PRACTICA 3

OBTENCIN DE MICROORGANISMOS FIJADORES DE

NITROGENO DE VIDA LIBRE
OBJETIVOS

Obtener microorganismos fijadores asimbiticos de nitrgeno de los gneros Azospirillum y

Azotobacter
Comprobar La tcnica de aislamiento en cultivos selectivos para la obtencin de bacterias
fijadoreas de nitrgeno activas
Observar las caractersticas fisiolgicas y morfolgicas de bacterias fijadoras de nitrgeno de
vida libre, en respuesta a condiciones ambientales propicias para su actividad.

PROCEDIMIENTO
PREPARE LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS PARA AISLAMIENTO

Medio Ashby para aislamiento de Azotobacter sp

Componente
Cantidad (gr / L)
K2HPO4
0,2
MgSO4 7H2O
0,2
NaCl
0,2
CaCO3
5
K2SO4
0,1
Manitol
15
Agar
15
PH Ajustar a 7
*Se puede agregar 5ml de extracto de suelo o 0.1 gramo de extracto de levadura.
Esterilizacin: 20 minutos a 121 oC
Medio NFB cido mlico Semislido para aislamiento de Azospirillum sp
Componente
Cantidad (gr / L)
K2HPO4
0,5
Na2MoO4
2 mg
MnSO4
0.3mg
MgSO4 7H2O
0,2
NaCl
0,02
CaCl2
5
FeSO4
0,0017
Acido Mlico
5
KOH
4
Agar
2
*Azul de bromotimol (Solucin)
3 ml
PH Ajustar a 6,5 - 7
*Azul de bromotimol Solucin al 0.5% con KOH 0.2 N.
Esterilizar a 121C, 20 minutos en autoclave
El medio semislido se sirve en tubos de ensayo o frascos ocupando un tercio del volumen.
Con la misma preparacin se agregan 15 gramos de agar para preparar medio slido y se
suplementa con 0,5 gramos de extracto de levadura

Para evidenciar el crecimiento de algunas especies de Azospirillum se puede preparar el medio

slido sin azul de bromotimol y a cambio se agrega 15ml de solucin de rojo congo(1 g disuelto en
400 mL)
OBTENCIN DE MICROORGANISMOS NFB EN LOS MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS
PURIFICACIN DE CEPAS
Azotobacter: mtodo??
Tome muestras de suelo de buena calidad, pase la muestra por tamices de diferente tamao de
poro hasta obtener partculas de suelo uniformes, del menor tamao posible conservando su
estructura y agregacin. Transfiera los grnulos seleccionados a una caja de petri seca y estril,
con unas pinzas estriles, tome los grnulos de suelo y dispongamos de a 5, 7 o 9 sobre las cajas
con medio de cultivo Ashby (Figura1). Incube a 30oC y observe peridicamente hasta evidenciar
colonias en crecimiento alrededor de los grnulos. Consulte la literatura para reconocer las
caractersticas del genero en este medio de cultivo. Tome las colonias tpicas de Azotobacter,
realice coloracin de Gram para reconocer sus caractersticas microscpicas y purifquelas sobre
nuevas cajas de medio de cultivo selectivo.

Figura 1: Disposicin de grnulos de suelo sobre medio de cultivo Ashby

Fijadores microaerofilicos tipo Azospirillum mtodo??
Tome muestras de raicillas finas (con el suelo adherido sobre su superficie) de plantas gramneas
(maz, caa, arroz, pastos). Coloque 1 gramo junto en un tubo con 9 ml de solucin salina al
0,8% . Agite vigorosamente en vortex durante 5 minutos, posteriormente prepare diluciones
seriadas y de cada una de las diluciones inocule 0,1ml en cada frasco del medio selectivo
semislido, incube a 30 oC hasta observar la formacin de una pelcula fina de color blanco o
amarillo a 2-5 ml de la superficie del medio. Con un asa tome una parte de la pelcula formada y
transfirala al medio selectivo slido realizando estriado por agotamiento, con el fin de obtener
colonias aisladas. Realice coloraciones de Gram para reconocer sus caractersticas microscpicas.
PROCEDIMIENTO COMPLEMENTARIO OPCIONAL
OBTENCIN DE
SELECCIONADOS.

UN

BIOPREPARADO

BASE

DE

LOS

MICROORGANISMOS

A partir de cada aislamiento microbiano de los diferentes grupos funcionales se lleva a cabo una
propagacin masiva para la obtencin de un inculo en caldo nutritivo enriquecido con extracto de
levadura y glucosa, o en diferentes medios que permitan el crecimiento rpido y abundante de los
diferentes microorganismos.

INOCULACIN DE PLANTAS DE CRECIMIENTO CORTO CON BIOPREPARADOS A BASE DE

MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL
4.1 Se colocan 500 gramos de suelo en recipientes plsticos.
4.2. Se sembraron 10 semillas de la planta seleccionada (planta indicadora de crecimiento rpido)
en cada uno de los recipientes.
4.3. Seguidamente se aplican10ml del biopreparado con el microorganismo a probar sobre toda la
superficie del suelo y se riega inmediatamente sin inundacin. Se coloca un tratamiento sin inoculo
como control y se adiciona el medio de cultivo sin microorganismo.
4.4. Realice conteos diarios del porcentaje de semillas germinadas en cada tratamiento

DETERMINACIN DEL EFECTO DE LA INOCULACIN POR MEDIO DE PARAMENTROS DE

CRECIMIENTO VEGETAL
Despus de varios das de crecimiento das se desentierran cuidadosamente todas las plantas y se
realizan las siguientes determinaciones:
Longitud Promedio de la raz.
Longitud Promedio de las hojas.
Biomasa del follaje y de races.

CUESTIONARIO

Consulte las caractersticas morfolgicas propias del genero Azotobacter y Azospirillum

que permiten su reconocimiento en el laboratorio.
Consulte el fundamento de los medios de cultivo utilizados en el laboratorio para el
aislamiento de Azotobacter sp y Azospirillum sp.; que ocurre bioqumicamente en cada
medio de cultivo, que permite el desarrollo de un gnero bacteriano en particular.
Qu diferencia hay en el proceso de fijacin de nitrgeno entre bacterias de vida libre
como las estudiadas en esta prctica y bacterias simbiticas como Frankia sp y Rhizobium
sp?
Que importancia ha tenido el uso de inoculantes microbianos a base de Azotobacter y
Azospirillum para la agricultura.