13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0

0,5

1,5

2,5
3
3,5
4
4,5
5
Cantidad de Alcali (meq NaOH)

5,5

6,5

Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Bioqumica de la Universidad de Oriente, Ncleo de Bolvar

Fig.4 Titulacin de un aminocido bsico con hidrxido de sodio 0,5 N

pH, (adimensional)

Titulacin del Aminocido Arginina con NaOH 0,5N


12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

910111213141516

Cantidad de alcali, (meq NaOH)

Fuente: Datos obtenidos del Laboratorio de Bioqumica de la Universidad de Oriente del Ncleo de Bolvar

Actividad Especial: Segn indicacin de su profesor realice las grficas,


disociaciones y calcule el pI en cada caso:
Titulacin de aminocido 1 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000

1,815
1,864
1,913
1,964
2,016
2,069
2,123
2,179
2,238
2,298
2,362
2,429
2,501
2,580
2,666
2,765
2,880
3,023
3,217
3,535
5,720
7,909
8,230
8,428
8,575
8,696
8,800
8,892
8,978
9,057
9,133
9,206
9,277
9,347
9,416
9,484
9,552

18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000

9,621
9,689
9,758
9,826
9,895
9,963
10,031
10,098
10,166
10,233
10,300
10,367
10,436
10,505
10,576
10,648
10,724
10,803
10,886
10,974
11,066
11,163
11,262
11,360
11,454
11,541
11,620
11,691
11,753
11,809
11,859
11,903
11,944
11,980
12,014
12,045

Titulacin de aminocido 2 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500

1,763
1,808
1,853
1,900
1,949
1,998
2,049
2,102
2,157
2,215
2,276
2,341
2,410
2,486
2,571
2,667
2,781
2,922
3,114
3,431
5,612
7,800
8,123
8,322
8,472
8,595
8,701
8,797
8,886
8,970
9,050
9,129
9,208
9,286
9,365
9,446

18,000
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000

9,529
9,614
9,701
9,790
9,879
9,969
10,057
10,143
10,227
10,308
10,386
10,463
10,537
10,611
10,684
10,757
10,831
10,905
10,981
11,059
11,138
11,219
11,301
11,382
11,461
11,537
11,608
11,673
11,733
11,787
11,837
11,882
11,923
11,960
11,994
12,026
12,055

Titulacin de aminocido 3 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000

1,799
1,846
1,895
1,944
1,995
2,047
2,100
2,155
2,212
2,272
2,335
2,401
2,473
2,550
2,636
2,734
2,849
2,991
3,185
3,502
5,744
7,991
8,315
8,516
8,668

12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000

8,792
8,901
9,001
9,093
9,182
9,269
9,356
9,444
9,536
9,635
9,742
9,864
10,010
10,195
10,455
10,826
11,182
11,414
11,569
11,683
11,772
11,844
11,905
11,957

Titulacin de aminocido 4 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000

1,635
1,673
1,712
1,752
1,794
1,836
1,881
1,927
1,976
2,027
2,082
2,141
2,205
2,276
2,355
2,447
2,555
2,692
2,878
3,181
3,963
4,754
5,069
5,268
5,419
5,543
5,652
5,751
5,843
5,932
6,019
6,106
6,194
6,286
6,384
6,492
6,613

18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000

6,758
6,941
7,194
7,550
7,906
8,159
8,342
8,486
8,608
8,715
8,813
8,905
8,994
9,080
9,167
9,255
9,347
9,446
9,553
9,676
9,823
10,010
10,279
10,683
11,072
11,313
11,472
11,588
11,679
11,752
11,815
11,868
11,915
11,956
11,994
12,027

Titulacin de aminocido 5 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000

1,639
1,677
1,716
1,756
1,798
1,841
1,885
1,932
1,981
2,032
2,087
2,146
2,211
2,282
2,361
2,453
2,562
2,699
2,887
3,200
5,135
7,081
7,405
7,606
7,757
7,882
7,990
8,089
8,181
8,269
8,355
8,440
8,527
8,617
8,711
8,813
8,925

18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000

9,052
9,199
9,370
9,559
9,748
9,918
10,063
10,188
10,298
10,397
10,488
10,573
10,654
10,733
10,810
10,886
10,962
11,038
11,115
11,192
11,270
11,347
11,423
11,497
11,567
11,633
11,694
11,750
11,802
11,849
11,892
11,931
11,967
12,001
12,032
12,060

Titulacin de aminocido 6 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000

1,740
1,783
1,827
1,872
1,918
1,965
2,013
2,063
2,114
2,168
2,224
2,282
2,344
2,409
2,479
2,553
2,634
2,720
2,813
2,912
3,014
3,118
3,221
3,320
3,415
3,506
3,593
3,677
3,759
3,841
3,922
4,005
4,090
4,180
4,277
4,385
4,508

18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000

4,658
4,858
5,182
6,951
8,721
9,046
9,246
9,397
9,522
9,630
9,729
9,821
9,908
9,994
10,079
10,166
10,255
10,348
10,449
10,558
10,680
10,818
10,972
11,134
11,289
11,424
11,536
11,629
11,707
11,773
11,830
11,880
11,925
11,964
12,000
12,033

Titulacin de aminocido 7 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000

1,889
1,944
2,000
2,057
2,115
2,174
2,233
2,295
2,357
2,422
2,490
2,561
2,636
2,718
2,807
2,908
3,026
3,171
3,366
3,686
6,134
8,587
8,912
9,112
9,263

12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000

9,388
9,497
9,596
9,688
9,776
9,863
9,949
10,036
10,126
10,222
10,326
10,441
10,573
10,728
10,913
11,119
11,315
11,477
11,604
11,704
11,786
11,855
11,913
11,964

Titulacin de aminocido 8 (0,05 M) con NaOH (0,1 M)

Volumen

pH

Volumen

pH

0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000

1,839
1,889
1,940
1,992
2,046
2,100
2,155
2,212
2,270
2,331
2,394
2,460
2,529
2,603
2,683
2,769
2,865
2,972
3,092
3,224
3,366
3,508
3,644
3,769
3,883
3,987
4,083
4,174
4,261
4,346
4,430
4,515
4,603
4,694
4,792
4,900
5,025

18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000

5,175
5,376
5,699
7,185
8,670
8,994
9,194
9,345
9,470
9,579
9,677
9,769
9,857
9,943
10,029
10,115
10,205
10,299
10,400
10,511
10,635
10,777
10,938
11,109
11,273
11,414
11,529
11,624
11,703
11,770
11,828
11,879
11,923
11,963
11,999
12,032

V.

EJERCICIOS

1. Defina los siguientes trminos: pH, pKa, Pkb, pI y solucin amortiguadora.


2. Escriba la forma estructural de los 20 L--AA y clasifquelos segn la polaridad de sus
grupo R.
3. Efecte un enlace peptdico.
4. Cul es la aplicacin de la frmula de Herdenson-Hasselbalch.
5. Por qu los aminocidos poseen capacidad amortiguadora?
6. Cmo se calcula el pK de la protena?
7. Cul es la relacin que existe entre la polaridad de una protena y sus aminocidos?
8. La hemoglobina (Hb) es uno de los amortiguadores ms importantes en los procesos
fisiolgicos. En cul de sus aminocidos radica esencialmente su capacidad
amortiguadora? Explique su respuesta.
9. Dado 500ml de una solucin de cido glutmico 0,15 M.
9.1 Calcular el volumen de una solucin KOH 0,4 M requeridos para titular el cido
glutmico cuando se encuentra protonado hasta su punto isoelctrico.
9.2 Calcular el volumen de una solucin HCl 0,2 M necesarios para titular el cido
glutmico cuando est totalmente desprotonado hasta su punto isoelctrico.
10. Por qu no existe ninguna protena fisiolgica cuyo punto isoelctrico sea 7,2 +/- 0,2?
11. Calcule la concentracin: molar, normal y porcentual, de una solucin de L-Lisina que
se ha preparado al pesar 20 mg y se completa con 50 ml de agua.
12. Calcule los meq de OH consumidos al titular la solucin anterior, si se gastaron 0,2 ml
de KOH 0,1 N.
+
13. Calcule los Eq de H consumidos de HCl 1 N, si se consumen 0,2 ml cuando se titula
L-Val 0,1M.
14. Si el pH de la disolucin 0,01 M de un HA, es 3,80. Calcule el pKa del cido.
15. Cundo el tretapptido GLU-ASP-VAL-LYS, se somete a un campo elctrico, hacia
cual electrodo, migrar explique su respuesta.

VII.- BIBLIOFRAFA RECOMENDADA


Baynes J. y Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier. 2:
5-10.
Lozano J., Galindo J., Garca-Borrn J., Martnez-Liarte J., Peafiel R. y Solano F. 2005.
a
Bioqumica y Biologa Molecular para Ciencias de la Salud. 3 Ed. Editorial McGraw-Hill.
McKee T. y McKee J. 2013. Bases moleculares para la vida.5ta Ed. Editorial Graw Hill. 5:105169
Moreno, J.1986. Aminocidos, pptidos y protenas. Teora y Problemas. 1ra ed. Ed.
Espasande. Vol (2):400
Murray R., Bender D., Kennelly P., Rodwell, V., Botham K., Weil A. 2000. Bioqumica de
Harper. 28va. Ed. Editorial McGraw-Hill.

PRCTICA 2: SALADO" (SALTING OUT) DE PROTENAS, SU


APLICACIN EN LA SEPARACIN Y DETERMINACIN DE ALBMINA
Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA SANGUNEO.
OBJETIVO GENERAL
Inducir la separacin y determinar cuantitativamente las protenas presentes en el suero
combinando dos mtodos colorimtricos con los reactivos Verde de Bromocresol y Biuret.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Diferenciar plasma y suero sanguneo con relacin a su contenido de protenas
plasmticas.
2. Separar las protenas totales del suero humano por el mtodo de precipitacin
salina.
3. Separar selectivamente la albumina de la protenas totales con el uso de solventes
orgnicos.
4. Construir una grfica de tendencia para protenas totales con el reactivo de Biuret.
5. Construir una grfica de tendencia para albumina con el reactivo Verde de
Bromocresol (BCG).
6. Determinar por el mtodo grfico las cantidades de protenas totales, de albumina y
de las globulinas presentes en un muestra de suero de un paciente.
7. Relacionar la cantidad de protena total, de albmina y de globulinas con respecto al
rango normal o al valor patolgico y deducir el estado de salud del paciente.

I. INTRODUCCIN
Las protenas estn constituidas por cadenas polipeptdicas. Un polipptido puede
50
adoptar > 10 conformaciones distintas, el plegado de la conformacin apropiada es
fundamental para que cumpla su funcin biolgica. Los esqueletos polipeptdicos estn
conformados por aminocidos, unidos por una conexin comn, el enlace peptdico.
Las protenas se caracterizan por ser multidisociables, por poseer grupos qumicos
disociables en la cadena lateral de los aminocidos que la constituyen, grupos carboxilos
(carboxiterminal) y aminos (aminoterminal) del enlace peptdico. Obtiene su forma ms
estable (de menor energa libre) cuando orienta todas sus partes hidrofbicas hacia el interior
de la protena, es decir, cadenas laterales neutras, no ionizables o apolares y hacia la parte
externa las cadenas laterales ionizables y polares, que es soluble en agua (regin hidroflica).
Por la estructura peptdica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las
protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes qumicos originndose productos

coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa de


las protenas.

Las diferentes protenas y fracciones proteicas pueden separarse mediante distintas


concentraciones de sales de acuerdo a sus diferentes solubilidades. En soluciones salinas
concentradas, las distintas protenas se comportan de modo caracterstico de acuerdo a su
afinidad por el agua, las cargas elctricas totales y su peso molecular.
Las protenas plasmticas son los constituyentes ms importantes de las clulas y
tejidos del cuerpo humano. Estructuralmente, presentan diversos aminocidos y poseen
diferentes funciones como el transporte de sustancias liposolubles, mantenimiento de la
presin coloidosmtica e inmunidad humoral, lo que contribuye al mantenimiento de la
homeostasis.
La albmina y globulinas dependen de sus diferentes solubilidades en soluciones de
sales neutras para su separacin. Las globulinas son precipitadas con soluciones
saturadas de sulfato de sodio al 23% o soluciones al 50% de sulfato de amonio.
La determinacin de la albumina forma parte de los anlisis que se reviste de gran
importancia en la prctica clnica; adems, de sus funciones como protenas de reserva en la
deplecin nutricional y cmo regulador osmtico es una protena de transporte. La albumina
es la principal protena plasmtica responsable del transporte de cidos grasos hidrofbicos y
frmacos.
En la presente experiencia se utilizar la tcnica del "Salting Out", que es til para
separar la albmina de las globulinas del suero o plasma humanos. Posteriormente se
cuantificarn, utilizando los mtodos colorimtricos combinados con el reactivo de Biuret y
Verde de Bromocresol para determinar la cantidad de protenas totales y albmina,
respectivamente.
La cantidad de protenas totales (Pt) presentes en el suero sanguneo se determina
empleando el mtodo de Biuret, esta reaccin se realiza entre las uniones polipeptdicas con
los iones cpricos del reactivo, en medio alcalino, formando un complejo de color violeta cuya
intensidad de color es proporcional a la concentracin de las Pt en la muestra. Se lee
espectrofomtricamente a una longitud de onda de 640 nm. Valor de referencia (6,5-8,0) g/dl.
A su vez, la cantidad de albumina srica se une, a travs de puentes de hidrgenos y
fuerzas de Van der Waals, a ciertos colorantes o indicadores como Verde de Bromocresol
(BCG), formando complejos coloreados cuya intensidad de color es proporcional a su
concentracin en la muestra. Se lee espectrofomtricamente a una longitud de onda de 600
nm, cuyo valor de referencia es de (3,5 4,8) g/dl.

La albumina, es la ms importante de las protenas plasmticas y es producida por los


hepatocitos. La velocidad de produccin depende de varios factores, cantidad de
aminocidos, la presin onctica del plasma, niveles de citoquinas inhibitorias
(particularmente IL-6) y el nmero de hepatocitos funcionales. La vida media de la albumina
es de 19 a 21 das. Las concentraciones de albumina son bajas en neonatos, tpicamente de
28 a 44 g/L (2,8 - 4,4) g/dl. En la primera semana de vida, se alcanzan los valores del adulto
de 37 a 50 g/L (3,7 5,0) g/dl, luego aumenta de 45 a 54 g/L (4,5 5,4) g/dl a los 6 aos y
permanece constante hasta llegar a los valores tpicos del adulto.

Un aumento en los valores de la albumina puede deberse a hemoconcentracin,


causada, ya sea, por deshidratacin, uso del torniquete prolongado durante la toma de
muestra o evaporacin de la misma; no obstante, una disminucin regularmente es originada
por prdidas de protenas (sndrome nefrtico, quemaduras, enteropata con prdida de
protenas, un recambio incrementado de albumina (estados catablicos, glucocorticoides),
una disminucin en la ingesta de protenas (malnutricin, dietas muy bajas en protenas) y en
las enfermedades hepticas, con niveles disminuidos en la hepatitis aguda y el la crnica; sin
embargo, es uy escasa cuando la enfermedad progresa a cirrosis.
Una Grfica de Tendencias es una representacin utilizada para determinar la
concentracin de diversas sustancias en solucin.
Para construir esta grfica se preparan diferentes patrones a partir de una solucin
estndar de concentraciones conocida, cuya concentracin debe estar dentro del rango de
los valores normales de la sustancia a determinar. Cada patrn se le aplica el mtodo
colorimtrico, se lee la absorbancia de cada en un espectrofotmetro a una longitud de onda
especfica, los datos obtenidos son utilizados para construir una grfica semejante al de la
Fig. 5. Para conocer la concentracin de la muestra de suero del paciente, se le aplica en
mtodo colorimtrico y se lee la absorbancia en el equipo adecuado, se extrapola en la curva
de calibracin elaborada previamente y se determina la cantidad de sustancia.

Abs

Concentracin de protena, Cp (mg)


Fig.5 Grfica de tendencia de Protenas

II.MATERIALES
Equipo
general:

Bao de Mara a 50 C
Espectrofotmetro
Porta pipeta

Material de vidrio por


experimento:

Centrfuga clnica
Gradilla de acero inoxidable
Lpiz graso.

Pipetas aforadas o volumtricas (1ml, 2ml, 5ml, 10ml)


Tubos de ensayo y de centrfuga:
Frascos compota

Reactivos por experimento:

Suero humano
Patrn de protenas 8 mg/ml
Cloruro de sodio 0,9%
ter dietlico
Sulfato de sodio a 23%

Reactivo de Biuret (Reactivo 1):


Sulfato de cobre, 7 mmol/l
Hidrxido de sodio, 0.75 mmol/l
Ioduro de potasio, 6 mmol/l

Verde de bromocresol (Reactivo 2):


Buffer citrato (pH 3.8 a 4.2),100 mmol/l
BCG, 0,25 mmol/l
TritonX100, 10g/l

III.

PROCEDIMIENTO

A) SEPARACIN DE PROTEINAS
A.1 Mzclese bien por inversin repetida en un tubo de ensayo 0.5ml de suero ms 9,5 ml de
Na2SO4 al 23% (no agitar para evitar la formacin de espuma).
A.2 Retire inmediatamente 2 ml para determinar protenas totales. Rotule como tubo N 1
(Solucin X1)
A.3 Retire 4 ml en un tubo de centrfuga, aada 2 ml de ter, pese bien y agtese vigorosamente.
Destape con cuidado, ya que el ter con las protenas y con el calor de la mano forma
mucha espuma, pudiendo derramarse la suspensin.
A.4 Centrifguese a 1.500 r.p.m. por 10 minutos.
A.5 Con una pipeta volumtrica de 2 ml y con el tubo de centrfuga inclinado, extraiga el lquido
claro de la capa inferior (un volumen no menor de 2 ml), enrase y lleve a un tubo de
ensayo rotulado como No. 2 (Solucin X 2). Al sacar la pipeta tenga cuidado de no absorber
con ella globulinas precipitadas.
A.6 Utilice los tubos 1 y 2 para la determinacin cuantitativa de protenas totales y de albmina
basado en la reaccin de Biuret.

A.
Fase superior:
corresponde al
sobrenadante y est constituido por ter.
Fase intermedia corresponde al precipitado de globulinas.
A inferior:
B. est constituido por solucin de albumina.
Fase

C.

Fig. 6 Separacin selectiva de las protenas plasmticas por adicin de un


solvente orgnico

B) CUANTIFICACION DE PROTEINAS.
B.1) Determinacin de protenas totales por el mtodo de Biuret
B.1.1

Tome 6 tubos de ensayos, identifquelos y adicione las cantidades segn


corresponda, tal como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3. Disposicin de los reactivos para realizar la cuantificacin de las protenas


totales
TUBOS

Suero
Standard
de
protenas
8mg/ml
NaCl, 0.9 %
Reactivo 1

----0,25 ml

----0,50 ml

-----0,75 ml

0,75 ml
3ml

0,5 ml
3ml

0,25 ml
3ml

B.1.2
B.1.3
B.1.4
B.1.5

----1 ml

MUESTRA
(Mpt)
0,1 ml
-----

BLANCO
(B)
-------

----3ml

----3ml

1 ml
3 ml

Despus de aadir las sustancias mzclese bien por inversin el contenido de


cada tubo evitando la formacin de espuma.
Incube a 50 C en el bao de temperatura constante durante 10 min. Deje enfriar.
Leer la absorbancia (abs) a 640 nm.
Registre los valores las absorbancias en la tabla 4, obtenidas de los tubos
elaborados en el paso 4.

B.1.6

Calcule la cantidad de mg de protenas que contiene cada patrn, tomando como


referencia el clculo tpico que se muestra a continuacin:
8 mg --------------1ml
X mg-----------------0,25 ml
X= 2 mg de protena

Tabla 4. Valores obtenidos por cada tubo preparado en el paso B.1.1

B.1.7

LECTURAS (abs)

Absorbancia, abs (Adimensional)

TUBOS
1
2
3
4
Mpt

mg de protenas

Grafique los resultados obtenidos de la tabla N 2, como se muestra en la fig. 7

Grfica de tendencia para protenas totales

1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

2
3
4
5
6
7
Cantidad de protena, Cp (mg de protenas)

Fig. 7. Representacin grfica de tendencia para protenas totales usando


el mtodo colorimtrico con el reactivo de Biuret.

B.1.8

A partir del valor de absorbancia obtenido con el tubo M pt, trace una paralela al eje
X hasta que intercepte la recta obtenida al graficar los patrones; posteriormente
trace una paralela al eje Y hasta interceptar el eje X; lea los mg de protena que
corresponde a su muestra.

B.1.9

Calcule la cantidad de mg de protenas totales presentes en su muestra de suero.

B.2) Determinacin

de albumina por el mtodo de Verde

de Bromocresol
B.2.1

Tome 6 tubos de ensayos y preprelos como se indica en la tabla 5

Tabla 5. Disposicin de las sustancia para la cuantificacin de albumina


TUBOS

Suero
Patrn de
albumina
4g/dl
NaCl 0,9%
Reactivo 2

---0,01ml

---0,02ml

---0,03ml

0,99ml
3ml

0,98ml
3ml

0,97ml
3ml

B.2.2
B.2.3
B.2.4
B.2.5

---0,04ml

Muestra
(Malb)
0,03
----

Blanco
(B)
-------

0,96ml
3ml

0,97ml
3ml

1ml
3ml

Despus de aadir las sustancias mzclese bien por inversin el contenido de


cada tubo evitando la formacin de espuma.
Leer la absorbancia (abs) a 600 nm.
Registre los valores las absorbancias en la tabla N4, obtenidas de los tubos
elaborados en el paso 3 de la parte B.
Calcule la cantidad de mg de protenas que contiene cada patrn, tomando como
referencia el clculo tpico que se muestra a continuacin:
40 g --------------1000ml
Xg-----------------0,01 ml

X= 0,0004 g de albumina
0,0004 g de protena X 1000mg/1g= 0,4 mg de albumina

Tabla 6. Valores obtenidos por cada tubo preparado en el paso B.2.1


TUBOS
1
2
3
4
5
6
7

LECTURAS (abs)

mg de protenas

V(ml)

0,300
0,580
0,830
1,100
1,400
1,700
1,960

0,40
0,80
1,20
1,60
2,00
2,40
2,80

0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07

Malbmina

0,03

Absorbancia, abs (Adimensional)

B.2.6

Grafique los resultados obtenidos de la tabla 6, como se muestra en la fig. 8

Grfica de tendencia para la albumina


1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

0,2

0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Cantidad de protena, CALB (mg de albumina)

1,6

1,8

Fig. 8. Representacin grfica de tendencia para la albumina, usando el mtodo colorimtrico


con el reactivo Verde de Bromocresol

B.2.7

B.2.8

A partir del valor de absorbancia obtenido en el tubo M alb, trace una paralela al eje
X hasta que intercepte la recta obtenida al graficar los patrones, posteriormente
trace una paralela al eje Y hasta interceptar el eje X; lea los mg de albumina que
le corresponde a su muestra.
Calcule la cantidad de mg de albumina presentes en su muestra de suero.

B.3) Determinacin de globulinas sricas


B.3.1
B.3.2
B.3.3

IV.

Determine por diferencia entre el valor de protenas totales y la cantidad de


albumina el valor de globulina
Calcule la relacin albumina/globulinas (A/G).
Analice los resultados obtenidos, explique la importancia de determinar estos
parmetros clnicos e indique patologas asociadas de un valor alterado.

VALORES DE REFERENCIA (Henry et al., 2005)

Protenas totales:
Adultos: 5,5 8,0 g/dl (55 80 g/l)
Recin Nacidos (RN): 4,6 -7,0 g/dl (46 70 g/l)
Albumina: 3,2 4,5 g/dl (32-45 g/l)

Globulinas: 2,3 3,5 g/dl (23 35g/l)


Alfa 1: 0,2 0,4 g/dl (2 4 g/l)
Beta 2: 0,5 0,9 g/dl (5 9 g/l)
Gamma: 0,7 1,7 g/dl(7 17 g/l)

V.

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Baynes J., Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier. 6:
59-71.
Dufour R., Lott J., Gretch D., y Seeff L. 2005. Gua de laboratorio para screening, diagnstico
y monitoreo de la lesin heptica. Acta de bioquim. Cln. latinoam. 30(3): 359-76.
Graw A., Murphy M., Srivastava R., Cowam R. y OReilly D. 2013. Bioqumica clnica. 5
Edit. ELSEVIER. 2:50-53.

Ed.

Hernry J., Davey F., Herman C., Mcpherson R., Pincus M., Thrette G. y Woods G. 2005. El
a
laboratorio en el diagnstico clnico. 20 Ed. Edit. MARBAN LIBROS. 13: 249-262.
Kennellly P., Murray R., Bender D., Rodwell V. y Weil A. 2000. Harper. bioqumica ilustrada.
a
28 Ed. Edit. Mc Graw Hill. 5:31-42.
Rothschild M. y Ortiz M. 1988. Serum albumin. Hepat. 8:385-401.
Wester D., Bignell A. y Atwood E. 1974. A study of the interaction of bromocresol green with
isolated serum globulin fractions. Clin. Chem. Ac. 53:109-115.

PRCTICA 3: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA


AMILASA SALIVAL
OBJETIVO GENERAL
Analizar la actividad enzimtica de la enzima amilasa salival y su relacin con diversos
factores que modifiquen los parmetros cinticos de la reaccin.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Definir el Km y Vmx.
2. Describir la funcin biolgica de la amilasa y su importancia biomdica.
3. Describir cmo vara la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de
sustrato y concentracin de enzima.
4. Describir el efecto del pH, temperatura sobre la actividad de la amilasa.
5. Determinar la actividad de la amilasa a pH 3, 5, 7, 9 y 11 bajo concentraciones
saturantes de sustrato.
6. Determinar la actividad de la amilasa a temperaturas de 0, 37, 40 y 50 C bajo
concentraciones saturantes de sustrato.
7. Determinar el efecto de la acarbosa, el cido sulfrico y cloruro de sodio sobre la
actividad de la enzima amilasa bajo concentraciones saturantes de sustrato.
8. Elaborar las grficas de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de
sustrato, variacin de pH, variacin de temperatura y variacin en presencia de
inhibidores.

I.

INTRODUCCIN

Las enzimas son catalizadores biolgicos que se encargan de realizar todas las
transformaciones energticas que ocurren en un organismo, modificando la velocidad de las
reacciones qumicas, ms no el equilibrio final. Para la transformacin de un gran nmero de
molculas de sustrato se requieren, por lo general, pequeas cantidades de enzima.
Las enzimas son protenas caracterizadas por su gran actividad y especificidad, ya
que catalizan un nmero pequeo de reacciones y en algunos casos tan solo una reaccin.
Las enzimas funcionan bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentracin de
sustrato y cofactores, siendo muy susceptibles a los cambios de cualquiera de estos
parmetros.
Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reaccin que catalizan como xidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas o sintetasas.

La velocidad de una reaccin enzimtica se puede expresar en funcin de la


concentracin del reactante transformado o del producto obtenido con respecto al tiempo,
luego de restar los valores debidos a cualquier transformacin no enzimtica.

La transformacin de sustrato con respecto al tiempo es lineal al comienzo, pero


pronto comienza a disminuir; la concentracin de sustrato disminuye con el tiempo de
manera que la actividad se hace menor porque la enzima estar menos saturada de sustrato.
Finalmente, la enzima tambin puede ser inhibida por los productos formados o puede
inactivarse lentamente por las condiciones experimentales. Todos estos efectos hacen
imposible derivar una ecuacin estndar que se ajuste a la curva de progreso. Por la tanto, la
actividad enzimtica se determina considerando nicamente la velocidad inicial de reaccin
(Vo) ya que en esta etapa los efectos mencionados anteriormente son ms pequeos.
Uno de los parmetros utilizados en el estudio de reacciones enzimticas es la
Velocidad Mxima (Vmx). Se define como la cantidad de producto formada por unidad de
tiempo bajo condiciones saturantes de sustrato. Una vez alcanzada, no se va a modificar por
aumentos en la concentracin de sustrato y es especfica para cada enzima en presencia de
determinado sustrato.
Otro parmetro es la Constante de Michaelis (Km), que representa la concentracin
de sustrato en donde la mitad de las molculas de enzima se encuentran formando el
complejo enzima-sustrato. Adems indica, indirectamente y bajo ciertas condiciones, la
afinidad de una enzima por su sustrato; a mayor Km menor afinidad y viceversa.
Los valores de Vmx y de Km pueden ser modificados por la presencia de inhibidores
de la reaccin. Dichos inhibidores pueden clasificarse en inhibidores irreversibles e
inhibidores reversibles y dentro de esta ltima categora tenemos inhibidores competitivos, no
competitivos, acompetitivos y mixtos.
Tanto el efecto del inhibidor competitivo como del no competitivo se ilustra claramente
usando los diferentes modelos grficos para el anlisis cintico de las enzimas. Se puede,
por ejemplo, graficar el inverso de la velocidad vs el inverso de la concentracin (grfica
Lineweaver-Burk), en donde el punto de corte de la ordenada representa el inverso de la
velocidad mxima, la pendiente es igual a Km/Vmx y si extrapolamos la recta al punto de
corte con el eje de las abscisas, ese valor representar el menos inverso de Km (1/Km). Los
efectos sobre los parmetros cinticos de la enzima tambin pueden estudiarse por medio de
grficas de Vo versus Vo/[S] (grfica de Eadie-Hofstee) o [S]/Vo versus [S] (Grfica de
Hanes-Woolf). Por tanto, utilizando una grfica de parmetros cinticos de Km y Vmx y de
acuerdo a las modificaciones producidas sobre dichos parmetros con respecto a la grfica
sin inhibidor se puede determinar qu clase de inhibidor est presente en una reaccin
enzimtica.

Muchas enzimas poseen un pH caracterstico al cual su velocidad es mxima. Por


encima o por debajo de este valor su actividad disminuye. La actividad de la enzima en
funcin del pH depende de: a-) el pK de los grupos ionizables de los aminocidos que la
constituyen, por ejemplo los del sitio cataltico que participan en la unin con el sustrato; y b-)
el pK de los grupos funcionales de la molcula del sustrato que participan en la unin con la
enzima; y de cualquier otro efecto que tenga el pH en las condiciones del medio donde se
encuentra la enzima.

El pH ptimo de una enzima no es necesariamente idntico con el pH de su entorno


intracelular. Este hecho siguiere que la relacin entre el pH y la actividad de una enzima
puede constituir un factor de control intracelular de la actividad enzimtica.
La temperatura recomendable para llevar a cabo ensayos en el laboratorio con
enzimas humanas est alrededor de la temperatura corporal (37 C), debido a que
temperaturas bajas tienden a inactivar a la enzima, cuya actividad puede recuperarse cuando
la temperatura se acerca a la corporal, mientras que la temperatura por encima de 40 C
tiende a desnaturalizar a las enzimas, siendo estos cambios normalmente irreversibles.
Con el fin de ilustrar los factores que afectan la actividad enzimtica, se utilizar como
ejemplo la enzima amilasa salival. Como actividad preliminar a esta experiencia el estudiante
deber consultar las caractersticas ms relevantes de esta incluyendo la relevancia en el
diagnstico de determinadas patologas. Adems de un repaso bsico sobre las
caractersticas bioqumicas del sustrato (Almidn) y los derivados de su hidrlisis. Para que
se tenga una perspectiva global de la funcin de estas enzimas, favor observe la tabla 7.
Tabla 7. Organizacin del tracto gastrointestinal segn requerimientos funcionales
(Baynes y Dominicsak, 2011)
rgano
Gastrointestinal
Glndulas
salivales
Estomago
Pncreas
Hgado/Vescula
biliar
Intestino delgado
Intestino grueso

II.

Funcin primaria en la absorcin de alimentos


Produccin de fluidos y de enzimas digestivas para la
homogeneizacin, la lubricacin y la digestin (de los carbohidratos, la
amilasa y de los lpidos, las lipasas linguales)
Secrecin de HCl y proteasas para iniciar la hidrlisisde las protenas
Secrecin de bicarbonato, proteasas y lipasas para continuarla
digestin de protenas, lpidos y amilasa para continuar la digestin de
almidn
Secrecin y el almacenamiento de los cidos biliares para su liberacin
en el intestino delgado
Digestin intraluminal (final de los productos alimenticios), digestin de
dmeros de carbohidratos y de determinadas vas de absorcin del
material digerido
Absorcin de fluidos, de electrolitos y de los productos por accin
bacteriana en el colon

MATERIALES

Equipos generales:

Gradillas
Pipetas

Tubos de ensayos
Beakers
Bao termosttico (0, 37, 40 y 60 C.)
Espectrofotmetro.

Reactivos:

Solucin de Almidn 0,08 %


Buffer fosfato de sodio o potasio (50mmol/l, pH 5,0; 7,2 y 11,0)
Solucin de amilasa humana
Solucin de lugol 3%
Solucin de acarbosa (500mg/100ml)
Solucin de H2SO4 (1 mol/l)
Cloroformo
NaCl (0,9%)

III.

PROCEDIMIENTO

A) OBTENCIN DE LA AMILASA SALIVAL


A.1 Elegir un voluntario por equipo que proceda a salivar hasta obtener aproximadamente
4 ml de saliva.
A.2 Diluir por cada 2 ml de saliva en 2 ml de agua destilada, dilucin 1:2; rotular como
extracto enzimtico y se usar en los experimentos B, C, D, E y F.

B) EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO SOBRE LA


ACTIVIDAD ENZIMTICA
B.1

Utilizando 5 tubos de ensayo, prepare cada uno de los mismos siguiendo el orden
estricto de adicin de las sustancias y tiempos respectivos, tal como se muestra en el
siguiente cuadro:
Sustrato
(ml)

BUFFER
pH 7,2
(ml)

INCUBACIN
Por 5 min

Enzima
(ml)

Tiempo de
Reaccin
(min)

LUGOL
(ml)

AGUA
(ml)

37C

0,5

6,5

1,5

37C

0,5

6,0

2,0

37C

0,5

5,5

2,5

37C

0,5

5,0

3,0

37C

0,5

4,5

ABSORBANCIA
A 600 nm

B.2

Rotule como control 1 (C1), control 2 (C2), control 3 (C3), control 4 (C4) y control 5
(C5) y preprelos as como se muestra en el siguiente cuadro:
CONTROLES

Sustrato
(ml)

BUFFER
pH7,2
(ml)

INCUBACIN
Por 5 min

LUGOL
(ml)

Tiempo
De
reaccin(min)

AGUA
(ml)

C1
C2
C3
C4
C5

1
1,5
2,0
2,5
3,0

1
1
1
1
1

37C
37C
37C
37C
37C

1
1
1
1
1

2
2
2
2
2

7
6,5
6,0
5,5
5,0

Construya una grfica de tendencia de la absorbancia (Abs) vs cantidad de mmoles de


almidn total (CT), usando los valores obtenidos con los controles (vease fig. 9).
Absorbancia, ABS (adimensional)

B.3

ABSORBANCIA
A 600 nm

Grfica de tendencia del almidn en funcin de la absorbancia


5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0

0,5

1,5

2,5

Cantidad de almidn total, CT (mmol/l)

Fig. 9 Representacin grfica de una grfica de tendencia para almidn

B.4

Calcule la cantidad de mmoles metabolizados del sustrato (C S) por diferencia entre la


cantidad de mmoles totales (CT) correspondiente a cada controles C1, C2, C3, C4 y
C5 y la cantidad de mmoles no metabolizados (CN).
a)
b)

CS (mmoles metabolizados)= CT (mmoles totales) - CN (mmoles remanentes o No metabolizados)


Vo = Cs/TR (mmol metabolizados/min)

B.5

Complete el siguiente cuadro


Sustrato CT
(mmoles/l)
(ml)

CN
(mmoles/l)

CS
(mmol/l)

Vo
(CS/TR)

1/Cs

1/Vo

B.4

Velocidad inicial, Vo (mmol metabolizados/min)

1
1,5
2,0
2,5
3,0

Grafique las velocidades obtenidas vs concentracin de sustrato (Fig.10)

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad inicial en la


hidrlisis del almidn
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0

0,5

1
1,5
2
Concentracin de sustrato, Cs (mmol/l)

2,5

Fig. 10 Representacin de una cintica con saturacin del complejo-enzima sustrato

B.5

Grafique la inversa de la velocidad (1/Vo) vs la inversa de la concentracin de


sustrato (1/CS) y determine los parmetros cinticos correspondientes (Fig.11).

Doble recproca o de Lineweaver-Burk 1/Vo en contraposicin con 1/Cs


3,5
1/Vo

3
2,5
2

1/Vmax

1,5
1
0,5
0
-0,4

-0,2

0,2

0,4
1/Cs

0,6

0,8

1,2

-1/Km

Fig. 11 Representacin grfica de la doble recproca.


Ntese los puntos de cortes con el eje X= -1/Km y con el eje Y= 1/Vmx
-1/Km = -0,3; por lo tanto, Km= -1/ -0,3 = 3,33 mmol
La velocidad mxima (Vmx) = 1/0,7= 1,42
mmol/min

C) EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMA


C.1 Utilizando 4 tubos de ensayo, preprelos siguiendo el orden estricto de adicin de las
sustancias y tiempos respectivos, tal como se muestra en el siguiente cuadro:
Sustrato
(ml)

BUFFER
pH 7,2
(ml)

INCUBACIN
por 5min

Enzima
(ml)

TR
(min)

LUGOL
(ml)

AGUA
(ml)

1
1
1
1

1
1
1
1

37C
37C
37C
37C

0,2
0,4
0,6
0,8

2min
2min
2min
2min

1
1
1
1

6,8
6,6
6,4
6,2

LECTURA DE LA
ABSORBANCIA A
600 nm

C.2 Prepare 1 tubo control


Sustrato
(ml)
1

BUFFERpH 7,2
(ml)
1

INCUBACINPor 5
min
37C

LUGOL
(ml)
1

TR
(min)
2

Agua
(ml)
7

LECTURA
DE
LA
ABSORBANCIA A 600 nm

C.3 Calcule CS por diferencia CT (correspondientes al tubo control) y CN obtenidos


experimentalmente.
C.4 Complete el siguiente cuadro y determine la Vo dividiendo los mmoles metabolizados
(CS) entre el tiempo de reaccin.
a)

CS= CT- CN (mmoles metabolizados)

b)

Vo= CS/TR (mmoles metabolizados/min)

Sustrato
(ml)

CT
(mmol/l)

CN
(mmol/l)

Cs
(mmol/l)

E
(ml)

Vo
(mmol/min)

0,2
0,4
0,6
0,8

Velocidad de la reaccin, Vo (mmol


metabolizados/min)

C.5 Grafique las velocidades inicial vs cantidad de enzima (Fig.12).


Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de la reaccin
en la hidrlisis del almidn
14
12
10
8
6
4
2

E4
E3 E2
E1

0
0

0,1

0,2
0,3
0,4
0,5
Cantidad de enzima, E (ml)

0,6

0,7

Fig. 12 Efecto de la concentracin de enzima en la hidrolisis del almidn

C.6 Analice la grfica y explique en trminos cinticos el comportamiento de la enzima.

D) EFECTO DE LA VARIACIN DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA


ENZIMA:
D.1

Utilizando 5 tubos de ensayo, prepare siguiendo el orden estricto de adicin de las


sustancias y use el tiempo de reaccin (TR) correspondiente, tal como se muestra en el
siguiente cuadro:

Sustrato
(ml)

BUFFER
(1ml)

INCUBACIN
por 5min

Enzima
(ml)

TR
(min)

LUGOL
(ml)

AGUA
(ml)

1
1
1
1
1

1 ml pH 3
1ml pH 5
1 ml pH 7,2
1ml pH 8,0
1ml pH 11,0

37C
37C
37C
37C
37C

0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

2
2
2
2
2

1
1
1
1
1

6,5
6,5
6,5
6,5
6.5

D.2

Prepare los controles segn la variacin de pH de la siguiente manera:

Sustrato
(ml)
1
1
1
1

D.3

BUFFER
1 (ml)
pH 5
pH 7,2
pH 8,0
pH 11,0

INCUBACIN
Por 5 min
37C
37C
37C
37C

LUGOL
(ml)
1
1
1
1

TR
(min)
2
2
2
2

AGUA
(ml)
7
7
7
7

LECTURA
DE
ABSORBANCIA A 600 nm

LA

Calcule CS por diferencia de CT (correspondientes a los controles) y CN(almidn no


hidrolizado)

D.4

a)

CS (mmoles metabolizados) = CT - CN

b)

Vo (mmol metabolizado/min)= Cs/TR

Complete el siguiente cuadro:

S(ml)

CT
(mmol/l)

CN
(mmol/l)

CS
(mmol/l)

pH
(ml)

Vo
(mmol
metabolizado/min)

3
4
5
7
11

D.5

LECTURA DE LA
ABSORBANCIA A
600 nm

Grafique las velocidades obtenidas vs pH (Fig13).

MANUAL PRCTICO DEL LABPO2RATORIO DE


BIOQUMICA

36

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica de la amilasa salival


Velocidad de la reaccin, Vo (mmol metabolizados/min)

D.6

5
4
3
2
1
0
0

3
4
5
6
7
8
9
101112
Solucin amortiguadora, pH (adimensional)

Fig. 13 Cintica de la amilasa salival a diferentes pH

Analice las grfica obtenida y explique el comportamiento de la enzima al variar el pH de


la solucin.

E) EFECTO DE LA VARIACIN DE LA TEMPERATURA SOBRE LA


ACTIVIDAD DE LA ENZIMA:
E.1

Utilizando 4 tubos de ensayo, prepare cada uno siguiendo el orden estricto de adicin de
las sustancias y tiempos respectivos, tal como se muestra en el siguiente cuadro:

Sustrato
(ml)

BUFFER
pH 7,2(ml)

INCUBACIN
por 5 min

E
(ml)

TR
(min)

LUGOL
(ml)

AGUA
(ml)

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml

0C
37C
40C
50C

0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml

2
2
2
2

1ml
1ml
1ml
1ml

6,5 ml
6,5 ml
6,5 ml
6,5 ml

E.2

LECTURA DE LA
ABSORBANCIA A
600 nm

Prepare los controles incubando a la temperatura que corresponda segn el siguiente


cuadro:

Sustrato
(ml)

BUFFER
pH
7,2
(ml)

INCUBACIN
Por 5 min

LUGOL
(ml)

MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

TR
(min)

AGUA
(ml)

LECTURA DE LA ABSORBANCIA A
600 nm

37

1
1
1
1

1
1
1
1

0C
37C
40C
50C

1
1
1
1

MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

2
2
2
2

7
7
7
7

38

E.3

Calcule CS por diferencia de CT (correspondientes a los controles) y los CN, utilice la


ecuacin sealada en la seccin D paso 3.

E.4

Complete el siguiente cuadro:

S
(ml)
1

CN (mmo/l)

CS (mmol/l)

Temperatura
(C)

Vo
(mmol metabolizado/ min)

0
37
40
50
Grafique las velocidades iniciales obtenidas vs temperatura (Fig.14).
Velocidad inicial, Vo (mmol/min)

E.5

CT (mmol/l)

Efecto de la temparatura sobre la actividad enzimtica de la


amilasa salival
6
5
4
3
2
1
0
0

10

20
30
40
Temperatura de la reaccin, T (C)

50

60

Fig. 14 Hidrolisis del almidn por la accin de la amilasa salival a diferentes


temperaturas
E.6

Analice la grfica de velocidad obtenida y explique el comportamiento de la enzima al


variar la temperatura de incubacin.

F) EFECTO DE LOS INHIBIDORES SOBRE LA ACTIVIDAD DE ENZIMA:

F.1Utilizando 9 tubos de ensayo, prepare tres bateras de tres tubos de ensayo cada una.
Cada batera se preparar de la manera siguiente:
Sustrato
(ml)
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5

Buffer
(ml)

INCUBACIN
por 5 min

INHIBIDOR
( ml)

37C

37C

37C

ACARBOSA
ACARBOSA
ACARBOSA
H2HSO4,
H2HSO4,
H2HSO4,
NaCl
NaCl
NaCl

Enzima
(ml)

TR
(min)

LUGOL
(ml)

0,5

2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min

0,5
0,5

AGUA
(ml)

LECTURA
DE ABS A
600 nm

6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0

1
1

F.2Prepare los tubos controles segn la variacin de inhibidor correspondiente


Sustrato
(ml)

BUFFER
(ml)

SUSTANCIA
(ml)

INCUBACIN
Por 5 min

LUGOL
(ml)

TR (min)

AGUA
(ml)

ACARBOSA

37C

2 min

H2SO4

37C

2 min

NaCl

37C

2 min

6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0

0,5
1
1,5
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5

ABS a 600
nm

F.3Calcule CS por diferencia entre CT (correspondientes a los controles) y CN, utilice la


ecuacin sealada en la seccin D paso 3.
F.4Complete el siguiente cuadro
Sustrato
(ml)
0,5
1,0
1,5

CT

CN

SUSTANCIA
Acarbosa
H2SO4
NaCl
Acarbosa
H2SO4
NaCl
Acarbosa
H2SO4
NaCl

CS (mmol/l)

Vo
(mmol
metabolizado/min)

F.5Grfique la velocidad de la reaccin vs concentracin de sustrato usada para cada


sustancia a evaluar su efecto inhibidor (Fig. 15)

Cintica de la amilasa salival con adicin de una sustancia X


Velocidad de la reaccin, Vo (mmol metabolizados/min)

4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
NaCl
H2SO4 ACARBOSA

0,5
0
0

0,5

1
1,5
2
2,5
Cantidad de sustrato, CS (mmol/l)

3,5

Fig. 15 Representacin de la cintica encimtica con saturacin del complejo-enzima


sustrato y la adicin de una sustancia X (sea la sustancia X el H 2SO4, el NaCl o la
Acarbosa).
F.6 Grafique la inversa de la velocidad inicial vs la inversa de concentracin de sustrato y
determine los parmetros cinticos correspondientes (Fig.16).
Grfico de Lineweaver-Burk en la hidrlisis del almidn con adicin de una
sustancia X
2,5
2

1/Vo

1,5
NaCl
H2SO4 ACARBOSA

1
0,5
0

-2

-1

0
-0,5

1
1/CS

Fig. 16 Grfico de Lineweaver-Burk obtenido en el estudio realizado en la hidrlisis del


almidn al adicionar una sustancia X (sea la sustancia X el H2SO4, el NaCl o la acarbosa).

F.7 A partir de cada recta obtenida, prolnguela hasta conseguir un punto de corte en el
eje X. Analice el Km y Vmax obtenido (Puntos de corte con los ejes X y Y
respectivamente, como se indica en la Figura 11) y explique la accin ejercida por
cada sustancia X sobre la velocidad de la reaccin e indique el tipo de inhibidor.

IV.

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Baynes J., Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier.
6:59-71.
Murray R., Bender D., Botham K., Kennelly P., Rodwell V. y Weil P. 2000. Bioqumica
ilustrada. 28va. Ed. Editorial McGraw-Hill. 8:62-83.

PRCTICA 4: ENZIMOLOGA: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE


L-LACTATO: NAD+ OXIDO-REDUCTASA EN MSCULO, HGADO Y
CORAZN DE ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
OBJETIVO GENERAL
Evaluar el sistema enzimtico de la L-Lactato Deshidrogenasa en distintos extractos
tisulares, su mecanismo de accin y su funcin en los procesos biolgicos.

OBJETIVOS ES PECFICOS
1.- Describir el mecanismo de accin del sistema Enzima-Coenzima.
2.- Describir el concepto de Isoenzima
3.- Interpretar un diagrama de flujo
4.- Extraer una enzima y una coenzima tisular
5.- Diferenciar mtodo de extraccin para una enzima y para una coenzima
6.- Describir el mecanismo de accin del Azul de Metileno.
7.- Describir el papel del aceite en los tubos de reaccin.
8.- Interpretar la actividad enzimtica en distintos extractos tisulares.

I.

INTRODUCCIN

Todas las enzimas conocidas son protenas, muchas de ellas contienen grupos no
proteicos (carbohidratos y lpidos). Es por eso que se les puede clasificar en protenas
simples o conjugadas.
La enzima conjugada activa es denominada holoenzima, su grupo no proteico puede
ser coenzima o un grupo prosttico, y su parte proteica se denomina Apoenzima. Las
diferencias entre la Apoenzima y la coenzima se pueden tabular de la siguiente forma:

Naturaleza
Termolbil
Dializable
Peso molecular

Apoenzima
Proteica
S
No
Alto

Coenzima
No proteica
No
S
Bajo

Existe un mtodo para separar enzimas de coenzimas presentes en un extracto de


tejido, se denomina DILISIS, que se denomina como el proceso por el cual una sustancia

puede pasar por el poro de una bolsa de celofn (membrana de dilisis) hacia un medio
carente de ella misma (H2O destilada) por simple difusin.
Es por ello que se dice que las coenzimas son dializables debido a que tienen un
peso molecular menor que las enzimas y entonces pueden pasar a travs del poro.
Hay membranas de dilisis (celofn) de distinto grado de porosidad.

Las Isoenzima son mltiples formas moleculares de una misma enzima que catalizan
la misma reaccin global.
Un buen ejemplo de Isoenzima es la L-lactato: NAD+ xido-reductasa (LDH) utiliza
L-lactato y NAD+, como sustrato y coenzima, respectivamente. Est formada por cuatro
cadenas polipeptdicas, su PM de 134.000 Dalton. Electroforticamente, se diferencian cinco
fracciones moleculares, con Km especficos para cada sustrato.
Las fracciones moleculares extradas del msculo esqueltico, contienen
predominantemente, fraccin M, las del miocardio, fraccin H. Existen adems, agregados
en diferentes combinaciones: M4, M3H, M2H2, MH3 y H4 en estos mismos tejidos y en
hgado. La variedad M4 y M3H, predomina en los tejidos con capacidad glucoltica
(msculo esqueltico blanco y tejidos embrionarios). La MH3 y H4, predominan en
tejidos con actividad aerbica (Corazn).
Las concentraciones bajas de oxgeno en los tejidos, estimulan la formacin de
lactato, a partir de glucosa, formando parte del ciclo de Cori. La nicotinadenindinucletido
(NAD+), es una coenzima de gran importancia en las reacciones metablicas de xidoreduccin, y es la que acta junto con la Lactato NAD+ Oxido-reductasa.
Su mecanismo de reaccin puede ser expresado:
COOH
HO - C - H

NAD
+
H

CH3

NADH+

COO

C=O
CH3

Piruvato

Lactato

Para cuantificar la cantidad de esta enzima existen varios mtodos:


1.- Cuantificar el lactato utilizado
2.- Cuantificar el piruvato aparecido
3.- Cuantificar el NAD+ utilizado
4.- Cuantificar el NADH+ H+ aparecido
Uno de los mtodos ms exactos es medir la aparicin del NADH por su absorbancia
especfica a 340 nm. Este Mtodo es de mucha utilidad para todos los sistemas de xidoreduccin que utilicen NAD/NADH.

En el trabajo prctico se utilizar Azul de Metileno como aceptor de equivalentes


reducidos, el cual se decolora indicando as actividad de Lactato NAD xido-reductasa.
Durante el desarrollo del trabajo prctico se ver la actividad de esta enzima extrada
de corazn, hgado y msculo esqueltico de animales de experimentacin. Se emplearn
dos mtodos de separacin de enzimas y coenzimas:
1.- Calentamiento de la mezcla: en este caso la enzima (protena) se destruye
quedando slo la coenzima.

2.- Dilisis: donde principalmente se obtiene la enzima purificada, es decir, libre de


coenzimas, sustrato o cualquier otra molcula presente en la mezcla.

II.

MATERIALES
Material general:
Barra de hierro para
dislocacin cervical
Papel peridico
Material quirrgico trado por el alumno
Homogenizador tipo omni-Mixer- marca
Sorvall
Centrfuga Internacional a - 4 C

Gradilla para tubo de ensayo (1)

Hielo
Balanza basculante
Frascos de centrfuga
Membranas de dilisis
Gradilla para pipeta (1)
Bao de Mara a 37C (4)

Material de vidrio por experiencia:

Frascos de compota para bao de


Mara
Pipetas volumtricas o graduadas,
2ml
Pipetas graduadas, 10ml

Gradilla para pipeta


Tubos de ensayo
Pipetas graduadas, 5ml
Gradilla para tubo de ensayo

Reactivos:

Solucin Buffer salina pH 7.2, 10ml por gramo de tejido, en fro.


Lactato de sodio al 1%
(6 ml)
Azul de metileno al 0.01 %
(4ml)
Aceite
(8ml)

Material Biolgico:

III.

Animales de Experimentacin (2)

PROCEDIMIENTO
A) Obtencin del homogenizado y enzima inactiva (Apoenzima).

A.1 Sedar el animal en estudio.


A.2 Sacrificar el animal por dislocacin cervical.

A.3 Hacer un corte en la regin anterior del cuello (paquete vsculo-nervioso), dejar
desangrar (con el objeto de eliminar la LDH y lactato presentes en eritrocitos y
plasma).
A.4 Extraer rpidamente el corazn, hgado y msculo del animal de experimentacin.
A.5 Determinar el peso del tejido y registrarlo (con el objeto de obtener un parmetro de
peso como referencia).
A.6 Seguir el esquema (ver fig. 17) para la obtencin y separacin de la enzima (LDH) y la
+
coenzima (NADH+H ).
Agregarle 10 ml de buffer fosfato NaCl 0,9% por gramo de tejido

(Omnimixer), 10 min
Homogeneizar en fro

1/2 incubar a ebullicin en bao


de Mara por 15 min

1/2 centrifugar a 3000 rpm


por 10 minutos

Enfriar

Sobrenadante

Descartar
(centrifugado)

Centrifugar a 3000 rpm por 10 min

Descartar
(centrifugado)

Dializar 24 h
contra agua dest.
(enzima
dializada)

Sobrenadant
e guardar
(coenzima)

Guardar
(enzima sin
dializar)

Fig. 17 Esquema de obtencin separacin de los componentes de la reaccin

B) Demostracin de la actividad enzimtica


B.1 Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin:
Reactivo/tubo
Enzima sin dializar (ml)
Enzima dializada (ml)
Coenzima (ml)
Lactato de sodio (ml)
Azul de metileno (ml)
Agua tridestilada (ml)

1
2
----2
1
3

2
--2
2
2
1
1

3
2
--2
2
1
1

4
--2
--2
1
3

5
2
--2
--1
3

6
--2
2
--1
3

7
----2
2
1
3

TUBOS

1) Control de coenzima con enzima sin dializar


2) Control de reaccin con enzima dializada

3)
4)
5)
6)
7)

Control de reaccin con enzima sin dializar


Control de coenzima con enzima dializada
Control de sustrato con enzima sin dializar
Control de sustrato con enzima dializada
Control de enzima
B.2 Colocar 1 gotero completo de aceite para cubrir el medio reaccionante y aislarlo del
oxgeno ambiental.
B.3 Llevar los tubos a un Bao de Mara a 37C y hacer observaciones cada 5 minutos
hasta total decoloracin del Azul de Metileno (no ms de 45 minutos en total).
B.4 Registre las observaciones en una Hoja de Reporte de Resultados mediante un
sistema porcentual cualitativo. (por ejemplo 1/4 parte del tubo decolorada
correspondera a 25 %).
B.5 Comparar los resultados obtenidos de cada rgano estudiado.

IV.

EJERCICIOS

1.- Cmo aplicara usted el hecho que, el Azul de Metileno una vez decolorado por accin
Enzimtica recupere nuevamente su color?
2.- En cul o cules de los tubos se observar decoloracin del Azul de Metileno, y por
qu?
3.- Qu resultado pueden tener concentraciones altas de oxgeno sobre la protena
cataltica estudiada?
4.- Qu relacin (es) observ en los resultados de la actividad de la L-lactato NAD+ :
oxido - reductasa del tejido procesado por usted y los resultados obtenidos por sus
compaeros en otros rganos?
5Cul sera el mtodo ideal para separar el complejo Enzima-Coenzima?

V.

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Moreno Y, Jos. 1986. Conceptos Fundamentales de Bioqumica. Vol. I Enzimas. Teora y


problemas. Ed. Espasande 1era Ed.

Murray R., Bender D., Botham K., Kennelly P., Rodwell V. y Weil P. 2000. Bioqumica
ilustrada. 28va. Ed. Editorial McGraw-Hill. 8:62-83.
Orten J. y Neuhaus O. 1984. Bioqumica Humana. 10ma Ed. Panamericana.

PRCTICA 5: METABOLISMO INTERMEDIARIO. EFECTO DEL AYUNO


SOBRE EL CONTENIDO DEL GLUCGENO HPATICO

OBJETIVO GENERAL
Analizar el fundamento y la metodologa de los procesos de aislamiento y
cuantificacin del glucgeno heptico y muscular en ratones alimentados y ayunados.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Describir un mtodo de extraccin de glucgeno a partir de tejido heptico y
muscular.
2. Explicar qu sucede durante dicha extraccin con las protenas, lpidos e hidratos de
carbono.
3. Cuantificar glucgeno heptico y muscular proveniente de los animales de
experimentacin.
4. Explicar el fundamento de la reaccin de la Antrona.
5. Comparar los resultados obtenidos en animales de experimentacin en ayunas y
alimentados con respecto a los valores de glucgeno en seres humanos.
6. Referir los resultados obtenidos con metabolismo normal y 24 horas despus de
recibir solamente solucin fisiolgica.
7. Describir el papel del glucgeno como reservado energtico en tejido heptico y
muscular.
8. Enumerar otros factores que influyen en la glucogenlisis y gluconeognesis y
explique la accin hormonal.

I.

INTRODUCCIN

El estudiante debe cuantitativamente demostrar el efecto que posee el ayuno sobre el


contenido del glucgeno heptico y muscular de animales de experimentacin. Se aspira con
esta experiencia a que el estudiante visualice el papel el aislamiento del glucgeno como
reservorio energtico del organismo.
Las clulas animales (hepticas y musculares) almacenan glucosa en su citosol en
forma de glucgeno, polmero muy ramificado y fcilmente movilizable. Su masa molecular
es variable, dependiendo de las unidades glucosdicas que lo formen, aunque posee una
estructura definida. Las unidades de glucosa, en nmero de 20.000 a 30.000, estn unidas
por enlaces glucosdicos 1-4 (amilosa), y 1-6 (amilopectina). Aproximadamente el 90% de
los enlaces glucosdicos son del tipo 1-4 y el 10% del tipo 1-6, formando stos los puntos
de ramificacin.

El msculo esqueltico contiene alrededor de los 2/3 del glucgeno total a una
concentracin de hasta el 1 g por 100 g de tejido. El hgado posee la concentracin de
glucgeno ms elevada; al final de la fase absortiva e inicio de la post-absortiva, llegando a

una concentracin de glucgeno almacenado de hasta 5-7 g por 100 g de tejido en seres
humano. En el msculo esqueltico, el glucgeno se utiliza como combustible glucoltico de
la propia clula, aunque, en este caso, acoplado a las necesidades de su especfica funcin
contrctil. Su papel es muy diferente en el hgado; la glucosa producida en la glucogenlisis
es liberada al lquido extracelular para ayudar a mantener la glicemia, principalmente durante
la fase postabsortiva y ser utilizada por todos los tejidos.

Fig. 18. Metabolismo del glucgeno heptico y muscular

Fig. 19 Ntese: A) el Ciclo de Cori y B) el ciclo de la Glucosa-Alanina (Makee y


Makee, 2013)

En esta prctica se utiliza la tcnica clsica de Pfluger para el aislamiento del


glucgeno. El mtodo se basa en la estabilidad notoria de este polisacrido a soluciones
concentradas de lcali, el cual hidroliza y solubiliza otros componentes hepticos como
protenas y lpidos sin modificar en modo alguno el glucgeno. Cuando se adiciona alcohol al
producto de la accin alcalina, el glucgeno se torna insoluble, mientras que las dems
sustancias permanecen en solucin, en estas condiciones resulta sencillo obtener el
polisacrido por centrifugacin.
Posteriormente, el glucgeno aislado se puede determinar indirectamente por el mtodo
del antrona, debido a que esta tcnica directamente cuantifica glucosa y a ese resultado se le
aplica un factor de conversin obteniendo la cantidad de glucgeno que contiene ese tejido.
La antrona se encuentra disuelta en cido sulfrico concentrado. Este cido tiene por
objeto hidrolizar los enlaces glucosdicos del glucgeno liberando as glucosa, la cual se va
a transformar en 5 - 0H CH - furtural por deshidratacin y va a reaccionar con el oxidrilo de
dos molculas de antrona dando un compuesto coloreado.
Es muy conveniente que el estudiante consulte los efectos del ayuno, Insulina,
Glucgeno, Epinefrina, etc., sobre la cascada enzimtica de la glucogenlisis y
gluconeognesis.

II.

MATERIALES
Materiales
Generales:

Barra decapitadora
Papel Peridico
Capsulas de Petri (4)
Material de ciruga (trado por el
alumno)
Balanza granatoria
Una gradilla con 2 tubos de
centrfuga
graduados
que
contenga 4ml KOH 30%
2 pinzas de madera
2 mecheros + 2 trpodes + 2
recipientes metlicos con agua
hirviendo
Centrifuga Clnica (1)
Espectrofotmetro (2)

Material de vidrio:

Buretas de 25 50cc con


solucin de antrona (3)
1 frasco compota.
30 varillas de vidrio
Tubos de ensayo 2
Pipetas graduadas de: l ml / 5
ml / 10 ml

Modelo experimental animal:

Ratones con administracin


solucin fisiolgica, con ayuno
48 h (02).
Ratones alimentados (02).

Reactivos:

KOH 30%
Etanol 95%
Standard de glucosa (0.2 mg/ml)
Antrona

de
de

III.

PROCEDIMIENTO

A) Aislamiento del glucgeno:


Se utilizar 0,5 g de hgado y de msculo esqueltico extrado de los animales de
experimentacin. Un animal estar alimentado, mientras que el otro se le administrar
solucin fisiolgica con un ayuno, por 48 horas.
El animal se debe sacrificar por medio de un golpe seco en la cabeza y decapitacin
posterior. Inmediatamente se debe extraer el hgado y el msculo esqueltico. La muestra
debe pesarse con un margen de error menor de 10 miligramos y la operacin total de
extraccin debe demorar unos pocos minutos. Una demora prolongada conducira a valores
anormalmente bajos.
Cada grupo de estudiantes deber pesar y recibir en un tubo de centrfuga con 4ml de
KOH al 30% medio gramo de muestra. Se calientan con agitacin en un bao de agua
hirviendo, durante 15 minutos, o durante el perodo de tiempo necesario para una disolucin
completa del tejido. Los tubos se dejan enfriar y se les agrega 7ml de etanol al 95%
mezclando rpidamente. La solucin se calienta de nuevo en el bao de agua hirviendo,
teniendo cuidado de preveer cualquier prdida de material, debida a la formacin aguda y
explosiva de burbujas. Se enfra y se centrfuga, descartando el lquido sobrenadante, Los
restos de alcohol que contiene el precipitado se deben evaporar colocndolo en un bao de
agua a 70 C hasta que el glucgeno se seque (Fig. 20).

SACRIFICAR

DESANGRAR

EXTRAER EL HGADO Y MSCULO ESQUELTICO

PESAR 0,5 GRAMOS DE CADA TIPO DE TEJIDO


(HEPTICO Y MUSCULAR)

COLOCAR 4ml DE KOH 30%

CALENTAR EN AGUA HIRVIENDO


POR 20 MIN

ENFRIAR
AGREGAR 7 ml de etanol al 95%

Calentar en bao de agua hirviendo por 15 min

Enfriar

Precipitado: Evaporar en alcohol remane


Sobrenadante: descartar

Fig. 20 Esquema del aislamiento del glucgeno del tejido heptico y muscular.

B-) Cuantificacin del glucgeno:


El glucgeno obtenido en el tubo se debe disolver en 10ml de agua.

Antes de proceder a la cuantificacin, se deben realizar unas diluciones segn la


condicin de alimentacin del animal de experimentacin:

B.1 Para animales de experimentacin alimentados, se toman 0,5 ml de la solucin de glucgeno


y se agregan 9,5 ml de agua destilada. Posteriormente se toman 2,5 ml de esta solucin y
cuantificar por el mtodo de la Antrona (Fig.21).
B.2 Para animales de experimentacin ayunados se toman 0,5 ml de la solucin de glucgeno y
se agrega 2,0 ml con agua destilada y cuantificar por el mtodo de la Antrona (Fig. 21).

B.1 Glucgeno obtenido del hgado o del msculo en ratones alimentados


Mida 2,5 ml S2

Mida 0,5 ml S1

Diluya
Con 10 ml de H2O

Solucin 1 (S1)
Volumen Total: 10 ml

Coloque
Diluya los 4 ml de Antrona con cuidado la reaccin es muy exotrmica, leer la absorbancia a 6
Con 9,5 ml de H2O
Dx2
Dx1

Solucin 2 (S2)
Volumen Total: 10 ml

Solucin 3 (S3)
Volumen Total: 6 ml

B.2 Glucgeno obtenido del hgado o del msculo en ratones a los que se
administr solucin fisiolgica con ayuno, por 48 horas.
Mida 0,5 ml S1 + 2,0 ml de H2O

Coloque los 4 ml de Antrona con cuidado la reaccin es muy exotrmica, leer la absorbancia a 620 nm
Diluya
Con 10 ml de H2O
Dx2

Solucin 1 (S1)
Volumen Total: 10 ml

Solucin 2 (S2)
Volumen Total: 10 ml

Fig. 21 Esquema para la realizacin de las diluciones

les

A continuacin se rotulan 8 tubos como patrn 1 (P1), patrn 2 (P2), patrn 3 (P3),
patrn 4 (P4), patrn 5 (P5), desconocido ayunado del tejido heptico (Dx1H), desconocido
alimentado del tejido heptico (Dx2H), desconocido ayunado del tejido muscular (Dx3M),

desconocido alimentado del tejido muscular (Dx4M) y el blanco (B). Adicione las sustancias
segn se indica en el siguiente cuadro:

VSt(ml)

VH2O (ml)

P1
P2
P3
P4
P5
Dx1H
Dx2H
Dx3M
Dx4M
B

0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
----------------------------------------------

2,4
2,3
2,2
2,1
2,0
------------------------2,5

Vantrona (ml)
(ml)
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4

Absorbancia

Se dejan los tubos en un bao de agua a temperatura ambiente (25C) durante 10


minutos y luego se leen a 620 nm.
Si las soluciones coloreadas son turbias se deben agregar 2ml adicionales de Antrona,
mezclar y leer.

IV.

RESULTADOS
1. Realice una curva de calibracin de glucosa usando la absorbancia de los patrones
de glucosa vs la cantidad de glucosa e identifique apropiadamente (Fig.22).
2. Extrapole los valores de absorbancia obtenidos correspondientes a Dx1 y Dx2 en la
curva de calibracin de glucosa para determinar el valor de glucosa de las muestras
en estudio.
3. Transforme la cantidad de glucosa obtenidas Dx1 y Dx2 a glucgeno multiplicando
por el factor de 0,9.
4. Multiplique por el factor de dilucin total.
5. Determine la cantidad de glucgeno por 100 gramos de tejido heptico en animales
de experimentacin alimentados y ayunados.
6. Investigue los valores de referencia de glucgeno heptico en seres humanos.
7. Compare los resultados obtenidos provenientes del modelo experimental animal con
valores de referencia de glucgeno heptico.

Absorbancia, (adimensional)

Grfica de tendencia de la glucosa


1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Cantidad de Glucosa, (mg)


Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Bioqumica de la Universidad de Oriente Ncleo de Bolvar.

Fig. 22 Grfica de tendencia de la glucosa

V.

EJERCICIOS
1.
2.
3.
4.
5.

VI.

Cul es el fundamento terico de la reaccin de la Antrona?


Por qu se utiliza el factor 0.9 para conversin del valor de glucosa a glucgeno?.
Qu otras sustancias tienen efectos glucogenolticos?.
Qu sucede con el glucgeno del tejido muscular durante el ayuno?.
Cul es la fuente de energa una vez consumido el glucgeno?.

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Baynes J., Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier. 6:
59-71.
a
Makee T. y Makee J. 2013. Bioqumica las bases moleculares de la vida. 5 Ed. Editorial
McGraw-Hill. Mxico.
Moreno JM., Manzanares J., Daz MC., Benlloch T. Protocolo de diagnstico y seguimiento
de pacientes con glucogenosis de afectacin fundamentalmente heptica. Madrid. 10:
245-287.

Moreno Y. Jos. 1986. Conceptos fundamentales en Bioqumica: Enzimas. Teora y


Problemas. Ed. Espasanda 1ra ed.
Murray R., Granner D., Mores P., Rodwell V.1994. Bioqumica de Harper. 13va Ed. El manual
moderno.
Orten J. y Neuhaus O. 1984. Bioqumica Humana. 10ma Ed. Ed. Panamericana.

PRCTICA 6: METABOLISMO INTERMEDIARIO. EFECTO DE DLMETIONINA Y DL-ETIONINA SOBRE EL CONTENIDO DE TRIGLICERIDOS


Y COLESTEROL EN HGADO DE RATAS
OBJETIVOS
Analizar la funcin de los lpidos en los distintos tejidos biolgicos y los mecanismos de
accin de la DL-Metionina y de DL- Etionina.

OBJETIVOS ESPECFICOS
1.
2.
3.
4.

Explicar el papel de los lpidos en los distintos tejidos biolgicos.


Explicar el papel de los solventes no polares en la extraccin de lpidos.
Diferenciar los mecanismos de accin de la DL- Metionina y de la DL-Etionina.
Calcular el contenido de triglicridos y colesterol heptico a partir de datos
experimentales.
5. Explicar el proceso de saponificacin.
6. Explicar el fundamento de la reaccin de Liebermman Buchard.

I. INTRODUCCIN
Los principales constituyentes del tejido adiposo son las grasas neutras. Otros tejidos
ricos en lpidos, tales como el cerebro, contienen relativamente pequeas cantidades de
grasa neutras, estos son ms ricos en cerebrsidos, ganglisidos, esfingolpidos y
sulfolpidos. Los fosfolpidos sencillos: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,
etc., son componentes estructurales de todas las membranas celulares en todos los tejidos y
difieren del grado de saturacin de los cidos grasos que los constituyen. Presentan adems
caractersticas funcionales en el transporte de las diversas Lipoprotenas presentes en el
plasma, formando una interfase polar-no polar entre el agua del medio y los lpidos
respectivamente.
En condiciones normales existe una movilizacin de cidos grasos desde hgado hacia
los depsitos (tejido adiposo) como material de reserva energtica, condicin esta que
depende del estado nutricional y fisiolgico del individuo. La forma estructural de reserva es
como triacilglicrido en mayor proporcin. El hgado es el principal encargado de sintetizar
fosfolpidos, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, ganglisido, sulfolpidos,
etc., los cuales son constituyentes estructurales de todas las membranas biolgicas.
En caso de administrar DL-Etionina en dosis crecientes a un animal de
experimentacin, se observar un efecto contrario al caso anterior. El ATP al reaccionar con
la Etionina forma S-Adenosil-Etionina, coenzima no reconocida o no funcional en la sntesis
de fosfatidilcolina. Por lo tanto, sta no se sintetiza y los cidos grasos libres hepticos se
acumularn dando origen a un hgado graso. La S adenosil metionina en vez de saturarse de

metilos lo har de grupos etilos, y no podr cumplir con su funcin en la sntesis de


fosfatidilcolina. Por lo tanto, sta no se sintetiza y los cidos grasos libres hepticos se
acumularn dando origen a un hgado graso.

Por otra parte, la etionina interfiere en la sntesis proteica, ocupa el sitio de la


Metionina, producindose error en la estructura primaria. El estudiante deber sacar sus
conclusiones con respecto al metabolismo del colesterol para ambos casos (DL- Metionina y
DL- Etionina).
El aislamiento de los lpidos complejos es un trabajo laborioso debido a los siguientes
hechos: los distintos grupos de lpidos tienen a menudo propiedades qumicas similares, son
inestables al someterlos a las manipulaciones ordinarias de laboratorios (fcilmente
oxidables a temperatura ambiente) y la mayora son solubles en sistema no acuoso y
extremadamente insolubles en sistemas acuosos.
El objetivo de esta prctica consiste en extraer lpidos totales a partir de tejidos de
animales, mediante la utilizacin de diferentes solventes no polares para separar y cuantificar
los lpidos en las diferentes condiciones experimentales.
Los lpidos saponificables (Ej. Triglicridos y fosfolpidos sencillos) reaccionan con
lcalis en caliente dando lugar a la sal del cido graso (jabn) y glicerol. Esta propiedad se
basa el mtodo de cuantificacin del trabajo prctico. Al extracto de lpidos obtenido, se le
agrega exceso de lcalis (concentracin determinada) y luego se titula con cido de
normalidad conocida. De esta forma por diferencia del blanco con respecto a la muestra se
conocer la cantidad de cido graso presente en el extracto. Para fines estequiomtricos
tmese como peso molecular promedio de cido grasos 265 g/mol. El valor final se deber
expresar como gramos de triglicridos por 100g de tejidos, para lo cual deber tomar en
cuenta el peso molecular del glicerol y la prdida de 3 molculas de agua.

Fig.23 Hidrlisis del triacilglicerol

El colesterol presente en el extracto lipdico se cuantificar por el mtodo Liebermman


Buchard, el cual consiste en una deshidratacin sucesiva a partir del C3 por parte de la
mezcla anhdrido-actico sulfrico.

II.MATERIALES GENERALES

3 Ratas machos normales inyectadas con solucin salina isotnica.

3 Ratas machos inyectadas con DL- Metionina.


3 Ratas machos inyectadas con DL- Etionina.
Barra de hierro para dislocacin cervical.
Papel peridico
Material quirrgico suministrado por el alumno.
Vidrio de reloj previamente tarado.
Balanza basculante
Homogenizador tipo omnimexer-marca sorvall
Cilindro graduado de 250ml (3)
Elermeyer de 500 ml (3)
Embudos medianos (3)
Filtros plegados (3)
Erlenmeyer de 25 ml (3)
Frascos de centrfuga (9)
Centrfuga internacional a 0 grados.
Kitasato con sus correspondientes gomas y pipetas Pasteur (3)
Baos de mara a ebullicin (3)
Beaker de 500 ml (3)
Embudos de separacin
Soportes para embudos de separacin (3)
Tubos de centrfuga graduados de 15 ml (6)
Buretas de 50 ml (12)
Espectrofotmetro
Celdas de cuarzo.
Goteros (5)

III. MATERIALES POR ALUMNO

Tubos de ensayos (3)


Frasco de compota (2)
Gradilla para tubos de ensayos (1)
Pipetas graduadas de 1 ml (1), 5 ml (2), 10 ml (2).

IV. REACTIVOS GENERALES

Mezcla de Folch 2000 ml


ter di etlico 1000 ml
Sulfato de sodio anhidro 200 g.

V. REACTIVOS POR ALUMNOS

ter de petrleo 10 ml
KOH alcohlico 0,2 N
Fenolftalena alcohlica 0,2 %
HCl 0,2 N

Cloroformo
Solucin clorofrmica
Solucin clorofrmica de colesterol 6,4 mg/8ml

Mezcla anhdrido actico: sulfrico (40:2)

VI. PROCEDIMIENTO
A) EXTRACCIN DE LPIDOS POR EL MTODO DE FOLCH
1. Inyectar 3 ml de una solucin salina de DL-Metionina (16,7 mg d DL-Metionina/ml)
intraperitonealmente a un grupo de ratas machos.
2. Inyectar 3 ml de una solucin salina DL-Etionina intraperitonealmente a otro grupo de
ratas machos.
3. Inyectar 3 ml de una solucin salina isotnica intraperitonealmente a un grupo de ratas
machos, que sirve como control.
4. Repetir los pasos (1, 2 y 3) a las 2 , 5 y 7 horas.
5. Sacrificar los animales 24 horas despus de la primera inyeccin por dislocacin
cervical. (consulte el esquema).
6. Extraiga el hgado y obtenga su peso.
7. Hacer el estudio macroscpico: tamao, color, contextura y elasticidad de los hgados.
Registrar cualquier diferencia observada en los mismos.
8. Prepare el reactivo de Folch (Cloroformo: metanol en la proporcin 2:1). Por cada
gramo de hgado utilizar 20 ml de la mezcla.
9. HOMOGENICE el tejido con el 70% del volumen del reactivo de Folch, y utilice el 30%
restante para lavar el homogenizador.
10. Filtre el homogenizado
11. Al filtrado agrguele 20% del volumen de agua destilada, mezcle bien y centrifugue a
1500 rpm durante 10 min.
12. Coloque el remanente, una vez fro en un embudo de separacin y agrguele beaker y
evapore el solvente en Bao de Mara a ebullicin hasta casi sequedad.
13. Coloque el remanente, una vez fro en un embudo de separacin y agrguele una
porcin de ter dietlico, lavar el beaker con 5 ml de ter dietlico y transferirlo al
embudo de decantacin. Agregar 1 ml de agua, agitar y decantar.

14. Transferir la capa acuosa inferior a otro embudo de decantacin y agregar a sta 5 ml
de ter dietlico. Agitar y dejar decantar. Desechar la capa inferior acuosa la capa
etrea mezclarla con el ter dietlico del primer embudo de decantacin y el papel de
filtro con 3 ml de ter etlico.

15. Evaporar la solucin de ter dietlico hasta un volumen inferior a 10 ml.


16. Transferir el ter dietlico a una probeta graduada y completar a 10 ml, rotule como
extracto de lpidos totales.

B-) DETERMINACIN DE CIDOS GRASOS


Se har el experimento con el extracto de lpidos totales preparados por los alumnos
1. Pipetese 5 ml de extracto de lpidos totales en un matraz Erlenmeyer de 50 ml,
adanse 10,0 ml de KOH 0,2 N alcohlico.
2. En un segundo matraz pipetese 5 ml de ter de petrleo y 10,0 ml de KOH alcohlico
0,2 N. Este servir como testigo o blanco.
3. Mzclense las soluciones en cada matraz y colquense en el bao de agua hirviendo
durante 30 min. Viglese constantemente para evitar que evapore el alcohol, en cuyo
caso se aadir alcohol puro en pequeas cantidades.
4. Al final de los 30 minutos, mientras est an caliente el lquido, adanse en cada
matraz 5 a 10 ml de alcohol de 95% y dos gotas de indicador de fenoleftalena.
5. Titlese con cido patrn (HCl 0,2 N) hasta desaparicin del color violeta, tanto el
matraz experimental como en el blanco.
6. La diferencia de los volmenes encontrados entre los frascos representa la cantidad
de lcali necesaria para saponificar los lpidos hidrolizables del extracto.

C) CUANTIFICACIN DEL COLESTEROL


1. Colquese 1,0 ml de extracto de lpidos en un tubo de ensayo.
2. Evaprese a sequedad completamente. No debe quedar el menor vestigio de
humedad.
3. Enfrese y adase 8 ml de cloroformo anhdro. Agtese con suavidad para disolver los
lpidos.
4. En un segundo tubo de ensayo pipeteense 8 ml de solucin de colesterol patrn en
cloroformo (cuya concentracin es de 0,8 mg/ml de colesterol).
5. Preprese un blanco, colocando 8 ml de cloroformo seco en un tercer tubo de
ensayo.
6. A cada uno de los tres tubos adase 4 ml de una mezcla recientemente preparada
de anhdrido actico y cido sulfrico concentrado (40:2).

CUIDADO, NO PERMITA QUE EL ANHDRIDO ACTICO ENTRE EN


CONTACTO CON AGUA O SOLUCIONES DILUIDAS. PARA AADIR LA
MEZCLA USE LA BURETA
7. Mzclese bien, tpese y djese en la oscuridad durante 10 minutos.
8. Calibre el espectrofotmetro a cero con el tubo blanco.
9. Lase el patrn y el desconocido en el espectrofotmetro.

VII.

ESQUEMA DE EXTRACCIN DE LPIDOS TOTALES EN HGADO


SACRIFICAR
DESANGRAR
EXTRAER EL
HGADO
AGREGAR 20 ML DE REACTIVO DE FOLCH POR GRAMO DE TEJIDO
HOMOGENIZAR Y FILTRAR
FILTRADO: AGRAGARLE 20% DEL VOLUMEN DE AGUA DESTILADA

MEZCLAR BIEN
CENTRIFUGAR POR 10 MIN A 1500 RPM

CAPA SUPERIOR

CAPA INFERIOR

DESCARTAR
EVAPORAR HASTA CASI SEQUEDAD
TRANSFERIR A EMBUDO DE
SEPARACIN AGREGAR TER
DIETLICO + 1Ml DE AGUA
AGITAR

CAPA SUPERIOR

CAPA INFERIOR

TRANSFERIR

A
EMBUDO

DECANTACIN + 5 Ml ETER DIETLICO


AGITAR

CAPA SUPERIOR

CAPA INFERIOR
DESCARTAR

FILTRAR CON Sulfato de Sodio+


ter dietlico Evaporar hasta un
volumen de 10 ml
Transferir a probeta graduada, completar hasta 10 ml

ROTULAR: EXTRACTO DE LPIDO TOTALES

VIII. REFERENCIA BILBIOGRFICA


Lehninger, A. 1972. Bioqumica. Ediciones OMEGA- Barcelona. 5ta. Ed.
Murray R., Granner D., More P., Rodwell V. 1994. Bioqumica de Harper. 13va. Ed. El Manual
Moderno.
Orten J., Neuhaus O. 1984. Bioqumica Humana. 10ma ed. Panamericana.